JPS6059212B2 - 第８因子の取得法 - Google Patents
第８因子の取得法Info
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- JPS6059212B2 JPS6059212B2 JP56006248A JP624881A JPS6059212B2 JP S6059212 B2 JPS6059212 B2 JP S6059212B2 JP 56006248 A JP56006248 A JP 56006248A JP 624881 A JP624881 A JP 624881A JP S6059212 B2 JPS6059212 B2 JP S6059212B2
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- JP
- Japan
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- plasma
- precipitate
- citrate
- factor
- anticoagulant
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- Expired
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
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- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は化学的沈澱試薬を使用することなく中間純度の
第■因子を得る方法に関する。
第■因子を得る方法に関する。
本技術は第■因子と冷一不溶性グロブリン（ＣＯｌｄ一
ＩｎｓＯｌｕｂｌｅｇｌＯｂｌｌｌｌｎ）（ＣＩｇ）と
いう血漿プロテインとのへバリンー誘発共沈によるもの
である。１９５詳にトーマス（ＴｈＯｍａｓ）等は１兎
及びヒト血漿中蛋白質のへバリンによる冷沈澱Ｊ（ＣＯ
ｌｄｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉＯｎｂｙｈｅｐａｒｉｎＯ
ｆａｐｒＯｔｅｉｎｉｎｒａｂｂｉｔａｎｄｈｕｍａｎ
ｐｌａｓｎｌａ）の標題の論文（ＰｒＯｃ．ＳＯｃ．Ｅ
ｘｐ．ＢｌＯｌ．Ｍｅｄ．８６：８１３−８１９）にお
いて、エンドトキシンで処理した兎からへバリンー誘発
の冷あるいは低温沈澱血漿が生することを報告した。
ＩｎｓＯｌｕｂｌｅｇｌＯｂｌｌｌｌｎ）（ＣＩｇ）と
いう血漿プロテインとのへバリンー誘発共沈によるもの
である。１９５詳にトーマス（ＴｈＯｍａｓ）等は１兎
及びヒト血漿中蛋白質のへバリンによる冷沈澱Ｊ（ＣＯ
ｌｄｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉＯｎｂｙｈｅｐａｒｉｎＯ
ｆａｐｒＯｔｅｉｎｉｎｒａｂｂｉｔａｎｄｈｕｍａｎ
ｐｌａｓｎｌａ）の標題の論文（ＰｒＯｃ．ＳＯｃ．Ｅ
ｘｐ．ＢｌＯｌ．Ｍｅｄ．８６：８１３−８１９）にお
いて、エンドトキシンで処理した兎からへバリンー誘発
の冷あるいは低温沈澱血漿が生することを報告した。
このフラクシヨンは、それ以来、血漿のへバリン沈澱フ
ラクシヨンとして知られるようになつた。その後の研究
はスミス（Ｓｍｉｔｈ）及びフオンコーフ（ＶＯｎＫＯ
ｒｆｆ）により１９５７年に１ヒト血漿のへバリン沈澱
フラクシヨン，１．このフラクシヨンの分離及び特性Ｊ
（Ａｈｅｐａｒｉｎ一Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｂｌｅｆｒａ
ｃｔｉＯｎＯｆｈｕｍａｎｐｌａｓｍａ．Ｉ．ＩｓＯｌ
ａｔｉＯｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａＴｉＯｎＯ
ｆｆｒａｃｔｉＯｎ）の標題で（Ｊ．Ｃｌｌｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．３６：５９６−６０５）、そしてスミス（Ｓｍ
ｉｔｈ）により１ヒト血漿のへバリンー沈澱フラクシヨ
ン■、正常人及び各種の病気状態の一このフラクシヨン
の存在及び意義Ｊ（Ａｈｅｐａｒｉｎ−Ｐｒｅｃｉｐｉ
ｔａｂｌｅｆｒａｃｔｉＯｎＯｆｈｕｍａｎｐｌａｓｍ
ａｌｌ．Ｏｃｃｕｒｅｎｃｅａｎｄｓｉｇｎｉｆｉｃａ
ｎｃｅ０ｆｔｈｅｆｒａｃｔｉ０ｎｉｎｎ０ｒｍａＩｉ
ｎｄｉｖｉｄｕａ１ｓａｎｄｉｎｖａｒｉ０ｕｓｄｉｓ
ｅａｓｅｓｔａｔＥｓ）の標題で（Ｊ．Ｃｌｌｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．３６：６０５−６１６），論文が報告され次
のことが示された。すなわち、大量の冷沈澱フラクシヨ
ンが或種の炎症性の伝染病及び新生腫瘍疾患をもつた患
者の血漿にへバリンを加えたときに、この血漿から形成
される。正常の血液提供者においてはその生成量が一般
に少・ないことも示している。近時このフラクシヨンの
主要成分がフィブリノーゲンであることが確認された。
このフラクシヨンの第二主要成分もまた認められ、１冷
一不溶性グロプリンョという名称で知られている。この
冷一不溶性グロブリン（Ｃｌｇ）は構造的にそして免疫
化学的にフィブリノーゲン及び他の全ての血漿プロテイ
ンと相違するノルマルプラズマグリコプロテインである
ことが知られている。
ラクシヨンとして知られるようになつた。その後の研究
はスミス（Ｓｍｉｔｈ）及びフオンコーフ（ＶＯｎＫＯ
ｒｆｆ）により１９５７年に１ヒト血漿のへバリン沈澱
フラクシヨン，１．このフラクシヨンの分離及び特性Ｊ
（Ａｈｅｐａｒｉｎ一Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｂｌｅｆｒａ
ｃｔｉＯｎＯｆｈｕｍａｎｐｌａｓｍａ．Ｉ．ＩｓＯｌ
ａｔｉＯｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａＴｉＯｎＯ
ｆｆｒａｃｔｉＯｎ）の標題で（Ｊ．Ｃｌｌｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．３６：５９６−６０５）、そしてスミス（Ｓｍ
ｉｔｈ）により１ヒト血漿のへバリンー沈澱フラクシヨ
ン■、正常人及び各種の病気状態の一このフラクシヨン
の存在及び意義Ｊ（Ａｈｅｐａｒｉｎ−Ｐｒｅｃｉｐｉ
ｔａｂｌｅｆｒａｃｔｉＯｎＯｆｈｕｍａｎｐｌａｓｍ
ａｌｌ．Ｏｃｃｕｒｅｎｃｅａｎｄｓｉｇｎｉｆｉｃａ
ｎｃｅ０ｆｔｈｅｆｒａｃｔｉ０ｎｉｎｎ０ｒｍａＩｉ
ｎｄｉｖｉｄｕａ１ｓａｎｄｉｎｖａｒｉ０ｕｓｄｉｓ
ｅａｓｅｓｔａｔＥｓ）の標題で（Ｊ．Ｃｌｌｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．３６：６０５−６１６），論文が報告され次
のことが示された。すなわち、大量の冷沈澱フラクシヨ
ンが或種の炎症性の伝染病及び新生腫瘍疾患をもつた患
者の血漿にへバリンを加えたときに、この血漿から形成
される。正常の血液提供者においてはその生成量が一般
に少・ないことも示している。近時このフラクシヨンの
主要成分がフィブリノーゲンであることが確認された。
このフラクシヨンの第二主要成分もまた認められ、１冷
一不溶性グロプリンョという名称で知られている。この
冷一不溶性グロブリン（Ｃｌｇ）は構造的にそして免疫
化学的にフィブリノーゲン及び他の全ての血漿プロテイ
ンと相違するノルマルプラズマグリコプロテインである
ことが知られている。
Ｃｌｇは一般に０．３３±０．１ｆ／ｅの血漿水準で正
常に循環する。種々な形の冷一不溶性グロブリンが様々
の名前でよばれており、１フイプロネクチンＪ（Ｆｉｂ
ｒＯ−Ｎｅｃｔｉｎ）の名称が近年受け入れられている
（ザ ストラクチヤー アン・ド バイオロヂツク ア
クティビティ オブ プラズマ フイプロネクチン（Ｔ
ｈｅＳｔｎｌｃｔｕｒｅａｒＫｌＢｉＯｌＯｇｉｃＡｃ
ｔｉｖｉｔｉｅｓＯｆＰｌａｓｍａＦｉｂｒＯｎｅｃｔ
ｉｎ）モツセソン（ＭＯｓｅｓｓＯｎ）ら、プラット（
ＢｌＯＯｄ）５６巻、ＮＯ．２、１４５−１関頁）。１
９７４ｊＶ．にフエケト（Ｆｅｋｅｔｅ）らに与えられ
た米国特許第３８０３１１５号は血漿または血漿フラク
シヨンから得られた第■因子すなわちＡＨＦの収率を改
良する方法には、低温沈澱により血漿または血漿フラク
シヨンから得られたＡＨＦの濃縮物にへバリンを加える
ことが包含されている。
常に循環する。種々な形の冷一不溶性グロブリンが様々
の名前でよばれており、１フイプロネクチンＪ（Ｆｉｂ
ｒＯ−Ｎｅｃｔｉｎ）の名称が近年受け入れられている
（ザ ストラクチヤー アン・ド バイオロヂツク ア
クティビティ オブ プラズマ フイプロネクチン（Ｔ
ｈｅＳｔｎｌｃｔｕｒｅａｒＫｌＢｉＯｌＯｇｉｃＡｃ
ｔｉｖｉｔｉｅｓＯｆＰｌａｓｍａＦｉｂｒＯｎｅｃｔ
ｉｎ）モツセソン（ＭＯｓｅｓｓＯｎ）ら、プラット（
ＢｌＯＯｄ）５６巻、ＮＯ．２、１４５−１関頁）。１
９７４ｊＶ．にフエケト（Ｆｅｋｅｔｅ）らに与えられ
た米国特許第３８０３１１５号は血漿または血漿フラク
シヨンから得られた第■因子すなわちＡＨＦの収率を改
良する方法には、低温沈澱により血漿または血漿フラク
シヨンから得られたＡＨＦの濃縮物にへバリンを加える
ことが包含されている。
この特許は１９７８年７月１１日にＲｅ２９６９８とし
て再発行された。この再発行特許において、フエケツト
らにより、低温沈澱により血漿または血漿フラクシヨン
から得られたＭｆ濃縮物にへバリンを添加することが示
され、そして更に、分留によソー層濃縮されたＭ正濃縮
物を得るためにさらに分画できることが示されている。
この再発行特許の第２欄３桁等にへバリンはクエン酸塩
と共に加えるのがＭ正の更に濃厚な濃縮物を得るに好適
であることが示されている。二つの抗凝血剤の添加の好
適の方法は、へバリンをへバリン化クエン酸塩溶液の形
で低温沈澱に加える方法てある。ＡＨＦの濃厚な低温沈
澱は更に分画され、更に濃厚なＡＨＦの形で得られる。
へバリンは２度加えるのが好適であり、１回目は最初の
低温沈澱にそして続いて更に分画されたＡＦ［Ｆ濃縮物
に加える。各々の場合、へバリンは第二の抗凝血剤とし
てのクエン酸塩と共に加えるのが好適である。フエケツ
トの原特許及び再発行特許において注目すべき重要なこ
とは、血漿は提供者源から冷凍されて受け入れられ、つ
いで、低温沈澱工程はへバリンを加える前に行われるこ
とである。
て再発行された。この再発行特許において、フエケツト
らにより、低温沈澱により血漿または血漿フラクシヨン
から得られたＭｆ濃縮物にへバリンを添加することが示
され、そして更に、分留によソー層濃縮されたＭ正濃縮
物を得るためにさらに分画できることが示されている。
この再発行特許の第２欄３桁等にへバリンはクエン酸塩
と共に加えるのがＭ正の更に濃厚な濃縮物を得るに好適
であることが示されている。二つの抗凝血剤の添加の好
適の方法は、へバリンをへバリン化クエン酸塩溶液の形
で低温沈澱に加える方法てある。ＡＨＦの濃厚な低温沈
澱は更に分画され、更に濃厚なＡＨＦの形で得られる。
へバリンは２度加えるのが好適であり、１回目は最初の
低温沈澱にそして続いて更に分画されたＡＦ［Ｆ濃縮物
に加える。各々の場合、へバリンは第二の抗凝血剤とし
てのクエン酸塩と共に加えるのが好適である。フエケツ
トの原特許及び再発行特許において注目すべき重要なこ
とは、血漿は提供者源から冷凍されて受け入れられ、つ
いで、低温沈澱工程はへバリンを加える前に行われるこ
とである。
へバリンは低温沈澱が生じた後に、低温沈澱またはＡＨ
Ｆ濃縮物にのみ加えられる。フエケツトの再発行特許の
４欄、４６〜４Ｃｆｆを参照すると、低温沈澱は可溶化
されていることがその温度より明らかであり、Ｃｌｇ５
ｌはフイプロネクチンは損失し、その為第■因子の回収
を目的とするには不利である。フエケツトによれば、第
■因子の収率はへバリンを用いない方法の１３．６％又
は１２．５％から、へバリンを用いる方法で１７％に改
善された。フエケツトはこの約４％の増加はへバリンを
用いない方法に対し２５％の増加であることを指摘して
いる。しかしながら、この特許の５欄の表、実施例１に
１おいて、低温沈澱からの総収率は３５％と低く、出発
血漿のリットル当り３５０単位にすぎないことを示して
いる。それ故、最終生成物の１７％の収得は出発血漿の
リットル当り１７師位にすぎないことを示している。こ
の計算は血漿のｍｌ当り１単位の・国際基準を基にした
。フイプロネクチン及びフィブリノーゲンの冷一沈澱は
１９η年の原フエケツト特許の出願日の数年前から確立
されていた方法であることは前記検討から明らかであろ
う。
Ｆ濃縮物にのみ加えられる。フエケツトの再発行特許の
４欄、４６〜４Ｃｆｆを参照すると、低温沈澱は可溶化
されていることがその温度より明らかであり、Ｃｌｇ５
ｌはフイプロネクチンは損失し、その為第■因子の回収
を目的とするには不利である。フエケツトによれば、第
■因子の収率はへバリンを用いない方法の１３．６％又
は１２．５％から、へバリンを用いる方法で１７％に改
善された。フエケツトはこの約４％の増加はへバリンを
用いない方法に対し２５％の増加であることを指摘して
いる。しかしながら、この特許の５欄の表、実施例１に
１おいて、低温沈澱からの総収率は３５％と低く、出発
血漿のリットル当り３５０単位にすぎないことを示して
いる。それ故、最終生成物の１７％の収得は出発血漿の
リットル当り１７師位にすぎないことを示している。こ
の計算は血漿のｍｌ当り１単位の・国際基準を基にした
。フイプロネクチン及びフィブリノーゲンの冷一沈澱は
１９η年の原フエケツト特許の出願日の数年前から確立
されていた方法であることは前記検討から明らかであろ
う。
冷却中でフイプロネクチンンを効果的に沈澱させるため
に、へバリン又は或種の他のポリサッカライド化合物を
加えることが必要なことは一般的に知られていた。しか
しながら、第■因子の製造のために冷一不溶性グロブリ
ン又はフイプロネクチンの処理の応用に関しては！この
文献に示唆又は直接触れられていない。事実、１９７５
年モウシヤー（ＭＯｓｈｅｒ）による論文０ヒプリンー
安定化因子による冷一不溶性グロブリンの交互結合．Ｊ
（ＣｒＯｓｓＬｉｎｋｉｎｇＯｆＣＯＩｄ一ＩｎｓＯｌ
ｕｂｌｅＧｌＯｂｕｌｌｎｂｙＦｉｂｒｉｎ−Ｓｔａｂ
ｉｌｉｚｉｎｇ．−ＦａｃｔＯｒ）（Ｊ．Ｂ．Ｃ．２５
Ｏ：６６１４，１９７５）によれば、冷一不溶性グロブ
リンは抗血友病因子（第■因子）から、アミノ酸分析、
４％寒天状ゲルからの溶離位置及びポリアクリルアミド
ゲル中の電気泳動により区別されたことが示されている
。本発明はフイプロネクチンあるいは冷一不溶性グロブ
リン（ＣＩｇ）の製造の手順を第■因子の製造に応用す
る処理方法である。
に、へバリン又は或種の他のポリサッカライド化合物を
加えることが必要なことは一般的に知られていた。しか
しながら、第■因子の製造のために冷一不溶性グロブリ
ン又はフイプロネクチンの処理の応用に関しては！この
文献に示唆又は直接触れられていない。事実、１９７５
年モウシヤー（ＭＯｓｈｅｒ）による論文０ヒプリンー
安定化因子による冷一不溶性グロブリンの交互結合．Ｊ
（ＣｒＯｓｓＬｉｎｋｉｎｇＯｆＣＯＩｄ一ＩｎｓＯｌ
ｕｂｌｅＧｌＯｂｕｌｌｎｂｙＦｉｂｒｉｎ−Ｓｔａｂ
ｉｌｉｚｉｎｇ．−ＦａｃｔＯｒ）（Ｊ．Ｂ．Ｃ．２５
Ｏ：６６１４，１９７５）によれば、冷一不溶性グロブ
リンは抗血友病因子（第■因子）から、アミノ酸分析、
４％寒天状ゲルからの溶離位置及びポリアクリルアミド
ゲル中の電気泳動により区別されたことが示されている
。本発明はフイプロネクチンあるいは冷一不溶性グロブ
リン（ＣＩｇ）の製造の手順を第■因子の製造に応用す
る処理方法である。
冷一不溶性グロブリン低温沈澱の処理を第■因子製造に
利用したことにより、低温沈澱中及び低温沈澱から得ら
れた冷一沈澱グロブリン中の第■因子の収率が極めて顕
著に増大した。この方法を行うことにより、第■因子の
８１％は低温沈澱から回収される。冷一不溶性グロブリ
ンは始めの第■因子活性の６２％を含んでいる。それゆ
え、始めの血漿のリットル当り６６弾位の最終回収が得
られ、そしてプロテインの量は１％より少なくなる。更
に、この方法は血液提供センターで行うことができ、ま
た、大規模の第■因子取得方法にも使用することもでき
る。このように、本発明は次の工程から成る第■因子を
得る方法を提供する。ａ カルシウムキレート抗凝血剤
で集められ新鮮に得られた血漿にへバリンを加えるか、
またはへバリン及びカルシウムキレート抗凝血剤を用い
てプラズマフエレーゼにより集められた血漿を用いる；
塩緩衝剤を加える； ｇ１１時間以上０′Ｃ〜１０℃の温度でこの緩衝化され
溶解された低温沈澱を培養する、これにより低温沈澱中
に存在する第■因子はへバリン沈澱性冷一不溶グロブリ
ンを用いて不溶化され、第■因子に富んだまた冷不溶グ
ロブリンを含む沈澱が得られる；ｈ第■因子の富んだ沈
澱を単離する； ｉ これから第■因子を単離する。
利用したことにより、低温沈澱中及び低温沈澱から得ら
れた冷一沈澱グロブリン中の第■因子の収率が極めて顕
著に増大した。この方法を行うことにより、第■因子の
８１％は低温沈澱から回収される。冷一不溶性グロブリ
ンは始めの第■因子活性の６２％を含んでいる。それゆ
え、始めの血漿のリットル当り６６弾位の最終回収が得
られ、そしてプロテインの量は１％より少なくなる。更
に、この方法は血液提供センターで行うことができ、ま
た、大規模の第■因子取得方法にも使用することもでき
る。このように、本発明は次の工程から成る第■因子を
得る方法を提供する。ａ カルシウムキレート抗凝血剤
で集められ新鮮に得られた血漿にへバリンを加えるか、
またはへバリン及びカルシウムキレート抗凝血剤を用い
てプラズマフエレーゼにより集められた血漿を用いる；
塩緩衝剤を加える； ｇ１１時間以上０′Ｃ〜１０℃の温度でこの緩衝化され
溶解された低温沈澱を培養する、これにより低温沈澱中
に存在する第■因子はへバリン沈澱性冷一不溶グロブリ
ンを用いて不溶化され、第■因子に富んだまた冷不溶グ
ロブリンを含む沈澱が得られる；ｈ第■因子の富んだ沈
澱を単離する； ｉ これから第■因子を単離する。
カルシウムキレート抗凝血剤は血液または血漿中のカル
シウムの生理学的レベルを低下に作用するよく知られた
抗凝血剤の何れからも選択することができる。
シウムの生理学的レベルを低下に作用するよく知られた
抗凝血剤の何れからも選択することができる。
この様な抗凝血剤の好適なタイプはクエン酸塩抗凝血剤
、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）及びシユウ
酸塩である。これらのうち、クエン酸塩抗凝血剤が好適
である。好適なりエン酸塩抗凝血剤は酸−クエン酸塩−
デキストロース（ＡＣＤ）およびクエン酸塩一リン酸塩
−デキストロース（ＣＰＤ）が含まれる。本発明の重要
な工程はクエン酸塩食塩へバリン（ＣＳＨ）緩衝剤を再
溶解低温沈澱に加えることそして低温沈澱を培養するこ
とである。
、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）及びシユウ
酸塩である。これらのうち、クエン酸塩抗凝血剤が好適
である。好適なりエン酸塩抗凝血剤は酸−クエン酸塩−
デキストロース（ＡＣＤ）およびクエン酸塩一リン酸塩
−デキストロース（ＣＰＤ）が含まれる。本発明の重要
な工程はクエン酸塩食塩へバリン（ＣＳＨ）緩衝剤を再
溶解低温沈澱に加えることそして低温沈澱を培養するこ
とである。
この緩衝剤は低温沈澱バッグ当り２〜１０ｍｔの範囲の
量加えるのが好ましく、好適には、低温沈澱バッグ当り
２〜４ｍ１の量加えそして最適には低温沈澱バッグ当り
２．５ｍ１加える。
量加えるのが好ましく、好適には、低温沈澱バッグ当り
２〜４ｍ１の量加えそして最適には低温沈澱バッグ当り
２．５ｍ１加える。
緩衝剤は好適には０．２Ｍクエン酸ナトリウム、食塩の
０．９％重量およびへバリンナトリウムの緩衝剤ｍｌ当
り１単位の組成物である。前述の培養は１時間以上０衝
〜１０℃で行う。
０．９％重量およびへバリンナトリウムの緩衝剤ｍｌ当
り１単位の組成物である。前述の培養は１時間以上０衝
〜１０℃で行う。
好適には２時間で０℃で行なわれる。冷一不溶グロブリ
ン（ＣＩｇ）はへバリンでＣＰＤ血漿を処理する前は不
溶性でない。
ン（ＣＩｇ）はへバリンでＣＰＤ血漿を処理する前は不
溶性でない。
ＣＩｇの沈澱は特定の条件になるまで生成しない。この
ように、上記条件には新鮮ＣＰＤ血漿にへバリンの導入
が含まれるが、この条件だけではＣＩｇの生成には十分
ではない。実際、視的観察はこの工程ではＣＩｇが生成
しないことを示す、何故なら、この物質は血液バッグの
底に白色析出物として見られるからである。これらの工
程は低温沈澱へのＣＳＨ緩衝剤の添加及び沈澱グロブリ
ンを生成する冷培養である。この併合工程を用いなかつ
たら、冷不溶グロブリンはへバリンの存在中でも生成し
ない。より具体的には、本発明の第■因子を得る方法は
以下の工程を含むことを特徴とする。ａ クエン酸塩一
リン酸塩−デキストロース抗凝血剤で集められ新鮮に得
られた血漿にへバリン，を加えるか、または、へバリン
およびクエン酸ナトリウム抗凝血剤を用いてプラズマフ
エレーゼによる血漿を集める；ｂ この血漿を−８０℃
に冷凍する； ｃ この血漿を００〜１０′Ｃの温度で３０〜１２紛、
，好適には４℃で７紛再溶解する；ｄ再溶解血漿を遠心
分離し低温沈澱を単離する；ｅ この低温沈澱を３７℃
の温度で２〜５分で再溶解する：
Ｃｆクエン酸塩食塩へバリン緩衝剤２〜
１０ｍ１を各再溶解低温沈澱バッグに加える：ｇ緩衝化
再溶解低温沈澱をＯ℃で２時間培養する。
ように、上記条件には新鮮ＣＰＤ血漿にへバリンの導入
が含まれるが、この条件だけではＣＩｇの生成には十分
ではない。実際、視的観察はこの工程ではＣＩｇが生成
しないことを示す、何故なら、この物質は血液バッグの
底に白色析出物として見られるからである。これらの工
程は低温沈澱へのＣＳＨ緩衝剤の添加及び沈澱グロブリ
ンを生成する冷培養である。この併合工程を用いなかつ
たら、冷不溶グロブリンはへバリンの存在中でも生成し
ない。より具体的には、本発明の第■因子を得る方法は
以下の工程を含むことを特徴とする。ａ クエン酸塩一
リン酸塩−デキストロース抗凝血剤で集められ新鮮に得
られた血漿にへバリン，を加えるか、または、へバリン
およびクエン酸ナトリウム抗凝血剤を用いてプラズマフ
エレーゼによる血漿を集める；ｂ この血漿を−８０℃
に冷凍する； ｃ この血漿を００〜１０′Ｃの温度で３０〜１２紛、
，好適には４℃で７紛再溶解する；ｄ再溶解血漿を遠心
分離し低温沈澱を単離する；ｅ この低温沈澱を３７℃
の温度で２〜５分で再溶解する：
Ｃｆクエン酸塩食塩へバリン緩衝剤２〜
１０ｍ１を各再溶解低温沈澱バッグに加える：ｇ緩衝化
再溶解低温沈澱をＯ℃で２時間培養する。
これにより、低温沈澱中に存在する第■因子はへバリン
沈澱性冷不溶性グロブリンを用い３て不溶化され、得ら
れた第■因子に富んだ沈澱は、また、冷不溶性グロブリ
ンを含んでいる；ｈ第■因子の富んだ沈澱を分離する；
そしてｉ これから第■因子を単離する。第■因子は、
０℃〜１０℃の低温度、好適には０４℃でクエン酸塩食
塩へバリン緩衝剤で不溶性沈澱を洗うことにより第■因
子に富んだ沈澱から単離できる。
沈澱性冷不溶性グロブリンを用い３て不溶化され、得ら
れた第■因子に富んだ沈澱は、また、冷不溶性グロブリ
ンを含んでいる；ｈ第■因子の富んだ沈澱を分離する；
そしてｉ これから第■因子を単離する。第■因子は、
０℃〜１０℃の低温度、好適には０４℃でクエン酸塩食
塩へバリン緩衝剤で不溶性沈澱を洗うことにより第■因
子に富んだ沈澱から単離できる。
ついで、沈澱を排出し、更にクエン酸塩食塩へバリン緩
衝剤で好適には３７℃で２〜５分で再溶解する。この第
■因子に富んだ溶液は後に残留物から最も簡易には遠心
分離で分離される。第■因子に富んだ溶液は出発血漿が
赤血球を分離した全血から得られた場合は中程度の純度
で得られるであろう。出発血漿がフエレーゼ（Ｐｈｅｒ
ｅｓｉｓ）血漿である場合は第■因子は高純度の品質の
活性をもつ。必要とあらば、第■因子の富んだ沈澱は高
純度第■因子が得られる適宜の従来方法、例えばグリシ
ン、エタノール、エタノ−ルーグリシン、プロピレング
リコールまたはグリシン−ポリエチレングリコール沈澱
及び／又は他の公知の精製剤による分画法を適用できる
。
衝剤で好適には３７℃で２〜５分で再溶解する。この第
■因子に富んだ溶液は後に残留物から最も簡易には遠心
分離で分離される。第■因子に富んだ溶液は出発血漿が
赤血球を分離した全血から得られた場合は中程度の純度
で得られるであろう。出発血漿がフエレーゼ（Ｐｈｅｒ
ｅｓｉｓ）血漿である場合は第■因子は高純度の品質の
活性をもつ。必要とあらば、第■因子の富んだ沈澱は高
純度第■因子が得られる適宜の従来方法、例えばグリシ
ン、エタノール、エタノ−ルーグリシン、プロピレング
リコールまたはグリシン−ポリエチレングリコール沈澱
及び／又は他の公知の精製剤による分画法を適用できる
。
これら、グリシンなどの公知の沈澱剤を用いて選択的に
第■因子を沈澱させる方法は本技術分野についてすでに
確立された方法であり、たとえば、以下の文献に記載さ
れている。グリシン沈澱法１Ｇ１ｙｃｉｎｅ−Ｐｒｅｃ
ｉｐｉｔａｔｅｄａｎｔｉｈｅｍＯｐｈｉＩｉｃｆａｃ
ｔＯｒｃＯｎｃｅｎｔｒａｔｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｃｌ
ｉｎｉｃａ１ｕｓｅ．Ｒ．Ｈ．Ｗａｇｒ１ｅｒ，Ｈ．Ｒ
．Ｒ０ｂｅｒｔｓ，Ｗ．Ｐ．Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｅ．Ｓｈ
ａｎｂｒ０ｍａｎｄＫ．Ｍ．ＢｒＩｌｋｈＯＬ！Ｓ．Ｔ
ｈｒＯｍｂＯｓｉｓＤｉａｔｈｅｓｉｓＨａｅｍＯｒｒ
′Ｈａｇｉｃａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３５：４１−４
８（１９６９）．２Ｐｒｅｐａｒａｔｉ０ｎ０ｆａｎｄ
ｃ１１ｎｉｃａ１ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｗｉｔｈａｎｔ
ｉｈｅｍ０ｐｈｉ１１ｃｆａｃｔ０ｒＣＯｎｃｅｎｔｒ
ａｔｅｓ．Ａ．Ｊ．ＪＯｈｎｓＯｎ，Ｍ．Ｈ．Ｋａｒｐ
ａｔｋｉｎ，ａｎｄＪ．Ｎｅｗｒｒ］Ａｎ．ＴｈｒＯｍ
ｂＯｓｉｓＤｉａｔｈｅｓｉｓＨａｅｍＯｒｒｈａｇｉ
ｃａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３５：４９−５９（１９６
８）．３Ａｎｅｗｈｉｇｔ１−ＰＯｔｅｎｃｙｇｌｙｃ
ｉｎｅ−ＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄａｎｔｉｈｅｍＯｐ
ｈｉＩｉｃｆａｃｔＯｒ（ＡＩ＋′）ＣＯｎｃｅｎｔｒ
ａｔｅ．Ｋ．■４．Ｂｒｉｎｋｈ０ｕｓ，Ｅ．ＳｈａＩ
１ｂｒ０ｍ，Ｈ．Ｒ．Ｒ０ｂｅｒｔｓ，Ｗ．Ｐ．Ｗｅ比
Ｔｅｒ，Ｌ．Ｆｅｋｅｔｅ，ａｎｄＲ．Ｈ．Ｗａｇｎｅ
ｒ．ＪＯｕｒｎａｌＯｆｔｈｅＡｒＴｌｅｒｉＣａｎＭ
ｅｄｉｃａｌＡｓｓ０ｃｉａｔ１０ｎ，２０５：６７−
７１（１９６８）．４Ｃ１１ｎｉｃａ１ｕｓｅ０ｆａｒ
１ｅｗｇ１ｙＣｉＩ１ｅ−Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄａ
ｎｔｉｈｅｍＯｐｈｉＩｉｃｆａｃｔＯｒｆｒａｃｔｉ
Ｏｎ．Ｗ．Ｐ．Ｗｅｂｓｔｅｒ畦畦．，Ａｍｅｒｉｃａ
ｎＪＯｕｍａＩＯｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２
５Ｏ：６４３−６５１（１９６５）．５Ｔｒｅａｔｎ１
ｅｎｔ０ｆｈｅｍ０ｐｈｊ１ｉａｗｉｔｈｇ１ｙｃｉｎ
ｅ−ＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄｆａｃｔＯｒＶＩＩＩ．
Ｃ．Ｆ．，ＡｂｉＩｄ？Ａｒｄ虹畦．，ＮｅｗＥｎｇｌ
ａｎｄＪＯｕｒ′ＮａｌＯｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，２７５
：４７１−４７５（１９６６）．エタノール沈澱法 １Ｍｅｔｈ０ｄｓｆ０ｒｔｈｅｐｒ０ｄｕｃｔｉ０ｎ０
ｆｃ１ｉｎｉｃａＩ１ｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅｉｎｔｅｒ
ｍｅｄｉａｔｅＡｎｄｈｉｇｈｐｕｒｉｔｙＦａｃｔＯ
ｒＶＩＩＩｃＯｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ．Ｊ．Ｎｅｗｍａ
ｎ，Ａ．Ｊ．ＪＯｈｎｓＯｎ，Ｍ．Ｈ．Ｋａｒｐａｔｋ
ｉｎ，ａｎｄＳ．Ｐｕｓｚｋｉｎ．ｊＢｒｉｔｉｓｈＪ
ＯｕｍａｌＯｆＨａｅｍａｔＯｌＯｇｙ，２ｌ：１−２
０（１９７１）．２ＰＬ１ｒ′ＩｆｉｃａｔｉＯｎＯｆ
ａｎｔｉｈｅｍＯｐｈｉｌｉｃｆａｃｔＯｒ（ＡＨＦ）
ＦＯｒｃｌｌｎｉｃａｌａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌｕｓｅ．Ａ．Ｊ．ＪＯｈｎｓＯｎ，Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ
，Ｍ．Ｂ．ＨＯｗｅＩ１，ａｎｄＳ．１ＰＬ］ＳＺｋｉ
ｎ．ＴＦｌｒＯｍｂＯｓｉｓｅｔＤｉａｔｈｅｓｉｓＨ
ａｅｍＯｒｒｈａｇｉｃａ（Ｓｔｕｔｔｇ．）Ｓｕｐｐ
Ｉｅｍｅｎｔ２６：３７７−３８１（１９６７）．３Ｌ
１１ｒ？−ＳｃａｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉＯｎＯｆＦａ
ｃｔＯｒＶＩＩＩ−ＣＯｎｃｅｎｔｒａｔｅｆｒＯｍｆ
ｒＯｚｅｎｃｒｙＯｅｔｈａｎＯｌ−Ｐｒｅｃｉｐｉｔ
ａｔｅ．Ｍ．Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒ．′ＮｌｒＯｍ
ｂＯｓｉｓｅｔＤｉａｔｈｅｓｉｓＨａｅｍＯｒｒｈａ
ｇｉｃａ，４３：１６５−１７３（１９７１）．エタノ
−ルーグリシン沈澱法 １Ｃ１ｉｎｉｃａＩｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉ０ｎ０ｆｉ
ｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅａｎｄ：Ｈｉｇｈｐｕｒｉｔｙ
ａｎｔｉｈａｅｍＯｐｈｉｌｌｃｆａｃｔＯｒ（Ｆａｃ
ｔＯｒＶＩＩＩ）ＣＯｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ．Ａ．Ｊ．
ＪＯｈｎｓＯｎ，Ｍ．Ｈ．Ｋａｒｐａｔｋｉｎ，ａｎｄ
Ｊ．Ｎｅｘｖｒｎａｎ．ＢｒｉｔｉｓＨＪＯｕｍａｌＯ
ｆＨａｅｍａｔＯｌＯｇｙ，２ｌ：２１−４１（１９７
１）．２Ｐｕｒｊｆｊｃａｔｉ０ｎ０ｆａｎｔｊｈｅｍ
０ｐｈｉ１１ｃｇ１０ｂＬ１１１ｎ．ＬＳ０ｍｅｓｔｕ
ｄｉｅｓ０ｎｔｈＥｓｔａｂｉｌｉｔｙＯｆｔｈｅａｎ
ｔｉｈｅｍＯｐｈｉｌｉｃｇｌＯｂｕｌｌｎａｃｔｉｖ
ｉｔｙｉｎｆｒａｃｔｉＯｎｌ−０ａｎｄａｍｅｔｈ０
ｄｆ０ｒｉｔｓｐａｒｔｉａ１ｓｅｐａｒａｔ１０ｎｆ
ｒ０ｍｆｉｂｒｉｎ０？Ｎ．Ｍ．ＢｌＯｍｂａｃｋ，Ａ
ｒｋｌｖｆＯｒＫｅｍｉ，ｌ２：３８７−３９６（１９
５８）．プロピレングリコール沈澱法１Ｐｒｅｐａｒａ
ｔｊ０ｎ０ｆａｎｔｉｈｅｍ０ｐｈｉ１ｉｃｆａｃｔ０
ｒｆｒ０ｍｉｎｄａｔｅｄｐ１ａｓｍａ．Ｍ．Ｗｉｃｋ
ｅＲｈａｕｓｅｒ．ＴｒａｎｓｆＬｌｓｉＯｎｌ６：３
４５−３５０（１９７６）．２Ｐｒｅｐａｒａｔｉ０ｎ
０ｆａｎｄｃＩｉｎｉｃａ１ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｗｉ
ｔｈａｎｔｉｈｅｍ０ｐｈｉ１１ｃｆａｃｔ０ｒＣＯｎ
ｃｅｎｔｒａｔｅｓ．Ａ．Ｊ．ＪＯｈｎｓＯｎ，Ｍ．Ｈ
．Ｋａｒｐａｔｋｉｎ，ａｎｄＪ．Ｎｅｗｎｌａｎ．Ｔ
ｌｌｒＯｍＢＯｓｉｓｅｔＤｊａｔｈｅｓｉｓＨａｅｍ
Ｏｒｒｈａｇｊｃａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３５：４９
−５９（１９６９）．３Ｌ１１ｒ？−Ｓｃａｌｅｐｒｅ
ｐａｒａｔｉＯｎＯｆＦａｃｔＯｒＶＩＩＩ一ＣＯｎｃ
ｅｎｔｒａｔｅｆｒＯｍｆｒＯｚｅｎｃｒｙＯｅｔｈａ
ｎＯｌｄｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ．Ｍ．Ｗｉｃｋｅｒｈａ
ｕｓｅＲ，′１１１ｒ０ｍｂ０ｓｉｓｅｔＤｉａｔｈｅ
ｓｉｓＨａｅｍ０ｒｒｈａｇｉｃａ，４３：１６５−１
７３（１９７１）．４Ｕｓｅ０ｆｆｒ０ｚｅｎｃｒｙ０
ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｆ０ｒｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔ
ｉ０ｎ０ｆｃＩｉｎｉｃａＩｆａＣｔＯｒＶＩＩＩＣＯ
Ｔｌｃｅｎｔｒａｔｅ．Ｊ．Ｔ．ＳｇＯｕＩ″Ｉｓａｎ
ｄＭ．Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｌ
Ｏｎ，ｌ３：３９９−４０４（１９７３）．グリシン−
ポリエチレングリコール沈澱法１ＡｎｅｗｈｉｇＦ１ｐ
０ｔｅｒ）Ｃｙｍｌｙｃｉｎｅ−Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔ
ｅｄａｎｔｉｈｅｍＯｐｈｉｌｌｃｆａｃｔＯｒ（ＡＨ
Ｆ）ＣＯｎｃｅｎｔ［′Ａｔｅ．Ｋ．Ｍ，Ｂｒｉｎｋｈ
Ｏｕｓ，Ｅ．ＳｈａｒｌｂｒＯｍ，Ｈ．Ｒ．ＲＯＹ：Ｅ
ｒ色，Ｗ．Ｐ．Ｗｅ比Ｔｅｒ，Ｌ．Ｆｅｋｅ拍，Ａｎｄ
Ｒ．Ｈ．Ｗａｎｇｎｅｒ．ＪＯｕｍａｌＯｆｔｈｅＡｍ
ｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓＯｃｉａｔｌＯｎ，
２Ｏ５：６７−７１（１９６８）．２Ｇ１ｙｃｉｎｅ−
ＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄａｎｔｉｈｅｍＯｐｈｉｌｌ
ｃｆａｃｔＯｒｃＯｎｃｅｎｔｒ′Ａｔｅｓａｎｄｔｈ
ｅｉｒｃｌｌｎｉｃａｌｕｓｅ．Ｒ．Ｈ．Ｗａｇｒｌｅ
ｒ，Ｈ．Ｒ．ＲＯｂｅｒｔｓ，Ｗ．Ｐ．Ｗｅｂｓｔｅｒ
，Ｅ．ＳｈａｎｂｒＯｍ，ａｎｄＫ．Ｍ．Ｂｒｉｎｋｈ
Ｏｕｓ．ＴｈｒＯｍｂＯｓｉｓｅｔＤｉａｔｈｅｓｉｓ
ＨａｅｍＯｒｒｈａｇｉＣａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３
５：４１−４８（１９６９）．へバリンは好適に血漿の
Ｔｎｌ当り１単位へバリンの濃度で加える。
第■因子を沈澱させる方法は本技術分野についてすでに
確立された方法であり、たとえば、以下の文献に記載さ
れている。グリシン沈澱法１Ｇ１ｙｃｉｎｅ−Ｐｒｅｃ
ｉｐｉｔａｔｅｄａｎｔｉｈｅｍＯｐｈｉＩｉｃｆａｃ
ｔＯｒｃＯｎｃｅｎｔｒａｔｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｃｌ
ｉｎｉｃａ１ｕｓｅ．Ｒ．Ｈ．Ｗａｇｒ１ｅｒ，Ｈ．Ｒ
．Ｒ０ｂｅｒｔｓ，Ｗ．Ｐ．Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｅ．Ｓｈ
ａｎｂｒ０ｍａｎｄＫ．Ｍ．ＢｒＩｌｋｈＯＬ！Ｓ．Ｔ
ｈｒＯｍｂＯｓｉｓＤｉａｔｈｅｓｉｓＨａｅｍＯｒｒ
′Ｈａｇｉｃａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３５：４１−４
８（１９６９）．２Ｐｒｅｐａｒａｔｉ０ｎ０ｆａｎｄ
ｃ１１ｎｉｃａ１ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｗｉｔｈａｎｔ
ｉｈｅｍ０ｐｈｉ１１ｃｆａｃｔ０ｒＣＯｎｃｅｎｔｒ
ａｔｅｓ．Ａ．Ｊ．ＪＯｈｎｓＯｎ，Ｍ．Ｈ．Ｋａｒｐ
ａｔｋｉｎ，ａｎｄＪ．Ｎｅｗｒｒ］Ａｎ．ＴｈｒＯｍ
ｂＯｓｉｓＤｉａｔｈｅｓｉｓＨａｅｍＯｒｒｈａｇｉ
ｃａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３５：４９−５９（１９６
８）．３Ａｎｅｗｈｉｇｔ１−ＰＯｔｅｎｃｙｇｌｙｃ
ｉｎｅ−ＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄａｎｔｉｈｅｍＯｐ
ｈｉＩｉｃｆａｃｔＯｒ（ＡＩ＋′）ＣＯｎｃｅｎｔｒ
ａｔｅ．Ｋ．■４．Ｂｒｉｎｋｈ０ｕｓ，Ｅ．ＳｈａＩ
１ｂｒ０ｍ，Ｈ．Ｒ．Ｒ０ｂｅｒｔｓ，Ｗ．Ｐ．Ｗｅ比
Ｔｅｒ，Ｌ．Ｆｅｋｅｔｅ，ａｎｄＲ．Ｈ．Ｗａｇｎｅ
ｒ．ＪＯｕｒｎａｌＯｆｔｈｅＡｒＴｌｅｒｉＣａｎＭ
ｅｄｉｃａｌＡｓｓ０ｃｉａｔ１０ｎ，２０５：６７−
７１（１９６８）．４Ｃ１１ｎｉｃａ１ｕｓｅ０ｆａｒ
１ｅｗｇ１ｙＣｉＩ１ｅ−Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄａ
ｎｔｉｈｅｍＯｐｈｉＩｉｃｆａｃｔＯｒｆｒａｃｔｉ
Ｏｎ．Ｗ．Ｐ．Ｗｅｂｓｔｅｒ畦畦．，Ａｍｅｒｉｃａ
ｎＪＯｕｍａＩＯｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２
５Ｏ：６４３−６５１（１９６５）．５Ｔｒｅａｔｎ１
ｅｎｔ０ｆｈｅｍ０ｐｈｊ１ｉａｗｉｔｈｇ１ｙｃｉｎ
ｅ−ＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄｆａｃｔＯｒＶＩＩＩ．
Ｃ．Ｆ．，ＡｂｉＩｄ？Ａｒｄ虹畦．，ＮｅｗＥｎｇｌ
ａｎｄＪＯｕｒ′ＮａｌＯｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，２７５
：４７１−４７５（１９６６）．エタノール沈澱法 １Ｍｅｔｈ０ｄｓｆ０ｒｔｈｅｐｒ０ｄｕｃｔｉ０ｎ０
ｆｃ１ｉｎｉｃａＩ１ｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅｉｎｔｅｒ
ｍｅｄｉａｔｅＡｎｄｈｉｇｈｐｕｒｉｔｙＦａｃｔＯ
ｒＶＩＩＩｃＯｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ．Ｊ．Ｎｅｗｍａ
ｎ，Ａ．Ｊ．ＪＯｈｎｓＯｎ，Ｍ．Ｈ．Ｋａｒｐａｔｋ
ｉｎ，ａｎｄＳ．Ｐｕｓｚｋｉｎ．ｊＢｒｉｔｉｓｈＪ
ＯｕｍａｌＯｆＨａｅｍａｔＯｌＯｇｙ，２ｌ：１−２
０（１９７１）．２ＰＬ１ｒ′ＩｆｉｃａｔｉＯｎＯｆ
ａｎｔｉｈｅｍＯｐｈｉｌｉｃｆａｃｔＯｒ（ＡＨＦ）
ＦＯｒｃｌｌｎｉｃａｌａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌｕｓｅ．Ａ．Ｊ．ＪＯｈｎｓＯｎ，Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ
，Ｍ．Ｂ．ＨＯｗｅＩ１，ａｎｄＳ．１ＰＬ］ＳＺｋｉ
ｎ．ＴＦｌｒＯｍｂＯｓｉｓｅｔＤｉａｔｈｅｓｉｓＨ
ａｅｍＯｒｒｈａｇｉｃａ（Ｓｔｕｔｔｇ．）Ｓｕｐｐ
Ｉｅｍｅｎｔ２６：３７７−３８１（１９６７）．３Ｌ
１１ｒ？−ＳｃａｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉＯｎＯｆＦａ
ｃｔＯｒＶＩＩＩ−ＣＯｎｃｅｎｔｒａｔｅｆｒＯｍｆ
ｒＯｚｅｎｃｒｙＯｅｔｈａｎＯｌ−Ｐｒｅｃｉｐｉｔ
ａｔｅ．Ｍ．Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒ．′ＮｌｒＯｍ
ｂＯｓｉｓｅｔＤｉａｔｈｅｓｉｓＨａｅｍＯｒｒｈａ
ｇｉｃａ，４３：１６５−１７３（１９７１）．エタノ
−ルーグリシン沈澱法 １Ｃ１ｉｎｉｃａＩｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉ０ｎ０ｆｉ
ｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅａｎｄ：Ｈｉｇｈｐｕｒｉｔｙ
ａｎｔｉｈａｅｍＯｐｈｉｌｌｃｆａｃｔＯｒ（Ｆａｃ
ｔＯｒＶＩＩＩ）ＣＯｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ．Ａ．Ｊ．
ＪＯｈｎｓＯｎ，Ｍ．Ｈ．Ｋａｒｐａｔｋｉｎ，ａｎｄ
Ｊ．Ｎｅｘｖｒｎａｎ．ＢｒｉｔｉｓＨＪＯｕｍａｌＯ
ｆＨａｅｍａｔＯｌＯｇｙ，２ｌ：２１−４１（１９７
１）．２Ｐｕｒｊｆｊｃａｔｉ０ｎ０ｆａｎｔｊｈｅｍ
０ｐｈｉ１１ｃｇ１０ｂＬ１１１ｎ．ＬＳ０ｍｅｓｔｕ
ｄｉｅｓ０ｎｔｈＥｓｔａｂｉｌｉｔｙＯｆｔｈｅａｎ
ｔｉｈｅｍＯｐｈｉｌｉｃｇｌＯｂｕｌｌｎａｃｔｉｖ
ｉｔｙｉｎｆｒａｃｔｉＯｎｌ−０ａｎｄａｍｅｔｈ０
ｄｆ０ｒｉｔｓｐａｒｔｉａ１ｓｅｐａｒａｔ１０ｎｆ
ｒ０ｍｆｉｂｒｉｎ０？Ｎ．Ｍ．ＢｌＯｍｂａｃｋ，Ａ
ｒｋｌｖｆＯｒＫｅｍｉ，ｌ２：３８７−３９６（１９
５８）．プロピレングリコール沈澱法１Ｐｒｅｐａｒａ
ｔｊ０ｎ０ｆａｎｔｉｈｅｍ０ｐｈｉ１ｉｃｆａｃｔ０
ｒｆｒ０ｍｉｎｄａｔｅｄｐ１ａｓｍａ．Ｍ．Ｗｉｃｋ
ｅＲｈａｕｓｅｒ．ＴｒａｎｓｆＬｌｓｉＯｎｌ６：３
４５−３５０（１９７６）．２Ｐｒｅｐａｒａｔｉ０ｎ
０ｆａｎｄｃＩｉｎｉｃａ１ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｗｉ
ｔｈａｎｔｉｈｅｍ０ｐｈｉ１１ｃｆａｃｔ０ｒＣＯｎ
ｃｅｎｔｒａｔｅｓ．Ａ．Ｊ．ＪＯｈｎｓＯｎ，Ｍ．Ｈ
．Ｋａｒｐａｔｋｉｎ，ａｎｄＪ．Ｎｅｗｎｌａｎ．Ｔ
ｌｌｒＯｍＢＯｓｉｓｅｔＤｊａｔｈｅｓｉｓＨａｅｍ
Ｏｒｒｈａｇｊｃａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３５：４９
−５９（１９６９）．３Ｌ１１ｒ？−Ｓｃａｌｅｐｒｅ
ｐａｒａｔｉＯｎＯｆＦａｃｔＯｒＶＩＩＩ一ＣＯｎｃ
ｅｎｔｒａｔｅｆｒＯｍｆｒＯｚｅｎｃｒｙＯｅｔｈａ
ｎＯｌｄｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ．Ｍ．Ｗｉｃｋｅｒｈａ
ｕｓｅＲ，′１１１ｒ０ｍｂ０ｓｉｓｅｔＤｉａｔｈｅ
ｓｉｓＨａｅｍ０ｒｒｈａｇｉｃａ，４３：１６５−１
７３（１９７１）．４Ｕｓｅ０ｆｆｒ０ｚｅｎｃｒｙ０
ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｆ０ｒｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔ
ｉ０ｎ０ｆｃＩｉｎｉｃａＩｆａＣｔＯｒＶＩＩＩＣＯ
Ｔｌｃｅｎｔｒａｔｅ．Ｊ．Ｔ．ＳｇＯｕＩ″Ｉｓａｎ
ｄＭ．Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｌ
Ｏｎ，ｌ３：３９９−４０４（１９７３）．グリシン−
ポリエチレングリコール沈澱法１ＡｎｅｗｈｉｇＦ１ｐ
０ｔｅｒ）Ｃｙｍｌｙｃｉｎｅ−Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔ
ｅｄａｎｔｉｈｅｍＯｐｈｉｌｌｃｆａｃｔＯｒ（ＡＨ
Ｆ）ＣＯｎｃｅｎｔ［′Ａｔｅ．Ｋ．Ｍ，Ｂｒｉｎｋｈ
Ｏｕｓ，Ｅ．ＳｈａｒｌｂｒＯｍ，Ｈ．Ｒ．ＲＯＹ：Ｅ
ｒ色，Ｗ．Ｐ．Ｗｅ比Ｔｅｒ，Ｌ．Ｆｅｋｅ拍，Ａｎｄ
Ｒ．Ｈ．Ｗａｎｇｎｅｒ．ＪＯｕｍａｌＯｆｔｈｅＡｍ
ｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓＯｃｉａｔｌＯｎ，
２Ｏ５：６７−７１（１９６８）．２Ｇ１ｙｃｉｎｅ−
ＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄａｎｔｉｈｅｍＯｐｈｉｌｌ
ｃｆａｃｔＯｒｃＯｎｃｅｎｔｒ′Ａｔｅｓａｎｄｔｈ
ｅｉｒｃｌｌｎｉｃａｌｕｓｅ．Ｒ．Ｈ．Ｗａｇｒｌｅ
ｒ，Ｈ．Ｒ．ＲＯｂｅｒｔｓ，Ｗ．Ｐ．Ｗｅｂｓｔｅｒ
，Ｅ．ＳｈａｎｂｒＯｍ，ａｎｄＫ．Ｍ．Ｂｒｉｎｋｈ
Ｏｕｓ．ＴｈｒＯｍｂＯｓｉｓｅｔＤｉａｔｈｅｓｉｓ
ＨａｅｍＯｒｒｈａｇｉＣａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３
５：４１−４８（１９６９）．へバリンは好適に血漿の
Ｔｎｌ当り１単位へバリンの濃度で加える。
しかしながら、血漿のｍｌ当り１〜１弾位の範囲でも効
果がある。ナトリウムヘパリンはこの方法に有効である
。この方法は、詳細には、新鮮なＣＰＤ血漿にへバリン
を加え−８０℃に凍結し、そして７紛間４℃で再溶解し
、ついで、遠心分離機にかける（スピン７０００Ｘｇ１
７分、０℃）。
果がある。ナトリウムヘパリンはこの方法に有効である
。この方法は、詳細には、新鮮なＣＰＤ血漿にへバリン
を加え−８０℃に凍結し、そして７紛間４℃で再溶解し
、ついで、遠心分離機にかける（スピン７０００Ｘｇ１
７分、０℃）。
得られた低温沈澱を３７℃で２〜５分間溶解放置し、つ
いで、ＣＳＨ（クエン酸塩食塩へバリン）緩衝剤２．５
ｍ１を各低温沈澱バックに加える。ついで、再溶解され
又はためられた低温沈澱を０℃で２時間冷却水浴中で培
養する。プールされた低温沈澱中に存在する第■因子は
冷不溶グロブリンとともに不溶化され、ついで、全不溶
性沈澱は遠心分離（スピン７０００Ｘｇ１７分、０℃）
により第■因子の少ない上澄みから分離される。上澄み
を除去後冷不溶沈澱は最初の低温バッグ当たり冷ＣＳＨ
緩衝剤２ｍ１でＯ℃で洗い、水切りし、そして最初の低
温沈澱バッグ当りＣＳＨ緩衝剤２〜１０ｍ１好適には２
ｍ１で５分間３７℃で再溶解する。更に遠心分離（スピ
ン３７００Ｘｇ１６分）を行い、第■因子の冨んだ溶液
を残渣から分離する。表Ａは本発明の方法で必要とする
工程を示すフローシートである。
いで、ＣＳＨ（クエン酸塩食塩へバリン）緩衝剤２．５
ｍ１を各低温沈澱バックに加える。ついで、再溶解され
又はためられた低温沈澱を０℃で２時間冷却水浴中で培
養する。プールされた低温沈澱中に存在する第■因子は
冷不溶グロブリンとともに不溶化され、ついで、全不溶
性沈澱は遠心分離（スピン７０００Ｘｇ１７分、０℃）
により第■因子の少ない上澄みから分離される。上澄み
を除去後冷不溶沈澱は最初の低温バッグ当たり冷ＣＳＨ
緩衝剤２ｍ１でＯ℃で洗い、水切りし、そして最初の低
温沈澱バッグ当りＣＳＨ緩衝剤２〜１０ｍ１好適には２
ｍ１で５分間３７℃で再溶解する。更に遠心分離（スピ
ン３７００Ｘｇ１６分）を行い、第■因子の冨んだ溶液
を残渣から分離する。表Ａは本発明の方法で必要とする
工程を示すフローシートである。
この詳細な工程は血漿の６単位のプールについて説明す
るものであり、前記の具体的方法はこの表により説明さ
れる。次の表１において、本発明の方法の評価を示す。
るものであり、前記の具体的方法はこの表により説明さ
れる。次の表１において、本発明の方法の評価を示す。
ヒトの新鮮に得られた血漿のｍｌ当りヘパリンナトリウ
ムの１単位を加えたものを示す。血漿の６バッグすなわ
ち６単位を本方法の説明に用いた。この表は各フラクシ
ヨン、出発血漿、低温沈澱プール及び冷一不溶性沈澱に
存在する第■因子の全単位、ならびに、プロテインの全
重量、プロテインのミリグラム当りの第■因子単位の比
活性、第■因子の純度および各フラクシヨンの容量を示
す。次の表２において、第■因子の回収は出発血漿のリ
ットル当りで表わされる。
ムの１単位を加えたものを示す。血漿の６バッグすなわ
ち６単位を本方法の説明に用いた。この表は各フラクシ
ヨン、出発血漿、低温沈澱プール及び冷一不溶性沈澱に
存在する第■因子の全単位、ならびに、プロテインの全
重量、プロテインのミリグラム当りの第■因子単位の比
活性、第■因子の純度および各フラクシヨンの容量を示
す。次の表２において、第■因子の回収は出発血漿のリ
ットル当りで表わされる。
冷一不溶性グ七プリン沈澱はリットル当り６６弾位の第
■因子、すなわち６５％の回収率を可能にすることが判
る。これはフエケツトらの先に示した再発行特許の５欄
の実施例に報告されている回収率と比較することができ
る。フエケツトにより得られた最終生成物の回収率は１
７％であり、出発血漿のリットル当りわずか１７師位で
ある。次の表３は、出発血漿フラクシヨン、低温沈澱プ
ールフラクシヨン及び冷一不溶性沈澱フラクシヨンの全
含有物の評価を示す。
■因子、すなわち６５％の回収率を可能にすることが判
る。これはフエケツトらの先に示した再発行特許の５欄
の実施例に報告されている回収率と比較することができ
る。フエケツトにより得られた最終生成物の回収率は１
７％であり、出発血漿のリットル当りわずか１７師位で
ある。次の表３は、出発血漿フラクシヨン、低温沈澱プ
ールフラクシヨン及び冷一不溶性沈澱フラクシヨンの全
含有物の評価を示す。
また、低温沈澱一冷不溶性グロブリン法を、血漿のｍｌ
当り１単位のナトリウムヘパリンとなるようにして、ハ
エモネテイツクモデル（ＨａｅｍＯｎｅｔｉｃｓＭＯｄ
ｅｌ）５０機を用いてプラズマフエレーゼにより得られ
たクエン酸塩血漿に適用すると、かなりの濃度をもつ第
■因子濃縮物が得られる。
当り１単位のナトリウムヘパリンとなるようにして、ハ
エモネテイツクモデル（ＨａｅｍＯｎｅｔｉｃｓＭＯｄ
ｅｌ）５０機を用いてプラズマフエレーゼにより得られ
たクエン酸塩血漿に適用すると、かなりの濃度をもつ第
■因子濃縮物が得られる。
この技術によれば、出発血漿の第■因子プロコアギユラ
ント活性（ファクター■：Ｃ）の８１〜８３％が低温沈
澱中に回収され、、また、出発血漿の第■活性汚性の５
６〜６２％が最終冷不溶性グロブリン沈澱中に全体を通
じて回収される。最終生成物の特異活性は０．９６〜０
．９弾位／Ｍｇのプロテインであり、血漿に比し純度に
おいて９９〜１６０倍増加している。表４及び５に示さ
れる如く、プラズマフエレーゼ血漿を用いた場合は、回
収率が増加し、高純度（１単位／Ｍ９より以上）の比活
性をもつた濃縮物が得られる。プラズマフエレーゼは自
動制御された方法であり、赤血球は元のドナーに戻され
、集められたクエン酸塩血液から血漿が回収される。
ント活性（ファクター■：Ｃ）の８１〜８３％が低温沈
澱中に回収され、、また、出発血漿の第■活性汚性の５
６〜６２％が最終冷不溶性グロブリン沈澱中に全体を通
じて回収される。最終生成物の特異活性は０．９６〜０
．９弾位／Ｍｇのプロテインであり、血漿に比し純度に
おいて９９〜１６０倍増加している。表４及び５に示さ
れる如く、プラズマフエレーゼ血漿を用いた場合は、回
収率が増加し、高純度（１単位／Ｍ９より以上）の比活
性をもつた濃縮物が得られる。プラズマフエレーゼは自
動制御された方法であり、赤血球は元のドナーに戻され
、集められたクエン酸塩血液から血漿が回収される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ａ カルシウムキレート抗凝血剤中で集められ新鮮
に得られた血漿にヘパリンを加えるか、または、ヘパリ
ン及びカルシウムキレート抗凝血剤を用いてプラズマフ
エレーゼにより集められた血漿を用いる；ｂ この血漿
を冷凍する： ｃ この血漿を再溶解する； ｄ この血漿から低温沈澱を単離する； ｅ この低温沈澱を再溶解する； ｆ この再溶解低温沈澱にクエン酸塩食塩ヘパリン緩衝
剤を加える；ｇ １時間以上０゜〜１０℃の温度でこの
緩衝化され再溶解された低温沈澱を培養し、これにより
低温沈澱中に存在する第VIII因子に富んだ、また冷不溶
グロブリンを含む沈澱が得られる；ｈ この第VIII因子
の富んだ沈澱を単離する；ｉ これから第VIII因子を単
離する 工程を含むことを特徴とする第VIII因子の取得法。 ２ カルシウムキレート抗凝血剤がクエン酸塩抗凝血剤
、エチレンジアミンテトラ酢酸およびシユウ酸塩から選
ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ カルシウムキレート抗血液凝固剤がクエン酸塩抗凝
血剤である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 抗凝血剤が酸−クエン酸塩−デキストロースである
特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 抗凝血剤がクエン酸塩−リン酸塩−デキストロース
である特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６ ヘパリン及びクエン酸ナトリウムを用いてプラズマ
フエレーゼにより集められた血漿が使用される特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ７ ０゜〜１０℃の低温クエン酸塩食塩ヘパリン緩衝剤
で不溶性沈澱から第VIII因子を単離する特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ８ ０℃の低温でクエン酸塩食塩ヘパリン緩衝剤で不溶
性沈澱を洗い、この沈澱ご排出し、更にクエン酸塩食塩
ヘパリン緩衝剤の存在下３７℃でこの沈澱を再溶解する
ことにより、第VIII因子に富んだ沈澱から第VIII因子を
単離する特許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA344,000A CA1115637A (en) | 1980-11-26 | 1980-01-18 | Method of obtaining intermediate purity factor viii |
| CA344000 | 1980-01-18 | ||
| US210385 | 1980-11-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56150019A JPS56150019A (en) | 1981-11-20 |
| JPS6059212B2 true JPS6059212B2 (ja) | 1985-12-24 |
Family
ID=4116072
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56006248A Expired JPS6059212B2 (ja) | 1980-01-18 | 1981-01-19 | 第８因子の取得法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4289691A (ja) |
| JP (1) | JPS6059212B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020231140A1 (ko) * | 2019-05-14 | 2020-11-19 | 엘지전자 주식회사 | 적응적 루프 필터 기반 비디오 또는 영상 코딩 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4386068A (en) * | 1980-02-26 | 1983-05-31 | Cutter Laboratories, Inc. | Antihemophilic factor concentrate and method for preparation |
| CA1178887A (en) * | 1981-10-01 | 1984-12-04 | Gail A. Rock | Factor viii concentrates prepared from heparinized plasma by the application of a cold precipitation technique |
| US4397841A (en) * | 1982-06-28 | 1983-08-09 | Monsanto Company | Production of blood coagulation factor VIII:C |
| DE3481109D1 (de) * | 1983-05-09 | 1990-03-01 | Novo Nordisk As | Antihaemophilie-faktor-viii-konzentrat und dessen herstellungsverfahren. |
| AT379510B (de) * | 1983-05-20 | 1986-01-27 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf) -haeltigen praeparation |
| US4965199A (en) * | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| US4543210A (en) * | 1984-10-04 | 1985-09-24 | Miles Laboratories, Inc. | Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate |
| CA1293941C (en) * | 1985-11-08 | 1992-01-07 | Maria Erlinda Co-Sarno | Method for preparing antihemophilic factor (ahf) by cold precipitation and for improving solubility of recovered ahf product |
| USH1509H (en) * | 1989-06-09 | 1995-12-05 | Eran; Harutyun | Heparin enhanced process for separating antihemophilic factor (Factor VIII) and fibronectin from cryoprecipitate |
| US5420250A (en) * | 1990-08-06 | 1995-05-30 | Fibrin Corporation | Phase transfer process for producing native plasma protein concentrates |
| US5644032A (en) * | 1990-08-06 | 1997-07-01 | Fibrin Corporation | Process for producing fibrinogen concentrates |
| SE9403915D0 (sv) * | 1994-11-14 | 1994-11-14 | Annelie Almstedt | Process A |
| US5845424A (en) * | 1997-11-13 | 1998-12-08 | Mitchell; Randy Dwayne | Protective tag receptacle |
| EP1950225A1 (de) * | 2007-01-25 | 2008-07-30 | Octapharma AG | Verfahren zur Steigerung von Proteinausbeuten |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3803115A (en) * | 1972-05-17 | 1974-04-09 | Baxter Laboratories Inc | Stabilization of ahf using heparin |
| US4022758A (en) * | 1973-06-19 | 1977-05-10 | Ab Kabi | Isolation of coagulation factors I and VIII from biological material |
| US4104266A (en) * | 1977-04-14 | 1978-08-01 | American National Red Cross | Method for preparation of antihemophilic factor |
| CA1074698A (en) * | 1977-12-19 | 1980-04-01 | Gail A. Rock | Method of collecting anti-hemophilic factor viii from blood and blood plasma |
-
1980
- 1980-11-26 US US06/210,385 patent/US4289691A/en not_active Expired - Lifetime
-
1981
- 1981-01-19 JP JP56006248A patent/JPS6059212B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020231140A1 (ko) * | 2019-05-14 | 2020-11-19 | 엘지전자 주식회사 | 적응적 루프 필터 기반 비디오 또는 영상 코딩 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS56150019A (en) | 1981-11-20 |
| US4289691A (en) | 1981-09-15 |
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