JPS5984828A - 安定化免疫複合体およびその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、安定化免疫複合体、およびそれを利用した免
疫グロブリン抗体力価の測定法または抗体活性成分のク
ラス、サブクラスの同定方法に関するものである。詳し
くは、免疫反応の特異性を高める安定化免疫複合体およ
び抗原抗体反応の改良に関するものである。

近年、医学、生化学、衛生ｉ、疫学および遺伝子工学等
の種々の分野において、微量物質とくに抗原および抗体
を定量することや、更に抗体を構成する免疫グロブリン
のクラス、サブクラス、タイプ別レベルでの抗体活性を
定損゛することが、極めて重要な課題となっている。

従来、この様な方法としては、抗原または抗体を感作さ
せたラテックス乞、ガラス板上で抗体または抗原と反応
させ、その凝集状態を肉眼で観察する方法が広く用いら
れている。

また希釈抗体を対応する抗原ヲ含む検体と反応させ、形
成された抗原−抗体複合体の光散乱を利用するとか、比
濁の比色による測定献１ζ♂ａさらに抗原−抗体反応系
において、該抗体を水に不溶な担体に感作し検定する方
法として放射免疫測定法〔ラジオイムノアンセイメンズ
（Ｒａｄｉ。

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　）　４８１
　ｉ　、　１９７１年、イギリス国参照〕、醇素免疫測
定法〔クリニカルケミストリー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｇ
ｂｅｍｉｓｔｒｙ）　２２巻。

１２４６向−１２５５画、１９７６年参照〕、光散乱あ
るいは光学的６１１１定法および凝集反応が公知である
。

〔例えば、クロアチアケミカアクタ（ＧＲＯＡＴＬＡＧ
ＨＩＩＣ；Ａ　ＡＣ；ＴＡ　”）　４２巻、４５７−４
６６自。

１９７０年、ユーゴスラビア国；ユーロピアン　ジャー
ナルオプバイオケミストリ−（ＥｕｒｏｐｐａｎＪｏｕ
ｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　）
　　２０巻１４号！５５８−５６０函、１９７１年、ド
イツ国およびイムノケミストリー（Ｌｍｍｕｎｏ　Ｃｂ
ｅｍｉｓｔｒｙ　）　１２奉書６４９−ろ５１白、１９
７５年・イギリス国参照〕かかる免疫反応の迅速性、島
感度、操作の簡易性等の不意性はあるが、被検体中に含
まれる非特異的干渉因子に起因する主反応以外の好まし
くない非特異的反応が問題である。かかる非特異的反応
は該免疫反応の特異性ケ著しく陥害し、往へにして不正
確な結果を提供し、この確認の為に繁雑な操作を必要と
した。

また、Ｆｃ部分による非特異的１工反応娑防止するため
に、Ｆ（ａｂ’）ｚ部分のみを抗体として担体に感作し
た免疫反応系もすでに公知である。〔例えば、ジャーナ
ルオブバイオケミストリ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
ｉｏｃｂｐ＋ｎ１ｓｔｒｙ　）　’ｉ３１巻＋１５５７
頁、１９７７年およびヨーロビアンジャーナルオブイム
ノロジ−（Ｅｕｒｏｐｅａｒ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｌ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　）　５巻、２７４頁、　１’９７
５年参照〕免疫化学反応で頻用される抗体″は免疫グロ
ブリンＧ（ＩｇＧ）クラスであり、１ｇ０分子はＦａｂ
とよはれ石部分２個とＦｃとよばれる部分１個とから成
立っている。抗体活性の上では、　Ｆａｂ部分に抗体の
特異活性７示す抗原結合部位が存在し、Ｆｃ部分は袖体
との結合、ヒフ感作−リウマチ因子の結合などに関与し
ている。１ｇ０分子の栴成各分画は、　Ｆ　（ａｂ’）
２＋　Ｆａｂ’　＋　Ｆａｂ　ｒ　Ｆｄ　＋　Ｆｃなど
の記号でも示される。

Ｆ　（ａ　ｂ’　）２は免疫グロブリンをペプシンで消
化して得られ、これンメルカグトエタノールで還元切断
するとＦａｂ’　　２個に解離する。これらは酸化によ
ってまたＰ′（ａ　ｂ’　）ｚは再生される。Ｆａｂは
免疫グロブリンをパパインで分解して得られ、これを更
に還元、アルキル化してＦｃＹ得る。

以上のととき理Ｍを基盤として筒井聡明らは免疫グロブ
リンはもとよりＦ　（ａ　ｂ’　）２抗体を用いる反応
で１さえも好ましくない非特異的反応要因の存在ア見出
し、この反応を防止するために鋭意検討を加えた結果、
（１）免疫グロブリンの構成分画（Ｆ（ａｂ’）ｚＩＦ
　ａｂ’　＋　Ｆ　ａｂ　＋　Ｆ　ｄおよびＦｐ、）　
’＆有効成分とする免疫反応の安定化剤および（２）反
応媒体中で、測定すべき抗原または抗体と、それに対応
する抗体または抗原とを反応させる抗原−抗体反応の測
定法において、抗原と抗体どの反応欠、測定ずべき抗体
または測定すべき抗原に対応する抗体とは異なる免疫グ
ロブリンの構成分画の存在下に行うか。

測定すべき抗原または抗体を含む検体と該構成分画を予
め接触処理し、該構成分分画の反応物な分離除去後行う
ことン特徴とする抗原−抗体反応の測定法ン開示してい
る（特開昭５７−９７２３．全８頁、１５６〜１６０負
）。

しかし、なお不特定多柿多様な被検体中に含まれる非特
異的干渉に起因する主反応以外の好ましくない非特異的
反応を常に的確に除外することは原理的に限界がある。

すなわち本発明の要旨は。

その最大の因子は抗体分子の主としてＦｃ部分への非特
異的１工に基因することに着目して、適当１、Ｃ方法に
より１１＋測定すべき抗原に対応する抗体を構成する免
疫グロブリン分子のＦｃ部位を特異的にマスクし、他方
特異的な抗原結合部位にあたるＦａｂもしくはＦｄ部位
を遊離型にとｙめた安定化免疫複合体および（２）それ
らを用いることを特徴とする抗原−抗体反応の測定法に
看するつ以下本発明の詳細な説明するっ 測定すべき抗原に対応する抗体のＦｃ部分による非特異
的１に反応ン防止するために＋１）プロティンＡまたは
（２）該抗体のＦｃＫ対応する第２抗体を結合させると
Ｆｃ部分がマスクされる。これを固相の安定化免疫複合
体にするには（１）のプロティンＡの代りに、プロティ
ンＡ−Ｊｉ担持せしめた微粒子担体であるプロティンＡ
−セファロース０Ｌ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎ
ｅ　Ｏｂｅｍｉｃａｌｓ社製）　’Ｙ、　（２１では、
第２抗体にプロティンＡ−セファロースＣＬ４Ｂｙ＜各
々結合させる。簡略に図式化すると以下の２神になる。

なお、抗体とプロティンＡ−セファロース０Ｌ４Ｂとの
結合は０．０５Ｍ）リス、０．１５ＭＮａＧｔ、ｐＨ８
，６からなる緩衝液を通常用いて行うが１モル濃度は変
更してもよい。重要なパラメーターはｐＨである。第２
抗体乞予め結合せしめたプロティンＡ−セファロース０
Ｌ４Ｂに図式（２）のごとく第１抗体を結合させるとき
も同じ緩衝液ｐＨ８，６’ｆ、用いる。

セファロースの代りに他の担体系を用いてもよい。微粒
子担体は１通常、水性媒体に実質的に不溶性の粒子であ
る。材質としては、＾分子商機化合物１例えはポリスチ
レン・スチレン−ブタジェン共重合体・ポリアクリル酸
エステル、ポリアクリル酸エステル、アクリルニトリル
−ブタジェン−スチレン共重合体やこれらの重合体中に
アクリル醪、メタクリル酸、アクリルアミド等を共重合
させてカルボキシル基または、アミド基等を導入して活
性化した重合体のラテックス；シリカ−シリカ−アルミ
ナ、アルミナ等の無機酸化ｔｊｆｌＸＪ＝鉱物粉末；金
属粉末：血球あるいはブドウ球菌：連鎖球菌等の球菌型
の細菌・霊菌またはリケッチアおよびそれらの破片等か
挙げられる。

これらの微粒子担体の太・きさは、その平均粒径が、好
ましくは０．１〜１．０１１ｍ、特に好ましくは０、２
〜（Ｊ、　５　μｒｎでアル。

前記微粒子担体へのプロティンＡの結合には。

周知の方法すなわち、微粒子担体へのプロティンＡの物
理的吸着もしくは化学的結合の倒れも用いられるし、こ
の両者を併用してもさしつかえない。

担体に結合さぜるプロティンＡの敏は目的とする測定の
梢欧等の条件により、適宜選択決定する。

本発明の安定化免疫複合体およびその利用方法によれは
、抗原ま、たは抗体乞免疫化学的に測定しようとすると
ぎに起る非特異反応乞回避し、そのｎ＋１＋足の特異付
ケ高めるにとど止らす、さらに固相の免疫複合体におい
てはマイクロプレートゲルいての１１１１巣な実験操作
により測定ずべき超９１．ｍの抗原もしくは抗体を物理
化学的、免疫（化学的もしくは生物学的に測定できるし
、とくに抗体については抗体を構成する免役グロブリン
のクラス、サブクラスおよびクイズ別のレベルでの抗り
活性をもｆｌｌｌｌ定することかできる。

以−トにマイクロプレート火剤いての微与抗ヒト免疫イ
ンターフェロン抗体の測定法を１本発明の同相の兎疫祖
合体ン適用して行う実験操作を今日的典型的な実施例の
一つとして挙り′て１本発明馨史に計１１１］に説り」
するが５本発明は特許請求の範囲の各項目および既述の
発明の詳細な説明内容７越えない限り、以下の典型的実
施例により限定ケ受けるものではない。

実施例 （１）主題 ヒト免疫インターフェロン（以下［（ｕ−ＩＦＮｒと略
す）に対応する特異抗体の免疫化学的ならびに生物学的
手法の絹合せによる測定に用いる固相の免疫複合体およ
びＨＬＩ−ＬＦＮｒ特異抗体の辿１定。

（２）　　目　　的 少油の試験採血時の非動化（５６′・ろ０分）血清腹水
上清あるいは雑種細胞株：Ｂ−セルハイプリドーマ培養
上清を試料として１［Ｊ　Ｑ　、ｕ　ｌレベルで予めカ
ラムクロマトグラフィーや輔、安沈澱法などの操作を行
わずにマイクロプレートを用いての簡易な実験操作のみ
で１本発明による固相の安定化免疫複合体を適用してＨ
ｕ−ＩＦＮｒに対応する結合性抗体を測定し、さらにそ
の抗体成分を構成する免疫グロブリンのクラス、サブク
ラスおよびタイプレベルでの抗体活性を測定するう １３＋　　材料および試薬の調製 プロティンＡ−セフ　７　ＣＩ　−、ｘ、　ＯＬ＋　４
　Ｂ（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｂｅｍｉｃａｌｓ
　）　Ｙ予め０．０５　Ｍ　）リス？Ｑ、１５ＭＮａＧ
Ｌ　、　ｐ）１８．６　　Ｙ用いて膨潤せしめゲル＠濁
液４焙希釈液乞調製しておき、それに目的に応じて以下
に示す特異抗血清の上記緩衝液で４倍希釈しろ過滅菌し
たものを同量添加して同相の安定化免疫複合体を形成せ
しめ、同一の緩拘液を用いて低速遠心（８００ｒｌ）ｍ
＝５分間、２０’）と洗浄を繰返して調製した。

特異抗血清の種類は目的に応じて選択した。

（Ａｌ　　家兎血清試料について抗体活性を迎ｊ定する
には山羊抗家免ガンマグロブリン− （Ｂ）　　マウスの腹水上ｆ＃　’ｔたはマウス雑神細
ｎ４株により産生されている抗体を含む培養上清につい
て： （Ｂ−１）抗体活性を測定するには雰免抗マウスＬｇＧ
（Ｆ’ｃ）Ｉ （Ｂ−２’）抗体のクラスまたはサブクラスレベルでの
抗体活性を測定するには山羊抗マウスＩｇＭ、家免抗マ
ウスＩｇＧ１＋１免抗マウスｌ　ｇ　Ｇ　２ａ　＋家兎
抗マウス１ｇＧ２ｂＴＷ免抗マウスＩｇＧ３’ｌｋ用い
た。ゲル懸濁液と特異抗血清希釈液との混合比率は特異
抗血清がプロティンＡ−セファローズ０Ｌ４Ｂゲ／ｌ／
’％’充分に飽和する量であることが重要なパラメータ
ーであった。

の標準希釈液 用時、　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ　Ｋ　Ｆ’Ｏ８’！ｌ
’　０．６　％〜１　％含む溶液で希釈した。

ろ−６）トリプシン・ＥＤＴＡ浴液 最終濃度０．０５チトリグシンに０．０２チ（１０ｍＭ
）ＥＤＴＡを含む溶液χＦＪｒ４製して濾過滅菌（０，
２２ｍＭＭＬＬＬＥＸ）して＋４Ｃで保存した。

３　４）　Ｆ！、ａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭに１０％Ｎｃｓ
’ｖ添加した溶液 ＭＢＪＭ（粉末）を９．６Ｖ−／ｌの浴液とし、１２０
Ｕ。

１５分間オートクレーブしたのち、＋４Ｃで保存した。

Ｚ５％ＮａＨＣ；０３でｐ　Ｈ７，３±αに溶液７色調
で判定したのち、１０％ＮＣ８を加えた。

３−５）　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍ　ＥＭに０．６％Ｆｃｓ
’ｒ添加前項１０％Ｎ　ＯＳの代りに０．６％ｈ’　ｃ
　ｓを加えた。

（４）方法 操作 ■　固相の安定化免疫複合体〔前述の６−１）記載〕の
８倍希択恕〜ゲルを絶え間なくよく混和しながら５０μ
ｔ／ｗｅｌｌ　　分注した。

■　トリス緩衝生理食塩液ｐＨ８，６Ｙ用いて予め希釈
調製した検体試料、対照試料、および対照の抗体価既知
の抗血清（抗ヒ１−ＩＦ’Ｎｒ家免血消ロット＆Ｒ−６
４）の標準台νく液Ｙ　Ｉ　Ｕ　［Ｊ　ｐｉ／ｗｅｔ　
１対応する固相の安定化免疫複合体の分注されている穴
へ添加して、マイクログレート振盪器（Ｍ　ｉｃｒ。

−ｍｉｘｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　ＭＸ−４）に掛けて室温で
６０分間、低速振盪し、６０分間静置後、遠心器（日立
Ｒｅｆｒｉｇｒａｔｐ、ｄ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　０
５ＰＲ２２）に掛けて、　２００Ｏｒｐｍ　、５分間、
２０°にて遠心分離後。

上清を除去してトリス緩衝生理食塩液ｐＨ８，６を１５
０μｔ／ｗｅｌ１分注して室温で１０分間、低速振盪し
、１０分間静蒔後、同様の栄件で遠心分離して上゛ｍを
除去した。

なお、対照試料は検体試料に対応して１例えは検体献料
が家免面消の場合には無感作の同系家兎から得た非動化
家兎血清を同一の緩倶ＳｔＬで同じ希釈倍数に勲製した
ものを用い、検体試料がマウスハイプリドーマ培養上清
または、そのノ＼イプリドーマ培査上清または、そのノ
・イブリドーマをプリスタン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ
　ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）で前処理マウスの腹腔内に
移植して得られた腹水上７６の場合には、前者に対応し
て、ノ・イブリドーマ作成のときに細胞融合をご用いた
ミエローマ細１１ｉ１の培養土苗χ、後者に対応して、
そのミエローマ細胞を腹腔内に移植して得られる腹水上
７Ｈを用いた。

■　ヒト、ＬＦＮｒ標準希釈液（辿常１０Ｕ／Ｉｎ７）
ａ’５０μｔ／ｗｅｌｌ添加してから、マイクロプレー
トン完全に密封して４Ｃで一夜放置した。なお、その際
、希釈には前項ろ−５）記載のＥａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ
に［１，６％Ｆ（３８を添加した溶液を使用した。

４−１−Ｂ）　　平底９６六マイクロプレートでの操作 ＦＬ−細胞ン前項ろ−４）記載のＥａｇｌｐ’ｓ　ＭＥ
Ｍに１０チＮＧＳ−ｇ添加した溶液ン用いてＴ−ｉｓ。

フラスコで予め２〜４日間、細胞培養したものから培養
上清ケ除去し、同じ培養液ヶあらためて添加して洗浄し
たのち、前項６−６）記載のトリプシｙ、ＥＤＴＡ溶液
”１８ｍ１／Ｔ−１５０フラスコ宛、添加して、フラス
コの底面に癒着しているＦＪｌｌｌｌｌａかＭ離して球
状になるまで反応させた。解離したＦ　Ｌ、細胞浮遊液
をガス滅菌済みの５ＱｍＪ用プラスチック乞遠心管に移
して遠心した（１５００ｒｐｍ。

５分間・４Ｃ）。上清を除去したのち、沈澱しているＦ
　Ｌ細胞へｈ：　ａｇｌ　ｒ；’ｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　（−
１Ｙ添加してピベツテングしてＦ’　Ｌ細胞の懸濁液と
して再度、同様に遠心、上清除去、Ｍｉ！；Ｍ（ｌ添加
の洗浄操作？数回繰返したのち、前記３−４）記載のｌ
（ａｇｌｐ’ｓＭＥＭに１０チＮＯ８を添加した溶液ケ
添加してＦＬ細胞の懸濁／Ｉ？Ｌ乞２．５　Ｘ　Ｉ　Ｑ
　　ｃｅｌ　ＩＳ／ｍｌに調製した。

これを ■平底マイクロプレートに１０［］μｔ／ｗｅｌ１分注
し。

■２．５チＣＯ３一度、６７°で一色培養した。

（４−２）第２白目 ■　第１Ｂ１に密封し℃、４°にて−（＋−放１夕した
■底マイクロプレート馨低速遠心した（　、２０００ｒ
ｐｒ口・５分間、２０’）。

■　Ｆ’ＬＩｖｌｌＩ胞を培養している前述の平底マイ
クロプレートへ、前項■記載の遠心、ト消乞５０．ｔＬ
ＶＷ（！１１分注した。

■　２．５チＣＯ□濃度、７）７″′で一晩放置した。

（４−３）ｍ３日エラつルスｉ＜’ｒｇ加（Ｖ　１ｒｕ
ｓ　Ｃｂａｌ　Ｌｐ＋＋ｇｅ）■　−８０ｔ、’凍結保
存のＳ　Ｂ　Ｖ　（５ｉｎｄｌ〕ｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）原
液を解凍して１５　ａｇｌ　ｅ’ｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　（−
）で希釈し又（通常２０倍希沢）　、　ＴＯＬＤ　５０
　（ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｂｉｂｉｔｏｒｙ
　ｄｏｅｓ　５０　）　；　（１００単位三ｌ　Ｕ　／
ｍｌ　）懸濁液ｙ！ｌ−調製した。

■　第２白目（４−２）■記載の試料を添加したＦ　Ｌ
　ｔｉｌｌ　ｌｉｔ培養の平底マイクロプレートを炭酸
ガスインキュベーク−からとり出し、予め１６０’。

９０分間、乾熱滅閉処坤済みのキムタオル上で数回トラ
ッピング（ｔｒａｐｐｉｎｇ　）　して上清を除去した
。

■　％Ｊ記■記載のマイクロプレートへ■記載のＳＢＶ
希釈懸Ｍ液’ｔ’　１００　μ／−／ｗｐ、ｌｌ添加し
て。

２．５チＣ６濃疫、６７°、にてｉ晩放１ｇシたつなお
１本項（４−３）のウィルス添加に用いたものはすべて
１２１°、２０分間、オートクレーブに掛けた。

（４−４）第４日目染色お′よび判定 ウィルス添加後、約２４時間以上経過後に染色操作を行
うが、その際、顕微鋭下にて、未染色の状態で、ＦＬ細
胞に５ＢＶＹｉ加しておいたプログラムの六を観察して
Ｆ’　Ｌ細胞が充分に破壊されていること’ａ？４１ｉ
ｉかめた。破壊が不充分であれは。

培養時間乞延長したのち、染色操作ン行った。

■　ウィルス添加したＦＬ細胞培養のマイクロプレート
を前項（４−５）■記載と同様にキムタオル上で数回ト
ラッピング（ｔｒａｐｐｉｎｇ　）　して上清を。

除去したのも、１％クリスタルバイオレット　（Ｃｒｙ
ｓｔａｌ　Ｖｉｏｌｅｔ　）　Ｙ約２００　ｐ　Ｌ／ｗ
ｅ　Ｉ　ｌ添加して。

約２〜６分間染色した。次いで流水でよく洗浄したのち
、数回トラッピングして水滴を除いたのち。

乾燥器に約１時間かけて乾燥した。

■判定 （２−１）・ＦＬ細側単独のフログラムが１強く青色に
染色されており、　（ｔｌＪ方、ＦＬ細胞に５ＢＶ）２
添加のグログラムがほとんど染色されずにほぼ透明であ
ることを確かめた。

（２−２）ＦＬ細胞にＨｕ−ＩＦＮｒ標準希釈液（６倍
段階希釈系列）乞添加したのちＳＢＶヶ徐加したプログ
ラムか、染色度合が段階的になっていること乞確かめた
。通常）１ｕ−ＬＦＮγ、１Ｕ／ｒａｔで染色され、０
，６ろＬｌ　／ａｉで染色洩が約５Ｕチ低丁していた。

（２−３）Ｆ’Ｌ細胞に対照状ＩＩの同相免役複合体処
理上ｍＴｆ：添加し５ＢＶｉ添加して、プログラムが強
く青色に染色されていみのを確かめた。

（２−４）ＦＬ、細胞に検体試料の同相免疫複合体処理
上清を添加しＳ　’Ｂ　Ｖを添加したプログラムについ
て染色の度合も前記（２−２）のＨｔｉ−ＬＦＮγ１Ｕ
／ｒｎｅおよびＣＬ５５Ｕ／ｍｌの場合と比較して。

後者よりも染色度が低いかまた（・工はｇ透明であれは
検体試料は陽性、前者と同等であれば陰性、前者と後者
の中間の場合には１次項のプログラムと比較したつ （２−５）Ｆ’Ｌ、細胞に抗体活性既知の抗８ＬＩ　−
Ｉ　Ｆ’Ｎ　ｒ家兎ｎｎ　ｔ＊の標準希釈液（６倍段階
希釈液）の固相！Ａ１疫複合体処押上消上清加しＳＢＶ
を添加してプログラムについて染色の度合を前記の検体
試料の場合と比較して、抗体活性の廟無を染色度がはｇ
５０チ低下しているレベルで決メタつ （５）結果 プロティンＡ−セファロース０Ｌ４Ｂは品質的にロット
間の品質の差はほとんど認められ、ず、はｇ均一であり
、従って、原典的に、これと結合せしめた抗体との結合
比率は一定していた。

抗１（ｕ−Ｌ　Ｆ　Ｎγ活性の検出感度は固相の安定化
免疫複合体ケ調製する際に用いる抗体の免疫グロブリン
量をプロティンＡの結合能を上廻る過剰な充分量ゲルい
さえすれば、抗体の棹類およびロットの差異による影響
はほとんどなく、添加するＨｕ−ＬＦＮｒ抗原量により
左右されたつずなわち、Ｈｕ−１ＦＮｒ抗原濃度を１（
ＪＵ／ｍｌにて１本法に当てはめたときの感度が最大で
あり、１Ｕ／ｍｇより低濃度にすると再現性がわるくな
り判定が困難であった。（表１参照）。

表１　特異抗体として山羊抗家兎ガンマグロブリンを結
合せしめた固相複合体（プロティンＡ−セファｏ−ス）
ｙ用いたＨｔ＋−ＩＬｉ’Ｎｒ抗体力価の測定 （表１の説明） ＊　　ベーリングベルゲ製、　Ｌｏｔ　１１８９０６　
　Ｂ＊＊　　プロティンＡ−セファロースＯＬ−４Ｂ（
ファルマシアファインケミカルズ製。

Ｌｏｔ　２３４２７　） ＊＊＊　　イムノモジュレーターズラボラトリー製。

Ｌｏｔ　８２０４−Ｇ 表中、＋は、試料中にＨｕ−ＩＦ’Ｎγ抗体活性が認め
られたこと、即ち抗原として添加した）ｌｕ−１Ｆ’Ｎ
で活性が消失していたことを示す。

（＋−）は、抗’１５ｆｉ　（）ｌｕ−ＬＥＩ’Ｎ　）
と固相化複合体との非特異的反応により、添加したＨｕ
−ＩＦＮ活性が消失し十と判定されたと思われるものを
示す。即ちこの測定条件においてはＱ、　４　Ｕ　／ｍ
ｌの抗原量でをオ、不足であることを意味す′る。この
表に示した結果から、添加する抗原ｔ　（Ｈｕ−ＩＦ’
Ｎ）は１０Ｕ／ｉｌ以下が適当であると考えられる。

固相の安定化免疫複合体ヲ構成する特異抗体の神類を目
的に応じて変更しても感度は両者で有意差は認められず
、　Ｉ（ｕ−ＩＦＮｒ抗原濃度１０Ｕ／ＩＬｌ乞用いて
実施したところ、再現性よくマウスハイブリドーマ産生
の抗Ｈｕ−ＩＦＮγの抗体活性を測定できた（表２参照
）っ ＊＊ 表２　家兎抗マウスＬｇＧ（Ｆｃ）　　Ｙ結合せしめた
固相複合体ゲルいたＩ（ｕ　−Ｌ　Ｐ’　Ｎγ抗体産生
）・イブリドーマのスクリーニング （表２の説明） Ｏ表中１列、２列および１２列目はコントロール。

６列から１２列まで（二重枠で囲んだ）は検定すべき試
料。

＊コントロールの説明 ｌ　Ａ　、　Ｉ　Ｂ　、　１０＋ＩＦ　Ｌ細胞２Ｘ１０
５ケ／ａ／ノみ。

・Ｉ　Ｄ　、　Ｉ　Ｅ　、Ｉ　Ｆ＋’！Ｆ’ＬＪ：（ｌ
ｌ側ＩＣ８Ｂ　ＶＹ添加。

・ＩＧ、１）１および１２Ａがら１２Ｆ゛まではハイプ
リドーマ作製用に用いたミエローマ細胞培養上清を同相
免疫複合体で前処理して得た試料乞ＦＬ細胞と混合した
のちＳＢＶを添加。

・１２Ｇ、１２Ｈは非動化家兎血清７．Ｆム細飽に加え
たのちＳＢＶ乞添加。

・２列目（２Ａから２Ｈまで）は、ＦＬ細胞にＨｕ−Ｌ
Ｆ’ＮｒＹ１００Ｕ／ｍｌ（２Ａ　）からｏ、７８Ｕ／
ｍ１（２Ｈ）まで順にｙ２希釈して添加後ＳＢＶを添加
。

Ｏ十のマスは染色されなかった穴を示し、−は有色に染
色された穴を示す。

＊＊　Ｍ　Ｂ　ＬＲＬｏｔ　０１−２２プロティンＡ−
セファローズに特異抗体として家兎抗マウスＩｇＧ（Ｆ
’ｃ）Ｙ結合ぜしめた固相安定化複合体を用いて、Ｈｕ
−４Ｆ’Ｎｒ抗体産生Ｂ細飽ハイブリドーマのスクリー
ニング７行つた結果７示したのが表２である。尚１表２
における各マスは本実験に用いた９６六マイクロプレー
トの各穴を示し、１列と２列および１２列目はコントロ
ール（表２の説明文参照）、６列から１１列までがＨｕ
−ｊ、ＦＮγ抗体産能欠調べろべき試料（）・イブリド
ーマ：１ｌ−７２ケ）である。このマイクロプレートで
は５Ａと７Ｂの２つのハイプリドーマにＨｕ−ＩＦＮ抗
体頗生能があることがわかった。

表６は、山羊抗家兎ガンマグロブリン（ベーリングベル
ケ製Ｌｏｔ　１１８９０６−Ｂ）Ｙ結合ぜしめた固相安
定複合体暑用いて、ハイブリドーマ細胞が産生するＨｕ
−ＬＦＮγ抗体の力価の測定を行った結果を示す。表中
、＋は染色されなかったもの１．−は青色に染色された
ものを示す。検定すべき試料（表中二重枠で囲んだ３列
から１１列゛まで）においては、Ａ段からＨ段にかけ（
但し５列と６列目は各々Ａ段からＤ段にかけ、とＥ段か
らＨ段罠かけ）試料が＃ｌｌ’ｔに希釈されているう従
って１判定が十から−へ変る点での感度から試１ｆ１の
）ｌｕ−ＩＦ’Ｎγ抗体力価ケ算出することかできる。

特出した抗体価は、定■すべ敦試料の説明の末尾にそれ
ぞれ示す。

表６　固相免疫複合体を用いた）ｌｕ−ＩＦＮｒ抗体の
定噴 （表６）の説明 ０表中１列、２列および１２列目はコントロール。

６列から１１列まで（二重枠で囲んだ）は定量すべき試
料　。

＊コントロールの説明 ＩＡ、　ＩＢ、　１０はＦＬ、細胞２　Ｘ　１０５ケ／
ｒｕｇ　ｃ７）　ｋＩ　Ｄ　、Ｉ　Ｌ　ＩＦ　＆！Ｆ　
ＬｍｌｉａＫＳ　Ｂ　Ｖ　ｋ添加１Ｇ、１［（、は非動
化家兎血消ン同相免役複合体（表１と同一）で前処理し
た試料をＦＬ細胞に添加したのちＳＢｖを添加 １２Ａから１２Ｄまではハイブリドーマ作製に用いたミ
エロ−マ細胞のマウス腹腔内培養の非動化腹水上清乞同
相免疫複合体（表２と同一）で前処理した試料−（（Ｆ
ＪＩＩ胞に添加したのちＳＢＶ乞添加 １２ｆ！；から１２８まではハイブリドーマ作製に用い
たミエローマ細胞をＴフラスコ内で細胞培養の非動化培
養上清の５倍濃縮溶液を同相免疫複合体（表２と同一）
で前処理した試料−１ＦＬ、細胞に添加したのち５ＢＶ
）１添加 ２列目（２Ａかも２Ｈまで）はＨｕ−ＩＦＮ□ｒ（表１
脚注３）Ｙ１００Ｕ／ｍ１（２Ａ）から０．７８Ｕ／ａ
（１＜　２Ｈ）まで倍々希釈シタ浴液をＦＬ細胞に添加
したのちＳＢＶン添加 ＊＊定量すべき試料の説明 ろＡ、から３Ｈまでは家兎用１清抗Ｈｕ−４ＦＮγ（Ｉ
ＭＩ、−１１−Ｉ（６５）の１００倍希釈液を１１１１
！１次倍り希釈したもｆｆ）　ＣＸ１０　Ｄ−＋３　Ａ
　　Ｘ　２００→６Ｂ・・・・・・Ｘ１６Ｌ１０−＋３
Ｅ・・・・・・Ｘ１２，８００→３）（）を同相免疫複
合体（山羊抗家兎ガンマグロブリン表１・脚註１）を結
合せしめたもの）を用いて前処理した試料ｉＦＬ細胞に
添加したのちＳＢＶ乞添加。

抗体価：１６００Ｕ／Ｉｎ１ ４Ａから４Ｈまでは家兎血消抗）１１１−Ｌ　Ｆ’Ｎ　
ｒ（ＩＭＬ−１１−８Ｐｆ（−６−８２１０２５）の倍
へ希釈浴液（×２→４Ａ、Ｘ４→４Ｂ、・・・−・・×
１２８→４Ｇ、Ｘ２５６→４Ｈ）を前項同様処理した試
料をＦＬ細胞に添加したのちＳＢＶ乞添加。　　　　　
　　　抗体価；１２８Ｕ／ｍ１５Ａから５Ｄまでは家兎
血清抗Ｈｔ＋−Ｉ　Ｆ　Ｎ　ｒ（ｉＭＬ−１１−８ＰＦ
ｔ−８−８２１０２５）の希釈溶液（×２→５Ａ、Ｘ４
→５Ｂ、Ｘ１３→５Ｃ，Ｘ１６→５Ｄ）　　について前
項と同様に実施っ抗体１ｉｔｔｉ；４　Ｕ　７ｍｌ８ ５Ｅから５［１までは、家兎＋ｍ　ｆＨ杭ｔ（１１’１
．ＦＮ７（Ｇ　Ｉ　Ｆ’・５Ｄ−８ＰＥ（−１０−８２
１０２５）の希釈溶液（×２→５Ｅ、Ｘ４→５Ｆ、Ｘ８
→５Ｇ。

Ｘ１６→５Ｈ）について同様に実施っ 抗イ？トイ曲　”、４Ｕ／ｍ１ ６Ａから６Ｄまでは家兎血ｆｆｔ抗Ｈロー１１”Ｎγ（
Ｇ　Ｌ　Ｆ−３；ｌ−８ＰＨ−１１−８２１［１２５）
の希釈溶液（Ｘ２．Ｘ４．Ｘ８・Ｘ１６）について抗体
価　；　　４　Ｕ　７ｍ１ ６ｈ：から６Ｈまでは家兎曲苗抗Ｈｕ−ＩＦ’Ｎγ（Ｇ
ＬＦ　ＳＬＪ　５ＰＵＲ１’２８２１０２ｂ）　ノ希Ｍ
Ｒ液（Ｘ２．Ｘ４．Ｘ８．Ｘ１６） ７Ａから７Ｈまでは家兎血消抗Ｈｕ−１に′’Ｎｒ（Ｇ
ＩＦ−８ａ−８ＰＲ−１６−８２１０２５）の希釈液（
×２〜Ｘ２５６）について 抗体価：’１６Ｕ／ｍｅ ８Ａから８８−ｊではマウス、１（Ｉｔ清抗［（ｕ−Ｉ
ＦＮｒ（ＧＩＦ’−８Ｄ−Ｂ５４−８２１［１２７）の
希釈液（×２〜Ｘ２５６）を固ＩＦ１免疫祷合体（家兎
抗マウＸ　ＩｇＧ　（Ｌ”ｃ　）ｌ’　２と同１））宛
結合せしめたもの）を用いて処理した試料ｙ、＝ＦＬ細
胞に添加したのち３ＢＶＹ添加つ 抗体価：２Ｕ／ｍＪ ９Ａから９Ｈまではマウス１１（！消抗８１１−４ＦＮ
ｒ（ＭＢｌ　１−（；ｏｎＡ２−Ｂ−５２−８２１０２
７）の希釈液（×２〜Ｘ２５６）ゲ同様に前処理しｔ−
試料について　　　　抗体価：８Ｕ／ｍ１１０Ａから１
ＤＨまではマウス血消抗日ｕ　−ＩＦＮｒ＜［１，−１
１−Ｂ−５７−８２１０２７）の希釈液（×２〜Ｘ２５
６）父同様に常処坤した試料について　　　　抗体価：
（３Ｕ／ｍぞ１１Ａから１１）１まではマウス腹水上清
抗Ｈｕ−ＩＦＮｒ（ＬＭＬ−１１−ハイプリドーマ８０
３−日６Ａ−Ｂ−２−８２１０２３）の希釈液（×２〜
Ｘ２５６）７同様に前処理した試料について　　　　　
　抗体価：　６４　Ｕ／１ｒｔ１表４は１種々の抗体成
分のクラス、サブクラスが感作して得られる特異抗体分
子を結合せしめた固相免疫複合体を用いて、Ｈｕ−ＬＬ
ｉ’Ｎγ　抗体産生ハイブリドーマの抗体活性の定量と
サブクラスの同定ケ行った結果を示す。表中１表２１表
６と同様＋は染色されなかったもの、−は染色されたも
のを示す。各マスの試料の詳細については１表の説明σ
）ところに記す。これらの結果は、ノ・イブリドーマが
産生する抗体活性成分クラスおよびサブクラスの１ｓｉ
１１定または同定ができたこと乞示す。

表４　固相免疫複合体を用いたＨｕ−ＬＦＮγ抗体産生
ハイブリドーマの抗体活性の定量とサブクラスの同定 （表４の説明） ０表中１列、２列および１２列目はコントロールで、内
容は表６のそれらと同一プログラム。６列から１１列ま
で（二重わくで囲んだ）は測定すべき試料である。

測定すべき試料の説明 １）６かも６までは抗体活性の定量に適用した。

検体試料として、抗Ｈｕ−ＩＦＮｒ（ＬＭＬ−１１）産
生のハイプリドーマＢ５２−Ｘ６５３−８０３−）］６
Ａの培養マウス腹水上清について３Ａから６Ｈまでは採
取個体識別Ｂ１−１０２６の希釈液（Ｘ２．Ｘ４．・−
・・・・Ｘ２５６）の同相免疫複合体（表２と同一の特
異抗血清で構成）前処理試料二８１−１０２６の抗体価
　１６単位／ｍｅ４Ａから４Ｈまでは採取個体識別Ｂ２
−１０２３の場合：　　　　　　　　　抗体価　６４単
位／ｒｎ１５Ａから５Ｈまでは採取個体識別Ｂ５−１０
２３の」ハ合：　、　　　　　　　　抗体価　３２単位
／ｍｅ６Ａから６Ｈまでは採取個体識別Ｂ５−１０２６
のＷ１合：　　　　　　　　　抗体価　３２　単位／ｍ
ｅ２）７から１１までは抗体のザブクラス同定に適用し
た Ａ段、Ｂ段は）］　ＩＩ　−Ｉ　Ｆ’　Ｎ　Ｙ　（表１
と同一）ノ各’ｓ５単位／ｍｌ、２単位／　ｍｌ’ｆｇ
　Ｆ　ＬＩｒ（ｌＩＩＩｉｌＫｆｆ１ｍ加後。

ＳＢＶを添加。

０段からＨ段までは下記の特異抗体で構成した同相免役
複合体を用いて前処理した試料につい実施例 ０段；家兎抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）（。表２と同一）０
段：家兎抗マウスＩｇＧ１　（Ｍｉｌｆ！ｓ　Ｌａｂ製
Ｌ＋しｔ６１） ６段；家兎抗マウス１ｇＨ２ａ　（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂ
製Ｌｏｔ６０） Ｆ段：家兎抗マウスＩｇＧ２ｂ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂ製
ＬｏＬ　２５　） ０段；家兎抗マウスＬｇＧ３（Ｍｉｌｒ：ｓ　Ｌａｂｖ
しりｔ２７） Ｈ段：ヤギ抗マウスＬｇＭ（Ｇａｐｐｅｌ製Ｌｏｔ１６
５９１）７Ｇから７　）（までは）Ｉｕ−ＬＦ’Ｎｒ　
（表１と同一）の添加Ｊ８度は２Φ９位／ｍｌ。

８かも１１までの０段からＦ１段までは前項Ｈｕ　−Ｌ
ＦＮｒのｉｓ加濃度は５単位７ｍｅ０検体試料として、
抗Ｈｕ−ＩＦ’Ｎｒ　（ＬＭＬ−１１）　ｒ’ｆｉ生の
ハイプリドーマＢ−５２−Ｘ６５３−８０３−Ｇ６Ｓ１
−９２５由来のＴフラ２２倍養液上消につ上清 ７から８までの０段からＨ段までは 培＃：ｍ識別Ａ９　Ｓ−１００２上清の５倍希釈液であ
る。免疫グロブリンサブクラスＬｇＧ１およびＬ　ｇ　
Ｇ　２ａを含んでおりＩｇＧ２ｂ　、ＩｇＧ３およびｒ
ｇＭを認めない。

９から１１までの０段からＩ４段までは２培養液識別Ａ
ｌＯ３−１００２上消である。

免疫グロブリンサブクラスＩｇＧ１および１ｇＧ２ａ乞
含んでおりＩｇＧ２ｂ・ｉｇ（，５およびＩｇＭン認め
ない。

表１１表２１表３および表４に示された結果は。

本発明における固相の安定化免疫複合体が、含量の俸め
て少ン、已・少購４の試わに含まれる免疫グロブリンの
特異抗体の力価を測定するはかりでなく。

特異抗体のクラス・サブクラスの同定や、それらクラス
、ザブクラスレベルでの抗体の力価をも測定するのに非
常に有用であることを示している。

また１本発明における測定法は例えはハイプリドーマな
どの抗体産生細胞のスクリーニングにも有用な応用範囲
の広い、微量の特異抗体のクラス・サブクラスレベルの
同定や抗体力価の定量にも嫡した方法である。

（以　上） 特許出願人　　サン　トリ　−株式会社（外４名） 手続補正書 昭和５８年１１月ν日 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１９５７５７　　号２、発明の名称 安定化免疫複合体およびその利用方法 ６、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名称（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 １ ６、補正の内容 （１）明細書の記載を下記の通り訂正する。

頁　　　　行　　　　補正前　　　　　　　補正後ろ　
　　　ろ　　メンズ　　　　　　メンズ３５ｉ！ｉ？素
　　　　　　　酵素 ５　　　　６　　　Ｆ　ａ　　　　　　　Ｆ　ａ５　　
　１２Ｆｅ　　　　　　　　Ｆｃ９　　１４　　抗り活
性　　　　　抗体活性９１６ｆｆ＆与　　　　　　　微
量 １６　　１９　　　ｄｏｅｓ　　　　　　　ｄｏｓｅ１
７　　５　　上清　　　　　　　上清４　　　　９　　
ヨーロピアン　　　ヨーロピアン４　　　　１０　　　
Ｅｕｒｏｐｅａｒ　　　　Ｅｕｒｏｐｅａｎｌｏ　　１
５　　マイクロブレー　　マイクロプレートド １１　　　Ｂ　　減菌　　　　　　　滅菌１！５１７−
１８　　　ビイラテン〆　　　ピペッティング６０　１
８　　常処理　　　　　　前処理３４　　１８　　　Ｔ
クララ２＃ｉ養　　Ｔフラスコ培養液液 （３）次の箇所の「家兎」を夫々「家兎」と訂正する。

第１１頁第１４行および第１８行、第１６頁第１５行、
第１４頁第８行の２箇所および第９行、第２１頁第１行
および第９行、第２６頁第７行、第２４頁第１６行、第
２５頁第６行および第１４行、第２７頁第８行、第２８
頁第８行、第１２行および第１７行、第２９頁第６イテ
、第８行、第１５行および第１７行、第６０頁第１行お
よび第７行、第６４頁第２行、第６行、第５行、第７行
および第９行。

以　　　　上 １９３−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）免疫グロブリン分子のＦｃ部分と特異的に結合す
   るようなプロティンＡなどの物質を微粒子担体に担持せ
   しめた結合体に、さらに特異抗体である免疫グロブリン
   分子を結合せしめた固相の安定化免疫複合体。 担持せしめた結合体に、さらに特異抗体である免疫グロ
   ブリン分子を結合せしめた免疫グロブリン力価測定用の
   同相の複合体に、力価を測定したり抗体を含む検体を混
   合し、ついで対応する抗ｍＶ混合後、残存する抗原量を
   測定し該検体中に含まれる抗体力価測定または抗体活性
   成分のクラス。 サブクラスを同定することを特徴とする免疫グロブリン
   の力価測定または同定方法。