JPS6030699A - 凝固因子の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、凝固因子を簡便な操作で正確に測定すること
ができるようにした凝固因子の測定法に関する。

現在、血液凝固、線溶における検査法としてフィブリン
塊形成時間を指標として部分トロンボプラスチン時間試
験、活性化部分トロンボプラスチン時間試験、一段法プ
ロトロンビン時間試験などの方法が用いられている。ま
た、近年、自動分析機の急速な普及に伴い、合成ペプチ
ド基質を用いた測定法が次々と開発された。

血液凝固、線溶において臨床的意義の高い凝固因子とし
ては、アンチトロンビンｍ（以下ＡＴ−■と略称するこ
とがある）、プラスミノーゲン、ヘパリン、α２−アン
チプラスミン、プレカリクレイン、第Ｘ因子、第■因子
、第■因子、α２−マクログロブリン、エンドトキシン
などが知られている。測定する凝固因子に応じて第１表
（ＣＬＩＮＩ　ＣＡＬ　ＣＨＥＭＩ　５ＴＲＹ、Ｖｏ　
１．２９゜Ｎｏ、２．１９８３．２２６頁、Ｊａｗｅｄ
　Ｆａｒｅｅｄ　ｅｔ　ａｌ）に示した如く各種の合成
基質が開発されている。これらの基質としてはｐ−ニト
ロアニリン（以下１）ＮＡと略称することがある）で修
飾した合成ペプチド（以下Ｒ−ｐＮＡと略称することが
ある）が一般的である。

第１表 第１表（続き−１） 第１表（続き−２） 第１表（続き−３） 注）上表中、Ｒゝ−ＣＨ，又はＨ 従来法においては、基質に酵素を作用させることによっ
て遊離するｐ−ニトロアニリンを４０５〜４１０ｎｍで
比色することによって凝固因子を測定するものである。

以下に凝固因子を測定する従来の一般的な方法を説明す
る。

（１）アンチトロンビンＩＩＩ　（ＡＴ−ＩＩＩ）ヘパ
リン＋ＡＴ−１［［−〉活性型Ａ　Ｔ−ＩＩＩトロンビ
ン＋活性型ＡＴ−ＩＩ［ トロンビン活性型ＡＴ−ＩＩＩ複合体 士残存トロンビン 残存トロンビン＋Ｒ−ｐＮＡ ＲＣＯＯＨ＋ｐＮＡ Ｒ−ｐＮＡ　（Ｓ−２２３８，ＣｈｒｏｍｏｚｙｍＴＨ
，ＣＢ５３４．４７） （２）プラスミノーゲン プラスミノーゲン＋ストレプトキナーゼ−〉プラスミノ
ーゲン−ストレプトキナーゼ複合体（Ｐ−３Ｋ） −３Ｋ Ｒ−ｐ　Ｎ　Ａ　ＲＣＯＯＨ＋　ｐ　Ｎ　ＡＲ−ｐＮＡ
　（Ｓ−２２５１＋　ＣｈｒｏｍｏｚｙｍＰＬ、ＣＢ５
３０．４１） （３）アンチプラスミン（ｅｘｔ　Ａ　Ｐ　）プラスミ
ン十−一−ＡＰ プラスミン−ｆｆ、−ＡＰ＋残存プラスミン残存プラス
ミン＋Ｒ−ｐＮＡ ＲＣＯＯＨ＋ｐＮＡ Ｒ−ｐＮＡ　（Ｓ　２２５１．ＣｈｒｏｍｏｚｙｍＰＬ
、ＣＢ５３０．４１） （４）ヘパリン ヘパリフ　＋　Ａ　７−［１−卜へバリアーＡＴ−ＩＩ
ヘパリン−ＡＴ−ＩＩＩ十活性型Ｘａ−〉ヘパリン−Ａ
Ｔ−ｍ−Ｘａ＋残存Ｘａ 残存Ｘａ　＋Ｒ−ｐＮＡ　−〉ＲＣＯＯＨ＋ｐＮＡＲ−
ｐＮＡ　（Ｓ−２２２２，３−２３３７，ＣＢ５３１．
３９） （５）Ｘ因子 アクチベータ Ｘ因子　Ｘａ Ｘ　ａ　＋　Ｒ−ｐ　Ｎ　Ａ−〉ＲＣＯＯＨ＋　ｐ　Ｎ
　ＡＲ−ｐＮＡ　（Ｓ−２２２２，Ｓ−２３３７，ＣＢ
５３１．３９） （６）■因子（プロトロンビン） アクチベータ ■因子　１１ａ　（）ロンビン） ＩＩ　ａ　＋Ｒ−ｐＮＡ−−→ＲＣＯＯＨ＋　ｐ　Ｎ　
ＡＲ−ｐＮＡ　（Ｃｈ　ｒ　ｏｍｏ　ｚ　ｙｍＴＨ，’
ｒ−２２３８、ＣＢ５３４．４７） （７）プリカリクレイン アクチベータ プリカリクレイン　カ１ツタレイン カリクレイン＋Ｒ−１）ＮＡ　−−→ ＲＣＯＯＨ＋ｐＮＡ Ｒ−ｐＮＡ　（Ｓ　２３０２．ＣｈｒｏｍｏｚｙｍＰＫ
、ＣＢ５３３．２７） （８）Ｘａ因子 ｘａ因子＋Ｒ−１）ＮＡ→ＲＣＯＯＨ＋ｐＮＡＲ−ｐＮ
Ａ　（Ｓ−２３３７，Ｓ−２２２２，ＣＢ５３１．　３
９） （９）α２−マクログロブリン トリプシン＋αえ−マクログロフ゛リンーーー→αえ一
マクログロブリンートリプシン 」残存トリプシン 残存トリプシン＋アプロチニンーーーー→トリプシン−
アプロチニン ５−マクログロブリン−トリプシン Ｒ−ｐＮＡ　−一一一一一一−□−−一一一−−−−一
−−）ＲＣＯＯＨ＋ｐＮＡ Ｒ−ｐＮＡ　（Ｃｈ　ｒ　ｏｍｏ　ｚ　ｙｍ−Ｔｒ　ｙ
）（１０）エンドトキシン カブトガニ血球抽出成分（ライセード）と合成基質（Ｂ
ｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を組み合わせて次の反
応によって測定する。

以下余白 エンドトキシン ↓ ｐＮＡ 以上の如き従来の反応におし）て、む）ずれも最糸冬的
に遊離するｐ−ニトロアニリンを４０５〜４１Ｑｎｍで
測定することによって凝固因子の活噌生をメチいる。ｐ
−ニトロアニリンの測定の仕方としては、Ｒａｔｅ　Ａ
ｓ５ａｙ法、ＥｎｄＰ。

ｉｎｔ　Ａｓ５ａｙ法の２通りの方法がある。自動分析
機にのせる場合には、Ｅｎｄ　Ｐｏ１ｎｔＡｓｓａｙ法
よりＲａｔｅ　Ａｓ５ａｙ法の方が好ましい。用手法の
場合には、Ｅｎｄ　Ｐｏ１ｎｔ法が使い易い。ところが
、Ｅｎｄ　Ｐｏ１ｎｌ　Ａｓ５ａｙ法の場合、自動分析
機にしても用手法にしてもいずれも血漿ブランクをとら
なければならない。というのは、ｐ−ニトロアユ１Ｊン
カ（黄色のため４０５〜４１０ｎｍで測定しなしすれｂ
ｉならず、この波長領域では血ジに中のビリルビンやヘ
モグロビンなどの有色物質の影響を受しナ、また乳びの
影響を受けやすいためである。

本発明は、上記の点に鑑み発明されたもので、ｐ−二）
ロアニリン及びその誘導体をジアゾ反応を用いて発色さ
せることによって、上述した有色物質の影響を回避し、
凝固因子を一層正確に測定できるようにした凝固因子の
測定法を提供することを目的とするものである。

本発明の第１の要旨は、ｐ−ニトロアニリン及びその誘
導体を修飾した基質を用いて凝固因子を測定する方法に
おいて、基質より遊離するｐ−ニトロアニリン及びその
誘導体をジアゾ化せしめて発色させ比色定量することを
特徴とする凝固因子の測定法に存する。

本発明の第２の要旨は、ｐ−ニトロアニリン及びその誘
導体を修飾した基質を用いて凝固因子を測定する方法に
おいて、酸性条件下で亜硝酸塩を不活性化させるととも
に基質より遊離するｐ−ニトロアニリン及びその誘導体
をジアゾ化せしめて発色させ比色定置することを特徴と
する凝固因子の測定法に存する。

本発明方法においてジアゾ反応を行わせる際に用いられ
る亜硝酸塩としては、代表的には亜硝酸ナトリウムを用
いるが、その他の塩も用いうるちのである。

カンプリング成分は、生成したｐ−ニトロアニリンと酸
性条件下で反応して発色し、ジアゾ色素を生成するもの
であり、発色剤としての作用を果たすものである。この
カンプリング成分の具体例としては、特願昭５７−１０
５８６．４号にも記載したごとく下記のものが挙げられ
る。

ａ）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−３’　、５’　−ジメチルアニリン及びその
塩類（ＭＡＯ３） ｂ）Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチ
ルアニリン及びその塩類（ＭＡＰＳ）ｃ）Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−メタト
ルイジン及びその塩類（ＴＯＯ３＞ ｄ）Ｎ−Ｎ−ジエチルメタトルイジン ｅ）Ｎ−エチル−（３−メチルフェニル）−Ｎ゛−アセ
チルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）ｆ）Ｎ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル−メタトルイジン及びその塩類（ＥＳ
ＰＴ） ｇ）ジエチルアニリン及びその誘導体 ｈ）ジメチルアニリン及びその誘導体 １）Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミン誘導体 その他のカンプリング成分としては、特開昭５４−２５
８９２号、同５４−１３８４９４号、同５５−２０４７
１号、同５５１３１４００号、同５６−１８９６号、同
５６−３７５５６号、同５６−３７５５７号、同５６−
５５１９９号、同５６−６１９　り　９号、同５６−９
９４５４号、同５６−１３１３９８号、同５６−１３３
６６０号の各公報に開示されたものが使用可能である。

なお、活性メチレン化合物もカンプリング成分としての
通性を有する。

これらのカンプリング成分は酸性下で反応するものであ
るが、具体的には塩酸、酢酸、蓚酸などによってｐＨ１
〜３程度の範囲の条件に維持するのが好ましい。

亜硝酸塩を不活性化する物質としては、スルファミン酸
及びその塩類、スルファミン酸アンモニウム及び尿素な
どがある。この物質を添加するのは、過剰の亜硝酸塩を
不活性化又は除去するためである。この物質を添加しな
い場合には、過剰の亜硝酸塩が一度生成したアゾ色素に
結合し、時間の経過とともにアゾ色素の色を変え、発色
を変化させるため正確な測定が困難となってしまうもの
である。なお、発色後、測定時間を一定に定めれば、ス
ルファミン酸等を加えなくても正確な測定が可能なこと
は勿論である。

本願第２発明は、スルファミン酸等が亜硝酸塩を不活性
化又は潰す速度とカンプリング成分（発色剤）がｐ−ニ
トロアニリンのジアゾ化合物を結合する速度の差を巧藩
に利用して完成されたちのである。多くのカンプリング
成分（発色剤）はスルファミン酸等が亜硝酸塩を潰す前
に、ジアゾ化合物と反応してしまい、その後に残存する
過剰の亜硝酸塩がスルファミン酸等によって不活性化又
は消費されるので、亜硝酸塩の影響なしに正確な測定が
可能となるスルファミン酸等を添加した場合の発色後の
安定性は極めて良好である。

本発明方法の具体例を反応式で示せば次の通りである。

以下余白 アゾ色素（黄褐色〜赤色） 本発明方法によれば、以下のような不１１点カベ達成さ
れる。

■血漿ブランクは不要となる。ビリルビンやヘモグロビ
ン等の影響を受けず又乳びの影響も少ないからである。

■ジアゾ反応を用いるため非常に高感度である。

■高感度であるためセル容量に十分な液量とすることが
容易となった。

■従来法よりも基質及び酵素量を節約でき経済的である
。

■Ｒａｔｅ　Ａｓ５ａｙ法及びＥｎｄ　Ｐｏ１ｎｔ　７
１．５ｓａｙ法のいずれを用いても測定が容易である。

以下に実施例を挙げて本発明方法をさらに具体的に説明
する。

実施例１ 本実施例ではＡ　′Ｉ”　−Ｉ［［の測定について実験
した。

玉二二Ｕ良 トリス緩衝液（ｐ　Ｈ８、１）　−−−−−−−−−−
−−−−−−−１０ｍ　ＭＮ　ａ　ＣＡ　）−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−１００ｍ　ＭＣｈ　ｒ　ｏｍｏ　ｚ　ｙｍ
ＴＨ曲−−−−−−−−−−−−−０，４５ｍＭＮ　ａ
　Ｎ　（）ｚ　−・−−−−−−−−一曲−−−−−・
−−−−−−−−−−−−−−−−−−０、６ｇ　／　
ｊ２旦二」Ｉ良 ＭＡＯＳ　−−−−−一・−・−−一一−−−−−−−
・−・−−−−一−−・−−−−・−−０，６６ｇ／ｉ
ｔスルファミン酸−一−−−−−・−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−５゜５６ｍＭ非イオン
界面活性剤−・・−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−一−−・−・−−−−−一・−３％Ｒ・２液のｐＨ
は１．５であった。

−ゴガ」じ１１紅液 ヘバリンー−−−−−−−−−−−−−・−・−−−−
−−−−−−一−−−−・−一−−−−−・３０００Ｕ
＃トリス緩衝液（ｐ　Ｈ８、１）　−−−−−−−−−
−−−−−−−−１０ｍＭ上旦ｌ見ｌ液 トリス緩衝液（ｐ　Ｈ８、１）　−・−−−−−−−−
−−−−−−１０ｍＭＮ　ａ　ＣＩ！　−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−１００ｍ　Ｍトロンビンー−−一
−−−−−−−−−−−−−−−−−・・−・・・−・
−−−−−−−−−−−５００Ｕ　／β操作法 血漿をヘパリン緩衝液で希釈する。１０１倍希釈のもの
をＡＴ−Ｉ［１１００％濃度とする。

血漿５０μｌにトロンビン液１００μＪヲ加ｔ、３７℃
で５分間加温した。ついでＲ−１液を１ｍ７！加えて３
７℃で５分間加温した。次ぎにＲ・２液を３．０ｍＡ！
添加した。得られた発色した液を５００ｎｍで比色した
。吸収スペクトル、タイムコース及び検量線について検
討したが、いずれも良好な結果を示した。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の実施例の実験結果を示し、第１図は発色
後の吸収スペクトルを示すグラフ、第２図はタイムコー
スを示すグラフ及び第３図は検量線を示すグラフである
。 特許出願人　三光純薬株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｐ−ニトロアニリン及びその誘導体で修飾した基
   質を用いて凝固因子を測定する方法において、基質より
   遊離するｐ−ニトロアニリン及びその誘導体をジアゾ化
   せしめて発色させ比色定量することを特徴とする凝固因
   子の測定法。
2. （２）ｐ−ニトロアニリン及びその誘導体で修飾した基
   質を用いて凝固因子を測定する方法において、酸性条件
   下で亜硝酸塩を不活性化させるとともに基質より遊離す
   るｐ−ニドロア井リン及びその誘導体をジアゾ化せしめ
   て発色させ比色定置することを特徴とする凝固因子の測
   定法。