JPS60501240A - 微生物の検出方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物の検出方法および装置 技術分野 本発明は、たとえば人間または動物の液体検体または該検体から取出した試料若 しくは汚染された水または食物から取出した試料における微生物の存在を測定す るための方法および装置に関するものである。

背景技術 人体または動物の感染を診断するために、または水、食物等に微生物汚染がある か否かを測定するために、検体を得、次いで検査に付されることは知られている 。かかる検査を行うための従来技術は後述する麻米の髄液（Ｃ３Ｆ）試料検査に 関する簡単な説明により分る如く複雑且つ時間のかかるものである。

先ず、試料を採取した患者の感染有無の間接証明を付与し得る種々の調査か、Ｃ ５Ｆに施される。かかる調査は細胞カウント、特に白血球および赤血球のカウン ト（顕微鏡により実施）並びに蛋白質評価および部分る。しかし、これら調査に おける負の結果は感染無しを煮味するものでなく１次の如き更なる検査が必要で ある。

Ｃ５Ｆを遠心分離し、生成した堆積物を幾つかの部分に分割する。第１の部分を 顕微鏡用スライド板上に置き、乾燥し、クラム染色試験し、これがら循細胞およ び／または感染微生物（特に細菌）の証拠を見ることができる。遠心分離堆積物 の他の部分に抗酸性微生物の存在を示すシイ−ルーニールセン染色試験を施すこ とかできる。

しかし、上述した染色試験における陰性結果は感染無しの決定的証拠と見做すこ とができないので、遠心分離堆積物を種々の条件（たとえば、好気性、二酸化炭 素または嫌気性条件）下で種々の異った培地並ひにミコバクテリウム用培地上で 培養することが必要である。その理由は、任意所定の培地および任意−組の条件 か全ての種類の微生物の成長を支持するものでないからである。培養期間中に形 成される細菌コロニーを染色試験、種々の生化学的技術および抗生作用敏感度の 測定により同足し、かがる同定は通常２４時間またはそれ以上を要する。

４　従来法と同し信頼性で且つ一層速かに実施し得る試料中の微生物の存在を測 定するための方法か明らかに要望されている。

が検体中に存在するか否かを決めることがしばしば必要である。臨床化学におけ る多くの試験は試薬ストリップまたはティップスティック、すなわち１種以上の 活性成分を含浸させたバッドを付着した通常プラスチック材料よりなるスティッ クまたはストリップの使用までに限定されている。たとえは、尿試料中の糖分存 在に関する試験は、適当なディツプスティックのパッドを試料中に数秒間浸漬す ることにより行うことかできる。このディツプスティックを試料から取出した後 、活性成分または活性成分の混合物が試料中の糖分と反応するとパッドが変色す る。試料中の糖分量は糖分値または各色に対する糖分値の範囲を特足するチャー ト上の色とバッドの色とを比較することにより評価することかできる。この色チ ャートは普通ティップスティックを販売する際のパッケージに含まれている。

ディツプスティック系は広範囲の化合物、たとえば蛋白質類、ケトン類、ビリル ピンおよびヘモグロビンの試験用に入手することかでき、各県は特足の活性成分 または活性成分組合せと、その色変化チャートとを有している。一連のバットを 単一スティック上に配列して数種の物質に対する試験を同時に実施し得る多目的 ディツプスティックを得ることも当然可能である。

発明の開示 本発明は、放射剤を試料の少なくとも一部と接触させ、任意過剰の放射剤を分離 除去し、放射レベルを残留放射剤の少なくとも一部から検出することからなる試 料中の微生物の存在を測定する方法を提供する。

検出された放射レベルは微生物のイラ無の指標として役立９・多くの場合・粗＜ 足性的″ｉ’ｌｌ定のみ７）必要とされる。換言すれば、微生物が元の試料中に 存在するかまたはほとんど存在しないかを知ることだけが必要である。他の場合 には、本発明の方法を用いて試料中の微生物のレヘルまたは濃度を定量的にめる ことかできる。さらに他の場合には、本発明の方法を用いて微生物の存在とその 抗生作用敏感度をめることができる。

本発明の方法はティップステインクフォーマットに容易に適用することができる 。すなわち、活性成分（類）をディツプスティック（ここでは試薬ヌトリンブを 包含する）上に担持させ、反応を該ティップスティックに制限させることかでき る。従って、本発明は放射剤と該放射剤用固体担体とからなることを特徴とする 試料中の微生物の存在を測定するための装置も提供する。液体試料中での微生物 の存在は、本発明に係る装置の固体担体を試料の少なくとも一部で湿らせ、過剰 の放射剤をたとえば固体担体の洗浄により除去し、然る少数桁レベルを該固体担 体から検出することにより検出することができる。

図面の簡単な説明 第１図、第２１．．６および第３図はそれぞれ８’に述する実施例に記載した実 験により得た結果を示すクラ７である。

発明を実施するための形態 液状でない供試物質を通常溶液（好ましくは水溶吻）または分散液にして試ネ４ を得る。

試料を人体または動物の液体検体、たとえは尿、髄！１φ、ＴＩ７ノ金、全血、 リンパ靜または他の１少引液から面接採バｙすることかできるか、好ましくはま す静体を遠心分離し、生成した十澄み液を除去し、残留物から試料を得る。当然 、！佼体は適切なる予備処理を施すことかできる。たとえば、全蒲の場合、細胞 をあらゆる存在し得る微生物から示差還心分陛または示差ろ過により分別するの が普通望ましい。

放射能、蛍光等の如き放射の使用は、ピコグラムまたはフェムトグラム程度の微 小量で存在する蛋白質類の如き物質を検出し得るために木発明では必須である。

放射剤は３５Ｓ、３２Ｐ、１ｌｌＣ１３Ｈまたは　■の如き放射性元素を含有す るのか好ましい。原則として、放射剤は微生物の代謝処理に利用し得る任意の化 合物、たとえば糖（たとえばグルコース、フラクトース、マルトースまたはラク トース）、有機酸（たとえば酢酸またはコハク酸）、炭化水素、アミノ酸、蛋白 質に混入し得る他の化合物、代謝によりアミノ酸に転化し得る化合物または無機 塩（たとえば燐酸塩または硫酸塩）とすることができる。放射剤として放射性ア ミノ酸の使用か特に好適で、−例としてｊＨロイシン、１４Ｃリシン、１４Ｃロ イシンおよび、１５　Ｓメチオニンかある。

ます、ティップステインクの使用を伴なわず、試料と放射剤とをその４昆合物の 形成により接触させる例につき木発明を説明する。放射剤は好ましくは水性媒質 中での溶液または分散液の如き液体状態にするのが便利である。

所要に応して、栄養媒質を試料と放射剤との混合物中に混入することができる。

栄養媒質はあらゆる慣例の媒質から逆折することができ、たとえば養分肉汁、脳 −心臓注入物すなわちイーグル媒質がある。栄養媒質の正確な選択は普通存在し 得る微生物の形の仮定により影響を受ける。もし栄養媒質を用いる場合、試料と 栄養媒質と放射剤とを一緒に混合する順序は臨界がないものと思われる。しかし 、多くの場合、栄養媒質の使用を省くのが時間および材料の両経済性の観点から 明らかに望ましいことを確かめた。たとえば、任意の栄養媒質の添加なしに尿試 料を用いて行った方法を示した。

次に、試料と放射剤との４昆合物を培養することができる。培養を常温（＋５° Ｃ〜２０°Ｃ）で行うのが便利であるが、たとえば３７℃まで僅かに一層けた温 度で行うことも可能である。培養期間は比較的短くすることかでき、良好な結果 が１時間または２時間からたとえは３０分、１５分またはほぼ５分またはそれ以 下の培養期間で得られた。実際、多くの場合試料と放射剤との混合物を形成した 直後に過剰の放射剤を除去することにより満足な結果が得られ、この場合の培養 期間は舌視し得るものであった。

微ノ１物か本発明に従って処理する試料中に存在する場合、少なくとも放射剤の 若干９か微生物によってともかく゛固定″されることか分る。この正確な機構は 分らないか、゛°固定″が広義には微生物および／ま、たはそのノ［−成物、特 に蛋白物！ケへの４昆人（たとえは転移または他の代謝処理による）または付着 による標識付けを包含するものと解釈すべきである。測定を行う前に、過剰（す なわち゛未固足′°）の放射剤を放射性に標識イ・ｊけされた物質から除去する 。放射性に標識付けされた物質が固体で、過剰の放射剤か溶液中に残留する場合 、たとえは上澄み液の除去（たとえはテカンテーションまたはピペット処理によ る）に続く遠心分離またはろ過により過剰放射剤の分離を容易に実施することが できる。

しかし、多くの場合放射性に標識付けされた物質を沈殿させることが必要になる 。たとえば、程合物中の蛋白質をトリクロル酢酸（ＴＣＡ）　、アルコール（た とえばメタノールまたはエタノール）またはＭｅアンモニウムの如き適当な沈殿 剤の添加により沈殿させるのが適している。

固定された放射剤から過剰の放射剤を分離すれはするほど、測定が一層正確にな ることは明白である。しかし、実際問題として且つ特に足性測足のみか要求され る場合、過剰の放射剤の最後の痕跡の除去を確実にするだめの特別の工程を取る ことは普通必要でない。

同様に、分離段階での放射性に標識付けされた物質の最小損失は通常ｂ１１定を 損なわず、従って訊しく正確な定性側Ｗか要求されない限り許容することができ る。

栄養媒質を用いる場合、これを使用する放射剤の非放射性類似体と無関係なもの とするのが望ましい。たとえば、放射剤か４５３−メチオニンの場合、栄養媒質 はメチオニンと無関係なものとすることができる。すなわち、放射剤は未標識性 は類似体と競合すべきものではなく、これにより放射剤の適当割合を固定するこ とか確実になる。

過剰の放射剤を除去した後、残留物を適当な装置内に入れ、その放射を放射レベ ルの読取りを得るに適した手段により感知する。すなわち、たとえば放射剤が放 射性の場合、放射を適当な放射線計歇器により検出することができる。

放射剤がβ−放射線を生ずる場合、シンチラントを添加し、シンチレーション計 数器を用いて放射を計数することが望ましい。適当なシンチラントは周知で、市 場で入手し得るものであり、２．５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）　、　 １．４−ビス−２−（５−フェニルオキサソイル）−ベンゼン（ｐｏｐｏｐ）、 １．４−ビス−２−（４−メチル−５−フェニルオキサソイル）−ベンゼン（ジ メチル−ｐｏｐｏｐ）　、および２−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）　−５ −（４−ビフェニルイル）−１，３，４−オキサシアソール（ブチル−ＰＢＤ） がある。これらシンチラントはトルエン溶液として使用することができ、特にシ ンチラントを水系で使用すべき場合にはたとえばトリトン（商品名）の如き表面 活性剤を含有する場合がある。しかし、シンチラントの使用を省略することが可 能で、実際にはシンチラントの使用なしに放射線をたとえばガイガー計数器等で 直接測定するのが好適である。

他の好ましい技術は、ろ過残留物からの放射性放射レベルをビイ−・アール・ブ ーラン発明のＥＰＣ特許願第８３３０７１０４．８に記載された如き検出装置を 用いて測定することにあり、その記述を参考のためここに開示する。該ブーラン 装置の１つの利点は検出すべき多数の試料からの放射を同時にシンチラントの添 加の必要なしに行い得ることである。

一般に、放射強さの高い読取りが試料を採取した患者における感染（または水道 水、食物等からの試料の微生物汚染）を指示するもので、一方低い読取りは感染 （または微生物汚染）無しを指示する。

上述した処理の興味ある変形は、試料中の微生物の抗生作用敏感度をめることに ある。すなわち、同一患者からの多数の試料、たとえば尿を用意しく簡便には単 一検体を多数の部分に分割することにより）、各試料を一連の異った抗生物質の 各対応するーっの存在下で、所要に応じて適当な栄養媒質の存在下で培養する。

次いで、放射剤を各試料混合物に添加し、次いで抗生物質により抑制された微生 物の活性程度を、過剰の放射剤を分離除去し、残留物からの放射を前述した方法 で検出することにより測定する。かくして、感染が患者に存在する場合には、こ の処理が該感染に応答し得る生物の薬敏感度の指標を付与する。この処理は複数 の試料の放射レベルの検出を包含するので、前述したブーラン装置の如き多重走 査または検出装置が特に有用である。

上述した方法の更なる変形を用いて患者の受ける処理で達成される抗生物質のレ ベルを評価−し、漿液中で達成されるレベルが感染生物の生長を抑制するに適し ているか否かをたとえば心内膜炎の場合逆滴定で測定することができる。漿液、 ＣＳＦまたは尿素の如き液体検体を患者から採取する。この検体の複数希釈を行 い、感染生物の標準接種源を各希釈物に添加する０次いで、各生成した混合物試 料を放射剤および栄養分（必要に応じて）と混合し、培養（必要に応じて）し、 分離工程に施し、然る後残留物からの放射レベルを検出する０次に、この結果を 対照標準生物および体液を省いた対照物を用いる対照実験で得たものと比較する ことができる。微生物生長に対する抑制は感染生物が抑制される希釈度およびモ ニター治療を決定する６次に、これは患者から採取した元の検体中の抗生物質レ ベルの指標を付与する。

また、本発明の方法は最小抑制濃度（ＭＩＧ釣の生体外測定に用いることができ る。抗生物質の異った希釈液を試験すべき微生物の標準接種源、放射剤および所 要に応じて栄養媒質を含有する一連の試料に添加する。

次に、試料中の微生物活性の抑制を上述した如く培養（所要に応じて）、分離お よび放射レベルの測定の工程により確かめる。

所定容積の検体、所定量の３５５メチオニン（または他の放射剤）および所定の 培養時間に対しては、残留物の放射性放射レベルが検体を感染する微生物の種類 の指標を付与することができる。たとえば、大腸菌は多くの実験で連鎖球菌より 一層高いカウントを与える。換言すれば、混入割合は感染程度に関する限り感染 の種類に関連するものと思われる。

上述した本発明方法の例は固体担体上または該担体内での放射剤の使用、特に担 体が吸収部材で放射剤を含浸したところの本発明に係る装置に容易に適用するこ とができる。

吸収部材は不織繊維材料、好ましくは紙が便利である。好適な繊維はマイクロフ ァイバーの如きカラス繊維であるが、天然または再生セルロースの繊維の如き他 の繊維類を用いることも可能である。特に好適な吸収部材はミリポアろ過材料で ある。

含浸吸収部材を単独で使用することができる。たとえば、本発明に係る装置を放 射剤か含浸された紙の如き吸収材料のストリップとして簡単に形成することが可 能である。しかし、これは放射剤の浪費になるので、支持体に同伴された吸収部 材を用いるのが好ましい。これは、たとえば吸収部材を木材またはプラスチック 材料の如き適当な不活性材料のストリップまたはスティックに付着した小さなパ ッドとして形成することにより放射剤の経済的使用を可能にする。すなわち、パ ッドを支持体に任意適当な方法、たとえば接着剤および／または支持体に対しパ ッドを保持する重ね合せ透過性材料により固定することができる。

装置の寸法には臨界がない。代表的には、支持体が約５〜１ＯＩＩＩ１１の幅、 ０，２〜１ＩＩｌｆｆｌの厚さ、７〜１２ｃ１１の長さで、またパッドは支持体 の幅と等しい幅および該幅の１〜３倍の長さを有するものとすることができる。

或はまた、吸収部材をガラスまたはパースペックス（商標名）のような４ｈ澄透 明な材料の小さい管の穴内に保持された小詰め物として形成することができ、こ の場合吸収部材と管状支持体の内壁との摩擦係合が吸収部材を所定位置に保持す るに充分なものとする。

本発明に係る装置を製造する際、吸収部材に放射剤の為釈溶靜を含浸させ、次い で乾燥することが好ましい。しかし、３５　Ｓメチオニンを放射剤として用いる 場合には、乾燥処理が装置の効率を減する場合があることを確かめた。この効率 減少自体は、感染試料の場合予期されたものより低いカウントになり、未疑染試 料の場合予期されたものより高いカウントになる。これは乾燥時の硫黄の酸化に よるものと思われる。従って、３５３メチオニン含有部材を還元剤で湿らせて保 持するか、または３５　Ｓメチオニン含有部材を非酸化性条件下、たとえは真空 中または窒素の如き不活性カス中で乾燥するのが有利であることを確かめた。或 いは、１４Ｃまたは３Ｈの如き他の放射性元素で標識付けした硫黄のない放射剤 を用いることが可能である。１４Ｃ−ロイシンが好適な放射剤である。時に１４ 　（−ロイシンをたとえば５重量％の分量で用いるグリセロールノ存在下で使用 するのが好ましい。

本発明の装置は、放射剤と試料とを接触させるために特に前述した広範囲の試料 の任意のものと共に容易に使用することかできる。たと元ば、吸収部材を尿試料 中に数分間浸漬し、取出し、たとえば蒸留水で洗浄することができる。未反応放 射剤を洗浄除去した後、吸収部材を乾燥後適当な装置内に入れ、その放射を放射 レヘルの読取りを行うに適した手段により感知する。放射剤が放射性の場合、放 射を前述した如きカイカ−計数器、シンチレーション計数器またはブーラン計数 器の如き適当な放射線計数器により検出することができる。

１種以上の吸収部材を１つの試料に対して用いる場合には、微生物の抗生作用敏 感度をめるだめの技術を使用することができる。１つの吸収部材に抗生物質なし に放射剤を含浸させ、一方他のもの（または複数の他のもの）に放射剤と抗生物 質とを含浸させる。各試料に対して実施する同一試験の数は検討すべき抗生物質 の種類およびその濃度範囲によって決まる。実際上は、微生物の抗生作用敏感度 が放射剤を抗生物質なしに用いた場合と放射剤を抗生物質と共に用いた場合との 比較に従った差の関数である。数種の吸収部材をかかる試験に用いることができ るか、これらを単一スティック（または他の支持材料）上に担持させることがで きる。

吸収部材に抗生物質並びに放射剤を含浸させることが可能であるが、これは本発 明によって存在が検出された任意の微生物の抗生作用敏感度をめる唯一の方法で ないことが分る。一般に、生存する微生物は抗生物質の殺菌効果により完全に影 響を受ける前に放射剤と反応する。従って、本発明に係る装置上の放射剤との反 応前に微生物含有試料を抗生物質て予備培養することが一層有益である。

本発明の重要な点は試料を採取した後でさるたけ早く吸収部材を該試料に添那す ることである。実際、試料を捕集すべｔ＝ｉ菌容温容器内収部材を収納すること か可能である。試験の即時性は、生存能力か困難である感染微生物の機会を減し てその感染付層以外で乾燥を保ち、また他のノリ染源からの汚染により試料に４ 人された外部微生物の保持の機会を減する。換言すれは、偽りの陰性または陽性 結果の機会を試験の即時性によって減することかでき、これは患者から採取した 細菌学的試料か実験室内分析用に現われるものと同しでない臨床実験分析の他の 多くの形と違っている。ここに記載した技術により試験を試料に対し、また試料 を試験に対して取ることができる６原則として、試験が完全（すなわち洗浄後放 射剤を含浸させた吸収部材を有する試料の想期間培養）な場合、吸収部材に付着 した放射性蛋白質を他の位鎖でまたは他の時間に計数するのを阻止するものがな い。

本発明は試料中の細菌の存在を測定するのに特に有用である。しかし、本発明は 他の種類の微生物、たとえば真菌（ここでは酵母を包含する）に対しても適用す ることができる。

本発明を体液の試料または体液から取出した試料における微生物の存在を測定す ることについて主として述べたけれども、本発明方法は診断医薬の分野に限定さ れるものでない。すなわち、試料中の微生物レベルの測定は多くの工業的分野、 たとえば携帯用水の処理、下水および他の廃水の処理並びに食品および飲料の調 製において必要な処理である。微生物の存在を本発明により確認した後、該微生 物を従来の微生物学的方法により、または本明細書に参考のため記述するアール ・イーやシルマン発明のＥＰＣ特許第０．０７７．１４９Ａ号記載の技術を用い ることにより同定することができる。たとえば、シルマン法で処理し得る移染微 生物用識別物を発生させるために、放射性蛋白質を本発明装置中の吸収部材から 溶出させることができる。

次に本発明を実施例につき説明する。

これら実施例に用いた３５　Ｓメチオニンは０．１％の２−メルカプトエタノー ルを含有する２０ｍＭの酢酸カリウム水溶液としてアマージャムインターナショ ナル社（英国）から入手したもので、特異活性は１０ｍｃｉ／ｍｕ以上の濃度で ６００〜１４５０　ミリモルの範囲内にあった。

実」１例」２ 尿検体を人間の患者から採取し、遠心分離し、生成した上澄み液を除去した。次 いで、２５ａｌの試料を遠心分離後に残存するスラリーから採取し、２５μ文の イーグル媒質と一緒にマイクロガラスＭｌに入れた。１ｐ−Ｑの３Ｓ　３メチオ ニン（約１０　ｐ、Ｃｉ）を混合物に添加し、生成した試料を常温で３０分間培 養した。培養後、ｌル文の試料を５０ｗ文のＢＳＡ　（牛血清アルブミン）（ｌ 　ｍｇ／ｍＪ１　）中に取出し、１ｍ文の１０％ＴＣＡを添加して蛋白質類を沈 殿させた。次いで、試料をろ過し、沈殿した蛋白質類をカラスミｍ紙上に捕集し た。

カラス繊維紙をその上に捕集した蛋白質類と共にシンチレーション瓶内に入れ、 １０ｍ　ｌのシンチラント（ＰＰＯ）溶液を添加した。次いで、シンチレーショ ン瓶をバラカード（商標名）シンチレーション計数器内に置き、読取りを行った 。この読取りにより放射に対する高いカウントを得、これにより患者に感染があ ることが分った。

夾」Ｕ汁ヱ 下記の処理を用いて一連の実験を行った。

尿検体をよ〈混合し、これから５０μ文の試料を取出し、これに１組文の３５３ メチオニン（約１０μＣｉ）　Ｌ含有する５０μ文のイーグル媒質を添加した。

緊、密捉合物を渦巻混合により形成した。所定時間経過後、２５経文のアリコー トを混合物から取出し、１ｏ分間者沸［、て殺菌した。１ルリの竺沸浬合物をガ ラス繊維ろ紙上に滴下し、２０ｍ文の食塩溶液でＳ−浄した。残留食塩溶液をメ タノールで除去し、ろ紙を５６℃で１ｏ分間乾帰した。

この乾燥ろ紙を計欲肋に入れ、１０ｍＪ−のシンチラント（ＰＰＯ／ＰＯＰＯＰ ／　）ルエン）を添加した。この肋に蓋をし、バラカードシンチレーション計数 器にガさ、放射を１分間計数し、カウントを記載した。

この方法により調査した各尿検体を従来技術による測定および同定に関する実験 熟練者にも供給した。本発明方法に従って得た結果を従来技術による結果ど共に グループ分けした。すなわち、微生物の顕著なレベルがなかったアリコートのグ ループ（°°非非成長ツクループ、ａ菌、すなわち大腸菌群およびプロテウス属 菌の顕著なレベル（尿１ｍ文当り１０５以上のｍ＋物）が見出されたグループ、 および細菌の混合物が見出されたグループ（゛°況合生長°′グループ）に分け た。

混合生長グループにおける結果を再分した。幾つかの結果を外米物として分類し た。その理由はこれらが患者の感染部位以外の感染源からの細菌による尿検体の 汚染であったからである。他のものを慢性生長として分類した。その理由は、こ れらか原因となる生物、すなわち感染を生じたものと見做されＩ−からであこれ らの結果を第１図に示す、これは所定期間後に取出した試料によるシンチレーシ ョン計数器の平均刺激を示すもので、該刺激を渦巻混３合と２５ａｌ）、の試験 用アリコート採取間の経過時間（分）に対しプロヤトする。アリコートを渦＠混 合直後に採取した実験においては、経過時間を零（０）とする。点に隣接する括 弧内の蚊は平均値をめた実験回数を示す。

刺激は対照物（尿検体の添加なしてのイーグル媒質と３ＳＳメチオニンとの混合 物）で得た刺激の関数として対数目盛で表示する。

本発明方法により得た結果が従来技術により得た結果と極めてよく相関すること が第１図から分る。すなわち、゛°非成長°゛試料は対照物カウントの０，８〜 Ｌ、８倍の平均カウントを付与するが、プロテウス属細菌に関して得た最低平均 カウントはたとえば対照物カウントの約８５倍である。従って、本発明は極めて ＆を感で且つなお簡単、迅速および確実に実施し得る微生物の有無を測定する方 法を提供する。

支亙亘」 本発明方法を抗生作用敏感度を測定するための手段として評価するために、下記 の処理を用いて一連の実験を行った。

ｍ菌感染した患者から採取した５０μ文の尿を５０μ文のイーグル媒質および所 定量の抗生物賀（特にアンピシリン）と混合した。生成した混合物を常温で１時 間培養し、次いでｌｈｌの３５Ｓメチオニン（約１０　ｐ、　Ｃｉ）を添加した 。全体を渦巻混合により緊雀に混合し、所定時間経過後、アリコート試料を採取 し、実施例２に記載したと同じ方法で試験した。

結果を第２図に示す。この場合、シンチレーション計数器の刺激を渦巻混合から 試験用アリコートの採取まで経過する時間に対しプロットする。第１図に示す如 く、刺激のカウントを対照物で得たカウントの関数として示す。

第２図は試料中にそれぞれ５００ｇｇ　、　２５０　ＡＬｇおよび　１００μｇ のアンピシリンを用いた３組の実験で得た結果を、アンピシリンの＃添加（０μ ｇ）における実験結果と共に示す。アンピシリンの存在は尿検体中の微生物の活 性を抑制することが分り、かがる微生物はアンピシリンに対し穏和な敏感度を有 することが従来技術により確かめられた。

支庭璽」 本発明に係る多数の試薬装置を下記の方法で作った。１島文の３５３メチオニン （約１０ｇＣ１）　’Ｆｔ　１００ｍ１　（７）水に溶解することにより試薬溶 液を調製した。次いで、紙ディスク（２，５ｃｍ直径）を生成した溶液に浸漬し 、取出し、その中に溶液を吸い取らせた。８枚の一′５Ｓメナオニン含授紙ティ スクを６種類の紙、すなゎちホワットマンＮ００１ろ紙、ホワットで７３ＩＩＩ ｍクロマトグラフ紙、ミリポア０．２２ｇ紙並ひにＧＦ／Ｃ，ＣＦ／ＤおよびＧ Ｆ／Ｆとして表示したカラス繊維の各々から製造した。

これら種々の紙は厚さおよび吸収性か異っているか、１００〜２００ｇ！：Ｌの 溶液か各ディスクにより吸収されることを確かめた。すなわち、各紙ディスクに は約０．００１〜０．００２　ｋ文の３５３メチオニンが含浸された。

感染されたものを含めて一連の尿検体を採取し、各種類の紙の一枚のディスク（ 吸い取っているか湿潤したままの）を各尿試料５００ル文と常温で３０分間接触 させた。

次いで、これらディスクを取出し、水洗いし１．突いで真柴塔でメタノール洗ン 争した。乾燥後、各ディヌクを対応するシンチレーション瓶に込れ、専有のシン チラントを添加し、放射線をシンチレーション計数器で計数した。

これら実験の結果（１分当りのカウント）を次の第１表に示す。培養物生長の同 定を従来技術により行った。

感染された尿検体中の感染程度は従来技術によってめられなかった。その理由は 、央験の目的が単に種々の紙で入手し得る放射レベルを比較することにあるから である。試験したすべての紙を成る程度まで加工したが、得られた結果はカラス 繊維紙が他の供試紙より一層はるかに効率的であることを示した。

Ｌ庭土」 カラス繊維紙（ＣＦ／Ｃ）をし」のｊ５Ｓメチオニン（約１０μＣｉ）を５０ｍ 文の水に溶解した溶液に浸漬することにより本発明に係る多数の試薬装置を作っ た。各カラス繊維は約２００ｐ文の溶液を啜収し、これは各パントに約０．００ ４　μ文のＪＳ　Ｓメチオニンが含浸されたことを示す。

８當活動中の病院の細菌惇゛部門に持ち込まれた全ての尿検体を次のようにして 試験した。１湧した如くして調製した含侵カラス繊雌バッドをペトリ皿に置き、 次いで所定の尿検体５００ｗ文を添加した。３０分経過した後、バッドを尿から 取出し、水洗いし、次いで真空塔でメタノール洗浄した。各実験を２回行った。

乾燥後、各パッドをシンチレーション瓶に入れ、これにシンチラントを添加した 。このｘｈｆｅｓ封し、シンチレーション計数器内に置き、放射を１分間計数し 。

七のカウントを記録した。

十述した方法により調査した各尿検体を従来技術による測定および同定の実験熟 練者にも供給した。本発明の方法に従って得た結果を第３図に記録し、これら結 果を細菌学実験室における従来技ＩＦｉによる調査結果とともにグループ分けし た。

かかる結果は対数目盛を用いて横軸に１分当りのカランｈ　（ｃｐｆｆＩ）とし て表示する。カウントの任敷所定のプロ・ンク内における試料の数は算術目盛で 縦軸に表示する。最下欄に沿ってグループ分けされた結果は細菌学実験室におい て゛非生長″（すなわち罫染無し）として同定された検体に関するものである。

次の欄における結果はｌＯ５生物（”ｏｒｇ　”　）　／ｍ文以上の純粋な大腸 菌と明白に同定された感染検体に関するものである。次の欄は１０’　ｏｒｇ／ ｍ　！；Ｌ＜プロテウス属菌で感染されたと同定した検体に関するものである。

次の欄は１０’　ｏＢ１ｍ文くシュードモナスで感染されたと同定した検体に関 するものである。次の樅１はサルモネラ、大腸菌またはプロテウス属菌の純粋生 長で１０４〜１１０５ｏｒ／ｍ又の濃度に感染された検体に関するものである６ 次の柵は＋０５ｏｒｇ／ｍ文くの混合生長に関するものであるが、主たる微生物 は大腸菌またはプロテウス属として同定された６次の欄もまた１０’　ｏｒｇ／ ｍ　９．＜の混合生長を有する検体に関するものであるが、感染微生物の更なる 同定はなかった。最終の欄は未同定の混合生長を１０４〜＋０５ｏｒｇ／ｍ文の 濃度で宥する検体に関するものである。

非生長グループにおける３種の試料（参照番号３４８，２８７および３３４を付 した）とは別に、低いコロニーカウントがあるかまたは結果か外部感染生物によ ると思われる場合以外感染された試料とオーバーラツプするものはなかった。

非生長グループにおける３柿の高いカウントに関し、試料Ｎｏ、３３４に対する ￥験は尿を廃棄し患者が退院したので繰返すことができなかった。尿試料Ｎｏ、 ３４８は実験室で再培養し、再試験した。２回目の試験では元のカウント２２＋ ８ｃｐｍに対し２２８３ｃｐｍのカウントを得た。しかし、実験執練者はラクト ース醗酵生物を若干の大腸菌を培養することができたにすぎなかった。法魂が退 院したので更なる調査は不可能であった。

試料Ｎｏ、２８７を採取した患者はまだ入院していた。この患者に耳下腺感染に 対するアンピシリンを投与した。該患者からさらに採取した尿検体を上述した方 法で試験し、１回目の試料での読取値８２０ｃｐｍに対し８４３ｃｐｍ（１分当 りのカウント）の読取り値を得た。しかし、この場合、細菌学実験室におけるｉ ｍ食は１０５以上ノコロニーカウントを有する大腸菌での全面前原移染で、衛生 物がアンピシリン耐性でセブトリンに過敏なことを示した。そこで、尿を種々の ′ｇＬ度のアンピシリンおよびセブトリンで１時間予備培養する実験をさらに要 施し、各試料を″Ｓメチオニン含浸ガラス繊維パッドによりｈａした方法で試験 した。セブトリンの最低濃度（約３２０　ｐＬｇ）で、カウントか抗生物質を含 有しない同一試料のものの１０％未満になったことを確かめた。しかし、アンピ シリンの最低潤度（約５００　ｐＬｇ）で、カウントは抗生物質のないものと同 じであつ試料Ｎｏ、３３４を無視すると、木米゛°偽りの陽性′°としたものに 対する残りの試験（すなわち試料Ｎｏ、３４８およびＮｏ、２８７の試験）は° ゛真の陽性゛′であることを示した。試料Ｎｏ、２８７および３４８を除いた結 果を次の第２表に示す。

第２表 １−５にゝける　の、計８的　析 純粋生長＞　ＩＱ５１２，５６（１５，５２７混合生長＞　１０’　４，４３２ 　６．７２７純粋又は４昆合牛長１０４−１０５４８３　８ｆ（１３非生長は純 粋生長＞１０’　（ｐ＜Ｑ、ＱＯＬ）と、また混合生長＞　１０’　（ｐ　＜　 ０．０１）とも著しく異なる。

産業上の利用可能性 放射剤の使用は細菌からの信号を他の給源か□ら試料中に存在し得る蛋白質類と 区別するために必要である。たとえば、試験すべき尿または他の物質は存在し得 る任意の微生物と無関係の蛋白質を多量に含有する場合がある。かかる放射剤の 使用は蛋白質類（または他の生成物）を合成するための活性な発生学的手段を有 した生存生物に対してのみ可能で、従って死滅物からの°゛雑音°”が排除され る。微生物は白血球の如き他の形態の生存組織より一層はるかに活性であるため 、得られる信号は主として試料中に存在した微生物によるものである。

本発明は、放射レベルの検出前に放射性に標識付けられた蛋白質類（または他の 放射生成物）を含む残留物を各成分に分１ｉＩ（たとえば電気泳動により）する ことを必要としない。すなわち、前述したＥＰＣ＃許０．０？７，１４１ｉＡに 記載されたシルマンの同定技術（放射生成物の混合物を分離し、放射成分からの 別個の信号のパターンを検出する〕と対比して、本発明では残留物中の種々の放 射性に標識付けられた蛋白質類（または他の放射生成物）からの信号の和である 信号を簡単に検出することが可能である。

たとえば定性測定においては、放射の検出工程に残留物の一部のみを用いること が可能なことも当然分る（残留物の残りは他の処理、たとえば上述したシルマン の同定技術に施す）。

最初、６Ｓメチオニンまたは他の放射剤を細菌性蛋白質に包含させ、ＴＣＡ等で 沈殿させろ過した後該蛋白質をガラス繊維上に保持することを考えた。しかし、 試薬ストリップまたはディツプスティックを用いる上述した方法においては、沈 殿がない。従って、細菌性蛋白質かガラス繊維の表面上に吸着されたものと思わ れる。すなわち、蛋白質（”Ｓメチオニン含有）が洗浄するにもかかわらず繊維 に付着し、遊離の３５８メチオニンが洗浄除去される。換言すれば、細菌が全体 としてガラスｍ紐材料に付着し、３５Ｓメチオニンの少なくとも一部を取り込み 、洗ｓＩまたは破壊に耐えるようになる。これらの説明は本発明を何部限定せん とするものでないこと当然である。その理由は、本発明の実施がここに包含され た代謝または他の機構の理解に左右されないからである。

時間（分） ＦＩＧ、２゜ （訂正）補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 昭和５８年１１月３０日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８４１００１１２ ２、発明の名称 微生物の検出方法および装置 ３、特許出願人 氏　名　シルマン、ロパート　ニドワード住　所　英国　ロンドン　ダブリュー 　４氏　名　タバカリ、ソード 氏　名　ホランド、ダイアネ　シールマ東京都港区赤坂５丁目１番３０号 第６セイコービル　３階 西暦１９８４年１０月８日 訂正−！Ｉ＝＊−４蓄奮木へ範、暢 １．試料中の微生物の存在を測定するに当り、放射剤を前記試料の少なくとも一 部と接触させ；あらゆる過剰の放射剤を分離除去し；放射レベルを残留物の少な くとも一部から検出することを特徴とする試料中の微生物の存在を測定する方法 。

２、放射剤が放射性であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。

３、放射剤を３５３メチオニン、１４　Ｃロイシンおよび他の放射性アミノ酸類 から選択することを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。

４、試料を放射剤と分離工程前に培養することを特徴とする請求の範囲第１項記 載の方法。

５、試料と放射剤とを含有する混合物を形成することによりこれらを接触するこ とを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。

６、試料が同一給源からの多数の試料の中の一つであり、試料と放射剤との接触 工程前に該試料に一連の抗生物質から選択した抗生物質を添加し、これにより一 連の試料に関して検出した放射レベルがこれら試料中に存在すべき微生物の薬敏 感度の指標を付与することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。

７、標準微生物を未知レベルの抗生物質を有する検体に婬加して試料を調製し、 該検体による標準微生物の抑制をめるために検出した放射レベルを対照物のもの と比較し、これにより前記検体中の抗生物質のレベルを評価することを特徴とす る請求の範囲第１項記載の方法。

８、放射剤と、該放射剤用固体担体とからなることを特徴とする試料中の微生物 の存在を測定するための装置。

８、担体が吸収部材で、該部材に放射剤を含浸させることを特徴とする請求の範 囲第８項記載の装置。

１０、放射剤を５３メチオニン、１４Ｃロイシンおよび他の放射性アミノ酸類か ら選択することを特徴とする請求の範囲第８項記載の装置。

１１、吸収部材は不織ガラス繊維材料であることを特徴とする請求の範囲第１０ 項記載の装置。

１２、固体担体はストリップ状および／または支持体に同伴されることを特徴と する請求の範囲第１項記載の装置。

国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨｍ　ＩＮＴＥＲＮＡＴｒＯＮＡ、Ｌ　５Ｅ−ＡＲＣ）！ 　ＲＥＰＯＲＴ　０ＮｒＮＴＥＲＮＡＴ：０ＮＡＬ　ＡＰ！’ＬＩＣＡＴＩＯＮ 　Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＧＢ　８４１００１１２　（ＳＡ　６９６９）ＵＳ−Ａ−４ ２３９７４５１６／１２／８０　ＮｏｎｅＦＲ−Ａ−２１７２０４１２８１０９ ／７３　Ｎｏｎｅ第１頁の続き ■Ｉｎｔ、、ＣＪ’　識別記号　庁内整理番号優先権主張　０１９８′ＲＥ、３ 月３１日［相］イギリス（ＧＢ）［株］８３３４３２６＠発明者　タバカリ、ソ ード　イギリス国　口り　デュークス ＠発明者　ホランド、ダイアネ　シールマ　ニュージ−ランクリン　ストリ ＠出　願　人　ホランド、ダイアネ　シールマ　ニュージ−ランクリン　ストリ １ンドン　タフリュー　４２ニーニー　チスウィッζ　アベニュー　３３ ／ド国　サウス　アイランド　グレイマウス　フラン１−ト　２０ ／ド国　サウス　アイランド　グレイマウス　フラン１−ト　２０

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中の微生物の存在を測定するに当り、放射剤を前記試料と接触させ：あ らゆる過剰の放射剤を分離除去し：放射レベルを残留物の少なくとも一部から検 出することを特徴とする試料中の微生物の存在を測定する方法。 ２、放射剤が放射性であることを特徴とする請求の範囲第１頓記載の方法。 ３、放射剤をＡｓ　Ｓメチオニン、１４Ｃロイシンおよび他の放射性アミノ酸類 から選択することを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。 ４、試料を放射剤と分離ＴＩＶ前に培養することを特徴とする請求の範囲第１項 記載の方法。 ５、試料と放射剤とを合唱するイ昆合物を形成することによりこれらを接触する ことを特徴とオる詰東の範囲第１項記載の方法。 ６、試料か同−給源からの多グシの試料の中の一つであり、試料と放射剤との接 触工程前に該試料に一連の抗生物質から選択した抗生物質を添加し、これにより 一連の試料に関して検出した放射レベルかこれら試料中に存在すべき微生物の薬 ｆｉ＋感度の指標を付与することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ７、標準微生物を未知レベルの抗生物質を有する検体に添加して試料を調製し、 該検体による標準微生物の抑制をめるために検出した放射レベルを対照物のもの と比較し、これにより曲記検体中の抗生物質のレベルを評価することを特徴とす る請求の範囲第１項記載の方法。 ８、放射剤と、該放射剤用固体担体とからなることを特徴とする試料中の微生物 の存在を測定するための装置。 ９　、　ｌＦｊ体が吸収部材で、該部材に放射剤を含浸させることを特徴とする 請求の範囲第８項記載の装置。 １０、放射剤を３５５メチオニン、１４Ｃロイシンおよび他の放射性アミノ酸類 から選択することを特徴とする請求の範囲第８項記載の装置。 ＋１．吸収部材は不織カラス繊維材料であることを特徴とする請求の範囲第１Ｏ 項記載の装置。 １２、固体担体は７トリツ・ブ状および／まＩ−は支持体に同伴されることを特 徴とする請求の篩、門弟１項記載の装置。