JPS5991369A - 生物学的流体中の物質の遊離部分の分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、蛋白、貢（または流体中に存在する他の結合
種）に結合した形および非結合即ち遊離の形の両方で、
上記遊離の形−Ｈよび結合した形が相互に平衡状態にあ
る生物学的流体中に存在する有機物質またはアナライ）
　（ａｎａｌｙｔｅ　）の遊離部分に対する分析法に関
する。 血液の如き生物学的流体中にｉｆ（１ｉｌＩの形および
蛋白質に結合した形の両方の形で一緒に見出すことので
きる大部分の生理的に活性な物質に対し、これらの物質
と連合した生理的応答を制御でき、従って遊１’Ｊｉ　
（または非結合）および蛋白質結合物質の両者を含む全
物質の濃度よりも臨床的に重要であることのできるもの
は、１１１ｉ　ｒｉｌｌ；の形の濃度であると通常考え
られている。 ヨーロッパ特許第２６１０３　名門Ｋｍ　ｉ！ｉ−には
この種の分析法が記載されている。この方法は′ｒアナ
ライトよびそのラベル利き誘導体をアナライトに対する
特殊結合剤との反ｊ杯を競争させることを含む。特定結
合剤に結合するよ−）になったアナライトのラベル付き
誘導体の量を次いて測定し、この測定値を生物学的流体
中の遊離アナライトの１ｆｔｌｌ’ｊｊＺ　ｌこ使用す
る。 ヨーロッパ特許第８９８０６号明細書には類似した種類
の別の分析法が記載されている。この方法はアナライト
およびその誘導体をアナライトに刻するラベノ１イ」き
特定結合剤との反応を競争させることを含む。ラベル付
き特定結合剤に結合Ｖるようになったアナライトの誘導
体の量をへいで測定し、この測定値を生物学的流体中の
遊離アナライトの）濃度の測定に使用する。 ヨーロッパ特許第２６１０３号および第８９８０６号の
両方法において、使用する特定結合ＩｔＩｌＯ量はアナ
ライトの遊離の形および結合した形の間の平衡に実質的
に影響を与えるのには不充分である。またアナライト誘
導体は生物学的流体中の天然結合剤と実質的に非反応性
であるように選択する。 両方法の使用を成功させるに当っての問題は、好適なア
ナライト誘導体を考えることにある。 好適なアナライト誘導体は、 （〜アナライト自体は天然結合剤と反応性であるが、生
物学的流体中の天然結合剤と実質的に非反応性であるよ
うに化学的変性ずべきであり、 ｌｂｌヨーロッパ特許第２６１０３号明細書の場合にお
いては、通常更に化学的変性を含む放射性原子または他
のマーカーでラベル付ケスべきであり、 （ｃｌヨーロッパ特許第８９８０６号明細９丁の場合に
おいては、一般に不溶性マトリックスに結合すべきであ
り、 （ｄｌそれにも拘らず特定結合剤に強力に結合すべきで
ある。 好適なアナライト誘導体を得るためアナライト分子を変
性することは特にそれが小さいものであるとき非常に困
帷なことでか／、［りの試行≦１（誤をしなければなら
ない。本発明の１］的はこれらの困難を克服することに
あり、この目的は゛ｒアナライト誘導体代りに、特定結
合剤に対する抗体の使用によって達成される。よくある
ように、特定結合剤がそれ自体アナライトに対する抗体
であるとき、特定結合剤に対するこの抗体は抗遺伝的抗
体であるとよい。 抗遺伝的抗体は良く知られた材料であり、それらの製造
は多くの文献に記載されている。抗遺伝的抗体の木質は
、アナライトのための特定結合剤がアナライトに対１−
る抗体（抗原）である場合に説明される。抗体は抗原結
合位置をＹの二つの側鎖の端で有するＹ型分子である。 抗原結合位置はＹの腕を（：゛り成する軽鎖および重鎮
の折り重ねによって形成され、抗体が結合する抗原の区
域を補う区域を形成する。免疫系が必要とする抗体特異
性の広いレパートリ−を発生させるため、抗体分子の軽
鎖および重鎖に措成される＝１変アミノ酸配列区域（可
変区域）の系がある１、従って抗体の可変区域でのアミ
ノ酸配列はその抗体の特異性を決定し、特にその配列は
その抗体に独特のものである。この独特なアミノ酸配列
（遺伝型と称される）は更に動物の自己４１１℃念の一
部ではない。従って異種として認めることかでき、それ
自体に抗体応答を誘発できる。かかる抗遺伝型抗体は免
疫系による抗体合成の天然制御における一部をなすと考
えられる。 従って抗体はその抗原（アナライト）結合位置における
独特のアミノ酸配列（遺伝型）を有し、これが抗遺伝型
抗体応答の基を形成できる。 ピー・ホトシンジャク等（サイニス、１９８２年、第２
１５巻、第１６３７〜１　（ｉ　３９　ｆＩ：　）は抗
遺伝型抗体を用いる放射能分析を発表している。 アナライト（抗原）は４４０００ダルトンｎ・ネ蛋白質
（ｐｂ４４）であった。モノクロナル（ｍｏｎ−ｏｃｌ
ｏｎａｌ　）抗体（３１）１１）はこの抗原に対し上昇
せしめられた。モノクロ＼ナル抗逍伝型抗体（２Ｄ１２
）は抗体３Ｄ１１の遺伝型に対して上昇せしめられ、沃
素１２５でラベル付けされた。抗体３Ｄ１１は分析管の
壁で不１ｎｋ（ｆＪ’ｅ＋化された。次いで二段培養で
、抗原ｐｂ４４および抗遺伝型抗体２Ｄ１２は抗体３Ｄ
１１上の結合位置に対して競争せしめられた。 −Ｌ述した分析法は全アナライトを１ｌｌｌＪ定′１−
るように設ｎ１された。これに対し、木シ渦１１月０〕
方法ｉｆ、：１ｆｆ１１１１Ｆアナライトオヨヒ結合７
　ナライト力＜　５Ｖ−Ｗｒｉ状Ｉノ県にある系での遊
！’ｌｌｔ、アナライトを１ｌｔＴｈ定゛するように設
置１：されている。以上に示す如く、ｔＡ逍イ云ｇ抗体
の使用は、アナライト０）　）ｐ　１４Ｉ　＋ｆｌｓ分
のｆｆｌ！Ｉ定番こおいて特別な利点をもたらす。 本発明は、アナライトおよびそ（７）ｌこめＯ）特定結
合剤からなる特定結合対Ｑ）−員であるアナライトのｙ
ｂｌ　ｌ’！ｉＥ、部分の濃度を測定する方ン去であっ
て、上記アナライトの遊離部分Ｃよ、丁ナライト番こ対
する［ｉ以上の天然結合剤番こ結合

【７たアカライトの
部分を含有し、アナライトの結合部う）および遊離部分
が平衡状態にある°Ｔリブ−イ）　０）遊ＰｉｌＩ部分
の測定方法を提供（７、この方法Ｃよ、（ａｌある計の
アナライトに対する特定１占合作ｊおよび特定結合剤に
幻」る抗体を含有する生４勿′学的も：Ｖ１体の試料混
合物を形成し、上記特定結合剤の甲は上記平衡に実質曲
番ご影響を与・えるのには不充分な（１とし、上記結合
剤および上言己抗体の少なくとも一つをラーくルイ・１
゛番すし、（ｂ）上記混合物を、アナライトおよび１九
イ木のｉ姓１’！ｉｔ部分が特定結合剤りの結合位置で
亦龜争し、試料中に存在するアナライトの遊ｆｆ１１１
部／、）のｒｔｒｔ度によって決る副台でそれ’ｒｃ　
Ｘ９合するよう１こ／、［ることを可能にする時間保持
し、 ｔｅｌ抗体に結合した特定結合剤の、ｉｌおよび／また
は抗体に結合しなかった特定結合剤のも支をｉｌｌ定し
、 ＋ａ＋ａｌ値を生物学的流体中σ）　遊１’４Ｉ　Ｔ−
ｊ−ライトθ）濃度の測定に使用する ことによって行なう。 本発明はまたアナライトθ）ためθ）１１寺５．’１７
結合斉１［の供給材料、および特定／ｓ、（Ｔインタ゛
−に文１Ｃる抗体の供給材料からなるＬ記方法番こｉＪ
：　Ｊｌｌ　１−るた？７）の分析キットも含み、特定
結合剤」６より”　打シ（木０）少なくとも一つはラベ
ル付けしである。 本発明の原理は添付図面を参照すること番こよって容易
に理解できる。第１図Ｃｊヨー「１゛ンノｆ／ｌ咎許第
２６１０３号および第８９８０（５号番こｉ己！１戊さ
れた如き従来の分析の反応図であり、第２１２１および
第３図は本発明による分析の反応図である。 各図面を参照すると、アナライト１２は文字ｔの形で示
してありこれらは相形頂部と二つのｔ１形ルｎを有して
いる。 １０はアナライトを含有する生物学的流体中に存在する
血清結合性蛋白質を示し、これらはアナライトのための
Ｕ形結合位置を有するように示しＣある。 第１１（において、アナライト誘導体は１４で示してあ
り、これは一つの腕を失った文字ｔとして示しである、
従ってそれは血清結合性蛋白質に結合しない。 特定結合剤は１６で示してあり、これはアナライト１２
およびアナライト誘導体１４のための箱形結合位置を有
するように示しである。 第２図において、抗体は１８で示してあり、これは特定
結合剤１６によって結合されるが血清結合性蛋白質によ
って結合されない箱形突起を有するように示し−Ｃある
。 第３図において、抗体１８は、を形アナライト１２の箱
形頂部よりも大きくかつ平らな箱形突起を有するように
示しである。特定結合剤は２柿類の結合位置を有するよ
うに示してあり、抗体１８のための結合位ｉＮオよびア
ナライトＪ２のための別の位置を有する。これらは、一
つの場所での抗体の結合がその位置でのアナライト分子
の結合を阻止し、またこの逆にｆ、（るように相関関係
にある。 全ての図において文字ＡおよびＢが現われている。各図
においてこれらは次の、べ味を有する。 ＡまたはＢの何れかがラベルを表わし、例えば放射性原
子または螢光基を表わす。他のＡおよびＢは、それが結
合している試薬が反応媒体から容易に除去される手段例
えば不溶性マ）　ＩＪソックス表わす。例えば第２図を
参照すると、抗体１８に結合したＡは放射性または他の
ラベルを表わし、特定結合剤Ｊ６に結合したＢは不溶性
マトリックスを表わすことができる。あるいはＡが不？
ｆｇ性マＩ・リツクスを表わすことかでき、この、鴨合
、ＢはＩｉＱ：　Ｑｔ性または他のラベルを表わす。 弔１図を匈１１：ｌすると、従来技術の本発明はアナラ
イト誘導体】４をアナライト１２と同様な方法で１１：
、確に′ｉ定結合剤１６に結合させなければならない、
叩ら’Ｉ’？　５Ｍ結合剤に結合するアナライトの区域
は、全体としてアナラ４１・分子が天然屓白質結含剤１
０に結合するのを防ぐため変性されているとき変性され
ていてはならない。 しかしながら２分子か特定結合剤に同じ方法で正確に結
合Ｖべきであることは必ずしも必要でない。必要である
ことは、アナライト分子が特定結合剤に結合するとき、
特定結合剤に対し競争するよう、他の分子が結合しては
ならないことであり、この逆もそうである。 ９３３図を参照すると、アナライト分子の結合を妨害す
るためアナライト１２の結合位置に充分に近接した位置
で特定結合剤１６に結合ｒる抗体１８の使用およびこの
逆の使用の別の解決法をもたらしている。 本発明による特定結合剤に夕・１１−る抗体の使用は次
の利点をもたらす。 （ｍ１群としての抗体が血清蛋白質に結合しない。 従って使用した抗体がアナライトを含有する生物学的流
体の血清結合性１′Ｔ、白質に結合する重大な危険がな
い。これは、遊離アナライトのための分析における重要
な利点である、しかし前述したホトシンジャクの；１Ｆ
６文における場合の如き全アナライトを分析する場合意
味がない。 （切抗体は、特定結合剤の結合を妨害づ゛る危険なし蕎
こ、不溶性マトリックス藝こラベル付けまたは結合させ
ることのできる充分に大きな分子である。 アナライトの性質について見たとき、本発明の方法は汎
用性がある。この方法が適用できるアナライトの群の例
には、ホルモン、生化学的メツセンジャー、ステロイド
、ビタミン、腫瘍抗原、トキシン、アルカロイド、およ
びモノ、ジ、ｔ；よびボリナッカラ・ｒドがある。本発
明はｔｊデに小さいアナライト５こ関連して有利である
、何Ｊｆ：４　ｊ、にらば、特定結合剤へのそれらの結
合を妨害ｚ１−ること？、Ｃ＜小さいアナライト分子の
変性・２す〜ることは特に田ｔＡｌｆだからである。 アナラ、（）は特定結合対のｌ員である。アノ−ライト
がハゲテンであるとき、またはそれ自体インミュノジエ
ン的であるとき、そのための４’＞定結合剤は特定結合
剤として抗体に限定され「、一般に特定結合剤例えばビ
タミンＢ１２−内因子系に適用できる。 °ｒアナライト遊ｊ碓部分は生物学的流体中の天然結合
剤に結合したアナライトの部分と平衡状態にある。従っ
て遊離アナライトの少量が系から除去されると（例えば
その特定結合剤に結合するよう番こなることによって）
、このときアナライトの対応する少量が生物学的流体中
の天然結合剤によって放出され、平衡を回復するよう番
こなる。更にこの方法は、分析にとられる時間よりも一
般に短い時間で、そして如何なる場合にも実に的に長（
ない時間で生起する。 特定結合剤はアナライトに対して高親和性を有している
べきであり、その親和性は分析Ｖべき生物学的流体中に
存在する天然蛋白質結合剤のそれと望ましくは同じか、
好ましくはそれより大であるべきである。大体の経験則
として、アナライト／特定結合剤錯体の解ｌＴｉ１ｌ’
定数は分析試料中の遊離アナライトの濃度（モル／ｉ）
よりも好ましくはｌＯのファクター内で大か小であるべ
きである。特定結合剤がアナライトに対し低すぎる親和
性を有するときは、分析感度が低Ｆし、大ｉｉ−の特定
結合剤の使用を必要、−することがある。また特定結合
剤は生物学的流体中に存在しているようにアナライトと
門＋１ｉ−物７ヶの１ｆｉｌ／）区別ができなければな
らない。しばしばあるように、特定結合剤がアナライ）
Ｇこ対する抗体であるとき、抗体はモノクロナルである
のが好ましい。（全てがアナライトに対し親和性を有す
る）抗体の混合物を使用すると（標準抗血清中にｆ’−
Ｊられる如き）、このときは抗遺伝形抗体の混合物を必
・；Ｓと４−る。モノクロナル抗体は文献−こ巨く記載
されているハイリドマ（ｈｙｒｔｄｏｍａ　）法で作る
ことができる。 本発明一つの観点によれば、特定結合剤は免疫分析また
は免疫測定分析に使用される任意のラベルでラベル付け
することができる。ラベルの最も１１′Ｉ要！λ群は放
射性１ｇ子、酵；ゼまたは酵素系の成分、および化学発
光および螢光基である。 酵素分析は信号を発生さ１！−るため二つ以上の成分１
タリえば／ｉ￥索とその基質の使用を含み、特定結合剤
はこれらの成分の一つ以上−〇ラベル付けするとよい。 ＪｌをもＰ、　、＋ηには少ｌ、１′りとも一つの放射
性ＪＪｌ＜子、好ましくはＹ放射線を発する原子でう、
ベルｒ、ｔ　＋’ｔする。抗体および他のｌｉ、＋ｐ定
結合剤をラベル伺けする方法は当業者ｌこ知られており
、ここに説明しＩλい。 本発明の別の具体例において、それはラベル付けされる
抗体である。この場合、特定結合剤は反応媒体からその
答易な除去をするだめの手段を有しているのが便利でよ
く、あるいは不溶性の形で使用してもよい。例えば特定
結合剤は分析を行なう曲番こ、分析管の壁または不溶性
粒子上に吸収させることができる。 従来の競争分析においては、アナライトに対する特定結
合剤は全アナライトおよびその誘等体と反応するには不
充分な−で存在させている。 従って第１に、本発明番こおいて、特定Ａ＋１５合剤は
遊離アナライトおよび抗体の全部と反応するには不充分
な量で存在させるへきであると思うかも知れない。 これはそうではない。何故ならば幾らかの遊離アナライ
トが特定結合剤によって除去されると、それ以上のアナ
ライトがその場でとられるよう天然結合剤から除去され
るからである。始めから存在する遊離アナライトおよび
抗体の全てと反応するのに必要な情より大なる１神の特
定結合剤を使用することが有利なことがある。明らかに
主眼は、天然結合剤に対して遊Ｍ！トであるか結合して
いる存在しているアナライトの全て・ｊよびＩ＋’ｔ：
体の１）計と反バヌする′Ｉｆ定詰今、メ１りの１迂（
こ、Ｌつで１夾ろ１．［７かしこれは実［二３的ｌλ使
用のために非常に助けとｔｌる指１朶てＩ：Ｉない。 ・Ｉ’　Ｆ：！ｉ　ｌＲｊ、抗体番こ結合したｆ１キ定
結合ｉ’ｒｌｌの）ｆす合は、ｆｆ−イ］ミする天然結
合Ａすおよび特定結合剤の［こよつＣ１ＴノーライトＦ
Ｊよび抗体に対するそれらの゛１゛見和力定故によって
、およびアナライトおよび抗体の励によ一つＣ決る。こ
の割合のχ１１識ぢよび１１１の関ｉ１４１゛−夕から
ｉ、ｌｔ　Ｆｉｌｌの形でのアナライトのＭを理論的に
計ＳｒすることはＵ（能であるが、これは実際的な方法
でなく、慄準分析法に依存しなければｌλらない、即ち
「投与１ｆｌ−７６百曲、腺」または［標準曲線Ｊの使
用をしなければ！よらない。この方法において、既知の
遊１’ｌＩアナライト定数の（望準１１１１清の数（例
えば平衡、透析によって測定）、この方法の必要作用範
囲の大きさを測定する。結果をグラ懲にプロットし、未
知試料を曲線について読み　る。試料、特定結合剤およ
び抗体の実際の里を、分−析の所望の作用範囲にわたっ
て適切なスロープの（従って釘切な分析感度の）投与は
応答曲線を〜えるために最良なものにする。分析を最適
化する方？、１ミは放！ｉＪ線免疫分析およびμ］連法
に習熟ぜる当−’、Ｑ己昔ｔこは良く刈られている。 しかしながら、使用する′！７１が犬とＩＳればなる程
、天然結合剤に結合したアナライトおよび遊離アナライ
トの間の平衡の位置はま８１まず親化する、即ち平衡時
遊離アナライトの、Ｆ度はまずます変化することで、遊
離アナライト分Ｖ［に使用する特定結合剤の岨に限定が
ある。ある程バ〔まで、平衡の位置は未知試料および標
Ｅｌ、Ｉｔ試料において同様な方法で変化することで、
投与ｔｒｌＨ応答曲線の使用はこれに対して正しい。し
かしながら、血清標準と患者試料は必ず異なる１１１の
天然結合剤を有するから（遊離アナライト分析を価値あ
るものにする異なる患者の血清中の天然結合剤の異なる
量がある）、天然結合剤から除去されるアナライトの両
分（天然結合剤上に存在する全アナライトによる）（−
１できろ１）１４り小さくすべきことが非常に望ましい
。（７かしｌλがら、天然結合剤から除去できるアナラ
イト画分は、個々の試験番こおける臨床医によって要求
される正確度、遊離状態で通常存在するアナライトの割
合、天然結合剤の濃度に関する患者試料に経験する変動
可能性笠によって決ることで、一般的規則を与えること
はできない。通常の臨床分析番こおける如く、その目的
に対して分析を最適化することである。 これから生ずることは、必要以上に結合−遊離アナライ
ト平衡を混乱させることを避けるように゛、適切スロー
プの投与量一応答曲線をイ得ることと両立するよってき
る限り、高規相力特定結合剤のＭを少なく使用するのが
好ましい。 曲性した如く、抗体は結合位圓に対し、遊１碓ｒナライ
Ｉ・と〆λ争するような方法て１１）１定結合剤に結合
しなけれはならない。特定結合剤に対し抗体の混合物を
含有する精製した抗血清を使用できる。それにも拘わら
ず、モノクロナル抗体の使用が好ましい、これは特定結
合剤がそれ自体モノクロナル抗体であるとき特にそうで
ある。 抗遺伝型抗体を作るため、変性しないか、アラム沈酸さ
せたままの、またはグルタルアルデヒドで架４ｎさせる
ことによって重合さｌ−た精製した抗体を動物に注射す
る。抗血清は動物から取った血液から通常の方法で作る
ことができる。 モノクロナル抗体生成細胞のクロンをＪＰ離できるバイ
ブリドマス（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　）を作るため免疫
にしたマウスからの肝細胞を使用できる。ド記文献に抗
遺伝型抗体の作用が記載されている。 ウォーカー・アイ・ディおよびモラハン・ジーの５ｃａ
ｎｄ、Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．．１９８１年ｆｇ１３巻第
４３３頁〜第４４０頁。 ウイーバーＯエム・ニス、シコラ便」ニレＪ、ｔよびレ
ヴイ・ジエイ・ジーのＭｏＪ、ｅｚ！ｕｌａｒ　ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏＦ、７１９８２年、第１９巻第１０５頁〜第
１１７頁うホトシンジャク・ピー等の５ｃｉｅｎｃｅ１
９８２年＠２１５巻￥ＪＳｌ　６３７頁〜第１６３９頁
。 本発明の一具体例において、抗体はラベルｆ；１゛けす
ることができる。ラベル付は基準は１１与定結合剤につ
いてのものと同じであり前述した。 前述した如く特定結合剤または抗体の何れかをラベル付
けする。これら二つの試ｐの他のものは、特定結合剤／
抗体錯体の一部を形成するラベル付は試薬の両分の迅速
かつ容易な測定を可ｆｉｔｇ　ｌこする性質を有する。 （このため抗体に結合しなかった全特定結合剤はアナラ
イトに結合するようになつ“Ｃ消費される。）この関係
で二つの分析カテゴリーがある。 （１）均質分析。これら番こおいて、特定結合剤／抗体
錯体の部分を形成するラベル付き試薬の両分は、ラベル
によって発せられる信号の測定前にその錯体の部分を形
成しないラベル付き試薬の画分から分離しない。これＣ
さ酵素、化学発光石よび螢光分析系にとって有利であり
、実際的である。しかし、特定結合剤／抗体錯体の部分
を形成するラベルのその両分によって発せられる信号は
、その錯体の部分を形成しないラベルのその両分によっ
て発せられる信号とはある方法で異なることが必要であ
る。 従って本発明においては、抗体を、それに結合するよう
になるラベル寸き！Ｉキ定結合剤の画分によって発せら
ｎる信号を変性するよう選択するか、あるいは特定結合
剤を、それに結合するようになるラベル付き抗体（同え
ばラベル付き抗遺伝型抗体）の−分によって発せられる
信号を変性するよう５こノ穴択するとよい。 （４）不均質分析。これらにおいて、特定結合剤／抗体
錯体の部分を形成するラベル付き試薬の両分を、一つま
たは他の画分によって発せられる信号の測定前に錯体の
部分を形成しないラベル付き試薬の両分から分離する。 放射能分析系は通常不均質であり、他の分析系もそうで
ある。この場合において、特定結合剤または抗体の何れ
かが分離のための手段として作用し、一般に固体相の形
で、または液体から固体相へ容易に移る形で使用さａ’
する。 培養時間および温度、および分析媒体のＰＨを含む本発
明方法を実施するのに好適な条件は、アナライトに対す
る従来の分析の知識から容易に決定できる。反応成分は
次の１．・１々な方法で混合できる。 ＋Ｉｌ特Ｔｊ−結合／ＩＩ　ｓよび抗体を分析試料に同
時にまたは連続的にＩＪＩＩえる、これによって遊！ｉ
ｊ［アナライト、および抗体は特定結合剤と反応するた
め競争する。 ＋Ｉ１１特定結合剤を抗体に結合した形で分析試料に加
える。特電結合剤の幾分かはε１シ休から遊離し、遊離
“アナライトに結合するようになる。 前述した如く、特定結合剤はしばしばアナライトＪこ対
ＴＪ″る抗体である。抗体は２価であることが知られて
いる。抗体の分子はアナライトの分子および抗体の分子
の両方と反応することから間ノーが生４゛ると考えられ
る。ある大きさの程度でこれが生づると、これは分析の
感度を低トさせる。しかしながらこの問題は実際には何
ら大きｌ＾程度で生ずることはない。必要ｌＳらば倒え
は抗体を二つの小さい１価分子（例えばファブ・ララグ
メント９に分解させることにより、抗体を１価にするこ
とによってこの問題は避けることができる。 本発明方法は主として分析−＼の平衡ｈ・〆決法として
考える。しかしながら、ある反応は平１ｊｉｉに達する
のにかなり遅いことがあり、′１＋ｉにアナライトおよ
び／または抗体が大きな分子であるときそうである。ま
た分析は異なる反応速度を有する二つの異なる反応（ア
ナライト／特定結合剤結合反応および特定結合剤／抗体
結合反応）の間の競争を含む。必要ならば本発明方法は
動　　　　゛力学的または非平衡解決手段に適用できる
。 本発明方法は均質および不拘ヱ（分析の両方に適用でき
る。不均質分析におい［は、抗体番こ結合した特定結合
剤の両分のかく結合してない画分からの分離は液体相か
らの固体の分ｐ、：［を含み、これは通常の方法例えば
遠心分＋：、＋ｈ、によって行なうことかできる。結合
したよ５よひ／または結合していない画分によって発−
Ｌ」゛ら、！−する（＋４１σ月１１１１定はこれも普
通の方法で行なうことができる。得られた測定値の分析
試料中の遊ｉ’ｉｌＵ　アナライトの濃度の値へ敦換す
るため、Ｊ’３ＦｊｆＥアナライトの異なり既知の濃度
を含有する一つの・ヒツトの標阜に依存しなけ１１ばな
らない。桿ｐｊ＜　＋ζ対【７で得られた値は１．峙ｒ
；１［アナラ・イトず官庁ｒ）、−１する信号のグラフ
１−にプロット（７、分析試料の遊＋’、ｌｉアナライ
トｉＧ５　Ｉｓ！をグラフから読みとる。 実施例 アルブミン溶ｉｔり中の遊１誰７−・アザ−８−オキソ
−９−（４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−二トロフェ
ニル）ノナン酸（Ｎ、ＩＰ　−ｃａｐ　）に対Ｖる伜準
曲線 下記試薬を使用した： １、緩衝剤；これはアジ化ナトリウム１　Ｂ２．／ｌを
含有するリン酸塩Ｊ、　Ｏｍｍｏｌ／／　、　ｐ）Ｉ　
７．４てあった。 ２、アナライト；７−アザ−８−オキソ−９−（４−ヒ
ドロキシ−５−ヨード−３−二トロフェニル）ノナン酸
（以降Ｎ工ρ−Ｑｎ、■Ｉと称する）であった。これは
アルブミン４．５　ｉ／Ｉを含有する緩衝剤中Ｉｎ溶解
した。アナライト溶液は当業者に良く知られた参考方法
として超濾過透析によってＪ／α離Ｎ工ｐ　−ｃａｐ濃
度について補正した。 ３、特定結合剤；これはモノクロナル抗体（Ｂ１．−８
と命名した）であった。特定結合剤はノ１ブテン（４−
ヒドロキシ−３−ニトロフェニル）アセチルで免疫化し
たマウスから牌細胞と骨ｔｆｉｉｆ　ＩＦＪｉを合着さ
せて作った。（エム・１／ス、ジー・ジエイ・ハンマー
リングおよびケイ・ラジエウスキー、Ｊ、　Ｉｍｍｏｎ
ｏｌ、第８巻第３９３頁〜第４００頁（１９７８年）〕
。かかるモノクロナル抗体の製造およびそれらの性質は
当業者に良く知られていることである。 特定結合剤は同相顕微鏡的プラスチック粒子とカップリ
ングした。かかる引立子、カップリング法および結合剤
被覆プラスチック粒子は当業者に良く知られている。特
定結合Ａｌｌカップリング粒子は緩４ｈｉ剤中ｉｃ　ｊ
ｉｌ濁し、ｉＳ’ｉ　合ｒ＋ｌＩ　（１，２ｍｇ／ｌ　
Ｏ）濃度とした。 ４、特定結合剤に対する抗体；これはＢ１−８で免疫に
したマウスからＩｉ’？−細胞と骨ｔｉｌｆｆ　Ｉｊｉ
ｉとを台ｉ′イさせて作ったモノクロナル抗体（ＡＣ１
４（ｉと命名した）であった。〔エム・レス、ティ・イ
マミシカリおよびケイ・ラジエウスキイ、Ｅｕ　ｒａ　
Ｊ−ｉｍｍｕｎｏｌ、　　第９巻、ｔｏ　１００４頁〜
第１０１４頁＜　１．９７９年）　）。モノクロプル抗
逍伝型抗体０）ＩｉＩｉ　１ｊ＋＝は当業者に良く知ら
オフており、こ第１．はエム・ジエイーネルス、エル・
ニーφギルパザリスすｊよびニー・ニソノフ１．ｒ、　
Ｆ＋ｘｐ、〜Ｉｅｄ、第１５４巻、第１７５２頁〜瘍１
７　（ｉ　３頁（１９＋＋　１イ０；ジエイ・エフ・；
トーアニイ、アール・バーレツタ、ゼット・ニス・ファ
ンおよびジエイ・クインタス、Ｅｕｒ、　；ｒ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｉ、　第１１巻、１８７７頁〜第８８３頁（１
９８１年）；シイ・モラノ１ン、Ｊ、工ｍｍｕｎｏｌ、
λりｅ　ｔ　ｈ（Ｔ　ｄｓ第５７巻、第１　（ｉ　５頁
〜第１７０ＦＴ：（１０８３年、）　電ヒー・４ｊ−ン
チェ７、シーール・グエルン、エル會ファレンｉ−、イ
ー嘩パルビアーシイ・ブツナンおよびピー・ニー・ギャ
セナフ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ工ｍｍｕｎｏ、’ＬｏＦ
！＋ｙ３Ｓ　］、　９巻、第８８５７’ｊ〜第８９２頁
（１９８２年）を参照できる。抗体ＡＣＪ、　４６は、
特定結合剤に対するその結合がＨＩＰ　−ｃａｐの如き
（４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロフェニル）
アセチルの誘導体≦こよって阻占されうる」；う特シを
結合剤−Ｊニでアイデイオトープ（１ｄｉｏｔｏｐｅ　
）　ｌご結合する〔エム・レス、ティ・イマニシカリお
よびケイ・ラジエウスキ・イ、Ｅｕｒ、　Ｉｉ、工ｍｍ
ｕｎｏ１．第９巻、第１００４頁〜第１０１３頁（１９
７９年）〕。 抗体２５μｇをポルトン・ノ１ンター試四を用いて１２
５Ｈの２　ｍｃｉでラベル利けした〔ニー・イー−ポル
トンおよびエム・グブリュ・）１ンター、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　Ｊ、第１３３巻第５２９頁〜ｆｇ５３＄１頁（１
９７３年））。ラベル付けした抗体を、放射能を測定し
たとき２５　ｃｐｍ／ｍｌを１４えるｉ１度でゼラチン
１ｇ／ｌを含有する緩衝フ）１１中に溶解した。 遊離アナライト分析においで、ｉ゛ナライト溶’ｉ！：
１００１ｚｆを、ラベル付き抗体４００μｌおよび特定
結合剤５００μｌと混合した。混合物を室温で１時間培
養した。反応混合物を次いで遠心分１°＋Ｉし、上澄液
を頑瀉した。管中に残った放則能（これは特定結合剤に
結合した放射ｔ１にのその部分である）を測定した。分
析は免疫分析系中の遊ＭｉＩ　Ｎ工ｐ　−ｃａｐ　ｉＪ
％度を用いて補正した。これはＮ１Ｐ−ｃａｐおよびア
ルブミンの解凶ｌ［定攻の値を用い試薬で稀釈した効果
に対して調整することによってアナライト溶液の遊離Ｎ
工ｐ　−ｃａｐ　濃度から計算した。 下記結果はこの方法を用いて得られた結果の代表例であ
る。 実施例　２ 種々な濃度のアルブミンを含仔する溶液中の遊ＰＨＩ　
ＮＩＰ　−ｃａｐ　ニ対−ｒ　ル分析この実験は（超濾
過透析）参考法を用いて得られた値と、遊離Ｒ工Ｐ　−
ｃａｐ　濃度の測定に対し本発明の方法を用いて得られ
た値を比較するために計１＠シた。 ＮＩＰ　−ｃａｐはヒト血清アルブミンを含有する緩衝
剤に溶解し、ラベル付き抗体および固体相抗体で稀釈し
た。これらの温液の遊離Ｎ工Ｐ−ｃａｐ濃度は実施例１
の方法で測定し、た。かくして得られた値を、アナライ
ト溶液の超濾過から計算した値に対して比較した；これ
は遊１λＩＬアナライトのｒａＫの正ＷＪ測定に好適な
方法であると当業者によって考えられている方法である
。 下記結果がかかる比較で得られた結果の代表例である。 二つの方法で測定したときの破Ｐ＋ＩｆＬＪ工ｐ−ｃａ
ｐｉ農度の相関係数は０．９８であった。これらの結果
から、−アナライト結合蛋白式が濃度において４４ざも
大きく変化したときでさえも、遊離Ｎ］、Ｐ　−ｃ、＋
４）ｒ農産Ｏ月１１１定のための超ｉｐ　ｉｆＡ透析と
本発明方法の間に近似１７だ一致があることが明らかで
ある。これは遊離アナライトの測定番こ本発明方法の好
適性を明示している。

【図面の簡単な説明】

第１ｍは従）１ξの分析の反応１゛シ１であり、第２図
および第３図は本発明による分析の反応１イ１である。 。 ｌＯは血清結合蛋白質、１２　（まアナライト、１６は
特定結合剤、１８は抗体。 ラド・コムバニー −Ｉ阿ｊ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　アナライトの遊離部分がｒナライＩ・のためのｌ
   挿具」二の天然結合剤に結合したアナライトの部分も含
   有４″る生物学的流体中に存在し、アナライトの結合し
   た部分右よび遊１’ｉｌｔ部分が相互に平衡状態にある
   アナライトおよびそのための特定結合剤からなる特定結
   合対の１員であるアナライトの遊＋’ｉｌｔ　ｇｌｓ分
   の濃度を測定する方法であって、 （〜特定結合剤に対リーる抗体と、および°Ｔアナライ
   トための特定結合剤のある量と生物学的流体の試料の混
   合物を形成し、上記特定結合剤の債を上記平衡に実質的
   に影響を与えるには不充分な量とし、上記抗体および上
   記特定結合剤の少Ｉλくとも一つをラベル付けし、ｆｂ
   ｌ抗体およびアナライトの遊へ１１部分を特定結合剤−
   Ｌの結合位置薯こ対し競争さぜることができ、試料中に
   存在するアナライトの遊ｆ’ｌｉｉ部分の１′農度によ
   って決る割合でそれに結合するようになる時間上記混合
   物を保持し、 （ｃｌ抗体に結合した特定結合Ａ’ｌＪの−および／ま
   たは抗体に結合しなかった特定結合剤の市を測定し、 ｃ山側定値を生物学的流体中の」′々ｉ：　ｉ’ｆｉＬ
   アナライトの濃度の測定に使用する ことを特徴とする方法。 ２、抗体が抗遺伝型抗体である特許Ｗ？Ｊ求の１・１１
   囲第１項記載の方法。 ３、抗体がラベル付けされている特許請求の１・１χ囲
   第１項または第２項記載の方法。 ４、特定結合剤を不溶性の形で使用する特許請求の範囲
   第３項記載の方法。 ５、特定結合剤がアナライトに対する抗体である特許請
   求の範囲第１項〜９Ｊｒｊａ項の何れか一つに記載の方
   法。 ６、特定結合剤がモノクロナル抗体である特許請求の範
   囲第５項記載の方法。 ７、　抗体が特定結合剤に対するモノクロナル抗体であ
   る特許請求の範囲第２項〜第６項の何れか一つに記載の
   方法。 ８、　アナライトのための特定結合剤の供給源、および
   特定結合剤に対する抗体の供給源を含み、特定結合剤お
   よび抗体の少なくとも一つがラベル付けされていること
   を特徴とするアナライトの結合した部分および遊離部分
   が相互に平衡状態にあり、アナライトのための１種以上
   の天然結合剤に結合したアナライトの部分も含有する生
   物学的流体中に存在するアナライトの遊離部分の濃度を
   測定するための分析キット。 ９、特定結合剤が不溶性の形であり、抗体がラベル付す
   されている特許請求の範囲第８項記載のキット。 １（）、特定結合剤が°ｒアナライト対Ｖるモノクロナ
   ル抗体であり、抗体が特定結合剤に対するモノクロナル
   抗遺伝型抗体である特許請求の範囲第８項または第９項
   記載のキット。