JPS6031057A - 過酸化物質の測定方法および測定用キツト - Google Patents
過酸化物質の測定方法および測定用キツトInfo
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- JPS6031057A JPS6031057A JP13896583A JP13896583A JPS6031057A JP S6031057 A JPS6031057 A JP S6031057A JP 13896583 A JP13896583 A JP 13896583A JP 13896583 A JP13896583 A JP 13896583A JP S6031057 A JPS6031057 A JP S6031057A
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は過酸化物質の測定方法、更に詳細には生体中あ
るいは加工食品中に存在する過酸化物質の測定に適した
測定方法、並びにこれに使用される測定用キットに関す
る。
るいは加工食品中に存在する過酸化物質の測定に適した
測定方法、並びにこれに使用される測定用キットに関す
る。
不飽和脂肪酸の酸化により生ずる過酸化脂質、とりわけ
ハイドロ型過酸化脂質（１ｉｐｉｄ ｈｙｄｒｏ−ｐｅ
ｒｏｘｉｄｅ ）は、生体膜の障害、細胞の壊死、酵素
類の失活などを誘起し、これらの生体内での生成と増量
は、生体の物質代謝に悪影響を与えるもので、臨床的に
も動脈硬化をはじめとする退行性変化などの疾患と過酸
化脂質との関連性につき糧々の報告がなされている。ま
た、加工食品等に含まれる油脂の酸化の問題も、上記の
ような有害性から注目をあびている。
ハイドロ型過酸化脂質（１ｉｐｉｄ ｈｙｄｒｏ−ｐｅ
ｒｏｘｉｄｅ ）は、生体膜の障害、細胞の壊死、酵素
類の失活などを誘起し、これらの生体内での生成と増量
は、生体の物質代謝に悪影響を与えるもので、臨床的に
も動脈硬化をはじめとする退行性変化などの疾患と過酸
化脂質との関連性につき糧々の報告がなされている。ま
た、加工食品等に含まれる油脂の酸化の問題も、上記の
ような有害性から注目をあびている。
しかしながら、過酸化脂質等の過酸化物質の測定は、過
酸化物質のみを特異選択的に定量しなければならないた
め極めて煩雑な操作が必要であること、またごく微量の
変化もとらえなければならないという必要水性から測定
感度が問題であること等の欠点を有し、未だ斯界の要求
に応え得る確立された方法は存在しない。
酸化物質のみを特異選択的に定量しなければならないた
め極めて煩雑な操作が必要であること、またごく微量の
変化もとらえなければならないという必要水性から測定
感度が問題であること等の欠点を有し、未だ斯界の要求
に応え得る確立された方法は存在しない。
斯かる実情において、本発明者は、過酸化物質の酸化能
によって惹起される化学発光スペクトルを測定すること
により過酸化物質量を測定するという方法に着目し、そ
の特異性、定量性（感度等）を改善すべく鋭意研究を行
った結果、その反応系に触媒として牛血清を存在させる
と、発光現象が著しく増大され、かつこれは過酸化物質
、特にノ・イドロバ−オキサイドに特異的であることを
見出し、本発明を完成した。
によって惹起される化学発光スペクトルを測定すること
により過酸化物質量を測定するという方法に着目し、そ
の特異性、定量性（感度等）を改善すべく鋭意研究を行
った結果、その反応系に触媒として牛血清を存在させる
と、発光現象が著しく増大され、かつこれは過酸化物質
、特にノ・イドロバ−オキサイドに特異的であることを
見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、測定試料中の過酸化物質量を、そ
の酸化能によって惹起される化学発光により測定する方
法において、その系に触媒として牛血清を使用する過酸
化物質の測定方法、並びにこれに使用する牛血清及び被
酸化性発光試薬を含有する測定用キットを提供するもの
である。
の酸化能によって惹起される化学発光により測定する方
法において、その系に触媒として牛血清を使用する過酸
化物質の測定方法、並びにこれに使用する牛血清及び被
酸化性発光試薬を含有する測定用キットを提供するもの
である。
本発明で触媒として使用される牛血清は、牛由来のもの
であれば特に制限されるものではなく、例えば牛の胎児
、乳児、子牛、放生血清が使用されるが、就中特に胎児
血清が好ましい。これらは、採血した血液より常法によ
って分離することにより、また市阪品として容易に入手
できる。更にこれらは凍結乾燥品として保存することも
できる。
であれば特に制限されるものではなく、例えば牛の胎児
、乳児、子牛、放生血清が使用されるが、就中特に胎児
血清が好ましい。これらは、採血した血液より常法によ
って分離することにより、また市阪品として容易に入手
できる。更にこれらは凍結乾燥品として保存することも
できる。
更にまた、これらの牛血清は、常法によって、非動化後
透析又はゲルｐ過等に付して、分子量１万程度の低分子
物質を除去して使用するのが好適である。この牛血清の
反応系への添加量は特に限定されないが、通常反応系中
に１．５ ｖ／ｖ ％ （血清原液として、以下同じ）
以上、特に２〜１０ ｖ／ｖ ％程度添加するのが好ま
しい。
透析又はゲルｐ過等に付して、分子量１万程度の低分子
物質を除去して使用するのが好適である。この牛血清の
反応系への添加量は特に限定されないが、通常反応系中
に１．５ ｖ／ｖ ％ （血清原液として、以下同じ）
以上、特に２〜１０ ｖ／ｖ ％程度添加するのが好ま
しい。
本発明による過酸化物質の測定は、測定試料に被酸化性
発光試薬及び牛血清を加えて反応を行い、生成する化学
発光スペクトルを測定することによって行われる。
発光試薬及び牛血清を加えて反応を行い、生成する化学
発光スペクトルを測定することによって行われる。
本発明によって過酸化物質量を測定できる測定試料は、
その中に過酸化物質の存在が予想される生体試料として
は、例えば、ヒト及び動物の血液、組織ホモジネート等
の体液成分が挙げられ、就中血液を血漿又は血清として
使用するのが好ましく、更に該試料より常法に従い分画
した脂質画分を用いるのがより好ましい。該分画操作と
しては自体公知の物理化学的、生化学的手段、例えば、
吸着法、クロマトグラフィー、電気泳動法、透析法、抽
出法、分配法等を適宜採用すればよく、一般には生体試
料より適当な溶媒、例えばリグロイン、ヘキサン、ベン
ゼン等の炭化水素系溶媒；クロロホルム、四塩化炭素等
のハロゲン化炭化水素系溶媒１水、メタノール、エタノ
ール、インプロパツール等のアルコール系溶媒；エチル
エーテル等のエーテル系溶媒；酢酸等のカルボン酸系溶
媒；アセトニ） ＩＪル、アニリン等の窒素化合物系溶
媒及びそれらの混合溶媒等の一般に脂質生化学にて頻用
される溶媒にて抽出するのが簡便である。該測定試料の
量は通常約１〜１，０００μ！程度で充分である。
その中に過酸化物質の存在が予想される生体試料として
は、例えば、ヒト及び動物の血液、組織ホモジネート等
の体液成分が挙げられ、就中血液を血漿又は血清として
使用するのが好ましく、更に該試料より常法に従い分画
した脂質画分を用いるのがより好ましい。該分画操作と
しては自体公知の物理化学的、生化学的手段、例えば、
吸着法、クロマトグラフィー、電気泳動法、透析法、抽
出法、分配法等を適宜採用すればよく、一般には生体試
料より適当な溶媒、例えばリグロイン、ヘキサン、ベン
ゼン等の炭化水素系溶媒；クロロホルム、四塩化炭素等
のハロゲン化炭化水素系溶媒１水、メタノール、エタノ
ール、インプロパツール等のアルコール系溶媒；エチル
エーテル等のエーテル系溶媒；酢酸等のカルボン酸系溶
媒；アセトニ） ＩＪル、アニリン等の窒素化合物系溶
媒及びそれらの混合溶媒等の一般に脂質生化学にて頻用
される溶媒にて抽出するのが簡便である。該測定試料の
量は通常約１〜１，０００μ！程度で充分である。
被酸化性発光試薬としては、酸化されると化学発光を呈
する試薬であれば特に限定なく、例えばルミノール、イ
ソルミノール、ルシゲニン、ルシフェリン、ローフイン
等が挙げられる。該発光試薬の使用量は、通常最終濃度
として５ Ｘ １０−７〜５ Ｘ １０−’ Ｍ程度、
特に５ Ｘ １０−’〜５ Ｘ １０−’ＭＭ程度好ま
しい。 − （５） 。 −−、測定試料中の過酸化物質 と定吐的に反応して発光する。斯くして生成する発光ス
ペクトルは通常の光量子針数器（フォトンカウンター）
にて計測される。
する試薬であれば特に限定なく、例えばルミノール、イ
ソルミノール、ルシゲニン、ルシフェリン、ローフイン
等が挙げられる。該発光試薬の使用量は、通常最終濃度
として５ Ｘ １０−７〜５ Ｘ １０−’ Ｍ程度、
特に５ Ｘ １０−’〜５ Ｘ １０−’ＭＭ程度好ま
しい。 − （５） 。 −−、測定試料中の過酸化物質 と定吐的に反応して発光する。斯くして生成する発光ス
ペクトルは通常の光量子針数器（フォトンカウンター）
にて計測される。
当該発光反応において、反応系のＩ）Ｈは特に制限され
ないが、一般にアルカリ領域において、特にｐＨ１ｏ〜
１２程度が至適であり、これは通常の公知のアルカリ、
酸及び／又は緩衝液等により調製される。例えば、水酸
化す） ＩＪウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、
炭酸カリウム、アンモニア等の塩基；塩酸、硫酸、リン
酸、酢酸、コハク酸等の酸；及びリン酸緩衝液、酢酸緩
衝液、フタル酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が用いられる。
ないが、一般にアルカリ領域において、特にｐＨ１ｏ〜
１２程度が至適であり、これは通常の公知のアルカリ、
酸及び／又は緩衝液等により調製される。例えば、水酸
化す） ＩＪウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、
炭酸カリウム、アンモニア等の塩基；塩酸、硫酸、リン
酸、酢酸、コハク酸等の酸；及びリン酸緩衝液、酢酸緩
衝液、フタル酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が用いられる。
また、反応温度も特に制限はないが、一般には０〜５０
℃、好ましくは２０〜３７℃程度において行われる。
℃、好ましくは２０〜３７℃程度において行われる。
斜上の如（、本発明方法によれば、極めて簡単な操作で
測定試料中の過酸化物質を迅速かつ正確に測定すること
ができる。更に、標準過酸化物質（６） ヘの発光抑制度合を測定することにより、未知物質の抗
酸化能を測定することもできる。
測定試料中の過酸化物質を迅速かつ正確に測定すること
ができる。更に、標準過酸化物質（６） ヘの発光抑制度合を測定することにより、未知物質の抗
酸化能を測定することもできる。
本発明の測定法を実施するためには、該試薬をキットと
して調製しておくのが好ましく、このキットには牛血清
及び被酸化性発光試薬を含有せしめる。牛血清は凍結乾
燥品であってもよく、この場合にはこれを溶かす溶媒を
含ませるのが好ましい。更にまた、必要に応じて、ｐＨ
調整のだめの緩衝液、通常の安定化剤、保存剤等を含ま
せることもできる。
して調製しておくのが好ましく、このキットには牛血清
及び被酸化性発光試薬を含有せしめる。牛血清は凍結乾
燥品であってもよく、この場合にはこれを溶かす溶媒を
含ませるのが好ましい。更にまた、必要に応じて、ｐＨ
調整のだめの緩衝液、通常の安定化剤、保存剤等を含ま
せることもできる。
次に実施例を挙げて説明するが、本発明はこれに限定さ
れるものではない。
れるものではない。
実施例１
発光試薬としてルミノール、標準物質としてクメンハイ
ドロパーオキサイド（ＣＨＰ）を用い、以下の操作によ
り触媒の比較検討を行った。
ドロパーオキサイド（ＣＨＰ）を用い、以下の操作によ
り触媒の比較検討を行った。
■ 各種濃度のＣＨＰ水溶液０．２ｄに下記触媒１ｖｒ
１％０．５ｍＭルミノールの０．ＩＮ水酸化ナトリウム
水溶液ｌ ｍｌを加え、常温にてフォトンカウンター（
Ｒ６４９Ｓ ｉ浜松フオトニクス社）にて発（７） 光量を測定した。
１％０．５ｍＭルミノールの０．ＩＮ水酸化ナトリウム
水溶液ｌ ｍｌを加え、常温にてフォトンカウンター（
Ｒ６４９Ｓ ｉ浜松フオトニクス社）にて発（７） 光量を測定した。
触媒；
０ＦＣ８（ギプコ社） ２０ｖ／ｖ％水溶液０凍結乾燥
後蒸留水にて複 元した上記ＦＣ８２０ｖ／ｖチ水溶液 ０Ｃ８（ギプコ社） ２０ｖ／ｖ％水溶液０健康成人よ
り常法通り採 取した血清（Ｈ８） ２０ｖ／ｖチ水溶液０ＣＩＩＳＯ
４１ｍＭ水溶液 ｏｌｉ’ｅ（’ｇ３ １ ｍＭ水溶液 ｏＫｓＦ ｅ （ＣＮ）ｅ １ ｍＭ水溶液０西洋ワサ
ビパーオキシダ ーゼ（ＨＲＰ Ｉシブマ社） ４ ｎＭ水溶液その結果
を第１表に示す。
後蒸留水にて複 元した上記ＦＣ８２０ｖ／ｖチ水溶液 ０Ｃ８（ギプコ社） ２０ｖ／ｖ％水溶液０健康成人よ
り常法通り採 取した血清（Ｈ８） ２０ｖ／ｖチ水溶液０ＣＩＩＳＯ
４１ｍＭ水溶液 ｏｌｉ’ｅ（’ｇ３ １ ｍＭ水溶液 ｏＫｓＦ ｅ （ＣＮ）ｅ １ ｍＭ水溶液０西洋ワサ
ビパーオキシダ ーゼ（ＨＲＰ Ｉシブマ社） ４ ｎＭ水溶液その結果
を第１表に示す。
以下余白
（８）
（９）
第１表より、触媒として牛血清を使用した場合は標準物
質の濃度に依存した発光量を示し、その測定が可能であ
ることが判る。
質の濃度に依存した発光量を示し、その測定が可能であ
ることが判る。
またＣ８に比しＦｅ８はブランク（ＣＨＰ濃度−〇）の
発光量が少く、より好ましいものである。尚ＣＩＪＳＯ
４、ＦｅＣ右、 Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）ａ及びＨＲＰは５０
０ｎモル／Ｋｌ以下の標準物質濃度ではいずれもブラン
クとの差がみられず、またＨ８については反応液の白濁
化がみられ、発光量の変動が大きく、いずれも触媒とし
て不適であることが判る。
発光量が少く、より好ましいものである。尚ＣＩＪＳＯ
４、ＦｅＣ右、 Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）ａ及びＨＲＰは５０
０ｎモル／Ｋｌ以下の標準物質濃度ではいずれもブラン
クとの差がみられず、またＨ８については反応液の白濁
化がみられ、発光量の変動が大きく、いずれも触媒とし
て不適であることが判る。
■ 各種濃度のＣＨＰ水溶液２００μｍに下記触媒１ｄ
及び０．１ ｍＭ ／＋／ミノールの０． Ｉ Ｎ水酸
化す） ＩＪウム水溶液１−を加え、実施例１と同様に
して発光量を測定した。
及び０．１ ｍＭ ／＋／ミノールの０． Ｉ Ｎ水酸
化す） ＩＪウム水溶液１−を加え、実施例１と同様に
して発光量を測定した。
触媒；
０ＦＣ８（ギブコ社） ５ｖ／ｖ％水溶液Ｏヘモグロビ
ン（和光純薬社） ＩＸＩｌＸｌｏ−６ｆ水溶液０ヘミ
ン（和光純薬社） ２ｘｔＯ−’Ｐ、Ａ！！水溶液０チ
トクロームＣ（シグマ社） ２Ｘ１０−’ＩＦ、４水溶
液（１０） その結果を第２表に示すっ 第２表 第２表より、触媒としてＦｅ２を用いる場合には低濃度
の標準物質濃度においてもブランクとの発光量の差が得
られ、かつ極めて定量的であることが判る。
ン（和光純薬社） ＩＸＩｌＸｌｏ−６ｆ水溶液０ヘミ
ン（和光純薬社） ２ｘｔＯ−’Ｐ、Ａ！！水溶液０チ
トクロームＣ（シグマ社） ２Ｘ１０−’ＩＦ、４水溶
液（１０） その結果を第２表に示すっ 第２表 第２表より、触媒としてＦｅ２を用いる場合には低濃度
の標準物質濃度においてもブランクとの発光量の差が得
られ、かつ極めて定量的であることが判る。
実施例２
Ｆｅ２を用い至適触媒濃度を検討した。Ｆ’Ｃ８（ギプ
コ社）は再蒸留水（Ｎ２置換）で種々濃度に調製した。
コ社）は再蒸留水（Ｎ２置換）で種々濃度に調製した。
サンプルとして５００ｎモル／ＷＬｌのＣＨＰ水溶液の
０．２１ｎｔ又は１．０Ｍを用い、これに上記ＦＣ５Ｉ
７）希釈系列の１ｒＲ１を加え、次いで０．５ｍＭルミ
ノールの０．ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液１ｄを加え、
以下前記実施例１と同様にして発光量を測定した。その
結果を第１図及び第２図に示す。
０．２１ｎｔ又は１．０Ｍを用い、これに上記ＦＣ５Ｉ
７）希釈系列の１ｒＲ１を加え、次いで０．５ｍＭルミ
ノールの０．ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液１ｄを加え、
以下前記実施例１と同様にして発光量を測定した。その
結果を第１図及び第２図に示す。
第１図において、タテ軸はフォトンカウント（２分間の
積算値）の対数を、ヨコ軸は使用したＦＣ８水溶液の濃
度を示し、各マークは次のものを示す。
積算値）の対数を、ヨコ軸は使用したＦＣ８水溶液の濃
度を示し、各マークは次のものを示す。
〇−〇： サンプル０．２ｒｎｌ使用の系・−・： 上
記ブランク（ＣＨＰ濃度−〇）△−△： サンプル１Ｍ
使用の系 ムーム： 上記ブランク また、第２図において、タテ軸はブランク値を引いたフ
ォトンカウント（２分間の積算値）を、ヨコ軸はＦＣ８
濃度（上記に同じ）奪示し、各マークは次のものを示す
。
記ブランク（ＣＨＰ濃度−〇）△−△： サンプル１Ｍ
使用の系 ムーム： 上記ブランク また、第２図において、タテ軸はブランク値を引いたフ
ォトンカウント（２分間の積算値）を、ヨコ軸はＦＣ８
濃度（上記に同じ）奪示し、各マークは次のものを示す
。
○−○寡 サンプルｌ ｍｌ使用の系
Δ−△： サンプル０．２ ｄ使用の系第１及び第２図
より明らかな如く、反応系の最終触媒（Ｆｅ２）濃度が
約１．５チで発光量がプラトーに達し、ブランクとの差
が大きい。従って触媒量は最終１．５チ以上程度が適当
緻と考えられる。
より明らかな如く、反応系の最終触媒（Ｆｅ２）濃度が
約１．５チで発光量がプラトーに達し、ブランクとの差
が大きい。従って触媒量は最終１．５チ以上程度が適当
緻と考えられる。
実施例３
測定系のｐｉ（による影響を検討した。それぞれ最終濃
度として、Ｆｅ１２．１チ、ルミノール０．２３ｍＭ％
ＣＨＰ４５．５ ｎモル／ｄとなる様に、Ｎａ２ＣＯ８
−ＮａＨＣＯ８緩衝液を用いて、各種ｐＨに調製し、実
施例１と同様にして発光量を測定した。その結果を第３
表に示す。
度として、Ｆｅ１２．１チ、ルミノール０．２３ｍＭ％
ＣＨＰ４５．５ ｎモル／ｄとなる様に、Ｎａ２ＣＯ８
−ＮａＨＣＯ８緩衝液を用いて、各種ｐＨに調製し、実
施例１と同様にして発光量を測定した。その結果を第３
表に示す。
以下余白
（１３）
第 ３ 表
第３表より、測定系のｐＨにかかわらず、ブランクとの
十分な発光量の差が得られるが、ｐＨが高値である＃ま
と発光量の増大及び差が大きくなり、より適しているこ
とが判る。
十分な発光量の差が得られるが、ｐＨが高値である＃ま
と発光量の増大及び差が大きくなり、より適しているこ
とが判る。
実施例４
発光試薬の至適濃度を検討した。
■ 標準物質、リルン酸ハイドロパーオキサイド（ＬＨ
Ｐ）の調製： リルン酸（東京化成社）に、０．２ Ｍホウ酸（１４） 緩衝液（ｐＨ９、Ｏ）内にて、リポキシダーゼ（シグマ
社）を添加し、水冷下に５分間酵素反応させ、塩酸にて
反応を停止し、エーテル抽出後減圧濃縮を行った。ＴＬ
Ｃにて純度を確認後シリカゲルカラムクロマトにより精
製し、−８０℃に保存した。
Ｐ）の調製： リルン酸（東京化成社）に、０．２ Ｍホウ酸（１４） 緩衝液（ｐＨ９、Ｏ）内にて、リポキシダーゼ（シグマ
社）を添加し、水冷下に５分間酵素反応させ、塩酸にて
反応を停止し、エーテル抽出後減圧濃縮を行った。ＴＬ
Ｃにて純度を確認後シリカゲルカラムクロマトにより精
製し、−８０℃に保存した。
■ 種々濃度のルミノールの０．ＩＮ水酸化す） ＩＪ
ウム水溶液１真ｌ、５チＦＣ８水溶液１ｍＡ’、サンプ
ルとして上記■のＬＨＰ１ｎモル／ｄ水溶液Ｏ１２ｍｌ
を用い実施例１と同様にして発光量を測定した。その結
果を第３図に示す。第３図中、タテ軸はフォトンカウン
ト（２分間の積算値）を、ヨコ軸は使用したルミノール
濃度を示す。
ウム水溶液１真ｌ、５チＦＣ８水溶液１ｍＡ’、サンプ
ルとして上記■のＬＨＰ１ｎモル／ｄ水溶液Ｏ１２ｍｌ
を用い実施例１と同様にして発光量を測定した。その結
果を第３図に示す。第３図中、タテ軸はフォトンカウン
ト（２分間の積算値）を、ヨコ軸は使用したルミノール
濃度を示す。
該図より、反応系の最終ルミノール濃度が約５×１０−
６〜５Ｘ１０”−’Ｍ程度において最高発光を示し、至
適濃度と考えられる。
６〜５Ｘ１０”−’Ｍ程度において最高発光を示し、至
適濃度と考えられる。
実施例５
グルタチオンパーオキシデース（ＧＳＨ−ＰＸ；Ｊ、Ｌ
Ｃ、、２４５，３６３２（１９７０）：Ｉ又はスーパー
オキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ＋ Ｊ、 Ｂ、 Ｃ
，。
Ｃ、、２４５，３６３２（１９７０）：Ｉ又はスーパー
オキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ＋ Ｊ、 Ｂ、 Ｃ
，。
２４６．２８７５ （１９７１） ）添加による本測定
法への影響を検討した。０．２ Ｍ りン酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７、以下ＰＢと略す）２５０μ形に、３．２ Ｘ
１０−’Ｍ ＬＨＰ水溶液５０μ形を加え、これに種々
濃度の５ＯＤ（シグマ社）水溶液１００μ形を加えるか
、又は４ ｍＭグルタチオン（和光純某社）水溶液１０
０μ看及び種々濃度のＧＳＨ−Ｐｘ（べ一すンガーマン
ハイム社）水溶液１００局を加えて３７℃、５分間イン
キュベートする。この２００μ形にメタノールＩＲ１を
加え、遠心（３０００ｒｐｍ。
法への影響を検討した。０．２ Ｍ りン酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７、以下ＰＢと略す）２５０μ形に、３．２ Ｘ
１０−’Ｍ ＬＨＰ水溶液５０μ形を加え、これに種々
濃度の５ＯＤ（シグマ社）水溶液１００μ形を加えるか
、又は４ ｍＭグルタチオン（和光純某社）水溶液１０
０μ看及び種々濃度のＧＳＨ−Ｐｘ（べ一すンガーマン
ハイム社）水溶液１００局を加えて３７℃、５分間イン
キュベートする。この２００μ形にメタノールＩＲ１を
加え、遠心（３０００ｒｐｍ。
５分）後、上清を採取してこれをサンプルとする。
サンプル２００μｆｆｌ、ｌＸｌ０”−’Ｍルミノール
の０、ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液１ ｔｄ 、 ５
ｖ／ｖ％ＦＣ８水溶液１ｄを用いて、前記実施例１と同
様にして発光量を測定した。Ｇ Ｓ Ｈ−Ｐｘ添加の結
果を第４図にＳＯＤ添加の結果を第５図に示す。
の０、ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液１ ｔｄ 、 ５
ｖ／ｖ％ＦＣ８水溶液１ｄを用いて、前記実施例１と同
様にして発光量を測定した。Ｇ Ｓ Ｈ−Ｐｘ添加の結
果を第４図にＳＯＤ添加の結果を第５図に示す。
第４図中、タテ軸はＧ ８ Ｈ−Ｐｘ濃度が０のときの
フォトンカウントを１００優とした時の発光比（罰を、
ヨコ軸は、上記Ｇ Ｓ Ｈ−Ｐｘ 水溶液の濃度を示し
、各マークは次のものを示す。
フォトンカウントを１００優とした時の発光比（罰を、
ヨコ軸は、上記Ｇ Ｓ Ｈ−Ｐｘ 水溶液の濃度を示し
、各マークは次のものを示す。
・−・Ｉ ＧＳＨ−Ｐｘ添加群
０−ｏＨ１ｏｏ°Ｃ，５分加熱処理して失活させたＧＳ
ｆ（−Ｐｘ添加群 また第５図中、タテ軸はＳＯＤ濃度が００ときのフォト
ンカウントを１００係とした時の発光比（チ）を、ヨコ
軸は上記ＳＯＤ水溶液の濃度を示し、各マークは次のも
のを示す。
ｆ（−Ｐｘ添加群 また第５図中、タテ軸はＳＯＤ濃度が００ときのフォト
ンカウントを１００係とした時の発光比（チ）を、ヨコ
軸は上記ＳＯＤ水溶液の濃度を示し、各マークは次のも
のを示す。
・−・、ＳＯＤ添加添
加−○； １００℃、５分加熱処理して失活させたＳＯ
Ｄ添加添 加−図よりハイドロパーオキサイドの分解酵素であるＧ
Ｓ Ｈ−Ｐｘ 添加により発光量は消失し、本測定系
はハイドロパーオキサイドを測定していることが判る。
Ｄ添加添 加−図よりハイドロパーオキサイドの分解酵素であるＧ
Ｓ Ｈ−Ｐｘ 添加により発光量は消失し、本測定系
はハイドロパーオキサイドを測定していることが判る。
また第５図より、スーパーオキサイド（０□）消去酵素
であるＳＯＤ添加により発光が抑制されることから、こ
の発光はＣを介した発光であることが判る。
であるＳＯＤ添加により発光が抑制されることから、こ
の発光はＣを介した発光であることが判る。
実施例７ （検量線の作成）
■ Ｆｅ２（ギプコ社）を５６９Ｃ，３０分非動化後、
０．９係塩化ナトリウム水溶液に対して４時（１７） 同透析（セロファンチューブ；和光純某社）したのち、
凍結乾燥した。
０．９係塩化ナトリウム水溶液に対して４時（１７） 同透析（セロファンチューブ；和光純某社）したのち、
凍結乾燥した。
■ 標準物質として、前記実施例４−■で得たＬＨＰを
用い、検量線を作成した。ＬＨＰ水溶液０．２ ｍｌに
、上記■（Ｄ Ｆ ＣＳ （Ｄ ５ ｖ／ｖ ％ 水溶
Ｗｌｄ及びＩ Ｘ １０−’ Ｍルミ／−ルノ０． Ｉ
Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１ｗＬｔを加え、実施例１
と同様にして発光量を計測した。その結果を第６図に示
す。
用い、検量線を作成した。ＬＨＰ水溶液０．２ ｍｌに
、上記■（Ｄ Ｆ ＣＳ （Ｄ ５ ｖ／ｖ ％ 水溶
Ｗｌｄ及びＩ Ｘ １０−’ Ｍルミ／−ルノ０． Ｉ
Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１ｗＬｔを加え、実施例１
と同様にして発光量を計測した。その結果を第６図に示
す。
第６図中、タテ軸はブランク値を引いたフォトンカウン
ト（２分間の積算値）を、ヨコ軸は使用したＬＨＰ濃度
を示す。該図に示す如く、ごく微量の標準物質に対して
も極めて良好な直線性が得られ、本測定法が高感度及び
良好な定量性を有することが判る。
ト（２分間の積算値）を、ヨコ軸は使用したＬＨＰ濃度
を示す。該図に示す如く、ごく微量の標準物質に対して
も極めて良好な直線性が得られ、本測定法が高感度及び
良好な定量性を有することが判る。
実施例８
マウス、ラット又はラビットより常法に従い採取したデ
キストランチャコール処理血漿１００ ｐ６に、ＰＢ２
００ＩＬｅを加え、これに２ ｍＭグルタチオン水溶液
１００ μＡ及び、０又は／ ｍｙ ／ ｍｌ（１８） Ｇ Ｓ Ｈ−ＰＸ水溶液１００ μｍｅを加えて、３７
°Ｃで５分間インキュベートする。この２００μ２にメ
タノール１ ｍｌを加え、遠心（３０００ｒｐｍ、５・
分）後上清を採取してサンプルとする。
キストランチャコール処理血漿１００ ｐ６に、ＰＢ２
００ＩＬｅを加え、これに２ ｍＭグルタチオン水溶液
１００ μＡ及び、０又は／ ｍｙ ／ ｍｌ（１８） Ｇ Ｓ Ｈ−ＰＸ水溶液１００ μｍｅを加えて、３７
°Ｃで５分間インキュベートする。この２００μ２にメ
タノール１ ｍｌを加え、遠心（３０００ｒｐｍ、５・
分）後上清を採取してサンプルとする。
実施例７において、標準物質のかわりに、上記サンプル
２００μ２を用いて、同様に発光量を測定した。結果を
下記第４表に示す。
２００μ２を用いて、同様に発光量を測定した。結果を
下記第４表に示す。
第 ４ 表
第４表より、該測定系により血清過酸化脂質量、ことに
ハイドロ型過酸化脂質の測定が可能であることが判る。
ハイドロ型過酸化脂質の測定が可能であることが判る。
実施例９
健常者及び高脂血症患者の血清過酸化脂質量を測定した
。
。
常法に従い採取した血漿０．５−にデキストランチャコ
ール５ダを加え、室温にて３０分放置後濾過する。炉液
０．２ ｄにメタノール１ｄを加え、遠心分離（３００
０ｒｐｍ ｘ １０分）して上清を採取する。この上清
０．２ Ｆｎｌを前記実施例７の標準物質のかわりに使
用して、以下同様にして発光量を測定した。ｔ＃Ｊ同一
サンプル（上溝）つきＴＢＡ法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｍ
ｅｄ、 １５５２１２． （１９７６） ］に従い測定
した。その結果を下記第５表に示す。第５表においては
、過酸化脂質量を前記実施例７で得た検量線よりめたＬ
ＨＰ換算量として示す。
ール５ダを加え、室温にて３０分放置後濾過する。炉液
０．２ ｄにメタノール１ｄを加え、遠心分離（３００
０ｒｐｍ ｘ １０分）して上清を採取する。この上清
０．２ Ｆｎｌを前記実施例７の標準物質のかわりに使
用して、以下同様にして発光量を測定した。ｔ＃Ｊ同一
サンプル（上溝）つきＴＢＡ法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｍ
ｅｄ、 １５５２１２． （１９７６） ］に従い測定
した。その結果を下記第５表に示す。第５表においては
、過酸化脂質量を前記実施例７で得た検量線よりめたＬ
ＨＰ換算量として示す。
以下余白
第５表
＊１ ｎモ＃／ＩＩｌｊＭＤＡ換算量
＊２ ｎモル／ｌｌｌ１ＬＨＰ換算量
第１図及び第２図は牛血清濃度と発光量の関係を、第３
図は被酸化性発光試薬（ルミノール）濃度と発光量の関
係を、第４図はグルタチオンパーオキシデースの添加に
よる本発明測定法への影響を、第５図はスーパーオキサ
イドディスムターゼの添加による本発明測定法の影響を
、第６図は本発明測定法により過酸化物質を測定すると
きの検量線を示すものである。 （２１） −Ｉ／：６４’：４−１’乙 ＧＳＨ−ＰＸ 濃度（ｍｙ／ｍ１） ＳＯＤ 磁度（■／−）
図は被酸化性発光試薬（ルミノール）濃度と発光量の関
係を、第４図はグルタチオンパーオキシデースの添加に
よる本発明測定法への影響を、第５図はスーパーオキサ
イドディスムターゼの添加による本発明測定法の影響を
、第６図は本発明測定法により過酸化物質を測定すると
きの検量線を示すものである。 （２１） −Ｉ／：６４’：４−１’乙 ＧＳＨ−ＰＸ 濃度（ｍｙ／ｍ１） ＳＯＤ 磁度（■／−）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、測定試料中の過酸化物質量を、その酸化能によって
惹起される化学発光により測定する方法において、その
系に触媒として牛血清を使用することを特徴とする過酸
化物質の測定方法。 ２、過酸化物質が、生体試料中の過酸化脂質である特許
請求の範囲第１項記載の測定方法。 ３、 牛血清の量が、反応系の１．５〜１（ｌである特
許請求の範囲第１項又は第２項記載の測定方法。 ４、牛血清及び被酸化性発光試薬を含有する過酸化物質
測定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13896583A JPS6031057A (ja) | 1983-07-29 | 1983-07-29 | 過酸化物質の測定方法および測定用キツト |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13896583A JPS6031057A (ja) | 1983-07-29 | 1983-07-29 | 過酸化物質の測定方法および測定用キツト |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6031057A true JPS6031057A (ja) | 1985-02-16 |
Family
ID=15234316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13896583A Pending JPS6031057A (ja) | 1983-07-29 | 1983-07-29 | 過酸化物質の測定方法および測定用キツト |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6031057A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52110563A (en) * | 1976-03-15 | 1977-09-16 | Hitachi Ltd | Hexagonal boride cathode |
| EP0175577A2 (en) * | 1984-09-21 | 1986-03-26 | Jonathan L Kiel | Microchemiluminescent assay system |
| JPH03262498A (ja) * | 1990-03-12 | 1991-11-22 | Nichirei Corp | 魚介類の鮮度測定方法及び測定装置 |
-
1983
- 1983-07-29 JP JP13896583A patent/JPS6031057A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52110563A (en) * | 1976-03-15 | 1977-09-16 | Hitachi Ltd | Hexagonal boride cathode |
| JPS6030054B2 (ja) * | 1976-03-15 | 1985-07-13 | 株式会社日立製作所 | 熱陰極 |
| EP0175577A2 (en) * | 1984-09-21 | 1986-03-26 | Jonathan L Kiel | Microchemiluminescent assay system |
| EP0175577A3 (en) * | 1984-09-21 | 1987-11-25 | Jonathan L Kiel | Microchemiluminescent assay system |
| JPH03262498A (ja) * | 1990-03-12 | 1991-11-22 | Nichirei Corp | 魚介類の鮮度測定方法及び測定装置 |
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