JPS596389B2 - 安定性を有するハプテンの免疫化学的測定試薬および測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、安定性のあるハブチッの免疫化学的測定試薬
および測定方法に関する。

従来、血液、尿その他の体液中に存在する生物学的活性
を有する微量物質を、免疫化学的手段で測定する方法は
古くから知られている。

かかる免疫化学的測定試薬としては、例えば、赤血球を
担体として用い、これを抗原又は抗体で感作し、これを
被検液中の抗体又は抗原と反応させ、その際、免疫化学
的凝集又は凝集阻止反応を生起させて、該微量物質を測
定する方法、また、担体として赤血球の代りに、非生物
学的粒子として例えば合成樹脂ラテックス、ペントナイ
ト、コロジオン、コレステロール結晶、水晶等を免疫化
学反応における固体担体として用いることも知られてい
る。しかしながら、ハブチッのように単独で動物を免疫
しても抗体を産生することができないものについては、
一定の条件において、例えば、タンパク質または多糖類
のような抗原性を有する物質をハブチッに結合して動物
に免疫し、その抗体を産生させることから、その抗原と
しても同じハブチッにタンパク質または多糖類を結合さ
せた試薬を使用することになり、かかる場合に、ハブチ
ッに結合しているタンパク質等の物質が変性または分解
、もしくは腐敗するために試薬の安定性が低下し、これ
がため、低温下もしくは氷冷下に保存せねばならず、殊
に長期の保存には種々な難点が多かつた。本発明者等は
、特にこの点に着目して室温において安定で且つ凝集お
よび凝集阻止像を明瞭に判別できる試薬の開発に重点を
おき、研究を重ねた結果、（５）ハプテンまたはその化
学的変性物を化学的に結合せしめたカルボキシル基含有
水溶性モノオレフィン系高分子化合物と、（８）ハプテ
ン抗体を担体、例えば高分子ラテツクスに化学的に結合
させるかまたは感作させたハプテン抗体担持担体とを別
々に用意し、これら両者を組合わせた免疫化学的測定試
薬を用いることにより、意外にも、凝集および凝集阻止
像の判定を比較的速かに且つ明瞭に判別ができて、しか
も、長期の保存にも安定性が増大し、取扱いに便利な試
薬とすることが可能であることが分つた。

本発明は、 （１）ハプテンまたはその化学的変性物がカルボキシル
基含有水溶性モノオレフイン系高分子化合物に化学的に
結合していることを特徴とする安定なハプテンの免疫化
学的測定試薬。

（２×Ｑハプテンまたはその化学的変性物を化学的に結
合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフイン系
高分子化合物と、（Ｂ）ハプテン抗体を担体に化学的に
結合させるかまたは感作させたハプテン担持担体とを別
々に用意し、これら両者を組合わせて使用することを特
徴とする安定なハプテンの免疫化学的測定試薬。

（３）ＣＡ）ハプテンまたはその化学的変性物を化学的
に結合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフイ
ン系高分子化合物と、０３）ハピテン抗体を担体に化学
的に結合させるか、または感作させたハプテン抗体担持
担体とを用い、被検体中のハプテンによる上記（４）お
よび（Ｂ）の両試薬の凝集阻止反応を測定することを特
徴とするハプテンの免疫化学的測定方法。

に関するものである。以下に本発明をさらに詳細に説明
する。

〔ハプテン〕

本発明においてハプテンとは、単独で動物に免疫しても
抗体を産生しないが、一定の条件によつて、例えばタン
パク質のような抗原性を有する物質にハプテンを結合さ
せて動物に免疫すれば該タンパク質に対する抗体とは別
に、その物質（ハプテン）に対する抗体を産生する物質
をいう。

かかるハプテンとしては、特に、生体内に存在する成分
（生理活性成分およびその代謝産物を含む）および生体
に投与された薬物およびその代謝産物が本発明の対象と
するハプテンとして重要である。かかるハプテンとして
は、例えば次の如きものが挙げられる。（１）ステロイ
ド系ハプテンとしては、例えば（１）エストロン、エス
トラジオール、エストリオール、エステトロール、エク
イリン、エクイレニン等の卵胞ホルモン、（１；）プロ
ゲステロン、プレグナンジオール、プレグナントリオー
ル等の生物中で産生または代謝産物として存在する天然
性黄体ホルモン、および１９−ノルーエチステロン、酢
酸クロルマジノンのような合成ホルモン等の黄体ホルモ
ン（Ｉｌｌ）テストステロン、デヒドロエピアンドロス
テロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステロン、
エチオコラノロン等の男性ホルモン） ０Ｖ）コルチゾール、コルチゾン、デオキシコルチコス
テロン、アルドステロン、テトラヒドロアルドステロン
、テトラヒドローコルチゾール等の副賢皮質ホルモン、
（ｖ）ビタミンＤ類；コレステロール；例えばコール酸
、デスオキシコール酸、ケノコール酸等の胆汁酸；強心
性ステロイド；サポニン；サポゲニン等のその他のステ
ロイド類、等をあげることができ、また、 （）生理活性アミン類ハプテンとしては、例えば、（１
）エピネフリン、ノルエピネフリン、ドパミン、エフエ
ドリン等のカテコールアミンおよびそれらの代謝産物；
（１；）モノフイン、コデイン、ヘロイン、モルフイン
グルクロナイド、コカイン、メスカリン、パパベリン、
ナルコチン、ヨヒンピン、レセルピン、エルゴタミン、
ストリキニーネ等の生理活性アルカロイド類；（Ｉｉｉ
）ＬＳＤｌアンフエタミン、メプロバメート、メタアン
フエタミン等のようなアミノ基含有薬物をあげることが
でき、１１）その他のハプテン類としては、 ＴＲＨｌＬＨ−ＲＨのような抗原性を有しない低分子ペ
プチド類；ジヨードサイロニン、トリヨードサイロニン
、サイロキシン等の甲状腺ホルモン；プロスタグランジ
ンＥ２、プロスタグランジンＥ３、プロスタグランジン
Ｆｌ２等のプロスタグランジン類；ビタミンＡ１ビタミ
ンＢ類（例えばビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂｌ２等）
、ビタミンＥ１ビタミンＫ等のビタミン類、ペニシリン
、アクチノマイシン、クロロマイセチン、テトラサイク
リン等の抗生物質；等々の生体内に存在する成分、生体
内に投与された薬物およびそれらの代謝産物の如く多く
のハプテン類をあげることができる。

本発明のハプテン類は、しかし、上記例示のハプテン類
に限定されるものではない。〔ハプテンの化学的変性〕 本発明においては、上記ハプテンは、そのままで、又は
それを化学的に変性した後、カルボキシル基含有水溶性
モノオレフイン系高分子化合物（以下これを便宜上ホル
ダーと呼ぶことがある）と化学的に結合せしめる。

ハプテンの化学的変性法としては従来種々の方法が知ら
れている。

本発明においては、ハプテンが該ホルダーの有する官能
基例えばカルボキシル基や水酸基と化学的に結合し得る
ように該ハプテンを化学的に変性する如何なる変性法を
採用してもよい。かかるハプテンの変性法としては、特
にハプテンにカルボキシル基、第１級又は第２級アミノ
基又は水酸基、就中カルボキシル基又は第１級アミノ基
を導入する化学的変性法が好適である。かかる方法とし
て例えば以下の如き変性法があげられる。カルボニル基
を有するハプテンに関しては、カルボキシルメチルオキ
シムに変換することによつてカルボキシル基を導入する
ことができ（例：ＪＯｕｒｎａｌＯｆＢｌＯｌＯｇｉｃ
ａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３４巻、１０９０−１０９
４頁、１９５９）、或いは、例えば、ブロム化したのち
チオグリコール酸と反応せしめて、カルボキシル基を持
たせる（例：ＳｔｅｒＯｉｄｓ，ｌ９巻３５７−３７５
頁、１９７２）こともできる。

カルボニル化合物のオキシムを還元すると一級アミノ化
合物になることは周知であるが、これもフハプテンとし
て利用できる。

また水酸基を有するハプテンは例えばモノクロル酢酸と
反応させて、カルボキシメチルエーテル化（例：Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，ｌ６８巻、１３４７−１３４８頁、１９７０
）、或いは無水コハク酸と反応させてヘミサクシネート
とする方法（例：ＪＯｕｒｎａｌＯｆＣｌｌｎｉｃａｌ
ＥｎｄＯｃｒｉｎＯｌＯｇｙ，３３巻、７７５−７８２
頁、１９７１）等がある。

フエノール性水酸基を有するハプテンに於ては、その水
酸基のオルト又はパラ位に例えばパラカルボキシベンゼ
ンジアゾニウム塩をジアゾカツプリングさせて、カルボ
キシル基を導入することも可能である（例：ＳｔｅｒＯ
ｌｄｓ，ｌ８巻、５５５−５６３頁、１９７１）。

さらにまた、ステロイド類の代謝物であるグルクロナイ
ドは、そのカルボキシル基を利用することができるし（
例：ＪＯｕｒｎａｌＯｆＳｔｅｒＯｉｄＢｉＯ一Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，３巻、２７５−２８８、１９７２）、そ
のカルボキシル基を直接利用できなければ、適当なジア
ミン誘導体と反応させて、アミノ化合物に変換すること
もできる。

二級アミノ基をもつハプテンに於ては、例えば、そのア
ミノ基をＮ一保護アミノアルキルハロゲン化合物でアル
キル化したのち保護基を脱離すれば一級アミン誘導体に
変えることができ（例、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，３６
巻、３３９−３４２頁、１９７３）、或いは、例えば、
プロム酢酸エステルと反応させたのち加水分解すること
により、カルボキシル基をもたせることもできる（例：
ＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２５巻、８３８−８４０頁、１９７
７）。

適当な官能基を持たないハプテンは、まず、例えば、微
生物による水酸化反応のような手段を講じ、次いで上述
の方法によつて、求むる官能基に変換することもできる
。

〔ホルダー〕

本発明で用いるカルボキシル基含有水溶性モノオレフイ
ン系高分子化合物（ホルダー）としては、カルボキシル
基を含有する水溶性モノオレフイン系高分子化合物の如
何なるものでもよく、ここで「水溶性」とは該高分子化
合物の少くとも１重量部を１０００重量部の蒸留水に添
加した場合に透明な溶液を形成することをいう。

該高分子化合物の溶解度が上記下限を満足する限り、そ
の溶解度はいくら大であつてもよい。また該高分子化合
物の平均重量分子量は約１０３〜１０７又はそれ以上で
あつてもよく、通常数万乃至数百万のものが好適に使用
できる。またかかる高分子化合物は、官能基としてカル
ボキシル基の他に水酸基（−０Ｈ）を有していてもよく
、之等の官能基は、ハプテン又はその化学的変性物の官
能基との化学的結合に関与すると共に、該高分子化合物
に水溶性をも付与する。本発明で使用するかかる高分子
化合物は、生理的には不活性物質と見られるものであつ
て、一般に抗原性を有しないものである。

また、かかる高分子化合物としては、例えば、アクリル
酸又はメタアクリル酸のホモ一又はコーポリマ一；マレ
イン酸と酢酸ビニルとの共重合体又はそのケン化物、マ
レイン酸と例えばビニルアルコール、低級アルキルビニ
ルエーテル、アクリル酸又はその低級アルキルエステル
、メタアクリル酸又はその低級アルキルエステルとの共
重合体又は所望によりそれらの加水分解物があげられる
。

之等の高分子化合物はまた、例えばアクリル酸又はメタ
アクリル酸と、例えばアクリル酸のβ−ヒドロキシエチ
ルエステル又はアクリルアミドとの共重合物、或いは前
記のモノマーを構成単位として含有する三元重合体であ
つてもよい。〔ハプテン又はその変性物とホルダーとの
化学的結合〕上述したハプテン又はその化学的変性物と
ホルダーとの化学的結合は、アミド結合又はエステル結
合によつて行われるが、特にアミド結合によつて行うの
が好適である。

かかる結合は、従来既知の下記の如きアミド結合反応又
はエステル結合反応を用いて行うことができる。

例えば、ハプテン又はその化学的変性物をハプテンで代
表して説明すると、ハプテンが例えばアミノ基を有しそ
してホルダーがカルボキシル基を有する場合、又はその
反対の場合、ハプテンとホルダーとを下記の如き方法で
アミド結合により化学的に結合することができる。

（アミド結合でハプテンとホルダーとを結合する方法）
（１）カルボジイミド法 アミノ基とカルボキシル基との間で脱水縮合によりアミ
ド結合を形成させる方法で、両成分の溶液中に等モルも
しくは僅かに過剰のカルボジイミド化合物を加えて室温
又は氷冷下に反応させることにより目的を達する。

カルボジイミド自身は尿素誘導体に変換する。反応溶媒
としてはそれ自身が反応にあずかる官能基を有しない限
り特に限定されることはなく、例えば酢酸エチル、テト
ラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、
クロロホルム等が使用できる。

また任意の割合で水を含有する系であつてもよく、水溶
液中で反応させることもできる。用いるカルボジイミド
化合物としては、有機溶媒中の反応にはシンクロヘキシ
ルカルボジイミドが最もよく用いられ、含水系溶媒中で
の反応には例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のような水溶性カ
ルボジイミドを用いることができる。２）カルボニルジ
イミダゾール法 カルボジイミド法と全く同様にアミノ基とカルボキシル
基との間の脱水縮合を起させる方法で、両成分の溶液中
に必要量のカルボニルジイミダゾールを加えればよい。

この試薬は水分に敏感で、水で直ちに分解するから、水
を含有しない溶媒を用いるのが好ましい。３）混合酸無
水物法 カルボキシル基は例えばクロル蟻酸エステルと、有機塩
基の存在下、いわゆる混合酸無水物を形成し、これはア
ミノ基と容易に反応して、アミド結合を形成する。

クロル蟻酸エステルとしては例えばエチル、イソプロピ
ル、イソブチルのような低級アルキルエステル、特にク
ロル蟻酸イソブチルがよく用いられ、有機塩基としては
トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等のような第
三級アミンが用いられる。

反応溶媒にはカルボジイミド法に述べたものをそのまま
用いることができるが、混合酸無水物は水に不安定であ
るので、混合酸無水物を形成する際には含水したものを
用いないよう注意が必要である。

反応温度は、例えば先ず−１０〜−２０℃位の低温で混
合酸無水物を形成せしめ、ついでアミノ成分を加えてか
ら室温にて反応をつづける。アミノ成分を加えるときに
は水もしくは水を含んだ溶媒を使用してもかまわない（
４）活性エステル法 カルボキシル基を電子吸引性の大きい化合物のエステル
にすると、そのカルボニル基上の電子密度が減り、その
結果アミノ基のような塩基性の大きい官能基を攻撃して
アミド結合を形成することになる。

これが活姓エステル法の原理で、活性エステルとしては
例えば、パラニトロフエノール、２，４−ジニトロフエ
ノール、ぺンタクロロフエノール、チオフエノール、ナ
フトール、８−ハイドロキシキノリン等のフエノール誘
導体、Ｎ−ハイドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ハイドイ
キシピペリジン等のＮ−ハイドロキシ化合物、シアノメ
チルのようなアルキルエスチル等を用いることができる
。溶媒はカルボジイミド法で述べたものが使用される。
（５）アジド法 カルボキシル化合物をエステルに変え、ヒドラジンと反
応させると酸ヒドラジドになるが、これは亜硝酸の作用
により酸アジドになり、アミノ基と反応してアミド結合
を形成する。

ヒドラジドを希塩酸中亜硝酸ナトリウムと反応せしめて
生成した酸アジドを一たん単離して、ついで適当な有機
溶媒中アミン成分と反応させる古典的な方法と、ヒドラ
ジドを有機溶媒（含水したものでよい）中、塩化水素存
在下亜硝酸アルキルエステル例えば亜硝酸ｔ−ブチル、
亜硝酸１−アミル等で処理して酸アジドとし、単朧する
ことなくアミン成分と反応せしめることによりアミド結
合を形成することができる。

（６）酸クロリド法カルボキシル化合物を酸クロリドに
変え、アミノ化合物と反応させてアミド結合を生成する
最も一般的な方法も採用することができる。

酸クロリドにするには、カルボキシル化合物を五塩化リ
ン、塩化チオニル、オキシ塩化リン等と反応させる直接
法と、例えばシユウ酸クロリドと反応させる交換反応法
があげられる。アミノ化合物との反応には水の中でアル
カリを加えながら行なういわゆる［シヨツテンーバウマ
ン法」と、必要に応じて例えばベンゼンなどの不活性溶
媒中例えばピリジン、トリエチルアミン等の有機塩基存
在下に反応する方法などがある。（７） ＤＰＰＡ法 カルボキシル化合物とアミノ化合物との溶液中にジフエ
ニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、ついで例えばトリ
エチルアミン、或いはＮ−メチルモルホリン等の有機塩
基を加えてアミド結合を形成する方法も採用できる。

この際、溶媒としては例えばジメチルホルムアミドが好
適に用いられ、温度は氷冷から室温でよい。以上の例え
ば（１）〜（７）の如き化学的結合法のいずれをもつて
しても目的を達することができるが、本発明に応用する
際にはハプテンが有する他の置換基などによつては不安
定なものもあり得るので、あまり激しい条件を必要とす
るものは避けるべきである。

最も好適に使用できるのは（１）カルボジイミド法、（
７）ＤＰＰＡ法である。ホルダーと、導入すべき適当量
のハプテンの溶液中にハプテンに対し等モル又は僅かに
過剰のカルボジイミド、もしくはＤＰＰＡを加え、ＤＰ
ＰＡの場合には有機塩基を加えて反応せしめる。反応後
は全反応液をセロフアンチユーブ内にて水に対し透析す
れば、未反応のハプテン、試薬、副成物などは外液に逃
げるので内液を濃縮、或いは凍結乾燥することにより目
的のハプテン（又はその変性物）−ホルダー結合物を得
ることができる。（エステル結合によるハプテンとホル
ダーとの結合）ハプテンまたはその化学的変性物が適当
な反応性水酸基を有し、そしてホルダーカ幼ルボキシル
基を有する場合、またはその反対の場合には、ハプテン
とホルダーとをエステル結合で化学的に結合することが
できる。

エステル結合法の場合、ハプテン又はその化学的変性物
が水酸基を有し、ホルダーがカルボキシル基を有する場
合には、カルボキシル基を例えば塩化チオニルを作用さ
せて酸クロリドに変え、或・−１１−・・ ｈゞ １
−Ｆｔｒ．ｌ二７Ｊ７］１ｆ−レ１１ノノ〜ノ＾わメ―
ノトｆ】１辷１片合体ならば、そのままで、ハプテンと
反応させて、エステル結合によるハプテンーホルダ一結
合物を得ることができるが、その反対即ち、ハプテン又
はその化学的変性物がカルボキシル基を有し、ホルダー
が水酸基をもつ場合には、ハプテンの性質によつては反
応性誘導体例えば酸クロリドに変換し得る程充分な安定
性を有しない場合もあり、この場合エステル結合せしめ
るのは困難である。

かくして得られるハプテンーホルダ一結合物としては、
数多くのハプテンとホルダーの組合せからなる結合物を
得ることができるが、これらの代表例を例示すれば、１
７−アミノ−１，３，５（１０）一エストラトリエン一
３−オール結合ポリアクリル酸、１７−アミノ−１，３
，５（１０）一エストラトリエン一３−オール結合ビニ
ルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体、エストリオ
ール一１６−グルクロ、ナイト結合ポリアクリル酸、エ
ストリオール一１６−グルクロナイド結合ビニルメチル
エーテル無水マレイン酸共重合体、エストリオール一１
６，１７−ジヘミサクシネート結合ポリアクリル酸、プ
？グナンジオール一３−グルクロナイド結合ポリアクリ
ル酸、プレグナンジオール一３−グルクロナイド結合ビ
ニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体、プレグナ
ントリオール一３−グルクロナイド結合ポリアクリル酸
、プレグナントリオール一３−グルクロナイド結合ビニ
ルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体、３α，１１
β，１７α，２１−テトラヒドロキシプレグナン一２０
−オン−３−グルクロナイド結合ポリアクリル酸、３α
，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキ （シプレグ
ナン一２０−オン−３−グルクロナイド結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酸共重合体、カルボキシメチル
モルフイン結合ポリアクリル酸）
ｔカルボキシメチルモルフイン
結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体、エ
チオコラノロン一３−ヘミサクシネート結合ポリアクリ
ル酸、フ サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸
共重合体、サイロキシン結合ポリアクリル酸、 メタネフイリン結合ポリアクリル酸、 メタネフイリ７結合ビニルメチルエーテル無水マレイン
酸共重合体、等々をあげることができる。

〔抗体の作製〕

本発明において使用するハプテン抗体は公知の方法によ
り製造することができる。

即ち、ハプテンはそれ自体抗原性を有するものでないの
で、抗原性を有する物質と結合させて、これを抗原とし
て動物に免疫して抗血清を作製する。

この場合に使用するハプテンは前述の如き物質又はその
化学的変性物を使用することができ、これに抗原性を有
する物質、例えば牛血清アルブミン、家兎血清アルブミ
ン、ヒト血清アルブミン、牛γ−グロブリン、家兎γ−
グロブリン、ヒトγ−グロブリン、破傷風毒素、肺炎球
菌多糖体等のうちの適当なものと結合させ、例えばハプ
テン一蛋白質の結合物として動物に免疫すればよい。

この場合に使用するハプテン一蛋白質結合物としては、
例えば、ステロイド一蛋白質結合物の例としては、エス
トリオール一１６，１７−ジヘミサクシネート−ＢＳＡ
（牛血清アルブミン）、エストリオール一１６−グルク
ロニド一ＢＳＡｌ工ストリオール一６−（０−カルボキ
シメチル）−オキシム一ＢＳＡｌデヒドロエピアンドロ
ステロン一３−グルクロニド一ＢＳＡｌアンドロステロ
ン一３−ヘミサクシネート−ＢＳＡｌコルチゾール一２
１−ヘミサクシネート−ＢＳＡｌ等の如きもの、またそ
の他上記ステロイド以外のハプテン一蛋白質結合物とし
ては前述のハプテン類に例えば蛋白質の如き抗原性を有
する物質を結合させて動物に免疫すればよく、この場合
に例えば、コンプリートフロインドアジユバント等のア
ジユバントを併用すると一層有効に抗血清を得ることが
できる。動物としては、家兎、山羊、めん羊、モルモツ
ト等の補乳動物を使用することができ、得られた抗血清
をハプテンとの結合に用いた抗原性を有する物質により
吸収し、例えばアルコール沈殿又は塩析等の如き手段に
よつて、γ−グロブリンを分１υ画し、ハプテン抗体を
得ることができる。

〔担体〕

本発明においていう担体とは、ヒト、羊、兎等の赤血球
、高分子ラテツクス、ベントナイト、コロジオン、コレ
ステロール結晶、シリカ、カオリン等々従来免疫化学的
測定試薬の担体として使用できるものを使用することが
でき、本発明におけるハプテン抗体を担持できるもので
あれば何れでもよい。

但し、本発明においては上記担体にハプテン抗体を感作
させるという表現は、該抗体を担体に吸着せしめること
を意味し、化学的に結合せしめることを意味しない。

したがつて、合成樹脂等に化学的に結合させた場合には
、抗体を高分子ラテツクスに化学的に結合せしめた高分
子ラテツタスと呼称し、前者と後者を総合してハプテン
抗体担持担体と呼称するものである。〔ハプテン抗体担
持担体〕 （抗体を感作又は化学的に結合せしめた高分子ラテツク
ス）本発明においては、前述の如くして得られる抗体を
例えば高分子ラテツクスに感作又は化学的に結合する。

かかる高分子ラテツクスは、前記の如き官能基を有して
いても、有していなくともよい。しかし、抗体を該ラテ
ツクスに化学的に結合させる場合にはかかる抗体と反応
し得る官能基を有する高分子ラテツクスを用いる。かか
る高分子ラテツクスとしては、平均粒径が約０．０１〜
約２ミクロンのものであつて、抗体と反応し得る官能基
を有するものが用いられる。平均粒径が約０．０５〜約
１．５ミタロンのものが特に好適である。また、かかる
反応性高分子ラテツクスとしては、官能基としてカルボ
キシル基、第１級アミノ基又はカルボアミド基（−ＣＯ
ＮＨ２）を有し、且つ基体が例えばポリスチレン、スチ
レン−ブタジエン共重合体、スチレンージビニルベンゼ
ン共重合体、ポリビニルトルエン、ビニルトルエンータ
ーシヤリブチルスチレン等から成る高分子ラテツクスが
種々の商品名で市販されており、之等の高分子ラテツク
スのいずれも使用することができる。高分子ラテツクス
の基体は勿論上記の如き重合体又は共重合体に何等限定
されない。高分子ラテツクスが官能基としてカルボキシ
ル基又は第１級アミノ基を有している場合は、之等フ刀 の高分子ラテツクスをそのまま前記抗体の有するアミノ
基又はカルボキシル基と反応せしめて、アミド結合によ
つて該抗体と化学的に結合することができる。

このようなアミド結合は、前記のハプテン又はその化学
的変性物とホルダーとの化学的結合法により行うことが
できる。

また高分子ラテツクスと抗体との双方が官能基としてカ
ルボキシル基を有する場合、どちらか一方のカルボキシ
ル基を下記の如き方法によつて化学的に変性して、第１
級アミノ基を導入した後、抗体とアミド結合によつて結
合することもできる。

例えばカルボキシル基含有ラテツクスを水溶性カルボジ
イミド存在下へプタメチレンジアミンの様なポリメチレ
ンジアミンと反応せしめて第一級アミノ基を導入する方
法（例：ＪＯｕｒｎａｌＯｆＣｅｌｌＢｌＯｌＯｇｙ，
６４巻、７５−８８頁、１９７５）等がある。しかし、
抗体は多くの場合に、カルボキシル基と第１級アミノ基
の双方を有するので、通常は前述のような高分子ラテツ
クスに上記化学的な変性を行わなくともカルボジイミド
法等の手段で化学的に結合させることができる。

すなわち、例えば、抗エストリオール一１６−グルクロ
ナイド抗体をカルボキシル化ラテツクスにカルボジイミ
ド法で結合することにより抗エストリオール一１６−グ
ルクロナイド抗体結合ラテツクスを得ることができる。
かくして得られるハプテン抗体結合ラテツクスとしては
、例えば、抗エストリオール一１６−グルクロナイド抗
体結合ラテツクス、抗エストリオール一１６，１７−ジ
ヘミサクシネート抗体結合ラテツクス、抗１７−アミノ
−１，３，５（１０）一エストラトリエン一３−オール
抗体結合ラテツクス、抗プレグナンジオール一３−グル
クロナイド抗体結合ラテツクス、抗プレグナントリオー
ル一３−グルクロナイド抗体結合ラテツクス、抗３α，
１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシプレグナン一
２０−オン−３−グルクロナイド抗体結合ラテツクス、
抗カルボキシメチルモルフイン抗体結合ラテツクズ、抗
エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗体結合ラテ
ツクス、抗サイロキシン抗体結合ラテツクス、 抗メタネフイリン抗体結合ラテツタス、 等々をあげることができる。

本発明のハプテン抗体結合ラテツクスは、しかし、上述
の例示に限られるものではない。また、ハプテン抗体を
前記担体に感作させる場合には、抗体を該担体に吸着せ
しめることを意味するものであることを前述したが、こ
の場合には、抗体溶液と担体懸濁液とを単に攪拌混合す
ることにより抗体感作担体を得ることができる。

例えば、赤血球を担体として、ハプテン抗体をこれに感
作するには、通常行われている抗体感作血球の方法によ
り感作すればよい。

例えば、血球を、ホルマリン、グルタルアルデヒド又は
ピルビンアルデヒド等の適切なもので固定化した固定血
球を用い、必要に応じタンニン酸或いは他の縮合剤を用
い抗体を感作させ、抗体感作血球を得る。これを懸濁液
として用いるか、または必要に応じて凍結乾燥すること
により抗体感作血球（抗体感作担体）とすることができ
る。さらにまた、担体として高分子ラテツクスに抗体を
感作する場合にも従来既知の同様の感作方法によつて抗
体感作ラテツクスを作製することができる。

例えば、適度の濃度の抗体溶液にポリスチレンラテツク
スの如き担体を懸濁させた懸濁液を加えて混合すること
により抗体感作ラテツクスとすることができる。

かくして得られるハプテン抗体感作担体としては、例え
ば、抗エストリオール一１６−グルクロナイド抗体感作
血球、抗エストリオール一１６，１７−ジヘミサクシネ
ート抗体感作血球、抗１７−アミノ−１，３，５（１０
）一エストラトリエン一３−オール抗体感作血球、抗プ
レグナンジオール一３−グルクロナイド抗体感作血球、
抗プレグナントリオール一３−グルクロナイド抗体感作
血球、抗３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロく
キシプレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド抗体
感作血球、抗カルボキシメチルモルフイン抗体感作血球
、抗エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗体感作
血球、抗サイロキシン抗体感作血球、 抗メタネフイリン抗体感作血球、 抗エストリオール一１６−グルクロナイド抗体感作ラテ
ツクス、抗エストリオール一１６，１７−ジヘミサクシ
ネート抗体感作ラテツクス、抗１７−アミノ−１，３，
５（１０）一エストラトリエン一３−オール抗体感作ラ
テツクス、抗プレグナンジオール一３−グルクロナイド
抗体感作ラテツクス、抗プレグナントリオール一３−グ
ルクロナイド抗体感作ラテツクス、抗３α，１１β，１
７α，２１−テトラヒドロキシプレグナン一２０−オン
−３−グルクロナイド抗体感作ラテツクス、抗カルボキ
シメチルモルフイン抗体感作ラテツクス、抗エチオコラ
ノロン一３−ヘミサクシネート抗体感作ラテツクス、抗
サイロキシン抗体感作ラテツクス、 抗メタネフイリン抗体感作ラテツクス、 等々をあげることができる。

しかし、本発明のハプテン抗体感作担体は上述のものに
限定されるものではない。本発明による安定性のある新
規な免疫化学的測定試薬としての具体例を例示すれば、
例えば、以下のとおりである。

１．エストロゲンの測定試薬としては、例えば、（イ）
Ａ：エストリオール一１６−グルクロナイド結合ポリア
クリル酸と、Ｂ：抗エストリオール一１６−グルクロナ
イド抗体一結合−ラテツクスよりなる免疫化学的測定試
薬、 （ロ）Ａ：エストリオール一１６，１７−ジヘミサクシ
ネート結合ポリアクリル酸とＢ：抗エストリオール一１
６，１７−ジヘミサクシネート抗体結合ラテツクスより
なる免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：エストリオール一１６−グルクロナイド結合
ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体と、 Ｂ：抗エストリオール抗体結合ラテツクスよりなる免疫
化学的測定試薬、 （ニ）Ａ：エストリオール一１６，１７−ジヘミサクシ
ネート結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合
体と Ｂ：抗エストリオール抗体結合ラテックスよりなる免疫
化学的測定試薬、 （ホ）Ａ：エストリオール一１６−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸とＢ：抗エストリオール一１６−グルク
ロナイド抗体感作ラテツクス又は感作血球、よりなる免
疫化学的測定試薬、 （へ）Ａ：エストリオール一１６，１７−ジヘミサクシ
ネート結合ポリアクリル酸とＢ：抗エストリオール一１
６，１７−ジヘミサクシネート抗体感作ラテツクス又は
感作血球、 よりなる免疫化学的測定試薬、 （ト）Ａ：１７−アミノ−１，３，５（１０）一エスト
ラトリエン一３−オール結合ポリアクリル酸と Ｂ：抗エストリオール一１６−グルクロナイド抗体結合
ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬等々。

２．プレグナンジオール測定試薬としては、（イ）Ａ：
プレグナンジオール一３−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸と、Ｂ：抗プレグナンジオール一３−グルクロナ
イド抗体結合ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ロ）Ａ：プレグナンジオール一３−グルクロナイド結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体と Ｂ：抗プレグナンジオール一３−グルクロナイド抗体結
合ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：プレグナンジオール一３−グルクロナイド結
合ポリアクリル酸とＢ：抗プレグナンジオール一３−グ
ルクロナイド抗体感作ラテツクスよりなる免疫化学的測
定試薬、 （ニ）Ａ：プレグナントリオール一３−グルクロナｘ必 イド結合ポリアクリル酸と Ｂ：抗プレグナントリオール一３−グルクロナイド抗体
結合ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ホ）Ａ：プレグナンジオール一３−グルクロナイド結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体と Ｂ：抗プレグナンジオール一３−グルクロナイド抗体一
結合−ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、等々。

｝．１７−０ＨＣＳ測定試薬としては、 （イ）Ａ：３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロ
キシプレグナン一２０−オン−３ーグルクロナイド一結
合ポリアクリル酸と Ｂ：抗３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシ
プレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド抗体結合
ラテツクス よりなる免疫化学的測定試薬、 （ロ）Ａ：３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロ
キシプレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド結合
ビニルメチルエーテ ル無水マレイン酸共重合体と Ｂ：抗３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシ
プレグナン一２０−オン−３グルクロナイド抗体結合ラ
テツクス よりなる免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロ
キシプレグナン一２０−オン−３一グルクロナイド結合
ポリアクリル酸と Ｂ：抗３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシ
プレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド抗体感作
ラテツクス よりなる免疫化学的測定試薬、 （ニ）Ａ：３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロ
キシプレグナン一２０−オン−３グルクロナイド結合ポ
リアクリル酸と Ｂ：抗３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシ
プレグナン一２０−オン−３ーグルクロナイド抗体感作
血球 よりなる免疫化学的測定試薬、 （へ）Ａ：３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロ
キシプレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド結合
ビニルメチルエーテ ル無水マレイン酸共重合体と Ｂ：抗３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシ
プレグナン一２０−オンーグルクロナイド抗体感作血球 よりなる免疫化学的測定試薬、等々。

４．モルフインの測定試薬としては、 （イ）Ａ：カルボキシメチルモルフイン結合ポリアクリ
ル酸とＢ：抗カルボキシメチルモルフイン抗体一結合−
ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ロ）Ａ：カルボキシメチルモルフイン結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酸共重合体と Ｂ：抗カルボキシメチルモルフイン抗体結合−ラテツク
スよりなる免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：カルボキシメチルモルフイン結合−ポリアク
リル酸とＢ：抗カルボキシメチルモルフイン抗体感作血
球よりなる免疫化学的測定試薬、 （ニ）Ａ：カルボキシメチルモルフイン結合−ポリビニ
ルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体と Ｂ：抗カルボキシメチルモルフイン抗体感作血球よりな
る免疫化学的測定試薬、 （ホ）Ａ：カルボキシメチルモルフイン結合一ポリアク
リル酸とＢ：抗カルボキシメチルモルフイン抗体感作ラ
テツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （へ）Ａ：カルボキシメチルモルフイン結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酸共重合体と Ｂ：抗モルフイン抗体感作ラテツクス よりなる免疫化学的測定試薬、等々。

５．１７−ＫＳの測定試薬 （イ）Ａ：エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結
合ポリアクリル酸とＢ：抗エチオコラノロン一３−ヘミ
サクシネート抗体結合ラテツクスよりなる免疫化学的測
定試薬、 （ロ）Ａ：エチオコラノロン一３−ヘミサクシネ一卜結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体と Ｂ：抗エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗体一
結合ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結
合ポリアクリル酸とＢ：抗エチオコラノロン一３−ヘミ
サクシネート抗体感作ラテツクスよりなる免疫化学的測
定試薬、 （ニ）Ａ：エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体と Ｂ：抗エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗体感
作ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ホ）Ａ：エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結
合ポリアクリル酸とＢ：抗エチオコラノロン一３−ヘミ
サクシネート抗体一感作血球よりなる免疫化学的測定試
薬、 （へ）Ａ：エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体と Ｂ：抗エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗体感
作血球よりなる免疫化学的測定試薬。

６．サイロキシン（Ｔ４）測定試薬としては、（イ）Ａ
：サイロキシン結合ポリアクリル酸とＢ：抗サイロキシ
ン抗体結合ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ロ）Ａ：サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水
マレイン酸共重合体とＢ：抗サイロキシン抗体結合ラテ
ツクス よりなる免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：サイロキシン結合ポリアクリル酸とＢ：抗サ
イロキシン抗体感作ラテツクスよりなる免疫化学的測定
試薬、 （ニ）Ａ：サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水
マレイン酸共重合体とＢ：抗サイロキシン抗体感作ラテ
ツクス よりなる免疫化学的測定試薬、 （ホ）Ａ：サイロキシン結合ポリアクリル酸とＢ：抗サ
イロキシン抗体感作血球よりなる免疫化学的測定試薬、 （へ）Ａ：サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水
マレイン酸共重合体とＢ：抗サイロキシン抗体感作血球 よりなる免疫化学的測定試薬、等々。

７．カテコールアミンの測定試薬としては、（イ）Ａ：
メタネフイリン結合ポリアクリル酸とＢ：抗メタネフイ
リン抗体結合ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ロ）Ａ：メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無
水マレイン酸共重合体とＢ：抗メタネフイリン抗体結合
ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：メタネフイリン結合ポリアクリル酸とＢ：抗
メタネフイリン抗体感作ラテツクスよりなる免疫化学的
測定試薬、 （ニ）Ａ：メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無
水マレイン酸共重合体とＢ：抗メタネフイリン抗体感作
ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ホ）Ａ：メタネフイリン結合ポリアクリル酸とＢ：抗
メタネフイリン抗体感作血球よりなる免疫化学的測定試
薬、 （へ）Ａ：メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無
水マレイン酸共重合体とＢ：抗メタネフイリン抗体感作
血球 よりなる免疫化学的測定試薬 等々をあげることができるが、本発明の試薬は上記に掲
げる具体例の例示に限定されるものではない。

前記１〜７の例において、Ａのハプテン結合ホルダーの
ホルダーとしては主としてポリアクリル酸を示したが、
これを例えばビニルメチルエーテル・無水マレイン酸共
重合体に代えることもできるし、また、之等の例におい
て抗体感作ラテツクスの代りに抗体感作血球を使用する
こともできる。

本発明の新規な免疫化学的測定試薬を使用して免疫化学
的測定を実施するに際しては、以下に示す測定方法に従
い実施することができ、また本発明の特徴並びに利点に
ついても以下の測定法に続いて詳述する。

〔測定方法〕

尿、血液その他の体液中に存在する微量ハプテンは、前
記試薬を用いて簡易かつ迅速に測定することができる。

原理的には、前記ハプテン結合カルボキシル基含有モノ
オレフイン系高分子化合物と、ハプテン抗体感作（又は
結合）担体、殊にハプテン抗体結合ラテツクスとの凝集
反応を測定対象ハプテンが阻止する凝集阻止反応に基づ
く原理に従い行われる。具体的な測定法は、後記実施例
に示したが一般的な測定方法は次に述べる通りである。

すなわち、例えば（１）清浄なスライド板上に１滴の試
験検体（適宜希釈）を置き、その上に１滴の前記ハプテ
ン抗体感作（又は結合）ラテツクスを滴下し、この両者
を十分に混合した後、前記のハプテン結合カルボキシル
基含有モノオレフイン系高分子化合物溶液１滴を滴下し
、２分間揺動して肉眼で観察し、凝集像を陰性、凝集阻
止像（非凝集像）を陽性と判定する。検体中のハプテン
濃度は、検体を適宜希釈して試験を行ない、陽性像を呈
する最高希釈倍数に測定感度を乗することにより求める
ことができる。

なお、本発明における測淀方法は、上記の方法に限定さ
れるものでなく、例えば、検体希釈用液中に一定量の該
ハプテン結合物を溶解させておくことにより、これを用
いた希釈検体と抗体感作（又は結合）ラテツクスとの反
応も行ない得るものである。また（２）清浄な丸底試験
管に検体（適宜希釈）の０．１−を入れ、これに抗ハプ
テン抗体感作血球０．３ｄを加えて十分攪拌後、ハプテ
ン結合カルボキシル基含有水溶性モノオレフイン系高分
子化合物の溶液０．１７７！１１を添加して、攪拌後ミ
ラー付スタンドに２時間静置した後、管底像により判定
する。

この場合凝集阻市像は沈降リングを形成し、凝集像はマ
ツト状を呈する。なお、本発明の方法は上記の方法に限
定されるものでなく、例えば検体希釈用液中に一定量の
該ハプテン結合物を溶解させて検体を希釈し、この一定
量とハプテン抗体感作血球とを反応させる方法も採用で
きる。

〔本発明の方法の特徴〕

ハプテンの免疫学的ラテツクス凝集阻止反応による測定
法は、これまで抗原性の強い物質例えば牛血清アルブミ
ン、ヒト血清アルブミン、牛γグロブリン、破傷風毒素
、等にハプテンを結合させＺσたものを抗原として高分
子ラテツクスに感作した抗原感作ラテツクスとハプテン
抗体との凝集反応系およびハプテン抗体感作ラテツクス
と前記抗原性の強い物質にハプテンを結合させたものの
溶液との凝集反応系が用いられている。

本発明においては後者の凝集反応系において、従来用い
られてきた抗原性の高い蛋白等天然物あるいはその類縁
物質とは異なるカルボキシル基含有水溶性モノオレフイ
ン系高分子にハプテンを化学的に結合させて使用するこ
とにより、以下に述べるような種々の特徴及び効果を発
揮することが分つた。本発明において、ハプテン結合カ
ルボキシル基含有モノオレフイン系高分子は水溶液の状
態においても非常に高い安定性を有し、室温保存に十分
耐え得る。

従来用いられて来たものはハプテン結合に前記の様な天
然物又はその類縁物質を用いるため、長期保存において
これらハプテンを結合させている物質の変性あるいは分
解が生じるためか、ハプテン結合物の凍結乾燥末におい
てすら冷所保存が必要であり、溶液状態では冷所におけ
る保存期間は短かかつた。

本発明では生体成分にまつたく無関係な異質なカルボキ
シル基含有水溶性モノオレフイン系高分子を用いるため
極めて安定である。例えば尿中エストロゲン抑淀法とし
て、（Ａ） １７アミノ−１，３，５（１０）一エスト
ラトリエン一３−オール結合ポリアクリル酸溶液と抗エ
ストリオール一１６−グルクロナイド抗体感作ラテツク
スの組合わせ（本発明）、と但）エストリオール一１６
−グルクロナイド結合ＢＳＡ溶液と抗エストリオール一
１６−グルクロナイド抗体感作ラテツクスとの組合わせ
（従来法）の安定性を比較するため測淀感度を０．１μ
？？に調整し、（４）における１７−アミノ−１，３，
５（１０）一エストラトリエン一３−オール結合ポリア
クリル酸溶液と（Ｂ）におけるエストリオール一１６−
グルクロナイド結合ＢＳＡ溶液を４℃、室温に貯蔵し、
抗体感作ラテツクスは４゜Ｃに保存して、両溶液の安定
性を比較したのが下記第１表である。

第１表に示すごとく、（５）においては室温２４ケ月に
おいても安定であつたが、（Ｂ）では４℃保存において
６〜１２ケ月で感度が上昇し、２４ケ月では反応が認め
られなかつた。

この傾向は室温保存でより明確になり、３ケ月で感度が
２倍に上昇し、６ケ月では反応が認められなくなつた。
すなわち、（８）においては、経時的に抗体ラテツクス
との凝集が弱くなり、見かけ上の感度が上昇し、４℃、
２４ケ月、室温６ケ月ではエストロゲンを含まない本来
凝集を示すべき反応が生じなくなつていた。このことか
ら、ハプテンを蛋白に結合するよりも、カルボキシル基
含有水溶性モノオレフイン系高分子にハプテンを結合せ
しめた方が、はるかに安定であることが判明した。また
、本発明は、従来の測淀法に比較して反応時間が短く、
かつ高い測定感度を有する。

従来のラテツクスを用いた方法では、反応時間が３〜５
分であり、反応液量が少い場合あるいは漣淀室内環境（
温度、湿度等）により、５分近く経過すると、反応液の
乾燥が生じ、周辺からの非特異的反応像の乱れが生じ易
かつた。本発明のラテツクスを用いた方法によれば、１
〜２分で容易に判定することができる。凝集阻止反応に
よるハプテンの定量は、前述のごとく凝集阻止反応像を
もつて判定するが、ラテツクス凝集阻止反応では陰性で
ある凝集像の強さがその測定法の見易さ、判定し易さを
決定づける要因である。

本発明の方法によれば従来法におけるより凝集像が強く
かつ迅速に出現する。その発現機序は十分明らかでない
が、カルボキシル基含有水溶性モノオレフイン系高分子
を用いることにより、従来法において天然物又はその類
縁物質を使用している場合に比して抗体との反応性が増
加したためと推定される。

本発明はカルボキシル基含有水溶性モノオレフイン系高
分子に結合させるハプテンの量、あるいはハプテン結合
カルボキシル基含有モノオレフイン系高分子溶液の濃度
および／または対応する抗体指持担体における担体に結
合（又は感作）する抗体の量を調整するか、あるいは、
以上のいくつかを組合せることにより測定対照のハプテ
ンに合つた測定感度に調整することができる。

下記第２表に本発明の方法と従来法との尿中エストロゲ
ン測定における測定感度および反応時間の比較を示した
。

第２表における本発明の方法（４）は１７−アミノ−１
，３，５（１０）一エストラトリエン一３−オール結合
ポリアクリル酸溶液と抗エストリオール一１６−グルク
ロナイド抗体感作ラテツクスを用いた測定例であり、（
Ｂ）は１７−アミノ−１，３，５（１０）一エストラト
リエン一３−オール結合ポリアクリル酸溶液と抗エスト
リオール一１６ーグルクロナイド抗体感作血球とを用い
た測定例である。

従来法（Ａ）はエストリオール一１６−グルクロナイド
結合ＲＳＡ（家兎血清アルブミン）感作ラテツクスと抗
エストリオール一１６−グルクロナイド抗体とを用いた
測定例であり、（Ｂ）はエストリオール一１６−グルク
ロナイド結合ＲＳＡ感作血球と抗エストリオール一１６
−グルクロナイド抗体とを用いた測定例である。上記第
２表に示す如く、従来法に比して、本発明の方法は測定
感度において指体がラテツクスの場合２０倍、担体が羊
血球の場合５０倍感度力塙く、反応時間も表示のように
短縮することができた。

従来法においてさらに感度を上げようとすると、陰性像
である凝集像が弱くなることから、本発明の高感度の発
現機序は前記と同様カルボキシことにより抗体との反応
性が増加したためと推定される。さらに、本発明の方法
は、従来の方法に比して凝集阻止像から凝集像への移行
が明瞭であり、かつその移行濃度巾がせまく定量性が高
い。

妊婦の胎児胎盤機能を反映する尿中エストロゲンは主と
してエストリオール一１６−グルクロナイドである。

このエストリオール一１６−グルクロナイドをグリシン
緩衝化食塩水で第３表に示す標準溶液を調整し（エスト
リオール換算濃度）、凝集阻止像から凝集像への移行の
明瞭性を従来法と比較し第３表に示した。なお、この比
較例に用いた本発明の方法（４）は１７−アミノ−１，
３，５（１０）エストラトリエン一３−オール結合ポリ
アクリル酸溶液と抗エストリオール一１６−グルクロナ
イド抗体結合ラテツクスを用いた例であり、従来法は、
エストリオール一１６−グルクロナイド・ＲＳＡ感作ラ
テツクスと希釈抗エストリオール一１６−グルクロナイ
ド抗血清とを用いた例であり、いずれの方法も感度０．
１μ９／Ｍｔに調整して比較を行なつた。ｊ なお、この表では凝集像の強さを比較するために凝集像
を＋として表示した。

上記表に示す如く、同一感度に調整した比較において、
従来の方法では、エストリオール一１６ーグルクロナイ
ドを含まない緩衝液のみでも凝集像は弱く、凝集阻止像
から凝集像を呈する濃度巾が大であつた。

本発明の方法では、移行巾がせまくなり、明瞭に凝集阻
止像から凝集像への移行が認められた。この発現機序も
前記のごとく水溶性カルボキシル基含有モノオレフイン
系高分子を用いたための効果と考えられる。

従来行なわれてきたハプテンの凝集阻止反応による測定
においては、ハプテンの定義に示した如く、それ自体抗
原性を持たないため、抗体を得るのに抗原性の強い蛋白
質等に結合して、哺乳動物に免疫してはじめてハプテン
に対する抗体を得ることができるようになつたことから
、担体に感作する場合、あるいは溶液で用いる場合に同
様な抗原性の強い蛋白等にハプテンを結合して使用する
ことが必須のごとく考えられてきた。

本発明において、５ハプテンに対する抗体の作成には、
常法通り抗原性の強い物質に結合することが必要である
が、担体に結合するハプテン結合物、あるいは、溶液と
して用いるハプテン結合物は必ずしも抗原性の強弱に関
係なく、天然に存在しない全く異質なカルボキシル基含
有水溶性モノオレフイン系高分子にハプテンを結合させ
て用いることにより前記の如く、従来法にはない特徴及
び利点を得ることができることが明らかとなつた。以下
に実施例をあげて本発明を具体的に示すが、本発明は下
記実施例のみに限定されるものではないＯ実施例 １ 妊婦尿中エストロゲンの測定（１） （ａ）エストリオール一１６−グルクロナイド一ＢＳＡ
の製造エストリオール一１６−グルクロナイド４０ηを
ジメチルホルムアミド１．０ｄに溶解し、これに４℃以
下でトリ−ｎ−ブチルアミン２０．６μｔを添加したの
ち、イソブチルクロロカーボネート１１．２μｔを加え
３０分間撹拌した。

これに予めＢＳＡ（牛血清アルブミン）１１７７ｒＩ？
を２．８ＷＬｅの水に溶解したものに１Ｎ水酸化ナトリ
ウム液１５０μｔを加えたのちジメチルホルムアミド２
．０７７！１１を加え、８チＣに保たれた液を混合した
。次いでこれを８℃で攪拌し、１時間後に１Ｎ水酸化ナ
トリウム液１６．６μｔを加え、さらに３．５時間攪拌
したのち、セフアデツクスＧ−２５で未反応のエストリ
オール一１６−グルクロナイド及びトリ−ｎ−ブチルア
ミン等の低分子試薬を分離した。さらにこれを透析（精
製水に対し）したのち凍結乾燥すると、エストリオール
一１６−グルタロナイド一ＢＳＡが得ＩＣ（至） 初 られた。

この抗原の凍乾末についてのコーベル反応により、ＢＳ
Ａｌモル当リエストリオール一１６−グルクロナイド２
７〜３０モルの結合が確認されていた。（ｂ）抗エスト
リオール一１６−グルクロナイド抗体の製造上記（ａ）
で製造したエストリオール一１６−グルクロナイド一Ｂ
ＳＡ２Ｔｌ９を１ｄの生理食塩水に溶解し、同量のコン
プリートフロインドアジユバントで乳化し、成熟家兎の
足鍍および皮下に注射した。

この注射を１ケ月間隔で行ない、抗体価の上昇を確認後
全採血を行ない抗血清を得た。この抗血清を５６℃３０
分間非働化後ＢＳＡで吸収し、ついで硫酸アンモニウム
による塩析で抗エストリオール一１６−グルクロナイド
抗体を製造した。ｃ）抗エストリオール一１６−グルク
ロナイド抗体感作ラテツクスの製造上記（ｂ）で製造し
た抗エストリオール一１６一グルクロナイド抗体４Ｔｎ
９を５ｄのグリシン緩衝化食塩液に溶解し、これに１０
％ポリスチレンラテツクス１ｉを加えて混合し、５６℃
で３０分間処理した。

この後、遠心分離して得た沈澱をグリシン緩衝化食塩液
（ＰＨ９．６）にて遠心洗浄し、沈澱を０．０５％にＲ
ＳＡ（ウサギ血清アルブミン）を含むグリシン緩衝化食
塩液１５Ｔｎ！，にて懸濁させ、抗エストリオール一１
６−グルクロナイド抗体感作ポリスチレンラテツクスを
製造した。０エストロゲン変性物結合カルボキシル基含
有水溶性モノオレフイン系高分子化合物の製造（ｄ−１
） １７−アミノ−１，３，５（［０）一エストラトリ
エン一３−オール結合ポリアクリル酸の製造。

表記アミノステロイド１０，５ワ、ポリアクリル酸（平
均分子量約２００万）１００ｍｇをジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）５祷に溶かし、シンクロヘキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣ）９ηを加えて室温に３０時間放置する
。

反応液をセロフアンチユーブに移し、蒸留水２ｔ中で３
０時間透析する。

内液を沢過したのち沢液を濃縮して表記の目的物を得る
。液量８．０ｒｎｅに濃縮したときのアミノステロイド
含有量は波長２８０ｍμの光で定量した結果１．２６、
／ｄであつた。（ｄ−２） １７−アミノ−１，３，５
ａω一エストラトリエン一３−オール結合ビニルメチル
エーテル無水マレイン酸共重合体 （ＰＶＭＭＡ）の製造。

ＰＶＭＭＡＩＯＯ〜をＤＭＦ５ｍｅに加温して溶解し、
表記アミノステロイド３０ｍｆ７を加え、溶液を室温に
４日間放置する。

反応液をセロフアンチユーブに移し、蒸留水２ｔ中にて
８０時間透析したのち、内液を沢過する。

沢液の液量を５０ｍｅに調整したときのアミノステロイ
ドの含有量を波長２８０ｍμの光で定量した結果は０．
４４〜／一であつた。（ｄ−３） エストリオール一１
６−グルクロナ＊イド結合ポリアクリル酸の製造（Ｉ）
。

（ィ）エストリオール一１６−グルクロナイドーリジン
誘導体エストリオール一１６−グルクロナイド ２３２ｍｙ）ε−ベンジルオキシカルボニルリジンメチ
ルエステルートルエンスルホン酸塩２３３Ｔ！７９をＤ
ＭＦｌ５ｍｅに溶かし、氷冷下攪拌しつつジフエニルホ
スホリルアジド１６４７ｎ９、ついでトリエチルアミン
０．１４−を加える。

ｏ℃で１時間攪拌したのち室温に４８時間放置、次いで
、反応液を４０℃以下にて減圧乾固し、残渣をプレパラ
テイブ薄層クロマトグラフイに付し目的とする表記化合
物： ２４０ｍｆ７（対理論収率６５％）を得る。

本品は結晶し難いが、シリカゲルの薄層クロマトでＲｆ
＝０．５５（クロロホルム−メタノール５：１ ）の単
一スポツトを与え、硫酸で紫色に、ニンヒドリンで橙赤
色に発色する。

（ロ）上記（イ）で得たエストリオール一１６−グルク
ロナイドーリジン誘導体３７ｗ１ｙを第三級ブタノール
ー水（８：２）１５ゴに溶かし１０％パラジウム炭素１
０〜を加え、常温常圧で水素気流中で撹拌する。

反応の状態を薄層クロマトで追跡すると１．５時間で原
料は消失するから、触媒を沢別、洗浄し、沢液および洗
液を減圧乾固する。

生成物をポリアクリル酸１００Ｗ９とともにＤＭＦ７ゴ
に溶かしシンクロヘキシルカルボジイミド１２．４Ｗ１
９を加えて室温に４８時間放置したのち（ｄ−１ ）項
に従つて処理し、エストリオール含量２．０１ｍｆ７／
Ｍｅのエストリオール一１６−グルクロナイド結合ポリ
アクリル酸溶液１０−を得た。

（ｄ−４） エストリオール一１６−グルクロナイド結
合ポリアクリル酸の製造（）。

（イ）エストリオール一１６−グルクロナイドーヘキサ
メチレンジアミン誘導体エストリオール一１６−グルク
ロナイド ９３ｍｆ７と、Ｎ−ハイドロキシコハク酸イミド２５７
！１ｆ７をＤＭＦｌ．５−に溶かし、氷冷下攪拌しつつ
ＤＣＣ４工〜を加える。

３０分 後モノベンジルオキシカルボニルヘキサメチレンジアミ
ン塩酸塩５５〜、トリエチルアミン０．０３ゴをＤＭＦ
Ｉゴに溶かした溶液を加え、氷冷下で２時間、室温で１
２時間撹拌をつづける。

全体を減圧乾固し、残渣をプレパラテイブ薄層クロマト
に付して目的の標記化合物、 ８２ワ（対理論収率５５ｅ）を得た。

本品はシリカゲルの薄層クロマトでＲｆ ＝０．４２（クロロホルム−メタノール５：１）を示し
た。

（ロ）上記（イ）で得たエストリオール一１６−グルク
ロナイド・ヘキサメチレンジアミン誘導体５０ηをメタ
ノール３ｄに溶かし、パラジウム黒１０ＴＩ９を加え、
常温常圧で水素気流中で攪拌する。

２時間で反応は終了し 触媒を▲別し、沢液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加
えると、カルボベンジルオキシ基が脱離した目的物３５
ηを粉末として得た。

この生成物１０即をポリアクリル酸１００〜とともにＤ
ＭＦ２ｒｒｌｌに溶かし、ＤＣＣ４ηを加え、室温に５
０時間放置する。

反応液を透析し、内液を沢過後凍結乾燥すると、ｊエス
トリオール一１６−グルクロナイド結合ポリアクリル酸
９５７！９を白色粉末として得た。

（ｅ）尿中エストロゲンの測定（１） 妊婦尿５検体をグリシン緩衝化食塩液で５０５倍、１０
０倍、２００倍および４００倍に希釈し、各希釈尿の１
滴（０．０３ｄ）を反応スライド板上に滴下し、これに
（ｃ）で製造した抗エストリオール一１６−グルクロナ
イド抗体感作ラテツクスを１滴ずつ滴下し、混合後（ｄ
−１）で製 ｊ造した１７−アミノ−１，３，５（１１
−エストラトリエン一３−オール結合ポリアクリル酸の
工ストロゲン濃度として１２ｎｈ駕溶液を１滴ずつ滴下
する。

この三者を均一に混合し２分間揺動後肉眼で凝集像、凝
集阻止像を観察した。な ４お、この実施例においては
試薬の感度を０．１μｆ！Ｚｄに調整してあるので各妊
婦尿のエストロゲン濃度は第４表に示す値であつた。測
定例において、なお、エストロゲン変性物結合カルボキ
シル基含有モノオレフイン系高分子として、前記（ｄ−
２），（ｄ−３），（ｄ−４）を用いた場合も、上記（
ｄ−１）を用いた場合と同様の結果が得られた。

実施例 ２ 尿中エストロゲンの測定（） ａ）抗エストリオール一１６−グルクロナイド抗体感作
血球の製造ホルマリン固定羊血球の４％懸濁液（リン酸
緩衝化食塩液、ＰＨ６．４）に等量の０．０１％タンニ
ン酸溶液を加えて５６℃３０分反応させた後、リン酸緩
衝化食塩液にて血球を洗浄後、８％懸濁液とする。

ついで前記実施例１−（ｂ）で製造した抗エストリオー
ル一１６−グルクロナイド抗体の０．０５％溶液を等量
加え５６℃で２時間反応させる。反応終了後、リン酸緩
衝化食塩液にて血球を遠心洗浄し、０．２％にＮＲＳ（
正常家兎血清）５％に乳糖を含むリン酸緩衝化食塩液に
て１．５％血球濃度に希釈し、０．１ｍｅずつアンプル
に分注し、次いで凍結乾燥して抗エストリオール一１６
−グルクロナイド抗体感作血球を製造した。））尿中エ
ストロゲンの測定（Ｈ） 月経周期の各時期に採尿した正常婦人尿について、それ
ぞれをリン酸緩衝化食塩液で５倍、１０倍、２０倍、４
０倍および８０倍に希釈し、各希釈尿を丸底小試験管に
０．１ｄずつ分注し、ついで、前記（ａ）で製造した抗
エストリオール一１６−グルクロナイド抗体感作血球１
アンプルをリン酸緩衝化食塩液０．３ｄで懸濁させた全
量を、それぞれに添加し混合攪拌後、実施例１（ｄ−１
）で製造した１７−アミノ−１，３，５（１１ーエスト
ラトリエン一３−オール結合ポリアクリル酸溶液０．１
ｍｅを加え、よく攪拌後、ミラー付スタンドに２時間静
置し、管底像により判定した。

本実施例においては測定感度を２ｎ９／Ｗｌｅに調整し
てあるので各尿中エストロゲン濃度は第５表に示すごと
くであつた。実施例 ３ 尿中プレグナンジオールの測定 （ａ）プレグナンジオール一３−グルクロナイド一ＢＳ
Ａの製造プレグナンジオール一３−グルクロナイドとＢ
ＳＡを用いて実施例１（ａ）と同様の方法でプレグナン
ジオール一３−グルクロナイド一ＢＳＡを製造した。

（ｂ）抗プレグナンジオール一３−グルクロナイド抗体
の製造上記（ａ）で製造したプレグナンジオール一３−
グルクロナイド一ＢＳＡを用い、実施例１（ｂ）と同様
な方法で山羊に免疫して抗血清を得ることにより抗プレ
グナンジオール一３−グルクロナイド抗体を製造した。

（ｃ）抗プレグナンジオール一３−グルクロナイド抗体
結合ラテツクスの製造上記（ｂ）で製造した抗プレグナ
ンジオール一３ーグルクロナイド抗体５７ｒ１ｇを５Ｗ
１ｅの蒸留水に溶解後、これにカルボキシルモデイフア
イドラテツクスの１０％懸濁液１ｄを混合し、次いで、
１０ｒＩ９の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩を加え撹拌下一夜反応を
行なつた。

反応終了後、遠心分離して得た沈殿をグリシン緩衝化食
塩液で洗浄し、沈殿を０．０８％にヤギ血清アルブミン
を含むグリシン緩衝化食塩水１０Ｔ！！ｔにて懸濁させ
て、抗プレグナンジオール一３−グルクロナイド抗体結
合ラテツクスを製造した。］）プレグナンジオール一３
−グルクロナイド結合ＰＶＭＭＡの製造（イ）プレグナ
ンジオール一３−グルクロナイドーリジン誘導体プレグ
ナンジオール一３−グルクロナイド９９ｍｇ、ε−ベン
ジルオキシカルボニルリジンメチルエステル・トルエン
スルホン酸塩１４０ワをＤＭＦｌ２ｄに溶かし、氷冷下
攪拌しつつジフエニルホスホリルアジド６５ｍｇ、次い
で、トリエチルアミン０．０５６ｍ！．を加えたのち、
実施例１（ｄ−３）（イ）と同様にして、下記構造式で
表わされる目的のリジン誘導体１００ワ（対理論収率５
８％）を得た。

（ロ）上記（イ）で得たプレグナンジオール一、３−グ
ルクロナイドーリジン誘導体３８ｍｆを実施例１（ｄ−
３）（口）と同様にして接触還元した生成物をＰＶＭＭ
ＡｌＯＯηとともにＤＭＦ６−に加温溶解したのち、室
温に４日間放置した。

反応液を実施例１（ｄ−２）と同様に処理し、プレグナ
ンジオール含量０．４６Ｔｆ９／ｒ！１ｔ（硫酸発色に
よる定量）のプレグナンジオール一３一グルクロナイド
結合ＰＶＭＭＡの溶液３０ｍ１（ｅ）尿中プレグナンジ
オール測定妊婦尿５例をグリシン緩衝化食塩液で５０倍
、１００倍、２００倍、４００倍および８００倍に希釈
し、上記（ｃ），（ｄ）を用い、実施例１（ｅ）と同様
な操作で尿中プレグナンジオールを測定した。

なお、この実施例においては、試薬の感度を０．０５μ
Ｔに調整してあるので各妊婦尿のプレグナンジオール濃
度は第６表に示す値であつた。実施例 ４ 尿中プレグナントリオールの測定 （ａ）プレグナントリオール一３−グルクロナイド一Ｂ
ＳＡの製造プレグナントリオール一３−グルクロナイド
とＢＳＡとを用いて実施例１（ａ）と同様にしてプレグ
ナントリオール一３−グルクロナイド一ＢＳＡを製造し
た。

（ｂ）抗プレグナントリオール一３−グルクロナイド抗
体の製造上記（ａ）で製造したプレグナントリオール一
３−グルクロナイド一ＢＳＡを用い、実施例１（ｂ）と
同様な方法で家兎に免疫して抗プレグナントリオール一
３−グルクロナイド抗体を製造した。

（ｃ）抗プレグナントリオール一３−グルクロナイド抗
体感作ラテツクスの製造上記（ｂ）で製造した抗プレグ
ナントリオール一３−グルクロナイド抗体を用い、実施
例１（ｃ）と同様な方法で、抗プレグナントリオール一
３ーグルクロナイド抗体感作ポリスチレンラテツクスを
製造した。

』）プレグナントリオール一３−グルクロナイド結合ポ
リアクリル酸の製造（イ）プレグナントリオール一３−
グルクロナイドーヘキサメチレンジアミン誘導体。

プレグナントリオール一３−グルクロナイド１０２Ｔ９
とモノベンジルオキシカルボニルヘキサメチレンジアミ
ン塩酸塩６３Ｗ９とをＤＭＦ４ｍｌにとかし、氷冷した
のち撹拌しつつジフエニルホスホリルアジド５５〜、次
いで、トリエチルアミン０．０６ｄを加えた。

０℃で２時間攪拌を続けたのち、室温に７２時間放置し
、反応液を減圧乾固して残つた生成物をプレパラテイブ
薄層クロマトにかけて、目的のプレグナントリオーノレ
一３−グルクロナイドーヘキサメチレンジアミン誘導体
６１η（対理論収率４１％）を得た。

（ロ）上記（イ）で得たプレグナントリオール一３ーグ
ルクロナイドーヘキサメチレンジアミン誘導体５６ηを
実施例１（ｄ−４）と同様にして接触還元したのち、ポ
リアクリル酸２００ＴＶとともにＤＭＦ２Ｏｄに溶かし
、ＤＣＣｌ６ワを加え室温に５日間放置した。

反応液を実施例１（ｄ−４）と同様に処理し、プレグナ
ントリオール一３−グルクロナイド結合ポリ−アクリル
酸の凍乾末１６８〜を白色粉末として得た。→ 尿中プ
レグナントリオールの測淀 新生児または乳児の尿もしくはオシメに一定の大きさの
脱脂タンホンを挿入して尿を吸着させ乾燥したものを集
める。

このタンホンを一定量の蒸留水で浸出して検体とする。
この検体を生理食塩水で原尿換算２５，５０，１００，
２００および４００倍に希釈し上記（ｃ）と（ｄ）を用
い、実施例１（ｅ）と同様な操作で尿中プレグナントリ
オールを測定した。なお、この実施例では試薬の感度を
０．１馬Ｚｉに調整してあるので各検体中のプレグナン
トリオール量は第７表のとおりである。この方法で第７
表に示すように生れつき副腎 １（過形成の疾病の有無
が判定できるから、早期に副腎皮質ホルモン治療するこ
とで正常に成長でき、婦人ならば妊娠、分娩も正常にで
きる。

実施例 ５モルフインの測定
１．（ａ）カルボキシメチルモルフイン一ＢＳＡの
製造１００即のＢＳＡを２５ｄの蒸留水に溶解し、この
溶液にカルボキシメチルモルフイン８０ｍｇを溶解させ
、ＰＨ５．５に調整後８０ＴＩ！９の１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カル ２ボジイミド塩
酸塩を添加溶解し、室温で一夜攪拌下反応し、反応液を
蒸留水に対して透析し、透析内液を凍結乾燥してカルボ
キシメチルモルフイン一ＢＳＡを製造した。

（ｂ）抗カルボキシメチルモルフイン抗体の製造 ２
上記（ａ）で製造したカルボキシメチルモルフイン一Ｂ
ＳＡを用い実施例１（ｂ）と同様に家兎に免疫して抗血
清を得ることにより抗カルボキシメチルモルフイン抗体
を製造した。

（ｃ）−１ 抗カルボキシメチルモルフイン抗体感作
Ｊ血球の製造上記（ｂ）で製造した抗カルボキシメチル
モルフイン抗体を用い、実施例２（ａ）と同様な方法で
抗カルボキシメチルモルフイン抗体感作血球を製造した
。

．′（ｃ
）−２抗カルボキシメチルモルフイン抗体感作ラテツク
スの製造上記（ｂ）で製造した抗カルボキシメチルモル
フイン抗体を用い、実施例１（ｃ）と同様な方法で抗カ
ルボキシメチルモルフイン抗体感作ラテツクスを製造し
た。

（ｄ）カルボキシメチルモルフイン結合ポリアクリル酸
の製造ｌハ ふ１・」ｊ−３−ＳノＪこ二ｌノ一〔−
１１フッ）ノ一１１Ｓ〉）ノ千蝕４首１トカルボキシメ
チルモルフイン５１．５ワ、ε第三ブチルオキシカルボ
ニルリジンメチルエステル酢酸塩６１Ｗ１９、ジメチル
ホルムアミド１０ｍ１１ジフエニルホスホリルアジド４
９η、トリエチルアミン０．０４２ｍｅから実施例１（
ｄ−３）（イ）と同様にしてカルボキシメチルモルフイ
ン−リジン誘導体６６．７ｍｇ（対理論収率７８％）を
得た。

（ロ）上記（イ）で得たリジン誘導体４０ｍｇを９８％
蟻酸５ｄに溶かし室温に２時間放置したのち４０℃以下
で減圧乾固する。

さらに、苛性カリ上に２４時間減圧に保つ。これをＤＭ
Ｅ５ｄにとかし、トリエチルアミン０．０２ｍｅを加え
たのちポリアクリル酸１００ワとＤＭＦ３―を加え、さ
らにＤＣＣ２ｌＷ９を加えて４８時間反応させた。実施
例１（ｄ−３）（ロ）後段と同様に処理しカルボキシメ
チルモルフイン結合ポリアクリル酸溶液１０−（カルボ
キシメチルモルフイン含有量２．０Ｔｆ９／Ｍｔ）を得
た。ｅ）モルフインの測淀モルフインを生理食塩水およ
びモルフインを含まない尿で第８表に示す濃度に溶解し
、上記（ｃ）−１及び（ｄ）を用いて実施例２（ｂ）と
同様な操作でモルフインを測定した。

結果を第８表に示した。本実施例の測定感度は５０ｎ９
Δｄであり、この感度は尿成分の影響を受けないことが
判つた。また、前記（ｃ）−２，（ｄ）を用いた同感度
測定試薬においても上記検体について同様な結果が得ら
れた。実施例 ６ １７−ＫＳの測定 （ａ）エチオコラノロン一３−ヘミサクシネートＢＳＡ
の製造エチオコラノロン一３−ヘミサクシネートを用い
実施例１（ａ）と同様な方法によりエチオコラノロン一
３−ヘミサクシネートＢＳＡを製造した。

（ｂ）抗エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗体
の製造上記（ａ）で製造したエチオコラノロン一３−ヘ
ミサクシネートＢＳＡを用い、実施例１（ｂ）と同様に
して、家兎に免疫し抗エチオコラノロン一３−ヘミサク
シネート抗体を得た。

（ｃ）抗エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗体
結合ラテツクスの製造上記（ｂ）で製造した抗エチオコ
ラノロン一３−ヘミサクシネート抗体を用い、実施例３
（ｃ）と同様にして抗エチオコラノロン一３−ヘミサク
シネート抗体結合ラテツクスを製造した。

（ｄ）エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結合ポ
リアクリル酸の製造（イ）エチオコラノロン一３−ヘミ
サクシネート−リジン誘導体。

エチオコラノロン一３−ヘミサタシネート７８〜とε一
第三ブチルオキシカルボニルリジンメチルエステル酢酸
塩６４Ｗ９およびＮ−ハイドロキシコハク酸イミド２５
Ｗ１ｆをＤＭＦ２ｄにとかし、トリエチルアミン０．０
３ｍｅを加えたのち氷冷し、撹拌しつつＤＣＣ４ｌ即を
加え、氷冷下３時間、室温で１０時間反応させた。

全体を減圧乾燥したのち残渣をプレパラテイブ薄層クロ
マトで精製し、下式で示される目的化合物、
♀４Ｕ ６４７１１９（対理論収率５１％）を得た。

本品はシリカゲルの薄層クロマトでＲｆ＝０．６４（ク
ロロホルム−メタノール１０：１）に単一スポツトを与
えた。（ロ）上記（イ）で得たエチオコラノロン一３−
ヘミサクシネート−リジン誘導体３０ηを９８？蟻酸３
ｍ１に溶かし室温に３時間放置したのち、４５℃以下で
減圧乾固した。

これをポリアクリル酸１００１ｎ９とともにＤＭＦ５ｍ
ｅにとかし、トリエチルアミン０．０３−を加えたのち
ＤＣＣ２Ｏｍｆを加え室温に５０時間放置した。反応液
を実施例１（ｄ−３）（口）の後段に従つて処理しエチ
オコラノロン一３−ヘミサクシネート結合ポリアタリル
酸の凍乾品１００Ｗ９を白色粉末として得た。ｅ）尿中
１７−ＫＳの測定 上記（ｃ）で製造した抗エチオコラノロン一３−ヘミサ
クシネート抗体結合ラテツクスと前記（ｄ）で製造した
エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結合ポリアク
リル酸にて測定感度を０．５μｐ駕に調整して、尿中１
７−ＫＳを測定した。

正常男子尿２例を２，４，８，１６倍にリン酸緩衝化食
塩液にて希釈し、実施例１（ｅ）と同様な操作で測定し
た結果２例とも４．０μ９Ｚｄの１７−ＫＳが含まれて
いることが分つた。太施例 ７ サイロキシン（Ｔ４）の測定 ａ）サイロキシン・ＢＳＡの製造 ＢＳＡ５ＯＷ９を２５１ｎｔの蒸留水に溶解し、この溶
液に５ｍ１０ＤＭＦに溶解したサイロキシンを加え、攪
拌下３０ｍｇの１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リニル−４−エチル）カルボジイミドメト一ｐ−トルエ
ンスルフオネートを加え、室温にて一夜反応を行なつた
。

反応液を蒸留水に対して透析後、凍結乾燥を行なつてサ
イロキシン・ＢＳＡを製造した。））抗サイロキシン抗
体の製造 上記（ａ）で製造したサイロキシン・ＢＳＡを用い、実
施例１（ｂ）と同様な方法で家兎に免疫して抗血清を得
ることにより抗サイロキシン抗体を製造した。

→ 抗サイロキシン抗体結合ラテツクスの製造上記（ｂ
）で製造した抗サイロキシン抗体を用い、合ラテツクス
を製造した。

（ｄ）サィロキシン結合ビニルメチルエーテル無水マレ
イン酸共重合体（ＰＶＭＭＡ）の製造実施例１（ｄ−２
）と全く同様にしてＰＶＭＭＡとサイロキシンとから製
造し、透析内液を凍結乾燥して白色粉末として得た。

（ｅ）サイロキシン（Ｔ４）の測定 正常男子血清４例について、８−アニリノ−１−ナフタ
レンースルフオン酸を添加後、生理食塩水で１．５，２
，３倍に希釈し、上記（ｃ），（ｄ）を用いて実施例１
（ｅ）と同様な操作によりサイロキシン（Ｔ４）を測定
した。

本実施例における試薬の測定感度は３０ｎｇ〜に調整し
てあるので、測定値は第９表に示す値であつた。

実施例 ８ カテコールアミンの測定 （ａ）メタネフイリン・ＢＳＡの製造 メタネフイリンとＢＳＡとを用いて実施例１（ａ）と同
様な方法でメタネフイリン・ＢＳＡを製造した。

（ｂ）抗メタネフイリン抗体の製造 上記（ａ）で製造したメタネフイリン・ＢＳＡを用いて
、実施例１（ｂ）と同様な方法で家兎に免疫して抗血清
を得、抗メタネフイリン抗体を製造した。

（ｃ）抗メタネフイリン抗体感作ラテツクスの製造上記
（ｂ）で製造した抗メタネフイリン抗体を用いて実施例
３（ｃ）と同様な方法により抗メタネフイリン抗体感作
ラテツクスを製造した。

（ｄ）メタネフイリン結合ポリアクリル酸の製造実施例
１（ｄ−１）と全く同様にしてポリアクリル酸とメタネ
フイリンとからメタネフイリン結合ポリアクリル酸を製
造した。

（ｅ）メタネフイリンの測定 正常男子尿３例について生理食塩水で１．５，２および
３倍に希釈し前記（ｃ），（ｄ）とを用い実施例１（ｅ
）と同様な操作により尿中メタネフイリンを測定した。

本実施例における試薬の測定感度は２０ｎ９Ｚｄに調整
してあるので測定値は第１０表に示す値であつた。以下
に示す参考例は本発明でホルダーとして用いるカルボキ
シル基含有水溶性モノオレフイン系高分子化合物及びこ
れにハプテン又はその化学的変性物を結合させたものが
、免疫的に実質的に不活性であることを示す。

参考例 １ （ホルダーの抗原性） （ａ）免疫 ホルダーとしてポリアクリル酸（ＰＡＡ）（分子量２０
０万）、ＰＡＡ（分子量２５万）、ＰＡＡナトリウム塩
（分子量約１５０万）および対照としてＢＳＡについて
、各２ηを生理食塩水１ｄに溶解し、同量のコップリー
ド・フロインド・アジユバンドで乳化し、成熟家兎の皮
下および足鍍に注射した。

各群２羽について２週間隔で８回投与し、試験採血は投
与後７日目に３回投与後から行い、血清を分離した。（
ｂ）抗体の検索 （ａ）で得られた各血清について寒天ゲル内沈降反応（
オクテロニ一法および免疫電気向流法（ＣＩＥ法））に
より抗体の有無を観察した。

結果は第１１表に示す通り、対称のＢＳＡでは第１回の
試験採血時よりオクテロニ一法、ＣＩＥ法とも明瞭な沈
降線の形成が認められ抗ＢＳＡ抗体の産生が認められた
が、ＰＡＡはいずれも沈降腺形成が認められず抗ＰＡＡ
抗体は検出されなかつた。表中、−は沈降線非形成、十
は沈降線形成を示す。

参考例 ２ （ハプテン・ホルダーの抗原性） （ａ）免疫 後述の実施例１（ｅ−３）と同様にして製造したエスト
リオール一１６−グルクロナイド一ＰＡＡ（分子量２５
万）結合物をハプテン・ホルダー結合物の例として、又
、実施例１（ａ）と同様にして製造したエストリオール
一１６−グルクロナイド一ＢＳＡを対照として以下の方
法で家兎に免疫した。

各２Ｔｆ９を生理食塩水１ｍｔに溶解し、コップリード
・フロインド・アジユパンド１ｉで乳化し、家兎の背部
に皮下投与した。

各群２羽について投与間隔は２週とし、１０回まで投与
した。試験採血は投与後７日目に３回投与後から行い血
清を分離した。（ｂ）抗エストリオール一１６−グルク
ロナイド抗体の検索（ａ）で得られた各血清について抗
エストリオール一１６−グルクロナイド抗体の有無を３
Ｈ−エラジオイムノアツセイで検討した。

各試験採血血清ごとに硼酸緩衝液（０．０６７０ＢＳＡ
，０．０５％ウシγ−グロブリン含有）ＰＨ８．Ｏで１
０倍、５０倍、１００倍、２００倍以後倍数希釈で２０
４８００倍まで希釈し、これらについて以下に示す方法
によつて力価を求めた。

３Ｈ−エストリオール一１６−グルクロナイドのメタノ
ール溶液の一定量（１０，０００ｄｐｍ）を試験管にと
り、窒素気流下、蒸発乾固し、これに上記希釈血清の０
．２５ｍ１を入れ、よく振盪したのち、室温で３０分間
反応させ、次いで飽和硫酸アンモニウム０．２５ｒ！！
ｔを加えてよく混合し、１０分可放置後３０００ｒｐｍ
１０分間の遠心分離を行ない上清の０．２−をバイアル
ピンにとり、１０Ｔｎｔのジオキサンシンチレータ−を
入れて、液体シンチレーシヨンカウンタ一にて放射能を
測定し、３Ｈ−エストリオール一１６−グルクロナイド
の結合率を計算した。

工ストリオール一１６−グルクロナイド一ＢＳＡ投与群
は、１回目の採血時より７０％以上の結合率を示した。

この時の血清の季釈倍数は３，２００倍以上であつたが
、エストリオール一１６−グルクロナイド一ＰＡＡでは
１０倍希釈血清でも１０％前後であり、正常家兎血清（
ＮＲＳ）を同様に希釈して反応させた場合と同程度であ
つた。第１図に１０回投与後の血清についての力価を示
した。第１図に示した通り、エストリオール一１６−グ
ルクロナイド一ＢＳＡを投与した２羽はいずれも高い力
価を示したが、エストリオール一１６−グルクロナイド
一ＰＡＡを投与した２羽は、１回目と同様に力価の上昇
は認められずＮＲＳと同程度であつた。したがつて、エ
ストリオール一１６−グルクロナイド一ＰＡＡ投与では
ハプテンであるエストリオール一１６−グルクロナイド
に対する抗体は産生されておらずＰＡＡのキャリヤー効
果は認められなかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例２（ｂ）における抗エストリオール一１
６−グルクロナイド抗体の検索の実験結果をグラフに示
したもので、横軸を希釈倍数、縦軸を結合率とした時の
エストリオール一１６−グルクロナイド一ＰＡＡ（破線
）及びエストリオール一１６−グルクロナイド一ＢＳＡ
（実線）の各希釈倍数における力価を表わし、三角印の
つけた実線はＮＲＳの力価を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ハプテンまたはその化学的変性物がカルボキシル基
   含有水溶性モノオレフィン系高分子化合物に化学的に結
   合していることを特徴とする安定なハプテンの免疫化学
   的測定試薬。 ２ （Ａ）ハプテンまたはその化学的変性物を化学的に
   結合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフィン
   系高分子化合物と、（Ｂ）ハプテン抗体を担体に化学的
   に結合させるかまたは感作させたハプテン抗体担持担体
   とを別々に用意し、これら両者を組合わせて使用するこ
   とを特徴とする安定なハプソンの免疫化学的測定試薬。 ３ （Ａ）ハプテンまたはその化学的変性物を化学的に
   結合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフィン
   系高分子化合物と、（Ｂ）ハプテン抗体を担体に化学的
   に結合させるかまたは感作させたハプテン抗体担持担体
   とを用い、被検体中のハプテンによる上記（Ａ）および
   （Ｂ）の両試薬の凝集阻止反応を測定することを特徴と
   するハプテンの免疫化学的測定方法。