JPS60188400A - 組織蛋白ｐｐ↓１↓９およびその取得方法 - Google Patents

組織蛋白ｐｐ↓１↓９およびその取得方法

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JPS60188400A
JPS60188400A JP60022089A JP2208985A JPS60188400A JP S60188400 A JPS60188400 A JP S60188400A JP 60022089 A JP60022089 A JP 60022089A JP 2208985 A JP2208985 A JP 2208985A JP S60188400 A JPS60188400 A JP S60188400A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はｐｐ、、と呼ばれる組織蛋白およびそれを得る
ための方法に関する。ＰＰ１．は、特定の臓器の疾病の
診断のために、疾病の経過の監視または処置の監視のだ
めのマーカーとして組織および体液中のＰＰ、、の検出
および測定のために使用しうる抗血清の製造のために使
用することかできる。
組織蛋白負を含む蛋白質はこの技術分野においては勿論
既知であるがしかしいずれも＊　ＰＰ１９に対する以下
の性質は有していない。
本発明は以下の特性すなわち。
ａ）電気泳動移動りしかα１グロブリンとβ１グロブリ
ンとの間の領域にあり。
ｂ）等定点が４．６と５．４の間であり、Ｃ）沈降係数
８２０．Ｗが６．２５±０．２５８であり。
ｄ）超遠心により測定された分子量が３６，５００±４
，０００であり、そして ｅ）炭水化物分画が６．９±１．５　ｙ／１００ｙ　（
マン／−ス０．３±０．２＆／１００＃　、　７　：Ｉ
−ス０．２±０．１Ｊ／／１００＆’。
ガラクトース１．０±０．３．９／１０［］　、！／　
、グルコース０．４±０．２ｇ／１００９．　Ｎ−アセ
チルグルコサミン１２±０．３ｇ／１００，９．　Ｎ−
アセチルガラクトサミン０．１±０．１１１／１０ｃＪ
Ｆ／およびＮ−アセチルノイラミン酸０．７±０．３　
ｆｊ／１ｃＩＯｇ　）を有する蛋白質ＰＰ１．に関する
。
ｐｐｌ、のアミノ酸組成は以下の表の様に示される。
　５− アミノ酸　１００残基当り　変動係数 の残基数 リジン　８．６３　２．９２ ヒスチジン　１．７１　１４．２０’ アルギニン　２．７３　７．７１ アスパラキン酸　１１．５１　３．９９スレオニン　４
．２０　１５．７５ セリン　７．４８　２．２６ グルタミン酸　１１．０９　３．２０ プロリン　４．１２　１ａ２９ グリシン　６．８８　５．１２ アラニン　７．５６　５．５０ ε／スチン４　２．１０　２２．５８ かリン　７．４４　３．９８ メチオニン　２．３９　７．２４ イソロイシン　３．４０　６．３８ ０イシン　１０．０３　７．２９ チロシン　２．１９　２．９６ フエニルアラニン　５．０５　２．５８トリシトフアン
　１．４２　１５．４３６　− 以下はこの組織蛋白質を物件づける％徴を説、明するだ
めの詳細である。
電気泳動移動度はナトリ゛ウムジエチルバルビツレート
のＰＨ８，６の緩衝液および、ミクロゾーンＲ２００装
ｆｆ、　（ベツクマンインスツルーメンツ社）ヲ使用し
て、セルロースアセテートフィルム（サルトリウスから
提供されだ）十でのミクロモディフィケーションで６ｔ
ｌ＋定さＪｌだ。
等重点はＬＫＢ　（ストックホルム）によって提供され
だカラム（４４ｏｍｚ）を使用して測定された。アンホ
リン■（Ａｍｐｈｏｌ、ｉｎ■）混合物は４．０から６
．０のｐＨ範囲を有していた。
沈降係数は、ベックマンによって提供された分析用超遠
心機（スビンコ装置モデルＥ）において６０．００　Ｏ
ｒｐｍでダブルセクターセル中で。
２８０ｎｍでＵ、　Ｖ、スキャナーテクニックを使用し
て測定された。使用された溶媒は水であった。
蛋白質濃ルは２９／ｌであった。
分子側測定のために超遠心における沈降平衡法が使用さ
ねた。この目的のために蛋白質濃度は約１．０のＯ，Ｄ
、（光学濃度）に調整された。使用された溶媒は０．２
モル／ｌのＮａＣ１含有の、０．０５モル／ｌのリン酸
塩緩衝液（ｐＨ６，ａ）であった。
測定は９．００Ｏｒｐｍで実施された。記録は２８０ｎ
ｍで光知−スキャナーを使用して実施された。
炭水化物は以下の様にして測定された。グリコサイド結
合の加水分解の後、遊離された中性糖を陰イオン性イオ
ン交換体カラム上でボーレート錯体として分離しく　Ａ
ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２７．　（１９６９）。
５６７）、溶出液中でビシンコニン酔塩試薬混合物で染
色させ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　５６（１
９７３）。
４４［］）、そして内部標準としてラムノースを使用し
て定量的に測定した。アミノ糖はそれらのニンヒドリン
との反応により検出および測定された。ノイラミン酊含
％ｆ゛はウォレン法（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏ、ｇｙ、　Ｖｌ、　（１９６３）、　４６３−４
６５）により測定された、。
アミノ酸分析ばＡ、ｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、　、且、（１
９５８）１１８５の方法によって、ベックマン提供のマ
ルチクロムＢ液体クロマトグラフィーを使用して実施さ
れた。シスチンは蛋白質の遍ぎ酸による酸化（：Ａｎａ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　３０．　（１９５８）１１ＥＩ
５　）およびそれに続くクロマトグラフィー（Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。
２３８、　（１９６３）　２３５：）でシスティン酸と
して測定された。トリプトファン含量は旧ｏｃｈｅ＋ｎ
１ｓｔｒｙ、　６゜（１９１Ｓ７）、１９４８の方法に
よって直接Ｚ光度計測定により測定された。
免疫化学的方法を使用した神々の人臓器からの抽出物を
検査すると＋ＰＰ１９は、胎盤および胃中に比較的高濃
度で、そして牌臓中にはより低い濃度で検出された。そ
の他の人臓器例えば心　９− 臓、肺、肝臓、腎臓、副腎、結腸、直腸、空腸および子
宮抽出液はこの蛋白質を含有していないかまだは痕跡の
みを含有していた。免疫化学的にｐｐ、、と同一のまだ
はこれに密接に関連した蛋白質は猿胎盤抽出液中に検出
された。
従ってＰＰ１．の存在する人ならびに動物の臓器をこの
蛋白質の単離のために使用することができる。成熟人胎
盤はこの目的に対して特に適当である。その理由はそれ
らは大量に生理されそしてぞれらは充分に高い濃度でこ
の蛋白質を含有しているからである。
成熟人胎盤は平均約９０ｍ９のＰＰ、、を含有している
。希地溶液捷たは緩衝溶液で１例えば生理学的貴地溶液
でこの臓器を抽出した場合、胎盤中に含有されているＰ
Ｐ、、の約７５％たけか、溶解する。この蛋白質の残余
のものは組織中で膜に結合しているらしい。そり、て可
溶解ダン例えば１０− カオトロピック地溶液（ｃｂａｏｔｒｏｐｊｃ　５ａｌ
ｔ　ｓｒ＋１ｕｔ、１−ｏｎ）才たけ、更により良くｄ
６モル／を宋素溶液または０．５モル／ｌグリシンＨＣ
ｔ緩衝液（ｐＨ２，５）またはイオン性表面活性剤か使
用されるまで溶解しない。
従って、ＰＰ１．を冑るためには、＃３地浴液により胎
盤から得られた蛋白質抽出液か、丑たｄ、。
可溶性成分を洗去した後に可溶化（例えば６モル／を尿
素または酸グリシン緩衝液）によりその組織残渣から得
られた胎盤の蛋白質抽出液のどちらかを使用することが
可能である。この二の方法により得られた蛋白質ＶＪ免
疫化学的に同一でありそしてそれらの物理化学的性質も
すた本質的に合致している。
ＰＰ、、は次の性質を有しておりこれらはこれらの性質
に対して適当な方法を使用することによってその単離法
として使用することができる。
１）５〜８のｐＨおよび３０〜７０％飽和の硫酸アンモ
ニウムによって水性溶液から沈澱する。
２）　ｐＨ８〜９および４〜ＢＥ／ｌの塩基濃度の水溶
性アクリジン塩基例えば２−エトキシ−６，９−ジアミ
ノアクリジンラクテートによって本質的に沈澱する。ｐ
Ｈ６，（］および４　ｇ／ｌの塩基濃度では一部分しか
沈澱しない。
３）ｐＨ７では、生理学的食塩溶液または同様の希溶液
に、溶液１を当り２００ｍ１アルコール濃度までエタノ
ールを加えた場合、それは本質的に上澄中に残る。
４）ｐＨ７〜９の電気泳動により分離させた時。
イれはα、グロブリンとβ、グロブリンの中間の領域に
見出される。
５）等電点電気泳動においてそれは４．６〜５．４のｐ
Ｈ範囲にある。
６）セファデクス■使用のゲル済過においで、それは２
０．００　［１〜６０，０００の分子量の蛋白質の様に
行動する。
７）約０〜２　ｍｓの伝導度および約７から９のｐＨで
５弱塩基性イオン交換体例えばＤＴＤＡ、Ｆｉミセルロ
ースだはＤＥＡＥセファデクスにそれは結合しうる。
そしてこれはより濃厚な塩溶液（１０〜５０１／／１Ｎ
ａＣｔ溶液）により溶出されつる。
８）免疫吸着によって水性溶液中に富化させ。
そしてそれから単離させることができる。
従って本発明はまたＰＰ１．を得るだめのまたはこの蛋
白質を含有する臓器から希塩またはバッファー溶液を使
用して得られた抽出液を以下の方法の−またはそれＪＪ
−にのもの、即ち１ａ）　５から８のｐＨ範囲および３
０〜７０チ飽和の硫酸アンモニウムでＰＰ４．蛋白質を
沈澱させること。
１３− ｂ）ｐＨ８から９および４〜８１１／ｌの塩基濃度の水
溶性アクリジン塩基を使用して蛋白質ＰＰ、、を沈澱さ
せること。
ｃ）ｐＨ７で２００ｍ１／Ｌアルコールの最終濃度まで
エタノールを加えることにより付随する蛋白質の一部を
分離させること、 ｄ）プレパラテイーブゾーン電気泳動を実施してα１グ
ロブリンとβ１グロブリンの間の蛋白質分画を得ること
。
ｅ）ゲル沖過または超瀘過を実施して２０，０００〜６
０，０００の分子量範囲の蛋白質を得ること、ｆ）蛋白
質ＰＰ４．を剥塩基性イオン交換体に吸着させそして溶
出させること。
ｇ）免疫吸着法による富化。
にかけることを包含する方法に関する。
本発明はまたＰＰ１．を得るだめの、まだはそれを富化
させるための、′ １４− この蛋白質を含有する臓器を粉砕し１そ１〜ですべての
可溶性成分か除去されるまでこｔｌを生理学的食塩水で
洗い、その組織残渣を可溶止剤溶液例えば６モル／を原
素溶液または０５モル／ｌグリシンーｆ（Ｃｔ緩衝Ｍ、
（ｐＨ２，５）テ抽出し、そ１〜で中和および完全な透
析の後で得られた抽出液を前記ａ）〜ｇ）の方法の−１
たｔ；」それり上のものにかけることを包含する方法に
関する。
硫酸アンモニウムとは別に＋ＰＰ１９の沈澱に対しては
成分調製生化学で一般に使用されているその他の中性塩
を使用することも可能である。
アクリジン塩基とは別に１例えば蛋白質分画用に知られ
ているキノリン塩基の水浴性誘導体を本発明の方法の範
囲内で使用することも可能である。その電気泳動的行動
、その荷電およびその分子量に適当である様に、他の蛋
白質から記載の性質を有する蛋白質の分離に適当なぞの
他の方法を蛋白質の単離に適用することも可能である。
この目的に対してはプレパラティーブ電気泳動１等電点
電気泳動、ゲル済過、まだは超沖過の神々の方法ならび
に弱塩基性イオン交換体に結合しそしてそれから溶出さ
れうるというＰＰ、。
の性質を使用することが可能である。
しかし膜に部分的に結合されうるものでありまた酸グリ
シン緩衝液または６モル／を尿素溶液を使用してそれら
から溶出させうるＰＰ４．の特異的性質はこの蛋白質の
単離に対して特に適当である。
特に、ＰＰ、９の富化または他の蛋白質からのこの蛋白
質の分離をもたらす前記方法の適当な相合ぜによってｐ
ｐｌ、を単離させることが可能である。
上に記載のパラメーターとは別に、例えばＰＰ１．は抗
原性を有しているのであるから、分離操作からの分画中
のＰＰ、、の検出および測定に対しては免疫化学的方法
を使用することも可能である。
この目的に対して使用しうる抗１而消は以下の様にして
生成させることができる。
胎盤抽出液を２−エトキシ−６，９−ジアミノアクリジ
ンラクテートおよび硫酸アンモニウムを用いてＨ，Ｂｏ
ｈｎの方法（Ａｒｃｈ、　Ｇｙｎｉｋｏｌ、、　（１９
７１）。
２１０、４４０）により分画すると＊　Ｐ”Ｈの一部は
胎盤７ラクシヨ／Ｈに入る。この分画を更にセファデク
スＧ−１５０上でのゲル濾過により分離させると＊ＰＰ
１９は低分子量蛋白質範囲（分子量２０．０００〜６０
，０００）中に出現する。なかんず（ＰＰ、、に対する
抗体を含有する多価拐崩清はこの分画で兎に免疫感作さ
せることにより得られる。正常人血清でｐｐ、、を含有
しない胎盤分画。
１７− 清を本質的に抗原ＰＰ、、に特異的とすることができる
。
一方、この抗１血清はＰＰ４．の免疫学的検出用に。
そして他方ＰＰ１．の富化および単離のために使用しう
る免疫吸着媒の製造に使用することができる。
モノ特異性抗血清は既知の方法で実施例１により、そし
て特に本出願の実施例２により得られだｉ製ｐｐ、９を
使用して動物に免疫感作させることによって得ることが
できる。
第１ａ図は兎からの特異抗血清と寒天含有ゲ゛ル中の電
場内で分離させた後のＰＰ、、と兎の特異的抗血清との
免疫学的反応を示す。
これと比較するために、第１ｂ図は人血清（Ｈ８）に対
する兎抗血清とのそれらの免疫反応により示される血清
蛋白分離を示している。
１８− ＰＰ１９の免疫化学的検出のｔ（めにはオフタロニーゲ
ル拡散技術（Ｍｏ１．ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏ
ｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｏ−ｔｅｉｎｓ、、　１．　Ｐ、
　１３４）　４たは必要な場合にはより敏感な方法例え
ばラジオイムノアツセーまたは酵素イムノアツセーを使
用することも可ｔｆｂである。
ＰＰ、、の検出および測定は診断的意味を有している。
ＰＰ、、は特定の臓器のみに比較的置娘度で生ずる組織
蛋白質である。これら臓器に疾患の存在する場合には１
例えば増大した細胞の死の結果として、患者の血ｆ＃ま
たはその他の体液例えば尿中の組線蛋白１Ａｐｐ４．の
濃度に正常値以上の上昇が存在しうる。体液中のＰＰ１
．の検出および測定は即ちこれら臓器の疾病の診断用に
、′−！たは疾病の経過の追跡および処置の追跡のマー
カーとして使用することができる。
即ちＰＰ、、はＰＰ、、の検出および測定のためにそし
て免疫化学的方法の構成のために使用するだめの抗血清
の卆”Ｊ造に使用することができる。
本発す１］を以下の実施例により説明する。
実施例　１ Ａ）胎盤の抽出およびアクリジン塩基および硫酸アンモ
ニウム使用による抽出液の分画 １．０００に９のティープフリーザー凍結人胎盤をカッ
ターミキサー中で粉砕し、そして１．００　ＯＬの４１
／／ｌ　ｍ化ナトリウム溶液で抽出した。遠心分離によ
り組織残渣を除去した後、抽出液を次いで２００　ｍｌ
／　Ｌの酢酸溶液でｐＨ６，０に調節し。
そして攪拌しつつ２００１の３０　ｙ／ｌの２−二トキ
シ−６，９−ジアミノアクリジンラクテート（ヘキスト
ＡＧ製）の溶液を加える。沈澱を遠心分離により除去し
そして捨てた。１０１／ｌのはントナイ）Ａ（エルブス
ロー社供給、ガイゼンハイム／ライン）をこの上澄に加
え、２Ｎ　ＮａＯＨの添加によってｐＨをＺＯに調整し
、そしてこの混合物を濾過しだ。３００　ｇ／ｌの硫酸
アン・−二ニウムを攪拌しつつ徐々にこのＦ液に加えた
。こＪ］は胎盤蛋白質ｐｐ、、を他の蛋白質と共に沈澱
させた。
沈澱を炉別した。約１２ｋｇの湿ったペーストか得られ
た。そしてこわを以下に７ラクシヨンＡと記す。
Ｂ）エタノールによる分画 ５００ｇのフラクションＡを４００４の水に溶解させ、
そして４℃で生理的食塩水に透析させた。
透析後５０１／／ｌ　ＮａＣ１溶液の添加によって溶液
の伝導度を１５ｍ５Ｋ調節した。次いでこの溶液を０℃
に冷却させそして攪拌しつつ、９６０９／を含有のエタ
ノールを、２００１１／ｌアルコール最終濃度まで加え
た。次いで遠心分離により沈澱を除去した。上澄をはじ
めに水に対して、そして次いで１モル／ｌのＮａＣｔお
よび１１／／ｌのＮａＮ３含有の２１− ０、１　モル／ｌ　）リスＨＣＬバッフ　７−　（ｐＨ
ａＯ）　（バッファー溶液ＴＩ　”）に対して透析させ
た。次いで３８０　ｇ／ｌの固体硫酸アンモニウムの添
加によって蛋白質を沈澱させた。沈澱を水に溶解させそ
ｌ〜でバッファー溶液ＩＩに対して透析させた。平均１
４０〜のＰＰ１．含有の溶液（フラクションＢ）約８５
０−が得られた。
Ｃ）免疫吸着によるＰＰ、、の富化 １、免疫吸着剤の製造 ３４０ｒｎｌの兎抗−ＰＰ１．血清を０，０２モル／ｌ
ホスフェートバッファー（ｐＨ７，０）に対して透析し
、そしてＤＥＡＥセルロース上でのクロマトグラフィー
にかけて免疫グロブリンを除去した。この免疫グロブリ
ン分画（２，８９，９蛋白質）を次いで３６．２ｇのシ
アノゲンブロミドで活性化させたビーズの形の特別精製
アガロース２８１（セファロース０４　Ｂ　、、　、フ
ァルマシア、ウゾサク、スエーデン２２− 供給）と反応させ、そして即ち、共有結合的に担体に結
合させた。
適当な方法は５例えばＮａｔｕｒｅ、　２１４．１３０
２（１９６７）に記載さねている。その溶液から、和に
この方法で製造された免疫吸着藺を使用してＰＰ１．を
富化させた胎盤分画からは、蛋白質ＰＰ１゜を単離する
ことか可能であった。
２、免疫吸着法 免疫吸着媒をバッファー溶液＋１（０，１モル／ｌトリ
スＨＣｔバッフ７−ｔ　ｐＨａｏ、１Ｕモル／ＬＮａＣ
４および１　ｇ／Ｌ　ＮａＮ３含有）中に懸濁させ、そ
してクロマトグラフィーカラム（５，０Ｘ２ＤＣＩｎ）
にそれを充填させそしてバッファー溶液ＴＩで洗った。
次いでフラクションＢのｌの半分をこのカラムに適用し
た。ＰＰ、９は免疫吸着によりこれに結合した。カラム
をバッファーＩＩで完全に洗った。次いで約６００−の
３モル／ｌチオシアン酸カリウム溶液を使用して吸着さ
せた蛋白質をカラムから溶出させた。ＰＰ４．含有の溶
出液をバッファー溶液Ｉｆに対して透析させ、そして超
濾過で約１０ｍ／に濃縮した。−回の吸着当りの収量は
約６〃りＰＰ１．であった。
ＰＰ１．の溶出の直後にカラム中の吸着媒を再びバッフ
ァー溶液Ｉで中和させそして完全に洗った。次いでそれ
を免疫吸着によるＰＰ、、結合のために再び使用した。
Ｄ）　ＰＰ、、の最終的精製 免疫吸着により得られた蛋白質は、往々にして１だ非勃
異的に結合した血清蛋白質およびその他の胎盤蛋白質を
混入している。その他の血清蛋白質のほとんどはセファ
デクスＧ−１００上でのゲル沖過によって除去される。
残存するその他の蛋白質は次いで逆または負免疫吸着に
よって、即ち、まだ混在物として存在している蛋白質に
対する担体結合抗体の使用によって除去される。これら
は本質的には免疫グロブリンおよび胎盤組織蛋白質ＰＰ
、、　ＰＰ７．　ＰＰ１．およびＰＰ１３ならびにＰＰ
５と呼ばれる赤血球蛋白質であった。
胎盤組織蛋白質＊　ＰＰ７　＊　ＰＰ９　＊　ＰＰＮお
よびＰＰ、３の単離はすでに記載されている（ドイツ特
許公開公報第２，６４０，３８７号、ヨーロッパ特許Ａ
　Ｏ，０３７，９６３号、同第０．０２９，１９１号お
よびドイツ特許公開公報第３，２３０，９９６号の各明
細書）。これら蛋白質に対する抗血清はこれら蛋白質で
兎に免疫感作させることにより得られた。
ＰＰ１．分画中に混入物として見出される赤血球蛋白質
ＥＰ３はＰＰ、、より可成小さい分子蓋（約１５．００
０）を有しており、そして即にセファデクスＧ−１００
のゲル濾過において大部分ｐｐ、、からすでに除去され
ている。低分子量分画（分子ｌ゛２５− ２０．０００以下）においてはその他の蛋白質はほとん
ど完全に除去されている。赤血球蛋白に対する抗血清は
兎をこの補助分画で免疫感作させることにより得られた
。そしてこれは相当する免疫吸着媒の製造に使用された
。
実施例　２ Ａ）胎盤の粉砕および洗浄 ＰＰ１．膜結合分画の単離のためには、分娩時に排出さ
れる成熟人胎盤をカッターミキサーを使用して凍結状態
で粉砕しそして使用まで一２０℃に、この形で保存した
。はじめに生理的ＮａＣｔ溶液で洗うことによりすべて
の可溶性組織蛋白を除去した。この目的のためには７０
０−のＮａＣｔ溶液を５００ｇの粉砕胎盤組織に加え、
そしてこの混合物を短時間均質化させ、次いで４℃で数
時間攪拌しそして最後に遠心分離した。上澄を捨て、そ
して残渣を再び７００＋ｎ！、のＮａＣ１溶液と共２６
− に数時間攪拌しそして再び遠心した。この洗浄工程を合
計６回くりかえした。可溶性成分はこの方法で胎盤組織
から本質的に除去された。
Ｂ））ライドンｏＸ−１００による胎盤組織、の抽出こ
の組織残渣を３回、各回２−ポリエチレングリコールＰ
−イソオクチルフェニルエーテル（ト５４　トン０ｘ−
１００）／１００ｍ４水の溶液７００−を使用して抽出
した。各回、２０時間４℃で帽拌しそして次いで遠心分
離し７た。非イオン性洗剤トライトンｏＸ−１００によ
る処理ｄ膜結合蛋白ＭＰ１およびＭＰ２の除去に働いた
。（ドイツ特許公開公報第３，３１４，２９３号および
同第３，３３４，４０５号各明細書入この処理の開缶白
質ＰＰ、、の膜結合部分はほとんど全く溶解しなかった
。
Ｃ）酸グリシンバッファーによるＰＰ、、の可溶化ＰＰ
１．の再溶解のために、トライトン■Ｘ−１００による
処理の後の組織残渣を４℃で、２時間。
０５モル／ｌグリシンＨｃｔバッファー（ｐＨ２，５）
で各回５００−で２回抽出しそして遠心分離した。
抽出液を次いで１モル／１ＮａＣｔおよびｉ　ｐ、、ｙ
ｔナトリウムアジド含有の０．１モル／１　）リスＨＣ
ｔバッファー（１）Ｈ８，Ｏ）（バッファーＩＩ　）に
対して透析させた。
透析後この溶液をそれぞれＰＭ−１０膜を使用した超沖
過（アミコン社から供給）により約１００ｍ／’！：で
濃縮した。平均して１本来の胎盤組織５００ｇからの残
渣の抽出物は合計的２０■のｐｐｌ、を含有していた（
７ラクシラン２Ａ）。
Ｄ）免疫吸着によるＰＰ１．の富化 免疫吸着媒を製造し、そして実施例１に記載の様にして
免疫吸着を実施した。しかしこの場合にはグリシンバッ
ファーによる可溶化により胎盤組織から得られたＰＰ１
．溶液（フラクション２Ａ）が吸着用に使用された。吸
着された蛋白質は６モル／を尿素溶液を使用してカラム
から溶出させた。
Ｅ）　ＰＰ、、の最終的精製 一般に、アクリルアミドアガロースＡｃＡ３４上でのゲ
ル濾過が免疫吸着により得られる蛋白質の最終的精製に
対して充分である。痕跡柘でなお存在しているすべての
その他の胎盤組織１蛋白質は逆免疫吸着により除去され
た。
【図面の簡単な説明】
添付図面において、第１ａ図は兎からの特異抗血清と寒
天含有ゲル中の電場内で分離させた後のｐｐｌ　９と兎
の特異的抗血清との免疫学的反応を示し、第１ｂ図は人
血清（Ｈ８）に対する兎抗血清とのそれらの免疫反応に
より示される血清蛋白分離を示す。 ２９− 腺　鍜

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）以下の特性、即ち ａ）電気泳動移動度がα１グロブリンとβ１グロブリン
    との間の領域にあり、 ｂ）等電点が４，６と５，４との間であり。 Ｃ）沈降係”　Ｓ２０．Ｗが６．２５±［］、２５Ｓで
    あり。 ｄ）超遠心で測定された分子−が３６，５００士４．０
    ００であり、そして ｅ）炭水化物分画が３．９±１．５１ＡＯＯｇ（マンノ
    ース０．３±〇、　２１１／１Ｄ０，９．フコースｏ２
    ±０．１１／／１００．９゜ガラクトース１．０±〇、
    　３１１７１００ｇ、グルコ−ス０．４±０．２．９／
    １００１１．　Ｎ−アセチルグルコザミン１．２士〇、
    ５　ｆ／／１０ＣＪＩ、　Ｎ−アセチルガラクトサミン
    ０．１±０．１１／１００！ｑおよびＮ−アセチルノイ
    ラミン酸０．Ｚ±０．３９／　１ｏｏｋ）であること。 を有する蛋白質ＰＰ７．。 ２）この蛋白質を含有する臓器好ましくは胎盤。 四重たは肺臓から希薄塩またはバッファー溶液を使用し
    て、捷たけ溶解剤浴液好まり、　＜　Ｉｄ尿素溶液また
    はグリシンＨＣｔバッファーを使用して得られた抽出液
    を一寸たはそれ以上の以下の方法、即ち ａ）　５から８のｐＨ範囲で、そして３０〜７０％飽′
    ８Ｕ１の硫酸アンモニウムで蛋白ＰＰ４．を沈澱させる
    こと、 ｂ）　８から９のｐＨ範囲および４〜８　ｇ／ｌの塩基
    濃度の水溶性アクリジン塩基を使用して蛋白質ＰＰ１．
    を沈澱させること、 ｃ）ｐＨ７で２００　ｍｌ／　Ｌアルコールの最終濃度
    捷でエタノールを添加することによって付随する蛋白質
    の一部を分離させること。 ｄ）プレパラテイーブゾーン電気泳動によつて、α１グ
    ロブリンとβ１グロブリンの間の蛋白分画を得ること。 ｅ）ゲル濾過丑たは超炉ス１φによって２０，０００か
    ら６０，０００の分子編範囲の蛋白質を？ｊＨること、
    ｆ）弱塩基性イオン交換体に吸着さぜそして蛋白質ＰＰ
    、、を浴出させること。 ｇ）免疫吸着により富化させること にかけることを特徴する特許請求の範囲第１項に記載の
    ＰＰ、、の生成せたに富化法。 ３）抗血清を生成させるだめに、１そして疾病の診断、
    疾病の経過の監視捷た目処前の監視のためにこの蛋白質
    を検出および測定するための免疫化学的方法のデザイン
    に用いる特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質ＰＰ、、
    。
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