JPS60163667A - 血液中の糖含有物質の吸着材および吸着装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、各種病態と密接な関係をもつと考えられてい
る糖、糖タンパク質、糖脂質等の糖含有物質を体液中よ
り吸着浄化する体液浄化用吸着材およびその吸着装置に
関する。

近年、糖質化学、複合糖質化学の進歩によって、血液中
の糖含有物質が重要な生体機能を担っていることが明ら
かになｐつつある。特に炎症時の急性相反芯物質、免疫
抑制物質等は、炎症、悪性腫瘍等の原因、進行等と密接
な関係を持ち、血液中より吸着除去し、上記の如き疾患
の進行を防止し、症状を軽減せしめ、さらに治癒ヲ早め
ることが期待されていた。

従来、このような目的に対し、血漿交換療法が施療され
、増加した糖含有物質を非特異的に除去することが試み
られている。しかし、交換補液の確保や肝炎ウィルス感
染のリスクがあり、広く普及するには制約がある。また
、ポアーサイズを制御したガラスピーズを用いて吸着浄
化することも試みられているが、吸着能力が低く、目的
物以外のものも非特異的に吸着し、さらには凝固因子を
活性化する等の欠点を有している。さらに、植物の梅干
や動物の肝細胞等より抽出され、糖含有物質と特異的に
アフィニティーを有するタンパク質または糖タンパク質
であるレクチン全不溶化した吸着材は、目的物を特異的
に吸着できるが、レクチンは一般的に高分子の異種タン
パク質であり、強い抗原性を有することから、不溶化し
たレクチンの溶出に伴うかかる異種タンパクの体内移入
の懸念金有する。

本発明は、上記のような従来技術に基づく問題点に鑑み
、吸着能力と吸着選択性が高く、安全な糖タンパク質・
糖脂質吸着材およびその吸着装置を提供せんとするもの
である。

木兄り」者らは、上記目的に沿って鋭意研究した結果、
糖鎖とアフィニティーを有するペプチドを不溶性担体に
結合させた吸着材をヒト血漿と接触させたところ、篤＜
べきことに、血漿中の糖タンパク質を吸着除去すること
を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、不溶性担体に糖鎖とアフィニティ
ーを有するペプチドが結合していることを特徴とする血
液中の糖含有物質の吸着材、さらに、該吸着材が流体の
導出入口を有する容器に収容されていることを特徴とす
る吸着装置である。

本発明で対象とする目的物質は、体液中に存在または混
入する糖タンパク質、ムコ多糖、リポ多糖、ペプチドグ
リカン、その代謝生成物および糖含有複合体等の糖含有
物質である。免疫疾患における免疫クロプリン、免疫グ
ロブリンＬ鎖、免疫複合体、血液疾患におけるヘモグロ
ビン、トランスフェリン、フィブリノーゲン、プロトロ
ンビン等の糖タンパク質、悪性腫瘍におけるα−フェト
プロティン、カルシノエンブリオニツクアンティゲン（
ＣＥＡ　）等のガン胎児性糖タンパク、α１−アシッド
グリコプロティン、α２−マクログロブリン、α１−ア
ンティトリプシン等の免疫抑制性糖タンパク、炎症にお
けるＣ反応性タンパク、結石における硫酸化・糖タンパ
ク、タム−フォスフアル（Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌ
　）　’砧タンパク、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫
酸、ヘパリン等のムコ多糖、リピッドＡ等のリボ多糖、
細菌細胞壁のペプチドグリカン等を例示することができ
る。

本発明において糖鎖認識ペプチドとは、単糖またはオリ
ゴ糖と水素結合を形成することができるアミノ酸残基金
分子第に３０％以上、好１しくは５０％以上、特に好ま
しくは７０％以上含有するペプチドである。すなわち、
側鎖にカルボキシル基、アミン基、水酸基および芳香環
、複素環を有するアスパラギン酸、グルタミン酸、アス
パラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、セリン、
トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトフ
ァン、プロリン等の水素結合供与基や受容基を有するア
ミノ酸残基全前記含有率で含むペプチドである。

また、ペプチドの分子量としては、アミノ酸で６残基以
上５０残基で分子量１万以下、好ましくは３残基以上２
０残基以下である。これによシ、当該物質が不溶性担体
から溶出した場合にも、分子量１万以下であれば、生体
に対する抗原性が無視できるほど小さく安全であり、さ
らに好ましくは分子量４０００以下であシ、特に好まし
くは分子量２０００以下である。

具体的にハ、フェニルアラニル−セリルートレオニル−
セリルートレオニル−リジン（Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｔｈｒ
　−Ｓｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ　）、リプルートレオ
ニルーセリルーグルタミニルートレオニン（Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ　−８ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ　）、チロシループロ
リルーアスパラギニルートレオニルーアスパラギン酸（
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ　−Ａｓｎ　−Ｔｈｒ　−Ａｓｐ　）等
のジャックビーンレクチンの糖鎖結合に関与していると
報告されている（　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５．１１２０
．１９７６　）７ミ／酸残基を含むペプチド、およびア
ラニルーブロニルートレオニルーセリルーセリルーセリ
ルートレオニルーリジルーリジルートレオ＝　ｙ　（Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ　）等のヒト・インターロ
イキン２のシグナルペプチドを除いたＮ末端から１０残
基のペプチド（Ｎａｔｕｒｅ　。

３０２　．３０５．１９８５　）などを例示することが
できる。

本発明で用いられる不溶性担体は、親水性担体、疎水性
担体いずれも使用できるが、疎水性担体を用いる場合に
は、時に担体へのアルブミンの非特異的吸着が生じる場
合があるため、親水性担体の方が６７：ましい結果を与
える。

不溶性担体の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状
等いずれの公知の形状も用いることができるが、糖鎖認
識ペプチドの保持量、吸着材としての取扱い性よりみて
、粒子状のものが好ましい。

粒子状担体としては、平均粒径２５μないし３０００μ
の範囲にあることが好ましく、よシ好１しくは５０μな
いし１５００μの範囲である。

平均粒径はＪＩＳ−Ｚ−８８０１に規定されるフルイを
用いて流水中で分級した後、各級の上限粒径と下限粒径
の中間値を各級の粒径とし、その重量平均として平均粒
径を算出する。また、粒子形状は球形が好ましいが、特
に限定されるものではない。

平均粒径が３０００μ以上では、糖含有化合物の吸着量
および吸着速度が低下するし、２５μ以下では、圧損失
が大きく通常の条件で通液しにくい。

使用できる粒子状担体としては、アガロース系、デキス
トラン系、セルロース系、ポリアクリルアミド系、ガラ
ス系、シリカ系、活性炭系の担体であるが、ゲル構造を
有する親水性担体が良好な結果を与える。また、通常固
定化酵素、アフイニテイクロマトグラフイに用いられる
公知の担体は、特別な限定なく使用することができる。

また、粒子状担体としては、多孔性粒子、特に多孔性重
合体を用いることもできる。本発明で用いられる多孔性
重合体粒子は、その表面に糖鎖認識ペプチドを固定化で
きるものであり、平均孔径３００Ａないし９０００Ｘの
範囲のものである。

重合体組成はポリアミド系、ポリエステル系、ポリウレ
タン系、ビニル化合物の重合体等、多孔性構造をとりう
る公知の重合体を用いることができるが、特に親水性モ
ノマーにより親水化したビニル化合物系多孔性重合体粒
子が好ましい結果を与える。

該多孔性構造は、平均孔径６００Ｘないし９０００Ａの
範囲にあるのが好ましいが、平均孔径が小さすぎる場合
には、吸着される糖含有化合物の量が少なく、大きすぎ
る場合には、重合体粒子の強度が低下し、かつ表面積が
減少するため実用的ではない。

平均孔径の測定は水銀圧入式ポロシメーターによった。

この方法は、゛多孔性物質に水銀を圧入してゆき、浸入
した水銀量から気孔量を、圧入に要する圧力から孔径を
める方法であ５．４ｏｉ以上の孔を測定することができ
る。本発明の孔とは、孔径が４０Å以上の表面からの連
通孔と定義する。

平均孔径は、孔径をｒ、ポロシメーターで測定した累積
気孔量をＶとしたとき、　ｄＶ／ｄｌｏｇｒの値が最大
となるときのｒの値とする。

担体素材としては、水酸基を有する共重合体が好ましい
結果を与え、ビニルアルコール単位を主構成成分とする
共重合体が担体として極めて好結果を与える。ビニルア
ルコール単位を主構成成分とする架橋共重合体からなる
担体は、その親水性のため、血漿中のタンパク質等溶質
との相互作用が小さく、非特異吸着を最小限に低下させ
る。また血漿中の補体系、凝固系との相互作用が小さい
等の極めて優れた特性を有する。物理的特性の面でも、
耐熱性を有し、熱滅菌を可能ならしめ、さらには合成高
分子の特性である物理的機械的強度に優れている。

ペプチドを不溶性担体表面に固定する方法は、共有結合
、イオン結合、物理吸着、包埋あるいは重合体表面への
沈殿不溶化等あらゆる公知の方法を用いることができる
が、溶出性から考えると、共有結合により、固定、不溶
化して用いることが好ましい。そのため通常固定化酵素
、アフィニティークロマトグラフィーで用いられる公知
の不溶性担体の活性化方法および結合方法を用いること
ができる。また、必要に応じて不溶性担体とペプチドの
間に任意の長さの分子（スペーサー）を導入して使用す
ることもできる。例えば、アガロースのヒドロキシル基
とへキサメチレンジイソシアナートの片側のインシアナ
ート基を反応、結合させ、残ったインシアナート基とペ
プチドのアミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基
、カルボキシル基等を反応、結合させるごと〈実施する
ことができる。

本発明で担体に結合しているペプチドの量は、担体１−
当シ１〜１００μｍｏｌ−の範囲が好ましい。

保持量が１μｍ　ｏ　ｔ／ｌ’以下では、糖含有物質の
吸着量が極端に低下し、また、１００μｍＯ６／ｒｎ１
．以上では、保持されるペプチドどうしの立体障害が生
じるため吸着能が低下する場合がある。

以上、本発明に用いる吸着材の製造方法として、担体を
活性化し、糖鎖とアフィニティーを有するペプチド全結
合する方法について説明したが、本発明は、これに限定
されるものではない。例えば、重合性モノマーまたは架
橋剤にペプチドを結合後、重合（共重合）する方法、後
架橋時にペプチドを結合した架橋剤を用いる方法等も用
いることができる。さらに、不溶性物質にペプチドを結
合可能なポリマーをコート後、ペプチドを結合する方法
や、ポリマーにペプチドを結合後、不溶性物質にコート
する方法も用いることができる。その際、必要に応じて
コートポリマーを後架橋することもできる。また、ペプ
チドを活性化した後に担体と結合する方法も採用するこ
とができる。

すなわち、本発明は、吸着材中に糖鎖を認識するペプチ
ドが結合していれば、その効果を発揮するものであり、
製造方法に左右されるものでないことはいうまでもない
。

本発明の糖含有物質の吸着装置は、上述のような糖含有
物質の吸着材を、体液の導出入口を備えた容器内に充填
保持させてなるものである。

図面において、１は本発明の糖含有物質の吸着装置の１
例を示すものであり、円筒２の一端開口部に、内側にフ
ィルター３を張ったバッキング４を介して体液導入口５
を有するキャップ６をネジ嵌合し、円筒２の他端開口部
に内側にフィルター３′を張ったバッキング４′を介し
て体液導出ロアを有するキャップＩ３全ネジ嵌合して容
器を形成し、フィルター３訃よび５′の間隙に吸着材を
充填保持させて吸着材層９を形成してなるものである。

吸着材層９には、本発明の該吸着材を単独で充填しても
よく、他の吸着材と混合もしくは積層してもよい。他の
吸着材としては、例えば、幅広い吸着能を有する活性炭
等を用いることができる。

これによシ級着材　の　相乗効果によるよシ広範な臨床
効果が期待できる。吸着材層９の容積は、体外循環に用
いる場合、５０〜４００づ程度が適当である。

本発明の装置を体外循環で用いる場合には、大路次の二
連シの方法がある。一つには、体内から取シ出した血液
を遠心分Ｍ機もしくは模型血漿分離器を使用して、血漿
成分と血球成分とに分離した後、血漿成分を該装置に通
過させ、浄化した後、血球成分と合わせて体内にもどす
方法であシ、他の一つは、体内から取り出した血液を直
接核装置に通過させ、浄化する方法である。

体液の通液方法としては、臨床上の必要に応じ、あるい
は設備の装置状況に応じて、連続的に通液してもよいし
、また、断続的に通液使用してもよい。

本発明の吸着材および吸着装置は、以上述べてきたよう
に、体液中の糖含有物質を高率かつ選択的に吸着除去し
、非常にコンパクトであると共に簡梗かつ安全である。

また、滅菌操作も容易かつ確実に実施できるというメリ
ットも併せもっている。

本発明は、自己血液、自己血漿等の体液を浄化、再生す
る一般的な用法に適用可能であシ、急性および慢性の炎
症、生体免疫機能に関係した疾患の安全で確実な治療、
特に悪性腫瘍、膠原病、自己免疫疾患、血液疾患等の治
療および生体に害を及ぼす外来混入物の除去に有効であ
る。

実施例１ ｓａｇｓペプチドとして、チロシループロリルーアスパ
ラギニルートレオニルーアスパラギン酸（Ｔｙｒ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ　）を使用した。

ペプチドの合成は、ジシクロへキシルカルボジイミド法
（ＤＣＣ法）と活性エステル法の組合せにより、Ｃ末端
よシステップ・クイズに行なった後、常法により保護基
を除去した。

このようにして得たペプチドＴｙｒ　−Ｐｒｏ　−Ａｓ
ｎ　−Ｔｈｒ−ＡＳｐは、Ｃｏｎ　Ａ−セファｏ−ス４
Ｂと糖タンパク質（α、−アンチトリプシン）の吸着全
阻害した。

糖鎖とアフィニティーを有するペプチド固定化吸着材は
、次のようにして得た。すなわち、ＣＮＢｒ活性化セフ
ァロース４Ｂ（スウェーデン、ファルマシア社製）に通
常の方法によって、上記ペプチドを固定比重吸着材を潤
製した。保持量は１５μｍｏｔ／７！セファロースであ
った。該吸着材１ゴと胃癌患者よシ得た血清３−を３角
フラスコに入れ、３７Ｃ，２時間振とうし、吸着前後の
血清を測定に供した。α１−アンチ・トリプシン（糖タ
ンパク質）は免疫拡散法、アルブミン、総タン・くり質
は各々ＢＣＧ法、ビューレット法にて測定した。

吸着前のα１−アンチ・トリプシンが２５２ｍｇ／ｄｉ
であったのに対し、吸着後１８０〜／ａに低下した。ア
ルブミン、総りンノ（り質は前値２．４グ／ｄ１５．３
　ｙ　／ｄｌであったのが、吸着後裔々２．６り／ｄｌ
・５、Ｏｆ’／ｄｉであり、はとんど低下しなかった。

比較例１ 固定化するペプチドとして、クリシル−グリシル−グリ
シンを使用した以外は、実施例１と同様にして分析した
。吸着前のα１−アンチ・トリプシンが２５２　ｆｎ９
７ｄｉであったのに対し、吸着後は２３０１１１９７己
となり、はとんど低下しなかった。

アルブミン、総夕／）＜り質も吸着前、各々２．４ｆ　
／ｄ！、５，３　ｆ／　／　ｄｌｉ：、吸着後、各々２
．３　ｙ　／ｄｉ。

５、Ｏｒ／４Ａ’となり、はとんど低下しなかった。

実施例２ 糖鎖認識ペプチドは次のようにして得た。すなわち、糖
との結合に関与する側鎖に水素結合供与基および水素結
合供与基金有するアミノ酸を原料として、フェニルアラ
ニル−セリフートレオニル−セリｋ　−トＬ／　オ＝　
ｋ−リジン（Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ　−Ｔｈ
ｒ　−Ｌｙｓ　）を得た。このペプチドの合成は、ＤＣ
Ｃ法と活性エステル法の組合せにより、Ｃ末端よシステ
ップ・クイズに行なった後、常法により保護基を除去し
た。

このようにして得たペプチドＰｈｅ　−Ｓｅｒ　−Ｔｈ
ｒ　−８ｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓは、Ｃｏｎ　Ａ−セ
ファｏ　−，１４Ｂと糖タンパク質（α、−アシッドグ
リコプロティン）の吸着を阻害した。

糖鎖とアフィニティーを有するペプチド固定化吸着材は
、粒径１２０ミクロン、孔径５ｓｏＸの多孔性ガラスピ
ーズをγ−アミノプロピル）　ＩＪエトキシシランと反
応させてアルキルアミノガラスを得、グルタルアルデヒ
ド法により結合させた。

保持量は２０μｍｏ１．　／　ｍｌｔであった。該吸着
材１ゴと胃癌患者よシ得た血清３−を３角フラスコに入
れ、２時間振とうし、吸着前後の血清を測定に供したと
ころ、吸着前のα１−アシッドグリコプロティン９６ｍ
９／ｄｌが、吸着後５８ｍｇ／ｄ６に低下した。

アルブミン、総タンパク質は前値２．４グ／　ｄｉ　。

５．３ｒ／ｄｌであったが、吸着後裔々２．ｓｒ／ｄｉ
、５、ａｙ／ｄｌとなシ、はとんど低下しなかった。

実施例３ 糖鎖認識ペプチドとして、リジルートレオニルーセリル
ーグルタミニルートレオニン（Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−８ｅｒ
−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ　）　ｆポリビニル系多孔性ゲルＴｏ
ｙｏ　Ｐｅａｒｌ　ＨＷ６０　ｃ　（東洋曹達工業株式
会社製）にエポキシ活性化法によって固定し、糖鎖認識
吸着材を得た。

このペプチドはＤＣＣ法と活性エステル法の組合せによ
り合成した後、常法にしたがい保護基を除去して得た。

また、エポキシ活性化ゲルのエポキシ密度は１２０μｍ
ｏｌ　／　ｍｌグルであシ、この活性化ゲルに、常法に
よｐ糖鎖ｇ識ペプチドを固定し、未反応のエポキシドを
エタノールアミンを用いてブロックした。保持量は４０
μｍｏＡ　／　ｍｌグルであった。

該吸着材１ゴと胃癌患者より得た血清３１ｎｌを、実施
例１と同様に吸着実験をし、吸着前後の血清を測定に供
した。α２−マクログロブリン（糖タンパク質）は免疫
拡散法、アルブミン、総タンパク質は各々ＢＣＧ法、ビ
ューレット法にて測定した。

吸着前のα、−マクログロブリンが１８０〜／ｄｉであ
ったのに対し、吸着後１２０ｍ９７ｄ！！に低下した。

アルブミン、総タンパク質は、吸着前後でほとんど変化
しなかった。

実施例４ 糖鎖認識ペプチドとして、アラニループロリルートレオ
ニルーセリルーセリルーセリルートレオニルーリジルー
リジルートレオ＝　ン（Ａｌａ−ｐｒｏ−Ｔｈｒ−８ｅ
ｒ　−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈ
ｒ　）　ｆ合成した。合成はＤＣＣ−ＨＯＢｔ法（ジシ
クロへキシルカルボジイミド−１オキシベンゾトリアゾ
ール法）によシ、ｚ−Ａｌａ　−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（Ｂｚ
ｌ）　ｅ　５ｅｒ（Ｂｚｌ）　−５ｅｒ（Ｂｚｌ）　・
Ｓｅｒ　−ＯＭｅ−（１）とＢｏｃ−Ｔｂｒ（Ｂｚｌ）
　−Ｌｙｓ（Ｚ）　−Ｌｙｓ（Ｚ）　・Ｔｈｒ（Ｂｚｌ
）　−０Ｂｚｌ−＝−＝（２）　ｋ得た後、（１）のＣ
末端保護基と（２）のＮ末端保護基金除去して、ＤＣＣ
−）１０Ｂｔ法によりフラグメント縮合金した。得られ
た保護基を有するデカ・ペプチドの脱保護反応は、常法
にしたがいＨｚ　／　Ｐｄ法で行なった。

このデカ・ペプチドを、粒径１２０ミクロン、孔径５ｏ
ｏＸの多孔性ガラスピーズ全γ−アミノグロビルトリエ
トキシシランと反応させてアルキルアミノガラスとした
後、カルボジイミド法により固定ｆヒし、糖鎖認識吸着
材とした。保持量は６０μｍａｔ／ｒｎｌガラスピーズ
であまた。該吸着材１−と胃癌患者よシ得た血清３ｍＡ
−ｉ’３角フラスコに入れ、３７Ｃ１２時間撮とうし、
吸着前後の血清を測定に供した。吸着前のカルシノエン
プリオニツクアンテイゲン（ＣＩＡ）が１２．Ｏｎｇ／
−であったのに対し、吸着後５．Ｏｎｇ／ｍ１．に低下
した。

アルブミン、総タンパク質は、吸着前後でほとんど変化
しなかった。ＣＥＡの測定はラジオ・イムノアッセイ（
ＲＩＡ　）によシ、アルブミン、総タンパク質は各々Ｂ
ＣＧ法、ビューレット法により測定した。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の糖含有物質の吸着装置の１例を示す断面
図である。 １−・・・・・糖含有物質の吸着装置　２−・・・・・
円筒３．３′・・・・・・フィルター　４，４′・・・
・・・バンキング５・・・・・・体液導入口　６・・・
・・・キャップ７・・−・・・体液導出口　８・・・・
・・キャップ９・・・−・・吸着材

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）不溶性担体に、糖鎖とアフィニティーを有するペ
   プチドが結合していることを特徴とする血液中の糖含有
   物質の吸着材。
2. （２）流体の導出入口を有する容器内に、糖鎖とアフィ
   ニティーを有するペプチドが結合している吸着材が収容
   されていることを特徴とする血液中の糖含有物質の吸着
   装置。