JPS5965747A - 上皮細胞を細胞診断学的に検査する方法およびこの方法を実施するための遠心分離室 - Google Patents

上皮細胞を細胞診断学的に検査する方法およびこの方法を実施するための遠心分離室

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JPS5965747A
JPS5965747A JP58160609A JP16060983A JPS5965747A JP S5965747 A JPS5965747 A JP S5965747A JP 58160609 A JP58160609 A JP 58160609A JP 16060983 A JP16060983 A JP 16060983A JP S5965747 A JPS5965747 A JP S5965747A
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holes
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発す]は、特許Bri求の範囲第1項の上位概念に記
載の方法段(a)〜(1)に記載の方法段にょシ、検査
試料内に含まれている上皮細胞を細胞診断学的に検をす
る方法に関する。
塗床標本上で得られる上皮細胞を単個に分割し、これを
載せガラス上に可能な限シ均一に並べて沈着させること
が重要である。汚物並びに無数の細胞核、赤血球、白血
球等は分別にょシ徹底的に分離され、疎外物(軽量分画
)としてピペットによジ採取される。中心から離れた分
画と中心に近い分画(疎外物)の両分画は次いで個別に
それぞれ一つ当シの載せガラス上で遠心分離される。一
方の載せガラスは上皮細胞の認知、評価および計数に役
立ち、他方の載せガラスは検査された上皮細胞の重要で
ない部分が未だ疎外物中に存在していること、および第
一の載せガラスが塗抹標本の代表像であることを証する
従来の方法は、雑誌[−” Biotechnisch
eUmechau (生技術展望)′、1978、第4
巻に[Ein Ver−fahren zur 1so
lierten Depositionvon  Ze
llen  der  Cervixuter、i  
aufG1a80bjθkttrλgθr(ガラス載せ
物上に子宮頚上皮の細胞を沈着させる方法)”と云う題
名で、および雑誌” Tumor DiagnOsti
k 2 (腫瘍診断学2)+1981年、35〜68頁
および雑誌″ThθJoural of Hlstoc
hemistry and Cytuchemistr
y(組織化学および、細胞化学雑誌)″、27版、19
79年、14〜18頁、並びに雑誌″Actahiet
ochemica (組織化孝紀綱)”、合本−XyJ
巻、1980.167〜145@に記載されている。
これらの公知の方法にあっては全部で三回遠心分離を行
わなければならない。第一の作業工程においては、懸濁
試料を巻綿棒で振とうした後−この場合巻綿棒は検査す
べきI@胞を含んでいるー、巻綿棒および粗大な不純物
が、懸濁液をナイロン篩を通して注入することによって
、除去される。次いで懸濁試料は第二の作業工程におい
て遠心分離機により約200o分/回転で10分間に沈
降される。次いで懸濁試料(dm三の作業工程において
試験管に吸引され、分離媒液(無菌プラズマ)上に成層
される。第四の作業工程においては、改めて約10分間
500回転/分の遠心分離工程が行われる。このように
して得られた分画柱は第五の作業工程で、中心に近い分
画(疎外物)と中心から離れた分画(プラズマ)をピペ
ットにより採取して分離することによって調製される。
次いで其後第六の作業工程において、載せガラスは特許
請求の範囲第1項の上位概念に記載の遠心分離室内に入
れられる。この場合一方の孔内に中ノひに近い分画(疎
外物)が、他方の孔内には中心から離れた分画(プラズ
マ)が入れられる。
次いで、第七の作業工程で第三の遠心分離が行われ、こ
の場合約10分間2000回転/分で約10分間遠心分
離が行われる。
遠心分離工程の間、重い上皮細胞はこれに作用する遠心
力によシ液体中で載せガラス方向に移動し、沈降物の形
で貯留する。
検査すべき細胞が載せガラス上に沈降した後、遠心分離
室内の液状の残査はポンプで吸引され、検査されるべき
細胞と成層している載せガラスは96%のアルコール溶
液中に置かれる。次いで載せガラスのPap−染色が行
われる。孔が中心から遠い分画で満されている方の載せ
ガラスの領域上に上皮細胞が沈降し、等しい中心に近い
分画(疎外、物)で満されている孔を備えた載せガラス
の隣接している領域上に他の種類の細胞が沈降する。こ
の沈降が行われた領域は検査された上皮細胞の本質的で
ない部分がまだ疎外物質中に存在していること、即ち第
一の載せガラスが塗抹標本の代表的像であることを証し
ている。
この公知の方法における欠点は、三回と実際に手間と時
間とをかけて遠心分離工程を行わなければならないこと
である。特に、例えは原液の4mlを分離媒液6mlに
積層を行う第二の作業工程およびこのようにして造られ
た検査液体を遠心作業により中心に近い分画(疎外物)
と中心から離れた分画(プラズマ)とに分割し、この場
合次いで遠心方法による両分画をピペットによシ採集し
て分離し、遠心室の別個の室に充填しなければならない
ことは煩わしいことである。
本発明は、一つ或いは多数の作業段をまとめて唯一つの
作業工程で行い得るようにして、冒頭に記載した様式の
方法を手間および時間がより少くて済むように構成する
ことである。
上記の諌題は本発明によシ、方法段(e)、(f)およ
び(g)を唯一つの遠心工程の間に行うことによって解
決される。
即ち、本発明によシ、中心よシ遠い分画と中心に近い分
画への分離はこれらを遠心室の別個の孔内への人込みと
同時に、および両分画の遠心分離は載せガラス上への沈
降と一緒に唯一りの方法工程で遠心分離工程中に行われ
る。これに伴い時間上の浪費が著しく節減される。なぜ
なら上記の作業段(e)、(f)および(g)が予め遠
心分離機が停止している間に、かつ遠心分離室が取出さ
れている間に行わなければならいところ、本発明によシ
これは省略され、これらの作業段は遠心工程の間唯一つ
の作業工程で相前後して行われるからである。
特許請求の範囲第1項の本発明による他の構成によシ、
作業段(θ)、(f)および(g)が唯一っの遠心分離
工程で相前後して行われるのみならず、異径作業段(h
)もまだ遠心分離作業が行われている間に行われる。
特許請求の範囲第1項に記載の方法を実施するための遠
心分離室の特徴とするところは、平行に間隔をおいて設
けられた孔の間に流れ結合部(酸流路或いは管路)が設
けられていることである。即ち、遠心分離工程の間液体
は孔から隣接している孔内へと溢流案内される。
冒頭に詳しく述べたように、第二の遠心分離工程(作業
段C)は、可能な限シ最適な細胞密度下に載せガラスの
上皮細胞が沈降(成層)しだ領域を観察する原にきれい
なバックグラウンドが得られるように行われ、遠心分離
の間中上から離れた分画と中心に近い分画とが形成され
、同じ遠心分離工程の間中上に近い分画は本発明による
流れ結合部を介して遠心分離室の隣接している孔内へ溢
流案内される。即ち、細胞試料からの不都合な白血球お
よび細胞破片の除去によるこの試料の浄化並びに第一の
作業工程における細胞の遠心分離が違ぜられる。
上記の両孔の間に流れ結合部を設けることによυ以下の
作業工程を行わなくて済む。即ち、普通の試験管内で懸
濁液を遠心分離し、中心に近い分画と中心から遠い分画
とに分離し、異径両分画をピペットで採取して分離し、
遠心分離室の孔内に手で充填する作業工程が省略される
これは、今本発明によシ行わなくて済む。なぜなら本発
明によシ遠心分離室の一方の孔内に直ちに無菌プラスマ
ー溶液が充填され、この際この無菌プラスマー溶液上に
試料懸濁液が成層され′るからである。このように準備
された遠心分離室は遠心分離ロータ内で使用され、この
際本発明により装備された遠心分離室が振動する懸吊物
を備えた放てき遠心分離機と共に、またポット型ロータ
と共に使用されることに関しては更に以下に説明する。
遠心分離工程の間、成層された試料懸濁液の中心に近い
分画と中心から遠い分画への分離、が行われる。この場
合、両孔の間に流れ結合路が設けられていることによシ
遠心分離工程の間中上から遠い分画は隣接している孔内
に溢流案内される。したがって遠心分離工程が終了した
後遠心分離室の一方の孔内で上皮細胞が既にその下方に
設けられた載せガラスーヒに沈降されておシ、一方隣接
している孔にあっては載せガラス上に疎外物が沈降され
る。
即ち、冒頭に記載した方法は本発明によシ提案された技
術的な構成によって者しく簡略化される。
本発明の枠内において、中心から遠い分画を一方の孔か
ら隣接している孔内へ本発明による流れ結合部を介して
辱くことが可能となる多数の構成が可能である。構成の
第一のグループは、流れ結合部を弁して行われる溢流案
内を遠心力のみによって行うことであり、他方第二のグ
ループの構成により、中心から遠い分画と中心に近い分
画とを一緒に含んでいる孔内に圧縮空気が導入され、こ
の圧縮空気によυ中心から遠い分画が負荷され流れ結合
路を介して隣接している孔内に圧入される。
しかし、本発明の発明思想は、隣接し合っている二つの
孔間に管路或いは溢流孔の様式の流れ結合部を設けるこ
とにのみ限定されない。本発明によυ、二つの隣接され
た孔がその間に設けられた流れ結合部によって互いに結
合されているのみならず、二つ以上、例えば三つ、四つ
或いはもつと多い孔がそれぞれ並列してその間に設けら
れた流れ結合部によって接続されている。これによって
以下に述べる予期しなかった利点が達せられる。
第二の孔に並列して第三の孔を設けることによって、載
せガラス上に沈降する細胞体の染色および他の処理も可
能となると云う利点か達せられる。この場合第三の孔は
第一および第二の孔から第三の孔内に導出される液体の
だめの沈降室として働く。それぞれ第一および第二の孔
の下方に設けられた載せガラス領域上へ上皮細胞が沈降
された後これらの孔は空になる。この目的のため第一の
孔の内容物は圧縮空気によって負荷されることにより第
二の孔内へと移行され、この第二の孔を満す。圧縮空気
は第一の孔とこの第一の孔と第二の孔との間の結合管路
とを介して第二の孔に作用し、そこでそこに集積してい
る液体を他の管路を経て第三の隣接している孔内へと押
込む。この孔内で第一および第二の孔の内容物が集積す
る。第一および第二の孔が圧縮生気による負荷によシ完
全に空にされた後、染色液体は第一の孔内に導入される
第一の実施例−これは特に第24図との関連において明
細書中に詳しく説明する−によシ上記の目的のため遠心
分離機は停止され、第一の孔内に僅かな量の液体が導入
される。次いで遠心分離機が再び作動され、染色液体は
述心力によシ載ぜガラス領域方向に案内され、そこに貯
留され1いる細胞体を染色する。
次いで遠心分離工程の間圧縮突気が導入され、全染色液
体は第一と第二の孔との間の結合管路を経て第二の孔内
に導入さ!Lる。更に遠心分離工程を続けるとそこで載
せガラス領域上に集積している細胞体が染色される。こ
こで遠心分離t、stよ停止され、遠心分離室が静止し
たら再び圧縮空気が第一の孔内に導入され、この圧縮空
気は第一の窒になって直圧いる孔を通って流れ、結合管
路を紅て第二の孔内に達し、この第二の孔の底面に貯留
している染色液はそこに開口している管路を経て遠心分
離室の第三の孔内に導入される。ここで第三の孔は予め
集積されている液体以外に染色液体をも収容する。
上記の作業工程によシ簡単な方法で、細胞体を載せガラ
スの領域の異なる面上に沈降させるだめの遠心分離工程
を行うこと以外に更に同時に染色行程を行うことが可能
となる。しかもこの場合、載せガラスを遠心分離室から
外す必要も、また載せガラスに煩雑な染色工程を行う必
要もない。
第一および第二の孔から来る染色液の脱色を行った後、
本発明の他の構成によシ、他の液体を導入し、第一およ
び第二の孔の載せガラス領域を相応してこの液体で負荷
することが可能である。これは例えは、染色された細胞
を載せガラス上に固着させる固着液体を導入することに
よって可能である。同様に特別な洗流し液体の導入も可
能である。この場合常にその都度上記の作業工程が行わ
れる。
上記の発明思想の他の構成にあって不発明においては、
種々の液体、例えば染色液、固着液或いは洗い流し液が
遠心分離工程の間に導入される。即ち、遠心分離室が開
いている際に染色液或いは他の処理液を第一の孔内に導
入するために一上記のように−もう遠心分離機を停止さ
せる必gはなく、むしろ本発明の他の構成によシ、これ
らの液体は遠心分離機が作動している間に遠心分離室に
導入され、また遠心分離機が作動している間にはこれら
の液体が沈降孔内に送られるように上記の両孔から除去
される。
種々の処理液を供給する場合、この供給は、第一の圧縮
空気供給の際差尚って両孔が一上記の方法によシー空に
されることによって行われる。
ここで遠心分離室に取付けられた貯槽に圧縮空気が装填
され、これに伴いこの貯槽から液体が第一の孔内に滴下
される。
ここで染色工程が上記したような方法で行われる。この
場合この染色工程に引続いて遠心分離機を停止させ、液
体を第二の孔から第三の(沈降)孔内へ導入しなければ
ならない。
他の処理液体を含んでおりかつ遠心分離室の第一の孔と
の液体結合形成部内に行われる他の貯槽の配役によシ、
遠心分離工程の間に任意に多くの処理液体をミーの孔と
第二の孔内に導入すること、および最後に再び取出すこ
とが可能である。
以下に総括して、本発明によりどのようにして、第一の
孔から第二の孔−処理液が導入され、場合によっては第
二の孔を空にすることが行われ、そこの処理液を第三の
孔へ、そしてこの第可能で 三の孔から他の孔へと導入することがあるかに関するそ
のだめの作業可能性を詳説する。
この場合、特許請求の範囲第4項に記載の構成により、
流れ結合部を断面を変形可能な溢流孔から形成し、その
際一方の孔は直径の大きな孔と、この孔と同位置に存在
する直径の小感い孔とに分割されており、更に溢流孔が
大きな孔から小さな孔へ通じる延長部から出発している
ように構成するのが有利である。
段差を附された孔を持つ室は試料懸濁液のための充填室
であわ、貫通した孔を持った室は溢流室である。段差を
付された孔の高さは重量の異る両分画の分離層を形成す
る。
締付けねじは溢流開口の絞シ調整に、即ち溢流孔の断面
の変形のために働く。遠心分離作業、即ち容器担持体(
シーソー)の振動開始と共に既に溢流が遠心力に対抗す
る方向で始まる。締付けねじにおける僅かな間隙だけで
、疎外物(中心に近い分画)が十分に第二の孔内へと溢
流する。この場合、このための力は遠心力によって形成
される。
第二の実施形(特許請求の範囲第6項による構成)によ
り、閉鎖部材を備えた溢流室が設けられる。この閉鎖部
材は底部に切欠きを備えている。
この切欠きの寸法は一方の孔から他方への孔への通り抜
は断面を決定する。切欠きは遠心力の下で通り抜は断面
に構成される。深さの異る切欠きを備えた閉鎖部材を使
用して、懸濁液がどんな状態にあっても一方の孔から他
方の孔内へと流通する一定の通9抜は断面を形成するこ
とができる。
締付けねじの使用による先に述べた実施例の場合および
閉鎖部材を備えた次に述べた実施例にあって重要なこと
は、試料室が振動する懸吊物の使用を考慮したオフζ造
に形成されていることである。即ち試料室は停止した状
態では垂直に、作動状態では水平に存在する。載せガラ
スはその積層される面でもって停止している際は水平に
、作動している際は垂直に位置する。
第6のグループの実施形にあっては、一方の孔から他方
の孔への流れ結合部を介する溢流は圧縮空気によって行
われる。この目的のだめに設けられる試料室は特にポッ
ト型ロータを備えた遠心分離機のだめに使用され、この
遠心分離機にあっては遠心分離室は遠心分離工程の間9
0゜位置ずれしない。試料室はポット型ロータ内に挿入
され、この際空気接続口のだめの切欠きは空気出口のた
めのパツキン部材に当接する。遠心分離室は垂直な充填
接続管を介して充填される。しかもこの充填は一他の実
施例においても同様でるるが一差当シ6mlの無菌プラ
ズマ44m1の細胞懸濁液とで上下に成層するように行
われる。弾性的な板を備えだカッ<−、例えばゴム板に
よりすべての室が一緒に閉じられる。
したがって密閉された系が形成される。遠心分離機が作
動している間重力により両分画が層換えされる。
静止状態にあって水平に存在している分離面は遠心分離
工程の間垂直に指向される。この場合載せガラスは垂直
な位置に留まる。遠心力が僅か(約60g)である場合
、上皮細胞は無菌プラスマ内に浸入する。第一の実施例
(溢流孔、閉鎖部材)では他の孔内への溢流にかなp長
時間を要する疎外物は空気圧により遠心分離機軸を通シ
ポット型ロータの中空の底部を介してかつ接続部材を介
して充填接続部材内に導入され、したがって溢流は溢流
孔によって加速して行われる。
試料室を圧縮空気で負荷する場合、二つの異る実施形が
存在する。一方の実施形では試料室は段差を附された孔
を備えており、この場合この孔は無菌プラズマと試料懸
濁液を収容する。
この際溢流孔は大きな孔から小さな孔への移行位置の延
長部に開口している。
第二の構成は貫通した孔を備えだ試料室に関し、この孔
内には無菌プラズマと試料懸濁液が充填されている。平
行にかつ上記の孔に対して僅かな間隔をもって試料室の
材料に加工される結合管路が設けられる。この場合この
結合管路は差当りこの孔に対するどんな結合をも有して
おらず、その端面側で載せガラスに開口している。
この別個の結合管路にあって特異なことは、載せガラス
からそれぞれ任意の間隔をもって離して針でもって試料
懸濁液を収容する孔とこの結合管路との間の壁部内に結
合穴を刺通しによυ形成できること、およびこれによっ
て試料懸濁液を収容する孔内の残存液体量を変えること
ができることである。
このような試料室は例えば射出成形によp合成物質材料
から形成でき、したがって針によって試料液体を収容し
ている孔の壁部を刺通して、結合管路への結合を造るこ
とが容易に可能である。
即ち本発明により、一方の孔から隣接している孔−\の
液体の流れを制御するために三つの異なる可能性がとら
れる。これらの可能な構成は、結合管路の通り抜は断面
を変更する締付けねじであり、或いは開鎖部制であり、
又は管路内の流れ速度を増大させる圧縮空気の導入であ
り、この圧縮空気の導入による方法では締付けねじ或い
は閉鎖部制は用いられない。
上記の手段の代りに、本発明による他の構成により、遠
心分離工程の間外から手で操作して開閉される電気的な
弁がそれぞれ一つ結合管路内に設けられる。
本発明の発明思想は個々の特許請求の範囲の構成から得
られるのみならず、個々の特許請求の範囲の構成の組合
せによっても得られる。
明細書中に開示されているすべての記載および特徴、特
に図面に図示した立体的な構成は、これらが単独で或い
拡組合せによシ公知技術に対して新規なものである限り
本発明による本質的なものとして請求されている。
以下に添付図面に図示した実施例につき本発明を詳説す
る。
先ず第4図には、中心に近い分画12と中心が遠い分画
16とが沈降されて造られているのが試験管を以って示
されている。試料懸濁液(第4図には“試料”と記され
ている)は分離媒体(無菌プラズマ)上に成層されてい
る。次いで遠心分離工程が行われると、試料懸濁液中の
重量が比較的重い上皮細胞が分離媒体を通って試験管の
中心から遠い端部方向に移動する。
次いで遠心分離工程が終った後中心に近い分画(触外物
)12と中心から離れた分画(プラズマ)16が生成す
る。中心から遠い分画内には特にかつ高儂度に濃縮され
た形で検査されるべき上皮イ(11胞が存在する。
従来は、矢印で示した1沈降”の高さで中心に近い分画
12が中心から遠い分画16からピペットによシ採取さ
れ、次いで異径中心から遠い分画が改めて遠心分離され
、そこで懸濁された上皮細胞が遠心力の作用下に流去さ
せられ、試料室(孔)の中心から遠い端部方向に移動さ
せられ、そこに設けられ乏方ラス状に載置される。
第1図から第6図によυ、遠心分離工程の間(即ち通常
行われているピペットによる採取を行うことなく)中心
に近い分画12が中心から遠い分画16からどのように
して分離されるかが示されている。これにより、両分側
を分離するだめの冒頭に記載したピペット採取は回避さ
れる。
第1図から第3図に図示されている遠心分離室は、特に
合成物質−射出成形部分から成る試料室7から成る。こ
の試料室7は封隙リング5゜6を介して封隙された状態
で載せガラス上に載置されている。この場合この試料室
7は、保持体4内で担持板1の側面に設けられているあ
ぶみ状締付は体乙によってとの担持板1に対して固定締
付けられる。この担持板上には載せガラス2が設けられ
ている。試料室7の左側の孔は上方の小さな孔9とこれ
と同列の下方の大きな孔8とから成る。この場合、両孔
8,9の間には張出し部が生じる。
段差を付されている孔8,9の傍らには平行にかつ間隙
をもって他の孔10が設けられている。
この孔の孔壁部内には間隔をもって載せガラスの面の上
部に通シ抜は孔17が設けられてお泥この孔は水平な溢
流孔14と同列に存在し、この溢流を造るのに役立つ。
小さな孔9から大きな孔8への移行部から出発して、溢
流孔14が設けられており、この溢流孔は右側の孔10
内に開口している。試料室7内において、ねじ山付孔内
に締付ねじ15が挿入されており、この締付けねじはそ
の先端部でもって溢流孔14の内側断面内に突出してい
る。したがって、締付けねじ15を多少ねじ込んだり、
或いはねじり出したシすることにより溢流孔14の断面
を調節することができる。
遠心分離工程を開始する以前に左側の孔8,9内に先ず
、試料懸濁液と成層される分離媒体(例えば無菌プラス
マ)が満される(第4図参照)。
第10図〜第12図と関連した以下の記載によシ装置を
説明する。全試料室7は遠心分離機を備えだシーソー型
のケーシング内に挿入されており、したがって遠心工程
の間載せガラス2の面は垂直に起立し、孔8,9もしく
は10の長手軸線は水平に指向する。この場合、試料室
7は第1図による図系に関連して90°回転されてポッ
ト型ローク内に挿入され、したがって孔9の左側の垂直
な壁は底面に対して平行に、孔10の右側の垂直な壁は
ボッ)Wロータのカバー面に対して平行になる。次いで
、遠心力は第1図の図面により孔9,10の長手軸線方
向で下方へと中心から離れた端部に設けられた載せガラ
ス2に対する方向(矢印44の方向)で作用する。
第1図には試料の中心に近い分画12と中心から遠い分
画16への遠心分離工程中の分離が概略示されている。
この場合、中心から遠い分画16に関して云えば試料懸
濁液の上皮細胞は分離媒体中に拡散人込んでおり、遠心
力によシ孔8の下方端面において載せガラス2上に沈降
する。
遠心分離工程の間中心に近い分画(疎外物)12を中心
から遠い分画から分離するため、中心に近い分画12は
徐々に、孔9の長手方向で下方へと指向されている遠心
力に基いて孔8内へと圧入され、この際孔8の張出し部
11の近傍で開口している溢流孔14によって除荷され
る超過圧が生じる。
したがって中心に近い分画12はゆつく9と矢印13の
方向で溢流孔14を通って流れ、隣接した孔10内に流
入する。遠心分離工程の持続時間および締伺けねじ15
の調節に応じて、中心に近い分画12がすべて隣接して
いる孔10内に流入してしまうまでには多少の時間を要
する。
ここで、遠心分離工程を続行している間中心に近い分画
12の孔10の端面側での載せガラス2の観察桁上への
沈降が行われる。
即ち、唯一つの分離工程により、中心に近い分画と中心
から遠い分画の載せガラス2上への沈降が行われ、この
際両分画の煩雑な、ピペットによる採取およびその後の
調製を行わなくて済む。
第5図は第9図は試料室60の他の実施例を示している
。この場合、第1図〜第3図による実施例と一致してい
る部分は同じ符号で示した。
異なる点は、締付けねじの代りに第8図および第9図に
詳しく示した閉鎖部材22が設けられていることである
この閉鎖部材22の底面は半径方向で貫通している結合
管路24を備えており、この結合管路は円錐形の断面を
持つ切欠きとして形成されている。この場合、閉鎖部は
軸方向で試料室60内で所属する孔内を摺動可能であシ
、この際閉鎖部材22の結合管路24は大きな孔8内に
開口している左側の溢流孔19と右側の孔10内に開口
している右側溢流孔20との間の結合部である。
遠心力が大きくなればなるほどますます強く閉鎖部材2
2はその結合管路24で結合孔19゜20 間の平坦な
面上に押圧され、まずます流過断面が小さくなる。閉鎖
部材22は弾性的な合成物質から造られ、遠心力の作用
下で変形し、これにより断面の低減が行われるように構
成される。取手部分23で閉鎖部材22が試料室60か
ら取出される。
遠心分離工程が行われている開園様に、矢印44の方向
で作用する遠心力の作用の下で、左側の孔8,9内に充
填されている試料懸濁液の中心から遠い分画16とその
上方に積層されている中心に近い分画12への分離が行
われる。溢流孔19がこの場合も孔8,90間の段差部
11から出発しているので、支配している遠心力に基い
て中心に近い分画12上に作用する圧力は溢流孔19、
結合管路24と溢流孔20を経て導出され、したがって
中心に近い分画12は矢印21の方向で右側の孔10内
に流入し、そこで載せガラス2上に沈降する。
この際右側の孔10はその上方に位置ずれして設けられ
ている、小さな孔1日を倫えている段差を附されている
孔として形成されている。
第6図および第7図においては、第1図〜第6図と関連
して使用されたと同じ符号が当てられている。
第10図〜第12図は、第1図〜第6図もしくは第5図
〜第7図による試料室7,30と共に使用されるシーソ
ー型懸吊物を示している。そこに示されているシーソー
型懸吊物25は担持板26から成シ、この担持板には四
方のかつ相対している縁部29が設けられている。これ
に対して90°だけ位置ずれして担持板26の縁部に脚
部27が接続されており、この脚部はそれぞれ孔28が
貫通している。相対している孔28を詳細に図示してい
ない様式で担持ピンが貫通しておシ、との担持ピンは遠
心分a機のロータに固定されている。試料室7,30は
その担持板1でもってシーソー型懸吊物25の担持板2
6上に載っており、この際高く上方へと向って形成され
た縁部29と側方へ突出している脚部27とが試料室7
,6oがシーソー型懸吊物25からの脱落するのを防ぐ
。遠心分離工程の間、シーソー型懸吊物25はその孔2
8でもって詳しく図示しなかったピンを中心鈍して振動
する。したがって担持板26は垂直に起立し、担持板1
と試料室7,30のこの担持板に対して平行に設けられ
た載せガラス2も垂直に起立する。
第16図〜第15図および第16図〜第18図に図示し
だ試料室40.50は第19図および第20図に図示し
だポット型ロータ45と共に使用するためのものである
。この試料室40 、50を組み込んだ位置は第19図
から明らかである。
この際、シーソー型懸吊物は設けられず、その代シにこ
の試料室40.50が直接横おきにしてポット型ロータ
45内に挿入されている。
したがって、停止位置にジいても、作業位置においても
試料室40.50の位置は変らない。即ち、後方に設け
られる載せガラス2を備えた担持板1は常に垂直に起立
しておυ、孔9の第15図〜第15図および第16図か
ら第18図に図示した左側の垂直な壁は試料室40.5
0の底面を形成する。
第15図〜第15図に図示した試料室4oはやはり載せ
ガラス2が上側に載っている担持板1を備えており、こ
の場合試料室40は以前に記載した保持体4とあぶみ状
締付は体3とにより載せガラスと担持板1に対して押圧
される。
試料懸濁液および無菌プラスマー溶液とを収容する孔8
,9の充填は、第19図にょシ組込み位置で上方へと垂
直にその注入口が指向している充填接続管31を介して
行われる。
遠心工程の間、第13図に示すようにここにおいても矢
印44の方向で作用する遠心力の作用の下に中心に近い
分画12と中心から遠い分画16とが左側の室の上下に
存在していてかつ互いに同列に存在している孔8,9内
で形成する。
遠心分離工程の間に中心に近い分画12を中心から遠い
分画16から分離するため圧縮空気が使用される。この
圧縮空気は第19図に示すように圧縮空気ホース52と
圧縮空気接続管5′5とを経てポット型ロータ45のロ
ータ軸51内に供給され、ここで圧縮空気はポット型ロ
ータ45の底部に設けられている分配管路54を介して
第16図および第16図の所属している円錐形の収容孔
(接続部利63)に係合している接続部材55内に達す
る。接続片33から出発して(第13図もしくは第16
図)、圧縮空気は加圧管路32を経て試料室40 、5
0の上側に導入される。充填接続管ろ1の開口内への溢
流案内は、片側が開いている結合部材64が圧縮空気管
路32の注ぎ口と充填接続管31の注ぎ口との間に存在
し、上記の部分はポット型ロータ45のカバー56の下
側に設けられている弾性的な板58によって気密に覆わ
れている。即ち、これによって圧縮空気ホース52と充
填接続管61間に気密な結合が得られる。次で圧縮空気
は矢印44の方向で中心に近い分画12の表面に作用し
、この分画は圧力差違に基いて結合管路36と部材27
とを経て矢印69の方向で右側の孔10内に導入される
。孔38は第19図による弾性的な板58の傍らに開口
しておシ、排気のために働く。
第16図〜第18図による試料室5oの実施例により、
載せガラス2にまで通じている溢流管路(結合管路42
)と排気部(孔68)を備えていてかつ空気圧によシ負
荷される溢流室が設けられる。
第13図〜第15図による実施例におけると同じ部分は
同じ符号で示されている。
この実施例の特異な点は、第13図〜第15図の実施例
における段差を附された孔8,9の代りに貫通している
孔48が設けられている点であり、かつこの孔48に対
して平行にかつ間隔をもって結合管路42が試料室50
の材料内を走っている点である。針で孔48の壁41に
穿孔することが可能である。これは、例えば矢印43の
高さで行われ、したがって任意に予め定められた高さく
載せガラス2からの間隔)で孔4Bからの結合管路42
に対する通路が形成される。これによって、孔48内の
残余液体を変えることが可能である。
第16図において垂直に指向している結合路42は水平
な部分37に移行しており、右側の孔10内に開口して
いる。Jlloの排気部として働く孔38は第19図に
示すように弾性的な板58の傍らで開口している。
管路42を矢印46の方向で穿孔することによシ分両境
界を自由に選択することにょυ、左側の孔48内におい
てもまた右側の孔1o内においても中心から遠い分画1
2および中心に近い分画16とを得ることが可能となシ
、この場合両方の孔は重量の異る分画を保持する。
第19図は第16図〜第18図による実施例における試
料室50が組込まれている状態を略示している。
第20図による平面図において、第19図に図示した組
込み位置での試料室40或いは50は垂直なロータ枠5
9内に挿入されておシ、こノロータ枠内で形状一体的に
固持されている。
カバー56はその下方に存在している弾性的な板5日と
共に載っておシ、しだがって圧縮空気52は空気密に試
料室4o或いは5oの充填接続管61と結合されている
。カバー56は開閉ノブ57で固く結合されている。弾
性的な板58を備えたカバー56は同時に試料室4o或
いは50のための固定手段として働く。
次いで遠心分離機が始動され、この場合モータ46は担
持板47上に取付けられておシ、駆動ベルト49を介し
てロータ軸51を駆動する。
第21図〜第23図による実施例は第16図による実施
例を発展させた実施例である。
大きな孔61が設けられており、この孔内に上記した様
式で遠心工程の間中上から近い分画12と中心から遠い
分画16が沈降する。分離が行われた後、遠心工程の間
圧縮空気が管路63内に導入され、この圧縮空気は矢印
63の方向で管路内に流入し、そこで第19図に図示さ
れているカバー56により矢印65の方向で転向され、
管路31を経て矢印44の方向で孔61内に流入する。
そこで試料液体は管路42を経て押しやられ、第二の孔
10内に流入する。第16図による実施例に対するこの
実施例の拡張されている部分は、第16図による部分3
7が省略されていることおよびその代シに部分66が設
けられており、この部分が管路の他の部分67に移行し
ていることである。部分67の小さな孔10内への開口
68は試料室が垂直に起立している場合、即ち試料室が
底面69上に起立している際、試料室が起立している場
合に形成される液体レベル70の上方に存在する。従っ
て如何なる場合にあっても、試料液体71が第二の孔1
0から部分66 、67と管路42とを経て第一の孔6
1内に逆流するのが回避される点が重要である。
本発明による他の実施形は第三の孔72を設けたことで
ある。この孔72は第二の孔10に並列して接続されて
いる。この場合、液体レベル70の下側に存在している
管路73が試料容器が起立している際第二の孔10に開
口していることか重要である。第21図による実施例の
場合の開口は載せガラス2の直ぐ上方に示されており、
ここにはにimの僅かな遊びが存在している。しかし、
この開口は遠心分離機−管路76の領域内ならどこにで
も(例えば矢印43が示す領域におい゛て)形成するこ
とができる。
管路73は垂直な管路74にと続いておシ、この管路7
4は孔72に開口しているもう一つの水平な管路75内
に移行している。
この場合、遠心分離機が起立している際この第三の孔7
2からも液体が第二の試料室内に逆流しないように、管
路75の開口アロが液体レベル77の上方に存在するの
が重要である。
第三の孔72を第二の孔1oの後方に設けたことおよび
これらを管路73 、74 、75で結合したことは、
細胞診断学における著しい進歩である。
なぜなら、このよりな−全部で三つの孔を含んでいる一
試料容器を用いることによシ染色を遠心分離工程中に行
うことができるからである。
これは以下のようにして行われる。
第一の孔61内で形成される中心に近い分画12と中心
から遠い分画15とから出発して、次いで圧縮空気が管
路35を経て導入され、この圧縮空気は矢印44の方向
で孔61の全液体を管路42.66.67.68を経て
第二の孔10内に押込める。ここで遠心分離機は停止さ
れ、液体は液体レベル70の位置を占める。ここで再び
圧縮空気が管路63を介して導入され、この圧縮空気は
空の試料室61を通って流れ、そこで管路42,66.
67.68を経てI3二の孔10内に流入する。試料液
体は圧力下におかれ、管路73,74.75を経て第三
の孔72内に押込められる。
第三の孔72の配役は重要である。なぜなら−第一の両
試料室が空になった後−染色工程を行うことができるか
らである2、この目的のため、】3心分PJJ 4aは
停止され、カッく−が外され、充填接続管61を介して
第一の孔61内に数滴の染色液が与えられる。試料液体
を充填した後、遠心分離機が始動され、試料液体は第一
の孔61の載せカラス表向に対して押伺けられ、そこに
貯留している上皮細胞を染色する。一定の作用時間持つ
必要がある。なぜなら、圧縮空気が管路66を介して与
えられ、この圧縮空気が矢印44の方向でi戊せカラス
表1/11の近傍に貯留している染色液体に作用し、こ
こで染色液体が管路42 、66.67を経て弔二の孔
10内に押込まれ、そこに存在している載せカラス野を
染色するからである。作用時間が経過した後、遠心分離
機(d停止され、染色液体は下方へと液体レベル70に
対して平行に存在している底面上に流れる。
孔72の管路76はこの底面の領域内で孔10内に開口
しておシ、シたがって試料室60が停止している間およ
び圧縮空気が導入されている間圧縮窒気は矢印44の方
向で第一の孔61内に流入し、そこで管路42,55.
67を経て第二の孔]0内に流入し、そこで染色液体は
載せガラス面の傍らの管路76の開口を経てこの管路7
6内に圧入され、管路74 、75と開口アロとを経て
第三の孔72内に圧入される。この第三の孔72内には
試料l皮体から成る混合物から、および液体から成る廃
液が集積する。排気に役立つ貫通孔17からの液体の流
出を回避するため、管路75の開口と貫通孔17との間
に突起86が設けら九ている。
染色工程が終っ7’C後、類似の方法で更に他の液体、
例えば洗い流し液体、固着液体および類似の液体が加え
られ、この際多数の作業工程か行われた後消費された全
部の液体が孔72内に集められる。
多数の、相前後している孔(51,10,72を直列に
配設することにより、およびこれらの孔61゜10.7
2を管路によって有意義に結合することに−11)孔6
1,1oの載せガラス2の載せカラス面(即ち、載せカ
ラスの検査面およびコントロール面)が色々な処理液体
で処理され、しかもこの際全試料室60を一関も遠心分
離機のロータから屯外す必要がない。
第21図〜第26図には、二つの部分板79゜80から
成る全底板78の上方部分81からの簡単な取外しを可
能にする保持部が示されている。これに加えて、スライ
タ82の試料室6゜を唯一つのハンドルで摺動させるこ
とによ)底板78を上方部分81が解体することが可能
であり、したがって載せガラス2を直接取外すことがで
きる。この場合スライタは矢印83の方向に摺動可能で
あり、上方部分の相応する保持突起部84 、85と協
動する。
第24図には、本発明の思想をよシ一層よく図面で解り
易くするため、第21図の実施例による三つの孔が相前
後してどのように接続されているかの根本原理が略図に
より示されている。
同様に液体の流れと管路の開口とが示されている。第二
の管路73も設けることができることが、第二の孔91
の位置において破線で示されている。弔二の孔91内で
実線で示されている管路76は以下の作業工程のために
働くものである。即ち、遠心分離機か停止している時に
のみ第二の孔91から試料液体が取出され、この液体が
底部に流れ、そこで液体レベル7oを形成し、したがっ
てこの液体が管路75を経て第二の孔91からぶ三の孔
96内に導入されるような作業経過のために働く。しか
し遠心分GIt工程中に第二の孔からシβ三の孔内への
溢流を行うには、流れ結合を載せガラス2の近傍で終っ
ている破線で示し7′ζ管路73′に相応して選択され
る。第二の孔91内に流入する液体が除々に圧縮空気の
作用下で直ちにこの管路75′を経て第三の孔93内に
押込められはするが、この管路73′の断面を、試料液
体が載せガラス2上に送られる作用時間が第二の孔91
内で維持されるように小さく選択することが可能である
即ち、断面は例えば、約2分間経過後やつと第二の孔9
1の内容物が完全に第三の孔93内に導入されるように
、即ち2分間の作用時間が第二の孔91において保証さ
れるように選択さ7する。
第25図は変形された他の実施例を示している。この図
において、他の貯槽(染色液体のための染色貯招94)
を使用することによシ遠心分離槻を停止させることなく
かつ遠心分離機力バーを外すことなく一第21図〜第2
6図により説明したように、両試料室61と10が予め
空にされている場合に限るが−直ちに染色工程を行うこ
とが可能であることが示されている。試料室内で管路3
3に対してほぼ平行に設けられている第二の圧縮空気接
続口88を介して圧縮空気が染色貯槽94内に圧入され
た際、染料87は溢流部95 、96を経て染色貯槽9
4から押出され、直ちに導管97.98を経て孔90.
91内に導入される。したがって遠心分離機を停止させ
ることも、染料87を先ず第一の孔61内に入れること
も、また第二の孔91内に溢流させることも行わなくて
済む。むしろ、染料87tよ遠心分離機が働いている間
に平行して両孔91゜92に分配される。
これによって作業時間の短縮が達せられる。
染色が行われたら直ちに、上に記載した様式で、染料8
7が第一の孔90から管路42を経て第二の孔91に溢
流案内されるように圧縮空気を矢印44の方向で第一の
孔9oに与えることによシ染料液体が孔90.91から
排除される。
第一の孔42が空になったら、第二の孔91も管路76
.y4.z5を経て空にされ、全染料87が第三の孔9
3内に流れる。
第三の孔95に並列して更に他の一図示していない一孔
を設けることが可能である。
−例として、管路101の様式の第三の孔から詳しく図
示していない孔への他の流れ結合を示した。
圧縮空気を矢印44の方向で導入している間導管97.
98を介して圧縮空気が染色貯@94内に逆圧送され、
圧縮空気接続管88を経て逃げるようにさせるため、そ
こに逃し弁99が設けられている。
第25図による実施例にあっては類似の様式で任意の多
くの処理液体−貯槽、例えば洗い派し液体のための第二
の貯槽或いは固着液のための第三の貯槽等を設けること
が可能である。
この拡張された実施形にあって重要なことは、それぞれ
の貯槽からの順序正しい液体の流出が正しい時点で行わ
れることを保証するため、貯槽94の各々に逆止め弁を
備えた圧縮空気接続管を設けなければならないことであ
る。
この提案されたシステl、は、試料室100が常に遠心
分離機内にとどめられておシ、染色工程力1遠心分離機
自体内で遠心力の作用下に行われ、高価なかつ費用のか
かる、しかも不正確な自動染色装置を使用しなくて済む
という利点を有しているっ特に、土庄細胞が極端な染色
方法にあって載せカラス表面から洗い流されてしまうと
云う従来の公知の染色方法にあって大きな欠点とされる
作栗結果の生起が阻止される。
しかし、本発明により染色工程のみが自動化されるので
はなく、固着工程および洗い流し工程等も自動化される
更に、全試料室7,80,40,60,100 が比較
的廉価な合成物質射出成形体から成り、したがって製造
し易く、また0−リング−図面に記載されているーすら
射出成形された舌形パツキンで代替でき、したがってこ
のような試料室を低講入費の使い捨て物品として造るこ
とができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は液体分配が遠心分離工程中に行われている様相
において示した、第一の実施例による遠心分離室の第2
図による線1−1に沿った断面図、 第2図は第3図の矢印■の方向で見た遠心分離室の正面
図、 第6図は第2図の矢印Hの方向で見た遠心分離室の正面
図、 第4図は遠心分離管内の分虚柱の構成とフジクションを
、試料の沈降前(左側)と沈降後(右側)の状態で示し
た概略図、 第5図は液体配分が遠心分離工程中に行われている様相
において示した、第二の実施例による遠心分離室の第6
図の綴V−Vによる断面図、謁6図は第7図の矢印■の
方向で見た遠心分離室の正面図1 、+!7図は第6図の矢印■の方向で見た第二の実施例
による遠心分離室の平面図、 第8図は閉鎖部材の底面図、 第9図は第8図による閉鎖部材の側面図、第10図は第
1図〜第6図および第5図〜第7図による遠心分離室に
使用されるシーソー(シーソー型懸吊物)の側面図、 第11図は第10図の矢印Xの方向で見たシーソーの平
面図、 第12図はシーソーの部分側面図、 第16図は液体分配が遠心分離工程中に行われている様
相で示した、第三の実施例による遠心分離室の第15図
の線xn+ −xmに沿った断面図、 第14図は第15図による遠心分離室の正面図、 第15図は第73図の矢印Xvの方向で見た遠心分離室
の平面図、 第16図は液体分配が遠心分離工程中例行われている様
相で示した、第四の実施例による遠心分離室の第18図
による線1−XMに沿った断面図、 第17図は夷・16図による遠心分離室の正面図、 記18図は比16図の矢印X〜間の方向で見た遠心分離
室の平面図、 第19図は二つの異った遠心分離室の使用例のだめのボ
ット型ロータの断面図、 第20図は第13図〜9415図による実施例による遠
心分離室に使用した第19図によるポット型ロータの平
面図、 化21図は第23図の縁XXI−xX1に沿った遠心分
離室の第四の実施例の断面図、 第22図は第21図による遠心分離室の正面図、 第23図は第21図における矢印26の方向で見た第2
1因による遠心分離室の平面図、昂24図は第五の実施
例による遠心分離室の縦断面図、 第25図は第六の実施例による遠心分離室の縦断面図。 1・・・担持板 2・・・載せカラス 730405060100・・・試料室8.9,10,
18,48,72.9091.93      ・・・
孔 1/I、 +5.19,20,24,5637.42,
73,74,75.76  ・・・流れ結合部(管路)
図面の浄書(内容に変更なし) F/64 V→ F/に77 FI67B F/(579 Fl(i 20 Xxml Fl(i 27        FIG 22Fl(5
24 Fl(i 25 手続補正書。7.S) 昭和98年 70月6 口 特許庁長官  若杉和夫 殿 1、事件の表示 昭和ケS年特許願第tbobo’l  号3、補正をす
る者 事件との関係  出願人 4、代理人 7、補正の内容 別紙の通り

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 t、(a)  第一の作業工程において検査されるべき
    細胞を含んでいる試料懸濁液を第く遠心分離工程により
    沈降させ、 (b)生成した細胞沈降勿を第二の作業工程で吸引p過
    し、 (C)  第三の作業工程で吸引許過された細胞沈降試
    料を分離媒体(例えば無菌プラスマ)上に積層し、 (d)第四の作業工程において、第三の作業工程におい
    て得られた試料懸濁液を第二の遠心分離にかけ、この際
    中心から遠い分画と中心に近い分画とを形成し、 (θ) 第五の作業工程において中心から遠い分画と中
    心に近い分画とを分離し、 (f)  i六の作業工程においてそれぞれ中心から遠
    い分画と中心に近い分画とを遠心分離室のそれぞれ一つ
    の孔内に入れ、 (g)  第七の作業工程において遠心分離室の別個の
    孔内に存在する中ノしから遠い分画と中心に近い分画と
    を第三の遠心分離をかけ、遠心分離室に設けられた載せ
    ガラスを中心から遠い分画と中心に近い分画の上皮細胞
    で別個の面において積層し、 (h)  第への作業工程において載せガラス上に沈降
    した細胞を染色し、 (1)第九の作業工程において載せガラス上に載せられ
    ていて着色された細胞を光学手段で検査して 行う、検査されるべき試料内に含まれている上皮細胞を
    細胞診断学的に検査するだめの方法において、方法段(
    e)、(f)および(g)による作業工程を唯一つの遠
    心分離工程中に行うことを特徴とする、上記方法。 2、 作業段(h)をも遠心分離工程中に行う、前記特
    許請求の範囲第2項に記載の方法。 6、 担持板(1)およびこの担持板の上に固定された
    載せガラス(2)とを備え、この載せガラスの上方に封
    隙されて試料室(7,60,40,50゜60.100
    )が載置されておシ、これらの試料室が平行に間隙をお
    いて並列して設けられてふυかつ試料液体で充填用能な
    孔(8,9,10;9゜1(1,18;4B、10;6
    1,1[1および72;90,91および9乙)を備え
    ており、これらの孔の端面側開口がそれぞれ封隙されて
    載せガラス(2)上に座している。上記方法を実施する
    ための遠心分離室において、平行に間隔をおいて設けら
    れた孔(8,9と10;9と10.18 ; 48と1
    0;(51,10,72;90゜91 ;93; 10
    1 )の間にそれぞれ一つの流れ結合部(管路) (1
    4,15;19,20,24;36,37;42;73
    ゜74.75.76)が設けられていることを特徴とす
    る、上記遠心分離室。 4、 流れ結合部が断面変更可能な溢流孔(14;19
    ゜20.24)から成シ、一方の孔(8,9)が直径の
    大きい孔(8)とこの孔と同列に位置する直径の小さな
    孔(9)とに分割されておシ、溢流孔(14; 19,
    20.24)が大きな孔(8)の延長部から小さな孔(
    9)へと出張っている、前記特許請求の範囲第6項に記
    載の遠心分離室。 5、 溢流孔(14)の断面を変えるため締付けねじ(
    15)が設けられている、前記特許請求の範囲第4項に
    記載の遠心分離室。 6 溢流孔(19,20,24)の断面を変えるため孔
    (8,9,10)の長手方向で軸方向に摺動可能な締付
    は部材(22)が設けられており、この締付は部材の一
    方の端面が両温流孔(19,20)の間の結合を形成す
    る半径方向の結合管路(24)を備えている、前記特許
    請求の範囲第4項に記載の遠心分離室。 7 第一の孔(8,48,61、90)から隣接してい
    る孔(10,72,91,93)内に液体を溢流案内す
    るためそれぞれ隣接している孔(8,10,4B、61
    ,72゜90.91.93)を結合する管路(36,3
    7;42.!+7 ;42゜66.67 ;75.75
    )が第一の孔(8,48,61’、90)の底部に取付
    けられておシ、隣接している孔(8,10,48,61
    ,72,90,91,93)の被覆面に開口しておシ、
    第一の孔(8,4B、 、151.90)内の液体がそ
    れぞれ圧縮空気の圧力の下で管路C36,37;42.
    57;42,66.67;73,75)を通って隣接し
    ている孔(8,48,61,90)内に圧入されるよう
    に構成した、前記特許b)1求の範囲第6項に記載の遠
    心分離室。 8、 一つ或いは多数の異なる液体(例えば染色液体、
    固着、液体)が第一の孔(8,4B、61.90)内に
    導入可能であシ、これらの液体が瞬接している孔(8,
    10,48,61,72,90,91,93)を結合し
    ている管路(36,37;42,37 ;42,66.
    67)を介して並列して概−の孔(8,4B、 61.
    90 )の後方に接続されている他方の孔内にj陳次溢
    流であるように構成されている、前記特許請求の範囲第
    7項に記載の遠心分離室。 9 一つ或いは多数の異なる液体(例えば染色液体、固
    着、液体)の並列して設けられた孔(90,、91、9
    3)内への尋人と敲流某内とが遠心分離工程の間に行な
    われるように構成した、前記特許請求の範囲第8項に記
    載の遠心分離室。
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