JPS6040B2 - ７―アミノセフエム化合物の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、セフアロスポリンＣ（以下Ｃｅ−Ｃという）
の同族体から、微生物学的に下記一般式〔１〕（式中×
は水素原子、ヒドロキシ基、アセトキシ基又は求核性残
基を示す。 ）で表される７ーアミノセフェム化合物を製造する方法
の改良に関するものである。 セフアロスポリン系抗生物質は、ペニシリン類に比べて
低毒性で、かつ広い薬効範囲を有する優れた抗菌性剤で
あるが、セフアロスポリン系抗生物質製造の為の重要な
中間体である７−アミノセファロスポラン酸（以下単に
７−ＡＣＡという）を微生物学的に製造することが極め
て困難なところから、７一ＡＣＡはこれまで専らＣｅ−
Ｃの化学的変換によって供給されて来た。 ところがＬ特関脳５０一１０１５８５号公報によると、
７−ＡＣＡをその一員として含む、一般式〔１〕で表わ
される７−アミノセフェム化合物（以後化合物〔１〕と
いう）の微生物学的製造法が開示されている。 その方法は、Ｃｅ−Ｃの側鎖を変換した同族体である下
記一般式

〔０〕（Ｒは−ＣＯＯ日基又は−ＣＯＣＯＯＨ
基、Ｘは〔１〕式のものと同じものを示す）で表される
化合物（以後化合物

〔０〕という）のアミド結合を微生
物を用いて分解して相当する７ーアミノセフェム化合物
を得る方法であり、その分解能を有する微生物として、
シュードモナス・オバリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏ
ｖａｌｊｓ）ＡＴＣＣ９５０に属する一菌株「又はコマ
モナス属に属する一菌株ＳＹ−７７一１株（徴工研菌寄
第２４１０号）を見出したものである。 上言己公開公報開示の発明には、上記微生物によって生
産されるァミド結合分解酵素の使用形態についても開示
しているが「本発明の目的は、上記アミド結合分解酵素
のより顕著に改善された使用形態を提供することにある
。 この目的は、後に特定される線状成型物あるいはその二
次的加工物に上記アミド結合分解酵素を吸着させてなる
固定化酵素を、化合物

〔０〕に作用せしめることを特徴
とする方法によって達成されることが見出された。 本発明の出発物質である化合物

〔０〕は、公知の化合物
であって、例えば次の如き公知方法によって製造される
。 即ち、下記一般式〔Ｗ〕（×は〔１〕式のものと同じ） で表される化合物又はその塩に、好気的条件で、アスベ
ルギルス属、ベニシリウム属、ノィロスポラ属、ェアロ
バクター属、又はトリゴノプシス・バリアビリスから得
られるＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させる方法（英
国特許第１２７２７６び号明細書）、フザリウム属から
誘導されるＤ−アミノ酸オキシダーゼを好気的条件下で
作用させる方法（特開昭５１−４４６９５号公報）、グ
リオキシル酸又はその同族体を作用させる方法（特開昭
５１−８６４９０号公報、袴顔昭５０−８３５７４号、
同５０一８３５７５号、及び同５０−１５３２４１号明
細書）等の方法によって得られる。 本発明において用いられる化合物〔ロ〕から−般式〔１
〕の７−アミノセフェム化合物（化合物〔１〕を得る為
のアミド結合分解酵素は、どのような起源のものでもよ
く、前記侍関昭５０−１０１５８４号公報開示のＡＴＣ
Ｃ９５０及び微工研菌寄第２４１び号に属する菌株は、
勿論使用可能である。 これらの微生物を使用する場合は、特関昭５０一１０１
５８４号公報記載の方法に従って当該微生物を先ず培養
し「培養物から集菌された菌体から物理的又は化学的手
段を適用して得られる無細胞抽出液、例えば贋研処理「
超音波処理等による菌体破壊物、緩衝液「セチルピリジ
ニウムクロラィド等の処理による菌体熔解液又は無細胞
抽出液から既知の方法、例えば塩析、分画沈澱、透析、
吸着クロマトグラフィー、ゲル炉過等の公知の酵素分離
精製方法を適用して得られる部分精製或は完全精製され
たアミド結合分解酵素が使用できる。本発明は、上記ア
ミド結合分解酵素を特定の担体に担特せしめた固定化酵
素を用いて、化合物〔ロ〕から化合物〔１〕を製造する
方法に関するものであるが、の方法は後記するごとき格
別顕著な効果を奏するものである。 この顕著な効果は、その用いる固定化酵素の性質に依る
ところが大きく、そして、その固定化酵素の性質は、こ
れを担持する担体の性質に依るところが極めて大である
。以下、その坦体について詳述する。本発明の担体の特
徴は、１）比表面積が０．８の′多以上であること。 ２）基体がニトリル基を少くとも２岬ｔ％含有するニト
リル含有重合体であることにあり、このいずれか１つを
欠いてもすぐれた特性が失われてしまう。 これらの諸条件が、担体としての特性にどのように作用
しているかは、未だ充分に解明されていないが、ニトリ
ル基は主としてアミド結合分解酵素に対する吸着親和性
を増大させ、比表面積との相乗作用によって吸着能を向
上させるとともに〜くり返し使用した時の吸着能力を低
下させることなく持続させることに寄与しているものと
考えられる。 本発明の担体には「比表面積０．８で／多以上を有して
いるものでなければならない。 この理由は、単に表面積を大きくすることによって吸着
能を増大するのみでなく「ニトリル基との相乗作用によ
る吸着能増大を計るとともに、その再使用による吸着能
低下を防ぐところに意味がある。この作用は、その比表
面積が０．８で′タ以上のときに顕著に発揮されるもの
で、それより小さいときには満足されない。比表面積は
「上記のように０．８で′タ以上であればすぐれた作用
効果を発揮するものであるが、特に１．５で′タ以上の
ときには、著しくすぐれた作用を有するものとなる。 比表面積はＢＥＴ法等により測定できる。 本発明の吸着剤のニトリル基の含有量は２肌ｔ％以上含
まれていることが必要であり、これより少ないとき‘こ
は、吸着能が小さくなり、他の条件を本発明の範囲内に
調節しても、すぐれた吸着能を有する担体とはならない
。 そして、ニトリル基は、２肌ｔ％以上であれば、前記の
ようなすぐれた作用を発揮するが、３５ｗｔ％以上のと
きにはより一層すぐれた作用を発揮し、特にくりかえし
再使用することに耐えうる担体となる。そして、これら
のどの一つの条件を欠いても、本発明の効果は得られな
い。本発明の担体の基体となるニトリル基含有重合体は
、ニトリル基を少なくとも２冊ｔ％以上含有して、線状
成型物あるいはその二次的加工物になりうる重合体であ
れば特別な制限はない。 このニトリル基含有重合体の具体的なものを次に示す。 これらの重合体は、ニトリル基をもっている単量体、例
えばァクリロニトリル及びＱ−置換アクリロニトリル例
えばメタクリロニトリル、ェタクリロニトリル、フエニ
ルアクリロニトリル、Ｑ−クロロアクリロニトリル、シ
アン化ビニリデン等の単独重合体及びその共重合体、こ
れらの単量体のグラフト重合体例えばポリビニルアルコ
ールにグラフトした重合体、ポリエチレングリコールや
ポリプロピレングリコールにグラフトした重合体、シア
ノェチルセルロース「Ｎ−シアノェチルポリ−８−アラ
ニン等の各種ビニル系単量体の重合体「共重合体や縮合
系重合体である。アクリロニトリル及びＱ−置換ァクリ
ロニトリルの共重合体において用いられる共重合性単量
体は、従来より知られている重合性単量体を用いること
ができる。 その具体例としては、アクリル酸またはメタクリル酸及
びそれらのヱステル類、例えばアクリル酸メチル、アク
リル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸メチル
、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル（メタ）ア
クリル酸ジアルキルアミノェチルェステル、酢酸ビニル
、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、不飽和アミド類例
えばアクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチルア
クリルアミド、ジメチルアクリルアミドＬメチロールア
クリルアミド、Ｎーアリルアミド「ハロゲン化ビニル及
びハロゲン化ビニリデン、例えば塩化ビニル、塩化ビニ
リデン「臭化ビニル等、不飽和ケトン類、例えばメチル
ビニルケトン、メチルアリルケトン、ブタジェン類例え
ば１，３−ブタジエン、２ークロロブタジエン、不飽和
の脂肪族多塩基性酸及びそのェステル類、例えばフマー
ル酸、シトラコン酸、ィタコン酸等及びそれらのモノま
たはジメチル、エチル、プロピルェステル、ビニル環状
化合物、例えばスチレン、ビニルフラン、Ｎービニルカ
ルバゾール、不飽和エーテル類、例えばエチルビニルェ
ーテル、ジアリルヱーテル、エチルメタリルエーブル、
ビニルピリジン類、例えば２−ビニルピリジン、２−メ
チル一５−ビニルピリジン、スルホン酸基を有する不飽
和単量体、例えばアリルスルホン酸、メタリルスルホン
酸、スチレンスルホン酸、ベーターシアノビニルアミン
及びそのＮ−置換化合物である。本発明の担体は、その
ままの形で使用できるが、紙状物、不織布、織物、編物
、糸状物及び粒状物等の各種の形態に加工して使用する
こともできる。 特に「本発明の線状成型物を叩解等の手段によって微細
なヒゲ状凸起を多く発生させたものは担体としてすぐれ
た特性を発揮するので好ましいものである。 本発明の担体の使用に際しては出来る限り湿潤状態で行
うのが性能を発揮させる上で好ましい。 従って、凝固させた線状成型物あるいはその二次的加工
品も、水洗、延伸等の工程を経た線状成型物あるいはそ
の二次的加工品も、ともに乾燥工程を通す必要はない。
次に、本発明の坦体は各種の方法によって製造すること
ができる。 いわゆる湿式紙糸法で、前記重合体を熔解することがで
きる溶剤に溶解して液状物となし「該液状物を細孔を通
して、重合体を凝固することができる液体媒体中に押し
出す方法である。このときの溶剤は、アクリロニトリル
及びＱ一層襖ァクリロニトリルの単独及びそれを主成分
とする共重合体に対しては「例えばジメチルホルムアミ
ド（以下ＤＭＦという）、ジメチルアセトアミド（以下
ＤＭＡＣという）、ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳ
Ｏという）、エチレンカーボネート、ッ−ブチロラクト
ン、アセトン、アセトニトリル等の有機溶剤、硝酸、硫
酸、リン酸等の濃厚溶液からなる無機酸系溶剤、塩化亜
鉛、チオシアン酸塩、例えばチオシアン酸ソーダ等の各
種無機塩の濃厚溶液からなる無機塩系溶剤等があげられ
る。前記重合体をこれらの溶剤にとかして液状物とする
ときには、各種溶剤及び重合体との組合わせで、溶解す
るときに加溢してもよいし、又冷却し、そして押し出し
が完了するまでその状態を保持しておくことが必要な場
合もある。 例えば、ＤＭＦ、塩化亜鉛、チオシアン酸ソーダ等にと
かす場合には加溢することは好ましいことであり、硝酸
にとかすときには冷却することは好ましいことである。
これらの条件は、溶剤や重合体の種類の組合せに応じて
、操作上での著しい困難性や得られる吸着剤の著しい性
質変化を回避する等の問題を考慮して最適な条件を適宜
選定して行なうことが好ましい。 また、このときの溶剤に対する重合体の濃度は線状成型
物を形成できる程度であれば特に問題はないが、例えば
５％〜３０％が好ましい。 次に、このようにして得た重合体の液状物の凝固性媒体
は、通常溶剤の稀薄溶液、例えば溶剤の水溶液が好まし
く、その濃度は、重合体を溶解する濃度以下であればよ
い。 例えば、ＤＭＦを溶剤とした場合にはＤＭＦを約９肌ｔ
％以下含有する水溶液、硝酸を用いる場合には約５５Ｍ
％以下の水溶液等である。 そしてこの濃度は、重合体の分子量や、共重合体組成、
温度等により、又溶剤の種類により変わるものであるか
ら「最適条件は予備的実験により定める必要もある。ま
た、凝固性媒体は水のみを用いることもでき、この場合
は比較面積の大なる担体が得られ、担体としてすぐれた
吸着能のあるものが得られる。 前記重合体の液状物を凝固性媒体中に押し出して凝固す
るとき、溶剤の稀薄溶液あるいは水のみを用いて一般で
凝固することも、あるいは、比較的溶剤含有量の多い稀
薄水溶液及びそれより低濃度の稀薄水溶液を組合わせた
二段または多段にわたって凝固を行なう多段凝固法も用
いることができる。このような湿式法において「重合体
、及びその溶剤からなる液状物を、その溶剤を含有する
凝固性媒体中へ、紬孔を通して押し出して重合体の液状
物を凝固するとき、凝固性媒体の組成や、紬孔より押し
出す液状物の吐出線速度を変えることなく「凝固した糠
状物の引き取り速度を増大していくと、吐出線速度に対
する引き取り速度の比（以下単にドラフトという）が、
ある一定値以上では、凝固性媒体中で凝固過程にある線
状成型物が切断して、連続した糠状成型物を取得するこ
とができなくなる。 このときの連続した線状成型物を継続して得ることので
きる最大ドラフトの値は、重合体の液状物、凝固性媒体
の組成、吐出線速度及び、温度等種々の条件によって異
なるものである。今、重合体及び濃厚硝酸水溶液からな
る液状物を、紐孔からの吐出線速度をある一定の値に保
って、凝固媒体として硝酸水溶液を用いるとき、その中
の硝酸濃度を増加していくと、最大ドラフト値は減少し
てゆき「ある硝酸濃度で極少値を示した後、再び急激に
その値は増加し、更に高い硝酸濃度領域ではもはや重合
体液状物の凝固が不完全となり、連続した線状成型物の
取得が不能となる領域に至る。 この最大ドラフトの極小点の溶剤濃度を遷移濃度と仮称
すると、湿式級糸においては、この遷移濃度を境にして
、二つの凝固加熊領域が存在する。この遷移濃度の測定
法について、その一例を図一量にて説明する。 図一１Ｇまポリアクリロニトリル（重合平均分子量６４
７０００）を亜硝酸を０．００１％以下に精製した７０
％の硝酸含有水溶液に０℃で、重合体濃度１７ｗｔ％に
溶解した重合体液状物を０．０４脚×０．２仇帆の長方
形の紐孔を通して、０℃の硝酸水溶液からなる凝固性媒
体中へ５ｍ／分の吐出線速度で押し出し、このときの最
大ドラフトと、凝固性媒体中の硝酸濃度との関係を示し
ている。 これからわかるように、凝固性媒体中の硝酸濃度がゼロ
より増加するに従って、最大ドラフトは低下し、硝酸濃
度が３７％に達した時に極小点を示し、これより硝酸濃
度が増加すれば最大ドラフトは急激に増大する。このよ
うに凝固性媒体中の硝酸濃度が増加するに従って最大ド
ラフトが極小に達し、更に硝酸濃度が増加するならば、
最大ドラフトが急激に増加する。この過程における最大
ドラフトが極小を示す凝固媒体中の硝酸濃度を「この押
し出し条件における遷移濃度とする。そして「この濃度
を境にして、線状成型物の物理的性質が大きく変化する
。この遷移濃度の測定法について、図一１を使用して説
明したが、この遷移濃度は、重合体の種類、共重合成分
の量や種類、溶剤の濃度、重合体液状物中の重合体量、
温度、凝固性媒体の温度や組成、紬孔の大きさ、形状、
更には吐出線速度等の各種条件によって種々変化する性
質のものである。従ってこの遷移濃度は一義的に数値を
もって決めることは困難であるため、線状物の湿式法に
おける製造条件について実験的に決められるべきであろ
うことは容易に理解されるであろう。遷移濃度について
、溶剤として硝酸を例にとって説明したが、これは、硝
酸に限らず、例えばＤＭＦ，ＤＭＡＣ，ＤＭＳＯあるい
は塩化亜鉛やチオシアン酸ソーダのような各種溶剤につ
いても同様の現象がみられるものである。従って、硝酸
以外の溶剤についても上記と同様の測定法で遷移濃度を
測定することができる。ところで本発明の担体を湿式法
により製造する場合、凝固性媒体として上記のような、
遷移濃度よりも高い溶剤濃度の凝固領域（以下単に高濃
度城という）に重合体液状物を紬孔を通して押し出し、
一旦線状物を形成しその後更に、遷移濃度よりも低い溶
剤濃度の凝固領域（以下単に低濃度域という）に綾状体
を通して凝固させることにより得られる担体は、多孔質
なものであり、比表面積が大きく、特に吸着能にすぐれ
ており、好ましい製造法である。 前述した如く、本発明の方法の担体に適したものを製造
するにはいくつかの方法があるが、特に担体としてすぐ
れた吸着能を有する方法は「ニトリル基含有重合体の液
状物を高濃度城の凝固性媒体中に押し出し不完全凝固さ
せ、次いでそれより低い濃度である低濃度城の凝固性媒
体中に導いて沈澱凝固させる方法である。 この方法で得られた線状成型物あるいはその二次的加工
品は非常に多孔質なものとなり、ニトリル基との相乗効
果が大きくなり「ァミド結合分解酵素に対する吸着能が
非常に高いものとなる。またこの方法で得た線状成型物
は延伸工程を行ない、線状成型物の強度を大きくしても
、該酵素の吸着能は低下することもなく、延伸したもの
は強度が大きいため、二次的加工が施こしやすく、非常
に取扱いが容易となるという利点もある。 なお、ニトリル基含有重合体の溶媒と凝固液との種類が
同一である必要はなく、線状成型物を成型しうる種類の
組合せであればよい。例えば、重合体の溶剤としてＤＭ
Ｆを使用し、凝固液にアセトン、水等を使用することも
可能である。本発明において、７−アミノセフェム化合
物〔１〕の製造に用いられる固定化酵素は、上記線状成
型物あるいはその二次的加工物と前記アミド結合分解酵
素を含有する液とを接触させることによって得られる。 その接触方法としては、上記線状成型物あるいはその二
次的加工物を充填したカラムに該酵素含有液を流通せし
める方法、線状成型物あるいはその二次的加工物と該酵
素含有液を反応槽中で灘拝、混合した後、該酵素を吸着
した担体を炉刻する方法のいずれでもよく、要は酵素活
性の失われない条件で接触することであり、そうすれば
吸着は効率よく行われ、極めて活性の高い固定化酵素が
取得される。 上記接触の際、グルタールアルデヒド、ヘキサメチレン
ジイソシアナート、ビスアゾベンジジン〜ＮＦＮ−エチ
レンビスマレィンィミド等の架橋剤を存在せしめること
により、該酵素が線状成型物あるいはその二次的加工物
により強固に吸着固定された固定化酵素が取得される。 これらの架橋剤の作用機作は明らかではないが「架橋剤
共存下で固定化した場合の方が、非存在下の場合と比べ
て固定化酸素としての寿命が長い場合が多く、工業的に
該酵素を使う場合には非常に有利である。上記の如くし
て得られた固定化酵素を化合物

〔０〕に作用させれば、
本発明の目的化合物〔１）が得られる。 この作用の形式としては、カラム形式、バッチ形式のい
ずれも採用可能である。即ち化合物

〔０〕を含有する液
を固定化酵素のカラムに導通せしめてもよく、又化合物
〔ロ〕含有液を固定化酵素と容器中で渡洋接触させても
よい。その際の反応温度は、化合物〔１〕の安定性を考
慮すれば、２０〜４が０が良く、２５〜３７ｑ０なら更
に良い。反応のｐＨはｐＨ６〜９で実施するのが良いが
Ｌ特に化合物

〔０〕及び〔１〕の安定性からｐＨ６〜７
で行うのが望ましく、リン酸緩衝液、ホゥ酸、緩衝液等
のｐＨ緩衝剤の存在下水性媒体中で行うのも好ましい。
本発明の方法は、前記特開昭５０−１０１５８４号公報
記載の方法及び他の従来法に比べて次の点で格段に優れ
ている。 ■ 固定化酵素製造の際、酵素の吸着が効率よく行われ
ト操作が容易で酵素の損失が少ない。 ■ 得られる固定化酵素の単位重量当りの活性密度が極
めて高い。■ 得られる固定化酵素の連続反応による活
性の半減期が非常に長く、固定化酵素の反覆使用回数が
著しく大である。 ■ 固定化酵素の吸着蛋白の単位当りの酵素活性が極め
て高い。 このような■〜■の利点は、７−アミノセフェム化合物
〔１〕の製造において、反応時間の短縮、反応容器の稀
少を可能とするもので、その意味は特に重要である。 何故なら、一般に、セフアロスポリン系化合物は、生理
的ｐＨ範囲においても極めて不安定で「微生物的な変換
工程則ち温和な条件下においても、反応時間の短縮や反
応温度の低下を図らぬ限り、化合物〔１〕の生成率は低
下し、又反応中の基質（化合物〔１〕）の分解が起こり
がちだからである。このような理由から、本発明の固定
化酵素によって化合物〔Ｄ〕から化合物〔１〕を得る本
発明の製造方法は、工業的に極めて重要な貢献をなすも
のである。以下に実験例及び実施例を示す。 ％は重量表示とする。実験例 １（線状成型物の調製） アクリロニトリル８１％、アクリル酸メチル１９％から
なるニトリル基含有重合体を、７０％の濃硝酸に溶解し
て重合体濃度１６％の液状物を調製し、該液状物を直径
０．１２柳の紬孔から２批の吐出条件で高濃度城である
４３％の硝酸水溶液中に押し出し、不完全凝固させた後
、低濃度域である１５％硝酸水溶液に導き沈澱凝固させ
、次いで水中で硝酸を除去して、比表面積０．９の′夕
の湿潤状の線状成型物を得た。 このようにして得られた線状成型物をＦ−１と称する。
実験例 ２ （緑状成型物の調製） アクリロニトリル９２％、アクリル酸メチル６．０％「
アクリルアミド２．０％からなるニトリル基含有重合
体を、ＤＭＦに溶解して、重合体濃度１５．４％の液状
物を調製し、該液状物を直径０．１０脚の紬孔から１母
の吐出条件で高濃度城であるアセトン凝固浴中に押し出
し、不完全凝固させた後、低濃度城である水中に導き、
沈澱凝固させると同時にＤＭ『、アセトンを除去して比
表面積１．５で′夕の湿潤状態の線状成型物を得た。 このようにして得られた緑状成型物をＦ−２と称する。
実験例 ３ （緑状成型物の調製） 実験例１で得られた線状成型物を１００００の水蒸気中
で４倍延伸して線状成型物を得た。 このようにして得られた比表面積０．８で′夕の湿潤状
態の線状成型物をＦ−３と称する。実験例 ４ （線状成型物の調製） 実験例１で用いたニトリル基含有重合体の液状物を通常
凝固に用いられる低濃度城の３２％の硝酸水溶液中に、
実験例１と同様に押し出し、完全に凝固させ、次いで水
中で硝酸を除去して線状成型物を得た。 このようにして得られた比表面積０．１で′夕の湿潤状
態の線状成型物をＦ−４と称する。実験例 ５ （アミド結合分解酵素の調製） 肉エキス０．５％、食塩０．３０％、ベプトン１％を含
む液体塔地（ｐＨ７．０）５００の‘を５〆客三角フラ
スコに分注しも １２０つ○で１５分間蒸気滅菌した後
、コマモナス，スピシーズＳＹ−７７−１（徴工研菌寄
第２４１び烏）を接種し、３００○で１日間回転振糧培
養する。 その培養液全量をカゼイン２％、酵母エキス０．０５％
，ＣＳＬＯＨ４％、グルタミン酸ソーダ０．５％、グル
タール酸０．１％を含む液体培地（ｐＨ９。 ０）１０夕を２０〆容ジャーファーメンターに分注し〜
１２０ｏ０３０分間蒸気滅菌したものに接種し、３０
ｏｏで３日間、通気１００％／肌、櫨梓３０仇ｐｍで培
養した。 培養後、培養物を冷却下遠心分離して集菌した。このよ
うにして得られた湿潤菌体１００夕を１．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）５００の‘に懸濁し、この懸濁液に
界面活性剤カチオンＦＢ■（日本油脂製商品名）２５奴
を加え室温で１時間耀拝する。 菌体残湾を冷却下遠心分離して酵素液５００の‘を得る
。この操作による酵素の回収率は９３％であった。この
ようにして得られた酵素液をＥ−１と呼ぶ。実験例 ６
（アミド結合分解酵素の調製） 実験例５においてカチオンＦＢ■の代りにアデカトール
Ｓ○−１２ｏ■（旭電化製商品名）を用いたところ酵素
回収率は９２％であった。 この酵素液をＥ−２と称する。実験例 ７ （酵素の固定化） 湿潤状態の緑状成型物Ｆ−１ ３０外こ酵素液Ｅ−１
５００机上と２５％グルタールアルデヒド７．５奴を加
え、３０００で３時間振壷する。 振糧後炉過し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
洗浄し、湿潤担体を得る。これには用いた酵素の１００
％が吸着していることが確認された。この固定化酵素を
ＦＩ−ＥＩ−Ｇと呼称する。実験例 ８ （酵素の固定化） グルタールアルデヒドを用いないこと以外、実験例７と
全く同様にして固定化酵素を得た。 酵素の３０％の吸着が確認された。この固定化酵素をＦ
１一ＥＩと呼称する。実験例 ９ （酵素の固定化） 線状成型物にＦ２を用いた以外は実験例７と全く同様に
して固定化酵素を得た。 酵素の吸着は９５％であった。この固定化酵素をＰ２−
ＥＩ−Ｇと呼称する。実験例 １０ （酵素の固定化） 線状成型物にＦ３を用いた以外は、実験例７と全く同様
にして固定化酵素を得た。 酵素の吸着は８３％であった。この固定化酵素をＦ３−
ＥＩ−Ｇと呼称する。実験例 １１ （酵素の固定化） 線状成型物にＦ４を用いた以外は、実験例７と全く同様
にして固定化酵素を得た。 酵素の吸着は２４％であった。この固定化酵素をＦＩ−
ＥＩ−Ｇと呼称する。実施例 １ 実験例７で得られた固定化酵素ＦＩ−ＥＩ中Ｇを外とう
管付きカラム（２×１３．５ｃｍ，Ｖ＝４２柵）に充填
し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、洗
浄後１％の３山アセトキシメチルー７（４ーカルボキシ
ブタンアミド）セフ−３ーエム−４−力ルボン酸４０夕
を流速一定（ＳＶ≠３）で流す。 流出完了まで約３２腿寺間を要した。結果を添付図面（
図一２）に示すが、７−ＡＣＡの生成率は３０畑時間経
過後も９０％以上であった。全流出液４０そをｐＨ３．
４に調整した後、４℃で放置して７−ＡＣＡ２１３夕（
純度９４．０％）を得た。実施例 ２固定化酵素として
実験例８で得られたＦＩ−ＥＩを使用し、１％の３−ア
セトキシメチル−７−（４−力ルボキシブタンアミド）
セフ−３−エム−４−カルボン酸液を３そ用いる以外は
実施例１と同様に行い、７−ＡＣＡｉ５８夕（純度９３
，２％）を得た。 実施例 ３ 固定化酵素として実験例９で得られたＦ２−ＥＩ−Ｇを
使用すること以外「実施例２と全く同様にして７−ＡＣ
Ａ１６．７夕（純度９３．０％）を得た。 実施例 ４固定化酵素として実験例１０で得られたＦ３
−ＥＩ−Ｇを使用しトＳＶ主２で流すこと以外「実施例
２と全く同機にして７−ＡＣＡｉ４．５多（純度８９．
０％）を得た。 実施例 ５ 固定化酵素として実験例１１で得られたＦ４山ＥＩ−Ｇ
を使用し、ＳＶ≠０。 ５で流すこと以外も実施例２と全く同様にして７ＡＣＡ
１２．３夕（純度８５。 ０％）を得た。 実施例 ６〜１１ 実施例１において、３−アセトキシメチルー７山（４−
力ルボキシブタンアミド）セフー３ーエムー４一カルボ
ン酸の代りに、３−メチル−７一（４−力ルボキシブタ
ンアミド）セフ−３ーエム−４ーカルボン酸（実施例６
）、３ーヒドロキシメチルー７一（４−力ルボキシプタ
ンアミド）セフー３−ヱム−４−カルボン酸（実施例７
）、３ーメチル−７−（５−力ルボキシー５一オキソベ
ンタンアミド）セフ−３ーヱムー４−カルボン酸（実施
例９入 ３川ヒドロキシメチル−７−（５−力ルボキシ
日５−オキソベンタンアミド）セフー３−ェム−４−カ
ルボン酸（実施例１０）、Ｎ−〔７一（５力ルボキシー
５−オキソベンタンアミド）セフ−３−エム−３−イル
メチル〕ピリジニウム−４−カルボキシレート（実施例
１１）を用いて各々下記第１表の７−アミノーセフェム
化合物を得た。 第１表 （注） 展開溶媒 溶媒系１：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３：・；・溶媒
系０；ｎ−ブタノール；酢酸：ピリジン三水＝１５三３
：ｉ０三２ 溶媒系皿；ｎ−ブタノール：酢酸ミホルムアルヂヒド：
水＝３：１：５：１実施例 １２〜１８ 実験例９で得られた固定化酵素Ｆ２−ＥＩ−Ｇ及び下記
の化合物〔ロ〕を用いて「実施例１と同様に実験を行っ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は担体製造の際の最大ドラフトと凝固性媒体中の
硝酸濃度との関係を示す。 第２図は実施例１における化合物〔１〕の生成率と反応
時間との関係を示す。第１図 精２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式〔II〕 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは−ＣＯＯＨ基又は−ＣＯ・ＣＯＯＨ基、Ｘ
   は水素原子、ヒドロキシ基、アセトキシ基又は求核性残
   基を示す。 ）で表わされる化合物（化合物〔II〕という）から、一
   般式〔I〕▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘは〔II〕式のものと同じ。 ）で表わされる７−アミノセフエム化合物（以下、化合
   物〔I〕という）を微生物学的に製造するに当り、化合
   物〔II〕から化合物〔I〕を生成する能力を有するアミ
   ド結合分解酵素を、比表面積が０．８ｍ＾２／ｇ以上で
   少くとも２０ｗｔ％のニトリル基を含むニトリル基含有
   重合体の線状成型物あるいはその二次的加工物に吸着せ
   しめてなる固定化酵素を水性媒体中で化合物〔II〕に作
   用させることを特徴とする一般式〔I〕で表わされる７
   −アミノセフエム化合物の製造方法。 ２ 化合物〔II〕から化合物〔I〕を生成する能力を有
   するアミド結合分解酵素を、架橋剤の存在下に線状成型
   物に吸着せしめる特許請求の範囲第１項記載の一般式〔
   I〕で表わされる７−アミノセフエム化合物の製造方法
   。 ３ 架橋剤がグルタルアルデヒドである特許請求の範囲
   第２項記載の一般式〔I〕で表わされる７−アミノセフ
   エム化合物の製造方法。４ 固定化酵素と化合物〔II〕
   の反応を２０〜４２℃の温度で、ｐＨ緩衝剤の存在下水
   性媒体中で行なう特許請求の範囲第１項記載の一般式〔
   I〕で表わされる７−アミノセフエム化合物の製造法。 ５ ニトリル基含有重合体の線状成型物あるいはその二
   次的加工物が、ニトリル基含有重合体と硝酸水溶液、硫
   酸水溶液、塩化亜鉛濃厚水溶液、ロダン塩濃厚水溶液、
   ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチ
   ルスルホキシド、エチレンカーボネート、アセトンから
   えらばれる溶剤とからなるニトリル基含有重合体液状物
   を、遷移濃度以上の凝固性媒体中に押し出して不完全凝
   固をさせ、次いでそれより低い濃度の凝固性媒体中に導
   いて沈澱凝固させ、水洗工程をへて得た線状成型物ある
   いはその二次的加工物である特許請求の範囲第１項記載
   の一般式〔I〕で表わされる７−アミノセフエム化合物
   の製造方法。 ６ ニトリル基含有重合体の線状成型物あるいはその二
   次加工物が、ニトリル基含有重合体と硝酸水溶液、硫酸
   水溶液、塩化亜鉛濃厚水溶液、ロダン塩濃厚水溶液、ジ
   メチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチル
   スルホキシド、エチレンカーボネート、アセトンからえ
   らばれる溶剤とからなるニトリル基含有重合体液状物を
   、遷移濃度以上の凝固性媒体中に押し出して不完全凝固
   をさせ、次いでそれより低い濃度の凝固性媒体中に導い
   て沈澱凝固させ、次いで水洗、延伸を施こして得た線状
   成型物あるいはその二次的加工物である特許請求の範囲
   第１項記載の一般式〔I〕で表わされる７−アミノセフ
   エム化合物の製造方法。 ７ ニトリル基含有重合体の線状成型物あるいはその二
   次的加工物において、ニトリル基の含有量が少くとも３
   ５ｗｔ％以上である特許請求の範囲第１項、第５項及び
   第６項のいずれかに記載の一般式〔I〕で表わされる７
   −アミノセフエム化合物の製造方法。