JPS596388B2 - 新規なハプテンの免疫化学的測定試薬および測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はハブチッの免疫化学的測定試薬および測定方法
に関する。

従来、血液、尿その他の体液中に存在する生物学的活性
を有する微量物質を、免疫化学的手段で測定する方法は
古くから知られている。

かかる免疫化学的測定法として、例えば赤血球を担体と
して用い、これを抗原又は抗体で感作し、これを被検液
中の抗体又は抗原と反応させ、その際、免疫化学的凝集
又は凝集阻止反応を生起させて、該微量物質を測定する
方法も既に知られている。また、担体として赤血球の代
りに、非生物学的粒子として例えば合成樹脂ラテックス
ベントナイト コ、口ジオン、コレステロール結晶、
水晶等を免疫化学反応における固体担体として用いるこ
とも知られている（以上例えば特開昭５０−８２２３０
号公開公報）。

さらに、かかる免疫化学的測定法とＬ連して、、ハブチ
ッの一種である例えばステロイドを蛋白のリジン残基に
アミド結合を介して化学的に結合させｆζハブチッ−キ
ャリヤー結合物を一種のハプテン抗原として用いること
も知られている（ＪＯｕｒ−ＮａｌＯｆＢｌＯｌＯｇｉ
ｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＶＯｌ．２２８，７ｌ３−７
２７頁（１９５７））。

また、遊離アミノ基を有する抗原蛋白にハプテンの一種
であるステロイドを結合させたものを用いて補乳動物に
免疫して得られる抗体と、該抗原蛋白以外の蛋白を該ス
テロイドに結合することにより生成するステロイド蛋白
複合体で感作して得られる感作担体とを用いて、試料中
のステロイドを免疫化学的に測定する方法も知られてい
る（特開昭５０−１２３８１９号公報）。

さらに、最近に到つて、ハプテン抗体を担体に感作した
抗体感作担体と、該ハプテン抗体と反応ｒるハプテンを
抗原性のキヤリヤ一に結合させたハプテンーキヤリヤ一
結合物又はこの結合物感作担体とを用いるハプテンの免
疫化学的測定法が提案されている（特開昭５３−４１４
２０号公報）。

本発明者等は、血液、尿その他の体液中に存在する微量
ハプテン類を免疫化学的に再現性のある安定した操作で
しかも鋭敏な感度で且つ短時間に測定する方法につき研
究を行つた結果、ハプテン又はその化学的変性物を化学
的に結合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフ
イン系高分子化合物を、約０．０１〜約２ミクロンの粒
径の高分子ラテツクスに化学的に結合したものを、該免
疫化学的測定試薬として用いることによつて極めて有効
に上記の目的を達することができることが分つたｏ本発
明の上記試薬は、（ａ）ハプテン又はその化学的変性物
と、（ｃ）約０．０１〜約２ミクロンの粒径の高分子ラ
テツクスとの両者を、（ｂ）カルボキシル基含有水溶性
モノオレフイン高分子化合物でもつて化学的に結合せし
めたことに特徴があり、本発明者等の知る限り、ハプテ
ンの免疫化学的測定においてかかる試薬を用いることは
従来全く知られていなかつたものである。

本発明の上記試薬を用いて免疫化学的に体液中に存在す
るハプテン類を測定する場合、上記試薬及びこの試薬と
免疫化学的に反応する如何なる抗体又は抗体を感作又は
化学的に結合した担体を用い、之等両者の凝集阻止反応
を測定してもよい。しかしながら、本発明者等の研究に
よれば、４ハプテン又はその化学的変性物を化学的に結
合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフイン系
高分子化合物が、約０．０１〜約２ミクロンの粒径の高
分子ラテツクスに化学的に結合しているハプテン担持ラ
テツクスと、（有）ハプテン抗体を約０．０１〜約２ミ
クロンの粒径の高分子ラテツクスに感作又は化学的に結
合した抗体担持ラテツクス或はハプテン抗体（抗血清）
とを用い、被検液（被検体）中のハプテンによる上記Ｃ
Ｘ），（ｌ両試薬の凝集阻止作用を測定することにより
、殊に安定した操作で且つ鋭敏な感度で、短時間に該ハ
プテンを定量的に測定することが可能であり、かかるハ
プテンの定量的測定法として極めて好適であることが分
つた。

以下本発明について更に詳細に説明する。

〔ハプテン〕

本発明においていうハプテンとは、低分子化合物で、そ
れ自体は抗原性を有しないが、抗原性を有する物質、例
えば蛋白質、多糖類の如き抗原性を有する高分子化合物
と結合して抗原性を示し、このような抗原性物質で動物
を免疫して生成した抗体と反応性を有するものをいう。

かかるハプテンとして、特に、生体内に存在する成分（
生理活性成分およびその代謝産物を含む）および生体に
投与された薬物およびその代謝産物が本発明の対象とす
るハプテンとして重要である。かかるハプテンとしては
、例えば次の如きものが挙げられる。例えば（１）ステ
ロイド系ハプテンとしては、（１）例えばエストロン、
エストラジオール、エストリオール エステトロール
エクイリン 工Ｓ）クイレニン等の卵胞ホルモン、 （［［）例えば、プロゲステロン；プレグナンジオール
；プレグナントリオール；１９−ノルーエチステロンお
よび酢酸クロルマジノン等の合成黄体ホルモン等の黄体
ホルモン、（：１１）例えば、テストステロン、デヒド
ロエピアンドロステロン ジヒドロテストステロン ア
ンドロステロン、エチオコラノロン等の男性ホルモン〜 ＧＶ）例えば、コルチゾール、コルチゾン、デオキシコ
ルチコステロン、アルドステロン、テトラヒドロアルド
ステロン、テトラヒドロコルチゾニル等の副腎皮質ホル
モン、（ｖ）ビタミンＤ類；コレステロール；例えばコ
ーール類、デスオキシコール酸、ケノコール酸等の胆汁
酸；強心性ステロイド；サポニン；サポゲニン等のその
他のステロイド類、をあげることができる。

また、．生理活性アミン類としては、 （１）エピネフリン、ノルエピネフリン、ドパミン、エ
フエドリン等のカテコールアミンおよびそれらの代謝産
物；（１１）モルフイン、コデイン、ヘロイン、モルフ
イングルクロナイド、コカイン、メスカリン、パパベリ
ン、ナルコチン、ヨヒンピン、レセルピン、エルゴタミ
ン、ストリキニーネ等の生理活性アルカロイド類；（１
１１）ＬＳＤｌアンフエタミン、メプロバメート、メタ
アンフエタミン等、の如きアミノ基含有薬物等をあげる
ことができる。

さらにまた．その他のハプテン類としては、ＴＲＨ，Ｌ
Ｈ−ＲＨの如き抗原性を有しない低分子ペプチド類；ジ
ヨードサイロニン、トリヨードサイロニン、サイロキシ
ン等の甲状腺ホルモン；プロスタグランジンＥ２、プロ
スタグランジンＥ３、プロスタグランジンＦ１（ｔ等の
プロスタグランジン類；ビタミンＡ１ビタミンＢ類（例
えばビタミンＢｌ，Ｂ２，Ｂ６，Ｂｌ２等）、ビタミン
Ｅ１ビタミンＫ等のビタミン類；ペニシリン、アクチノ
マイシン、クロロマイセチン、テトラサイクリン等の抗
生物質；等々の生体内に存在する成分、生体内に投与さ
れた薬物およびその代謝産物の数多くのハプテン類をあ
げることができるが、本発明でいうハプテン類は上記例
示のハプテン類に限定されるものではない。〔ハプテン
の化学的変性〕 本発明においては、上記ハプテンは、そのままで、又は
それを化学的に変性した後、カルボキシル基含有水溶性
モノオレフイン系高分子化合物（以下これを便宜上スペ
ーサーと呼ぶことがある）と化学的に結合せしめる。

、ハプテンの化学的変性法としては従来種々の方法が知
られている。

本発明においては、ハプテンが該スペーサーの有する官
能基例えばカルボキシル基や水酸基と化学的に結合し得
るように該ハプテンを化学的に変性する如何なる変性法
を採用してもよい。かかるハプテンの変性法としては、
特にハプテンにカルボキシル基、第１級又は第２級アミ
ノ基又は水酸基、就中カルボキシル基又は第１級アミノ
基を導入する化学的変性法が好適である。かかる方法と
して例えば以下の如き変性法があげられる。カルボニル
基を有するハプテンに関しては、カルボキシルメチルオ
キシムに変換することによつてカルボキシル基を導入す
ることができ（例：ＪＯｕｒｎａｌＯｆＢｌＯｌＯｇｉ
ｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２巻３４，１０９０−１０
９４頁（１９５９））、或は、例えばブロム化したのち
チオグリコール酸と反応せしめて、カルボキシル基を持
たせる（例：ＳｔｅｒＯ一Ｉｄｓ，ｌ９巻３５７−３７
５頁（１９７２））こともできる。

カルボニル化合物のオキシムを還元すると一級アミノ化
合物になることは周知であるが、これもハプテンとして
利用できる〔本発明実施例１（ｅ−１），１（ｅ−２）
のアミノステロイド〕。

また水酸基を有するハプテンは、例えばモノクロル酢酸
と反応させて、カルボキシメチルエーテル化する方法（
例：Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌ６８巻、１３４７一１３４８頁
（１９７０））、或は無水コハク酸と反応させてヘミサ
クシネートとする方法（例：ＪＯｕｒｎａｌＯｆＣｌｌ
ｎｉｃａｌＥｎｄＯｃｒｉｎＯｌＯｄｙ，３３巻、７７
５−７８２頁（１９７１））等がある。フエノール性水
酸基を有するハプテンではその水酸基のオルト又はパラ
位に例えばパラカルボキシベンゼンジアゾニウム塩をジ
アゾカツプリングさせて、カルボキシル基を導入する（
例：ＳｔｅｒＯ一Ｉｄｓ，ｌ８巻、５５５−５６３頁（
１９７１））ことも可能である。さらにまたステロイド
類の代謝物であるグルクロナイドは、そのカルボキシル
基を利用することができるし（例：ＪＯｕｒｎａｌＯｆ
ＳｔｅｒＯｉｄＢｉＯｃｈｅ一Ｍｉｓｔｒｙ，３巻、２
７５−２８８頁（１９７２））、そのカルボキシル基を
直接利用できなけれ、ば、適当なジアミン誘導体と反応
させて、アミノ化合物に変換する（例えば本発明実施例
１（ｅ−３），１（ｅ−４等）こともできる。

二級アミノ基をもつハプテンに於ては、例えばそのアミ
ノ基をＮ一保護アミノアルキルハロゲン化合物でアルキ
ル化したのち保護基を脱離すれば一級アミン誘導体に変
えることができ（例：ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，３６巻
、３３９−３４２頁（１９７３））、或は例えばブロム
酢酸エステルと反応させたのち加水分解することにより
、カルボキシル基をもたせる（例：Ｃｈｅｍｉｃａｌａ
ｎｄＰｈａ一ＲｎｌａｃｅｕｔｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉ
ｎ，２５巻、８３８−８４０頁（１９７７））こともで
きる。

適当な官能基を持たないハプテンはまず例えば微生物に
よる水酸化反応のような手段を講じ、ついで上述の方法
によつて、求むる官能基に変換することもできる。

〔スペーサー〕

本発明で用いるカルボキシル基含有水溶性モノオレフイ
ン系高分子化合物（スペーサー）としては、カルボキシ
ル基を含有する水溶性モノオレフイン系高分子化合物の
如何なるものでもよく、ここで「水溶性］とは該高分子
化合物の少くとも１重量部を１０００重量部の蒸留水に
添加した場合に透明な溶液を形成することをいう。

該高分子化合物の溶解度が上記下限を満足する限り、そ
の溶解度はいくら大であつてもよい。また該高分子化合
物の平均重量分子量は約１０３〜１０７又はそれ以上で
あつてもよく、通常数万乃至数百万のものが好適に使用
できる。またかかる高分子化合物は、官能基としてカル
ボキシル基の他に水酸基（−０Ｈ）を有していてもよく
、之等の官能基は、ハプテン又はその化学的変性物の官
能基および後述する高分子ラテツクスの有する官能基と
の化学的結合に関与すると共に、該高分子化合物に水溶
性をも付与する。本発明で使用するかかる高分子化合物
は、生理的には不活性物質と見られるものであつて、一
般に抗原性を有しないものである。

また、かかる高分子化合物としては、例えば、アクリル
酸又はメタアクリル酸のホモ一又はコーポリマ一；マレ
イン酸と酢酸ビニルとの共重合体又はそのケン化物、マ
レイン酸と例えばビニルアルコール、低級アルキルビニ
ルエーテル、アクリル酸又はその低級アルキルエステル
、メタアクリル酸又はその低級アルキルエステルとの共
重合体又は所望によりそれらの加水分解物があげられる
。

之等の高分子化合物はまた、例えばアクリル酸又はメタ
アクリル酸と、例えばアクリル酸のβ−ヒドロキシエチ
ルエステル又はアクリルアミドとの共重合物、或は前記
のモノマーを構成単位として含有する三元重合体であつ
てもよい。〔ハプテン又はその変性物とスペーサーとの
化学的結合〕一１・ 上述したハプテン又はその化学的変性物とスペーサ一と
の化学的結合は、アミド結合又はエステル結合によつて
行われるが、特にアミド結合によつて行うのが好適であ
る。

かかる結合は、従来既知の下記の如きアミド結合反応又
はエステル結合反応を用いて行うことができる。

例えば、ハプテン又はその化学的変性物をハプテンで代
表して説明すると、ハプテンが例えばアミノ基を有しそ
してスペーサーがカルボキシル基を有する場合、又はそ
の反対の場合、ハプテンとスペーサーとを下記の如き方
法によりアミド結合により化学的に結合することができ
る。

（アミド結合でハプテンとスペーサーとを結合する方法
）（１）カルボジイミド法 アミノ基とカルボキシル基との間で脱水縮合によりアミ
ド結合を形成させる方法で、両成分の溶液中に等モルも
しくは僅かに過剰のカルボジイミド化合物を加えて室温
又は氷冷下に反応させることにより目的を達する。

カルボジイミド自身は尿素誘導体に変換する。反応溶媒
としてはそれ自身が反応にあづかる官能基を有しない限
り特に限定されることはなく、例えば酢酸エチル、テト
ラヒドロフラン、ジオキサン ジメチルホルムアミド
クロロホ））ルム等が使用できる。

また任意の割合で水を含有する系であつてもよく、水溶
液中で反応させることもできる。用いるカルボジイミド
化合物としては、有機溶媒中の反応にはシンクロヘキシ
ルカルボジイミドが最もよく用いられ、含水系溶媒中で
の反応には例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のような水溶性カ
ルボジイミドを用いることができる。（２）カルボニル
ジイミダゾール法 カルボジイミド法と全く同様にアミノ基とカルボキシル
基との間の脱水縮合を起させる方法で、両成分の溶液中
に必要量のカルボニルジイミダゾールを加えればよい。

この試薬は水分にメ＝Ｌ２４こＳＬｖ＄−↓一」ョＳ？
ハＴｔ？ｌ−呻−？ＲＬ＾″駆１八（、小（旦りｖし万
厨９Ｑり（、小τ己弔しない溶媒を用いるのが好ましい
。ソ （３）混合酸無水物法 カルボキシル基はクロル蟻酸エステルと、有機塩基の存
在下、いわゆる混合酸無水物を形成し、これはアミノ基
と容易に反応して、アミド結合を形成する。

クロル蟻酸エステルとしては例えばエチル、イソプロピ
ル、イソブチルのような低級アルキルエステル、特にク
ロル蟻酸イソブチルがよく用いられ、有機塩基としては
トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等のような第
三級アミンが用いられる。

反応溶媒にはカルボジイミド法に述べたものをそのまま
用いることができるが、混合酸無水物は水に不安定であ
るので、混合酸無水物を形成する際には含水したものを
用いないよう注意が必要である。

反応温度は、先づ例えば−１０〜２０℃位の低温で混合
酸無水物を形成せしめ、ついでアミノ成分を加えてから
室温にて反応をつづける。アミノ成分を加えるときには
水もしくは水を含んだ溶媒を使用してもかまわない。（
４）活性エステル法カルボキシル基を電子吸引性の大き
い化合物のエステルにすると、そのカルボニル基上の電
子密度が減り、その結果アミノ基のような塩基性の大き
い官能基を攻撃してアミド結合を形成することになる。

これが活性エステル法の原理で、活性エステルとしては
例えば、パラニトロフエノール、２，４−ジニトロフエ
ノール、ペンタクロロフエノール、チオフエノール、ナ
フトール、８−ハイドロキシキノリン等のフエノール誘
導体、Ｎ−ハイドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ハイドロ
キシピペリジン等のＮ−ハイドロキシ化合物、シアノメ
チルのようなアルキルエステル等を用いることができる
。溶媒はカルボジイミド法で述べたものが使用される。
（５）アジド法 カルボキシル化合物をエステルに変え、ヒドラジンと反
応させると酸ヒドラジドになるが、これは亜硝酸の作用
により酸アジドになり、アミノ基と反応してアミド結合
を形成する。

ヒドラジドを稀塩酸中亜硝酸ナトリウムと反応せしめて
生成した酸アジドを一たん単離して、ついで適当な有機
溶媒中アミン成分と反応させる古典的な方法と、ヒドラ
ジドを有機溶媒（含水したものでもよい）中、塩化水素
存在下亜硝酸アルキルエステル例えば亜硝酸ｔ−ブチル
、亜硝酸１−アミル等で処理して酸アジドとし、単離す
ることなくアミン成分と反応せしめることによりアミド
結合を形成することができる〇 （６）酸クロリド法 カルボキシル化合物を酸クロリドに変え、アミノ化合物
と反応させてアミド結合を生成する最も一般的な方法も
採用することができる。

酸クロリドにするにはカルボキシル化合物を五塩化リン
、塩化チオニル、オキシ塩化リン等と反応させる直接法
と、例えばシユウ酸クロリドと反応させる交換反応法が
あげられる。アミノ化合物との反応には水の中でアルカ
リを加えながら行なういわゆる「シヨツテンーバウンマ
ン法」と、必要に応じて例えばベンゼンなどの不活性溶
媒中例えばピリジン、トリエチルアミン等の有機塩基存
在下に反応する方法などがある。（７） ＤＰＰＡ法 カルボキシル化合物とアミノ化合物との溶液中にジフエ
ニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、ついで例えばトリ
エチルアミン、或はＮ−メチルモルホリン等の有機塩基
を加えてアミド結合を形成する方法も採用できる。

この際、溶媒としては例えばジメチルホルムアミドが好
適に用いられ、温度は氷冷から室温でよい。以上の例え
ば（１）〜（７）の如き化学的結合法のいづれをもつて
しても目的を達することができるが、本発明に応用する
際にはハプテンが有する他の置換基などによつては不安
定なものもあり得るので、あまり激しい条件を必要とす
るものは避けるべきである。

最も好適に使用できるのは（１）カルボジイミド法、（
７）ＤＰＰＡ法である。スペーサーと、導入すべき適当
量のハプテンの溶液中にハプテンに対し等モル又は僅か
に過剰のカルボジイミド、もしくはＤＰＰＡを加えＤＰ
ＰＡの場合には有機塩基を加えて反応せしめる。反応後
は全反応液をセロフアンチユーブ内にて水に対し透析す
れば、未反応のハプテン、試薬、副成物などは外液に逃
げるので内液を濃縮、或は凍結乾燥することにより目的
のハプテン（又はその変性物）−スペーサー結合物を得
ることができる。（エステル結合でハプテンとスペーサ
ーとを結合する方法）ハプテン又はその化学的変性物が
適当な反応性水酸基を有しそしてスペーサーがカルボキ
シル基を有する場合又はその反対の場合、ハプテンとス
ペーサ一とをエステル結合で化学的に結合することもで
きる。

エステル結合法の場合、ハプテン又はその化学的変性物
が水酸基を有し、スペーサーがカルボキシル基を有する
場合には、カルボキシル基を例えば塩化チオニルを作用
させて酸クロリドに変え、或はスペーサーが例えば無水
マレイン酸を含む共重合体ならばそのままで、ハプテン
と反応させて、エステル結合によるハプテンースペーサ
一結合物を得ることができるが、その反対即ちハプテン
又はその化学的変性物がカルボキシル基を有し、スペー
サ一が水酸基をもつ場合には、ハプテンの性質によつて
は反応性誘導体例えば酸クロリドに変換し得る程充分な
安定性を有しない場合もあり、この場合エステル結合せ
しめるのは困難である。

かくして得られるハプテンースペーサ一結合物としては
、数多くのハプテンとスペーサーの組合せからなる結合
物を得ることができるが、之等の代表例を具体的に示せ
ば、例えば１７−アミノ−１，３，５（１０）一エスト
ラロエン一３−オール結合ポリアクリル酸、１７−アミ
ノ−１，３，５（１０）一エストラトリエン一３−オー
ル結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体、
エストリオール一１６−グルクロナイド結合ポリアクリ
ル酸、エストリオール一１６−グルクロナイド結合ビニ
ルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体、エストリオ
ール一１６，１７−ジヘミサクシネート結合ポリアクリ
ル酸、プレグナンジオール一３−グルクロナイド結合ポ
リアクリル酸、プレグナンジオール一３−グルクロナイ
ド結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体、
プレグナントリオール一３−グルクロナイド結合ポリア
クリル酸、プレグナントリオール一３−グルクロナイド
結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体、３
ｄ，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシプレグナ
ン一２０−オン−３−グルクロナイド結合ポリアクリル
酸、３ｄ，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシプ
レグナン一２０−オン−３−グルクロナイド結合ビニル
メチルエーテル無水マレイン酸共重合体、カルボキシメ
チルモルフイン結合ポリアクリル酸、カルボキシメチル
モルフイン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共
重合体、エチオコラノロン一３−ヘキサクシネート結合
ポリアクリル酸、サイロキシン結合ビニルメチルエーテ
ル無水マレイン酸共重合体、サイロキシン結合ポリアク
リル酸、 メタネフイリン結合ポリアクリル酸、 メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン
酸共重合体等々をあげることができる。

〔反応性高分子ラテツクス］ 本発明においては、前記スペーサーを反応性高分子ラテ
ツクスとさらに化学的に結合する。

かかる高分子ラテツクスとしては、平均粒径が約０．０
１〜約２ミクロンのものであつて、該スペーサーと反応
し得る官能基を有するものが用いられる。平均粒径が約
０．０５〜約１．５ミクロンのものが特に好適である。
また、かかる反応性高分子ラテツクスとしては、官能基
としてカルボキシル基、第１級アミノ基又はカルボアミ
ド基（−ＣＯＮＨ２）を有し、且つ基体が例えばポリス
チレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレンージ
ビニルベンゼン共重合体、ポリビニルトルエン、ビニル
トルエンーターシヤリブチルスチレン等から成る高分子
ラテツクスが種々の商品名で市販されており、之等の高
分子ラテツクスのいずれも使用することができる。

高分子ラテツクスの基体は勿論上記の如き重合体又は共
重合体に何等限定されない。高分子ラテツクスが官能基
として第１級アミノ基を有している場合は、之等の高分
子ラテツクスをそのまま前記スペーサーの有するカルボ
キシル基と反応せしめて、アミド結合によつてスペーサ
ーと化学的に結合することができる。

かかるアミド結合の形成は、ハプテン（又はその変性物
）とスペーサーとの反応について既に説明した反応手段
を用いて行うことができる。また高分子ラテツクスとス
ペーサーの双方が官能基としてカルボキシル基を有する
場合には、該ラテツクスの有するカルボキシル基を下記
の如き方法によつて化学的に変性して、第１級アミノ基
を導入した後、スペーサーとアミド結合によつて結合す
ることもできる。

例えばカルボキシル基含有ラテツクスを水溶性カルボジ
イミド存在下ヘプタメチレンジアミンの様なポリメチレ
ンジアミンと反応せしめて第一級アミノ基を導入する方
法（例：ＪＯｕｒｎａｌＯｆＣｅｌｌＢｌＯｌＯｇｙ，
６４巻、７５〜８８頁（１９７５））等がある。本発明
では、また、例えばＮ−ε一第３級ブトキシカルボニル
リジンメチルエステル又はＮ−プタロール−Ｎｆ−メチ
ルトリメチレンジアミンの如き片方のアミノ基を保護し
たアルキレンジアミン誘導体をカルボキシル基を有する
高分子ラテツクスと反応させる。

この反応はハプテンとスペーサーとの結合に使用される
アミド結合形成反応の中から選択することができるが、
例えば高分子ラテツタスの粒径の如き物理的性質をかえ
ないで反応を行なう必要がある。そのためには水を含ん
だ系で行なうことが望ましく、特に水溶性カルボジイミ
ドを用いる水中でのカルボジイミド法が望ましい。反応
を行なつた後アミノ保護基を除去するとアミノ基を反応
基として有する反応性高分子ラテツクスが得られる。こ
の様にして得られた反応性高分子ラテツクスをカルボキ
シル基を有するハプテン又はその変性物とスペーサーと
の結合物と前述のアミド結合形成反応により反応させる
と本発明の測定試薬を得ることができる。Ｎ−ε一第三
級プトキシカルボニルリジンメチルエステルを使用した
場合を例としてとりあげると、上述した反応は図で示さ
れる〇第三工程の反応は第一工程の反応と全く同様に行
なうことができる。

同様の測定試薬は上記の反応順序を逆にして次図で示さ
れる方法によつても得ることができる。

かくして、前述のハプテンースペーサ一と上記反応性高
分子ラテツクスとを化学反応により結合せしめて、ハプ
テン・スペーサー・ラテツクスを製造することができる
。これらの具体例について例示すれば、例えば、エスト
リオール一１６−グルクロナイド結合ポリアクリル酸結
合ラテツクス、エストリオール一１６，１７−ジヘミサ
クシネート結合ポリアクリル酸結合ラテツクス、１７−
アミノ−１，３，５（１０）一エストラトリエン一３−
オール結合ポリアクリル酸結合ラテツクス一１７−アミ
ノ−１，３，５（１０）一エストラトリエン一３−オー
ル結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結
合ラテツクスエストリオール一１６−グルクロナイド結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラ
テツクスーエストリオール一１６，１７−ジヘミサクシ
ネート結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合
体結合ラテツクス、プレグナンジオール一３−グルクロ
ナイド結合ポリアクリル酸結合ラテツクス、プレグナン
ジオール一３−グルクロナイド結合ビニルメチルエーテ
ル無水マレイン酸共重合体結合ラテツクス、３α，１１
β，１７α，２１−テトラヒドロキシプレグナン一２０
−オン−３−グルクロナイド結合ポリアクリル酸結合ラ
テツクス３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキ
シプレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド結合ビ
ニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテツ
クス、カルボキシメチルモルフイン結合ポリアクリル酸
結合ラテツクス、カルボキシメチルモルフイン結合ビニ
ルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテツク
ス、エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結合ポリ
アクリル酸結合ラテツクス、サイロキシン結合ポリアク
リル酸結合ラテツクス、サイロキシン結合ビニルメチル
エーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテツクス、メタ
ネフイリン結合ポリアクリル酸結合ラテツクス、メタネ
フイリン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重
合体結合ラテツクス、等々をあげることができる。

〔抗体の製造〕

本発明において用いるハプテン抗体は公知の方法により
作製することができる。

ハプテンそれ自体又は前述した、その化学的変性物を、
抗原性を有する物質と結合させ、これを抗原として常法
により動物に免疫して抗血清を作製する。この抗血清を
作製するに際し使用する抗原としては例えば、エストリ
オール一１６，１７−ジヘミサクシネート−ＢＳＡｌエ
ストリオール一６（０−カルボキシメチノ（へ）−オキ
シム一ＢＳＡｌデヒドロエビアンドロステロン一３−グ
ルクロニド一ＢＳＡｌアンドロステロン一３−ヘミサク
シネート−ＢＳＡｌコルチゾール一２１−ヘミサクシネ
ート一ＢＳＡｌ等の他に、前述のハプテンに例えば牛血
清アルブミン或は兎血清アルブミン等を結合させたハプ
テンータンパク結合体を使用することもでき、それらを
例えばコンプリートフロインドアジユバント等のアジユ
バントを併用するとより有効に抗血清が作製される。

動物としては家兎、山羊、めん羊、モルモツト等の咄乳
動物を使用するのが通常である。得られた抗血清をハプ
テンとの結合に用いた抗原性を有する物質により吸収し
、例えばアルコール沈殿又は塩析等の如き手段によつて
γ−グロブリンを分画し、ハプテン抗体を得る。抗体を
作成する時に用いる抗原性を有する物質としては、例え
ば牛血清アルブミン、家兎血清アルブミン、ヒト血清ア
ルブミン、牛γ−グロブリン、家兎γ−グロブリン、人
γ−グロブリン、破傷風毒素、肺炎球菌多糖体等を用い
ることができ）る。

〔抗体を感作又は化学的に結合せしめた高分子ラテツク
ス〕本発明においては、上記の如くして得られる抗体を
高分子ラテツクスに感作又は化学的に結合する。

かかる高分子ラテツクスは、前記の如き官能基を有して
いても、有していなくともよい。しかし、抗体を該ラテ
ツクスに化学的に結合させる場合にはかかる抗体と反応
し得る官能基を有する高分子ラテツクスを用いる。一般
に、抗体を該ラテツクスに感作させる場合には、抗体を
該ラテツクスに吸着せしめることを意味し、化学的に結
合せしめることを包含しない。

本発明において、抗体を高分子ラテツクスに化学的に結
合あるいは感作するには、次のようにしておこなうこと
ができる。官能基を有する反応性高分子ラテツクス例え
ばカルボキシル基又は第１級アミノ基を有する高分子ラ
テツクスを用いる場合には前記のハプテンとスペーサー
の結合法により抗体と反応させればよく、望ましくは水
性媒体中で前記カルボジイミド法により抗体結合高分子
ラテツクスが得られる。

抗体を吸着により高分子ラテツクスに感作するには、抗
体溶液と高分子ラテツクス懸濁液とを混合することによ
り抗体感作高分子ラテツクスが得られる。例えば、抗エ
ストリオール一１６−グルクロナイド抗体をカルボキシ
ル化ラテツクスにカルボジイミド法で結合することによ
り抗エストリオール一１６−グルクロナイド抗体結合ラ
テツクスが得らべ該抗体を溶液としラテツクス懸濁液と
混合することにより抗エストリオール一１６−グルクロ
ナイド抗体感作ラテツクスが得られる。

この場合に使用しうる高分子ラテツクスとしては、平均
粒径が約０．０１〜約２ミクロンのものであつて、該抗
体と反応し得る官能基を有するものが用いられる。

平均粒径が約０．０５〜約１．５ミクロンのものが特に
好適である。また、かかる反応性高分子ラテツクスとし
ては、官能基としてカルボキシル基、第１級アミノ基又
はカルボアミド基（−ＣＯＮＨ２）を有し、且つ基体が
例えばポリ゛スチレン、スチレン−ブタジエン共重合体
、スチレンージビニルベンゼン共重合体、ポリビニルト
ルエン、ビニルトルエンーターシヤリブチルスチレン等
から成る高分子ラテツクスが種々の商品名で市販されて
おり、之等の高分子ラテツクスのいずれも使用すること
ができる。

高分子ラテツクスの基体は勿論上記の如き重合体又は共
重合体に何等限定されない。かくして化学的結合により
抗体をラテツクスに結合させた抗体一結合一ラテツクス
としては、例えば抗エストリオール一１６−グルクロナ
イド抗体一結合−ラテツクス、抗エストリオール一３−
ヘミサクシネート抗体一結合−ラテツクス抗１７−アミ
ノ−１，３，５（１０）一エストラトリエン一３−オー
ル抗体一結合−ラテツクス、抗プレグナンジオール一３
−グルクロナイド抗体一結合−ラテツクス、抗３ａ，１
１β，１７α，２１−テトラヒドロキシプレグナン一２
０−オン−３−グルクロナイド抗体一結合−ラテツクス
、抗カルボキシメチルモルフイン抗体一結合−ラテツク
ス抗エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗体一結
合一ラテツクス、抗サイロキシ抗体一結合−ラテツクス
、 抗メタネフイリン抗体一結合−ラテツクス、等々をあげ
ることができる。

また、本発明において使用しうる抗体は上記の抗体一化
学結合ラテツクスに限定されるものではなく、従来既知
の抗ハプテン抗体の物理的吸着による所謂抗体感作ラテ
ツクスおよびハプテン抗体（抗血清）（稀釈抗体を含む
）をも使用することができる。

以上の構成により組立てられた本発明に係る新規なハプ
テンの免疫化学的測定試薬および測定方法とは、第１に
は、ハプテン又はその化学的変性物を化学的に結合せし
めたカルボキシル基含有水溶性モノオレフイン系高分子
化合物が、高分子ラテツクスに化学的に結合しているこ
とを特徴とする新規なハプテン担持ラテツクスと、第２
には、ハプテン抗体を高分子ラテツクスに化学的結合ま
たは吸着により感作した抗体一感作ラテツクスもしくは
希釈ハプテン抗体との組合せからなる新規な免疫化学的
測定試薬並びに同試薬を使用することを特徴とする免疫
化学的測定方法に関するものである。

したがつて、本発明に係る新規な免疫化学的測定試薬の
具体例を例示すれば、例えば１．エストロゲンの測定試
薬としては、 （イ）Ａ：エストリオール一１６−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸結合ラテツクスとＢ：抗エストリオール
一１６−グルクロナイド抗体一結合−ラテツクスよりな
る免疫化学的測定試薬、 （ロ）Ａ：エストリオール一１６，１７−ジヘミサタシ
ネート結合−ポリアクリル酸結合ラテツクスと Ｂ：抗エストリオール一１６，１７−ジヘミサクシネー
ト抗体一結合−ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬
、 （ハ）Ａ：エストリオール一１６−グルクロナイド結合
ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテ
ツクスと Ｂ：抗エストリオール抗体一結合一ラテツクスよりなる
免疫化学的測定試薬、（ニ）Ａ：エストリオール一１６
，１７−ジヘミサクシネート結合ビニルメチルエーテル
無水マレイン酸共重合体結合ラテツクス、 Ｂ：抗エストリオール抗体一結合−ラテツクスよりなる
免疫化学的測定試薬。

（ホ）Ａ：エストリオール一１６−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸結合ラテツクスとＢ：抗エストリオール
一１６−グルクロナイド抗体感作ラテツクスよりなる免
疫化学的測定試薬、 （へ）Ａ：エストリオール一１６，１７−ジヘミサクシ
ネート結合ポリアクリル酸結合ラテツクスと Ｂ：抗エストリオール一１６，１７−ジヘミサクシネー
ト抗体感作ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ト）Ａ：エストリオール一１６−グルクロナイド結合
ポリアタリル酸結合ラテツクスとＢ：抗エストリオール
一１６−グルクロナイド抗体よりなる免疫化学的測定試
薬、（７）Ａ：１７−アミノ−１，３，５（１０）一エ
ストラトリエン一３−オール結合ポリアクリル酸結合ラ
テツクスと Ｂ：抗エストリオール一１６−グルクロナイド抗体一結
合−ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬等々。

２．プレグナンジオール測定試薬としては、（イ）Ａ：
プレグナンジオール一３−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸結合ラテツクスとＢ：抗プレグナンジオール一３
−グルクロナイド抗体一結合−ラテツクスよりなる免疫
化学的測定試薬、 （ロ）Ａ：プレグナンジオール一３−グルクロナイド結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラ
テツクスと、 Ｂ：抗プレグナンジオール一３−グルクロナイド抗体一
結合−ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：プレグナンジオール一３−グルクロナイド結
合ポリアクリル酸結合ラテツクスＢ：抗プレグナンジオ
ール一３−グルクロナイド抗体感作ラテツクスよりなる
免疫化学的測定試薬、 （ニ）Ａ：プレグナンジオール一３−グルクロナイド結
合一ポリアクリル酸結合ラテツクスＢ：抗プレグナンジ
オール一３−グルクロナイド抗体よりなる免疫化学的測
定試薬、（ホ）Ａ：プレグナンジオール一３−グルクロ
ナイド結合−ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重
合体結合ラテツクスと Ｂ：抗プレグナンジオール一３−グルクロナイド抗体よ
りなる免疫化学的測定試薬、等々。

３．１７−０ＨＣＳ測定試薬としては、 （イ）Ａ：３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロ
キシプレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド一結
合ポリアクリル酸結合ラテツクスと Ｂ：抗３ｄ，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシ
プレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド抗体一結
合−ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ロ）Ａ：３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロ
キシプレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド結合
一ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラ
テツクスとＢ：抗３α，１１β，１７α，２１−テトラ
ヒドロキシプレグナン一２０−オン−３一グルクロナイ
ド抗体一結合−ラテツクス よりなる免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロ
キシプレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド結合
−ポリアクリル酸結合ラテツクスと Ｂ：抗３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシ
プレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド抗体感作
ラテツクス よりなる免疫化学的測定試薬、 （ニ）Ａ：３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロ
キシプレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸結合ラテツクスと Ｂ：抗３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシ
プレグナン一２０−オン−３グルクロナイド抗体 よりなる免疫化学的測定試薬、 （ホ）Ａ：３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロ
キシプレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド結合
ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテ
ツクスと Ｂ：抗３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシ
プレグナン一２０−オン−３ーグルクロナイド抗体感作
ラテツクス よりなる免疫化学的滴淀試薬、 （へ）Ａ：３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロ
キシプレグナン一２０−オン−３−グルクロナイド結合
ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテ
ツクスと Ｂ：抗３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシ
プレグナン一２０−オン−３ーグルクロナイド抗体 よりなる免疫化学的測定試薬、 等々。

４．モルフインの測定試薬としては、 （イ）Ａ：カルボキシメチルモルフイン結合一ポリアク
リル酸結合ラテツクスとＢ：抗カルボキシメチルモルフ
イン抗体一結合一ラテツクスよりなる免疫化学的測定試
薬、 （ロ）Ａ：カルボキシメチルモルフイン結合−ビニルメ
チルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテツクスと Ｂ：抗カルボキシメチルモルフイン抗体一結合−ラテツ
クスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：カルボキシメチルモルフイン結合−ポリアク
リル酸結合一ラテツクスとＢ：抗カルボキシメチルモル
フイン抗体感作ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬
、 （ニ）Ａ：カルボキシメチルモルフイン結合−ビニルメ
チルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテツクスと Ｂ：抗カルボキシメチルモルフイン抗体感作ラテツクス
よりなる免疫化学的測定試薬、 （ホ）Ａ：カルボキシメチルモルフイン結合−ポリアク
リル酸結合ラテツクスどＢ：抗カルボキシメチルモルフ
イン抗体 よりなる免疫化学的測定試薬、 （へ）Ａ：カルボキシメチルモルフイン結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテツクスと Ｂ：抗カルボキシメチルモルフイン抗体 よりなる免疫化学的測定試薬、 等々。

５．１７−ＫＳの測定試薬、 （イ）Ａ：エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結
合ポリアクリル酸結合ラテツクスとＢ：抗エチオコラノ
ロン一３−ヘミサクシネート抗体一結合−ラテツクスよ
りなる免疫化学的測定試薬、 （ロ）Ａ：エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラ
テツクスと Ｂ：抗エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗体一
結合−ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結
合ポリアクリル酸結合ラテツクスとＢ：抗エチオコラノ
ロン一３−ヘミサクシネート抗体感作ラテツクスよりな
る免疫化学的測定試薬、 （ニ）Ａ：エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラ
テツクスと Ｂ：抗エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗体感
作ラテツクスよりなる免疫化学的測定試薬、 （ホ）Ａ：エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結
合ポリアクリル酸結合ラテツクスとＢ：抗エチオコラノ
ロン一３−ヘミサクシネート抗体よりなる免疫化学的測
定試薬、 （へ）Ａ：エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラ
テツクスと Ｂ：抗エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗体よ
りなる免疫化学的測定試薬 等々。

６．サイロキシン（Ｔ４）測定試薬としては、（イ）Ａ
：サイロキシン結合ポリアクリル酸結合ラテツクスとＢ
：抗サイロキシン抗体一結合−ラテツクスよりなる免疫
化学的測定試薬、（ロ）Ａ：サイロキシン結合ビニルメ
チルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテツクスと
Ｂ：抗サイロキシン抗体一結合−ラテツクスよりなる免
疫化学的測定試薬、（へ）Ａ：サイロキシン結合ポリア
クリル酸結合一ラテツクスとＢ：抗サイロキシン抗体感
作ラテツクス よりなる免疫化学的測定試薬、 （ニ）Ａ：サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水
マレイン酸共重合体結合ラテツクスとＢ：抗サイロキシ
ン抗体感作ラテツクス よりなる免疫化学的測定試薬、 （ホ）Ａ：サイロキシン結合ポリアクリル酸結合ラテツ
クスとＢ：抗サイロキシン抗体 よりなる免疫化学的測定試薬、 （へ）Ａ：サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水
マレイン酸共重合体結合ラテツクスとＢ：抗サイロキシ
ン抗体 よりなる免疫化学的測定試薬、 等々０ ィ．カテコールアミンの測定試薬としては、（イ）Ａ：
メタネフイリン結合ポリアクリル酸結合ラテツクスとＢ
：抗メタネフイリン抗体一結合一ラテツクスよりなる免
疫化学的測定試薬、 （ロ）Ａ：メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無
水マレイン酸共重合体結合ラテツクスと Ｂ：抗メタネフイリン抗体一結合−ラテツクスよりなる
免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：メタネフイリン結合ポリアクリル酸結合ラテ
ツクスとＢ：抗メタネフイリン抗体感作ラテツクスより
なる免疫化学的測定試薬、 （ニ）Ａ：メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無
水マレイン酸共重合体結合ラテツクスと Ｂ：抗メタネフイリン抗体感作ラテツクスよりなる免疫
化学的測定試薬、 （ホ）Ａ：メタネフイリン結合ポリアクリル酸結合−ラ
テツクスとＢ：抗メタネフイリン抗体 よりなる免疫化学的測定試薬、 （へ）Ａ：メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無
水マレイン酸共重合体結合ラテツクスと Ｂ：抗メタネフイリン抗体 よりなる免疫化学的測定試薬 等々をあげることができるが、本発明の試薬は上記に掲
げる具体例の例示に限定されるものではないＯ本発明の
新規な免疫化学的測定試薬を使用して免疫化学的測定を
実施するに際しては、以下に示す測定方法に従い実施す
ることができる。

また、本発明の特徴並びに利点につき以下に詳述する。
〔測定方法〕血液、尿その他の体液中に存在する微量物
質は前記試薬を用いて凝集阻止反応により定量すること
ができる。

具体的な測定法は実施例として示したが、一般的な測定
法は次に述べる通りである。原理的には抗原結合ラテツ
クスと抗体感作（又は結合）ラテツクスあるいは抗原結
合ラテツクスと抗血清の凝集反応系を用いた凝集阻止反
応である，すなわち、例えば清浄なスライド板上に１滴
の試験検体（適宜稀釈）を置き、１滴の水性懸濁の抗体
結合高分子ラテツクスあるいは抗体感作ラテツクスある
いは希釈抗血清を滴下し、次いでハプテン結合カルボキ
シル基含有モノオレフイン系高分子結合ラテツクスの水
性懸濁液１滴を加えこれら三者を混合攪拌するか、又は
、検体１滴、ハプテン結合カルボキシル基含有モノオレ
フイン系高分子結合ラテツクスの１滴、ついで抗体結合
（又は感作）ラテツクスあるいは希釈抗血清を１滴加え
これら三者を混合することにより達成される。１〜３分
で試験の結果が観察さへ凝集像を陰性、凝集阻止像（非
凝集）を陽性と判定する。

検体中のハプテンの濃度は検体を適宜希釈して試験を行
ない、凝集阻止像を呈する最高希釈倍数に試験の測定感
度を乗することにより求められる。〔特徴〕 従来行なわれてきたハプテンのラテツクス凝集阻止反応
は、抗原性の強い物質例えば牛血清アルプミン、ヒト血
清アルプミン、牛γグロブリン、破傷風毒素等にハプテ
ンを結合させたものを抗原として高分子ラテツクスに感
作した抗原感作ラテツクスとハプテン抗体との凝集反応
系およびハプテン抗体感作ラテツクスと前記抗原性の強
い物質にハプテンを結合させたものの溶液との凝集反応
系が用いられていた。

本発明においては、従来用いられている抗原性の強い天
然物あるいはその類縁物質とは異なるカルボキシル基含
有水溶性モノオレフイン系高分子にハプテンを結合させ
、これを反応性高分子ラテツクスに化学結合させて用い
ることにより以下に述べるような種々の特徴及び利点を
有する。本発明において、抗原結合ラテツクスは非常に
高い安定性を有し、室温保存に十分耐え得る。

従来用いられてきたものでは安定性が低いため冷所保存
をせざるを得なかつた。それは抗原に前記のような天然
物又はその類縁物質を用いているため長期保存において
これらハプテンを結合させている物質の変性あるいは分
解が生じるためと考えられ、本発明では生体成分にまつ
たく無関係な異質なカルボキシル基含有水溶性モノオレ
フイン系高分子を用いるため極めて安定である。また高
分子ラテツクスへの結合が化学結合で強固であるため従
来の感作と異なり安定性が高いものと思われる。これら
のことは担体に血球を用いた抗原感作血球の場合抗原自
体の安定性を保つため、又担体と抗原との結合を保持す
るため担体自体の安定性を保持するために通例凍結乾燥
が行なわれて室温保存が可能になつている。担体にラテ
ツクスを用いた場合には担体自体の安定性は増すが、従
来法においては感作血球の場合と同様な不安定要因が残
されたままである。感作ラテツクスの凍結乾燥はラテツ
クス自体の物性の変化により非特異的自然凝集が生じる
などさらに不安定になることから冷所保存にたよらざる
を得なかつたものである。また本発明は、従来の測定法
に比較して反応時間が短く、かつ高い測定感度を有する
。本発明においては、前記ハプテン結合カルボキシル基
含有モノオレフイン系高分子結合高分子ラテツクスと抗
体結合（又は感作）ラテツクスとの凝集反応系あるいは
該高分子ラテツクスと希釈抗血清との凝集反応系を用い
ることができる。従来の方法では反応時間が３〜５分で
あり、反応液量が少い場合あるいは測定室内環境（温度
、湿度等）により、５分近くなると反応液の乾燥が生じ
、周辺からの非特異的反応像の乱れが生じやすかつた。
本発明の方法によれば後者の凝集反応系においても２〜
３分で容易に判定が可能であり、特に前者の凝集反応系
においては１分〜２分で容易に判定ができる。ラテツク
ス凝集阻止反応によるハプテンの定量は前述のごとく阻
止反応像をもつて判定するが、陰性である凝集像の強さ
がその測定法の見やすさ、判定しやすさを決定づける要
因である。

本発明によれば、従来法におけるよりはるかに早く陰性
像である凝集像が出現する。その発現機序は十分明らか
でないが、後者の凝集系でも明らかに認められることよ
り、カルボキシル基含有水溶性モノオレフイン系高分子
を用いた抗原結合ラテツクスを用いることにより、従来
法における抗原感作ラテツクスにおいて天然物又はその
類縁物質を使用している場合と異なり、抗体との反応性
が増加したためと推定される。さらに、前者の凝集系に
おいてはこの効果に加えて、抗体もラテツクスに結合（
又は感作）して用いることにより抗体側のラテツクスも
凝集反応に直接加わるためと推定される。すなわち従来
のラテツクス凝集反応は抗原感作ラテツクスが希釈抗血
清と反応し、抗原感作ラテツクス上の抗原と反応した抗
体がさらに抗原感作ラテツクスと反応し、順次抗原感作
ラテツクスの凝集が発育して肉眼的に判定可能な凝集像
に到達していくのに比して、前者の凝集系では抗体もラ
テツクスに結合（又は感作）してあるので、ラテツクス
表面にある抗原および抗体の抗原一抗体反応がすべて直
接凝集に関与し、抗原および抗体のラテツクスによる凝
集が発育するため、より早く、より強く凝集像を呈する
ものと思われる。本発明はカルボキシル基含有水溶性モ
ノオレフイン系高分子に結合させるハプテンの量、ある
いは高升子ラテツクスに結合するハプテン結合カルボキ
シル基含有モノオレフイン系高分子の量および／または
対応する抗血清の希釈度あるいは高分子ラテツクスに結
合（又は感作）する抗体の量を調整するか、最終ラテツ
クス懸濁液調製時に加える象兎血清アルブミンあるいに
ヤギ血清アルブミン、牛血清アルブミン等の濃度を変え
るか、あるいは以上のいくつかを組合せることにより辿
淀対照のハプテンに合つた測定感度に調整することがで
きる。

第１表に本発明の方法と従来法との尿中エストロゲン測
定における測定感度および反応時間の比較を示した〇第
１表における本発明の方法（１）は１７−アミノ−１，
３，５（１０）一エストラトリエン一３一オール結合ポ
リアクリル酸結合リジンラテツクスと抗エストリオール
一１６−グルクロナイド抗体感作ラテツクスとを用いた
測定例であり、（有）は１７−アミノ−１，３，５（１
０）一エストラトリエン一３−オール結合ポリアクリル
酸結合リジンラテツクスと希釈抗エストリオール一１６
−グルクロナイド抗体を用いた測定例である。

従来法はエストリオール一１６−グルクロナイド一ＢＳ
Ａ感作ラテツクスと希釈抗エストリオール一１６−グル
クロナイド抗体を用いた測定例である。表に示す如く従
来法に比して本発明法は測定感度において４で２０倍、
（有）で１０倍感度が高く反応時間は、１／２．５〜１
／５に短縮することができた。従来法においてさらに感
度を上げようとすると、陰性像である凝集像が弱くなる
ことから、本発明の高感度の発現機序は前記と同様カル
ボキシル基含有水溶性モノオレフイン系高分子を用いる
ことにより抗体との反応性が増加したためと推定される
。さらに本発明の方法は、従来の方法に比して凝集阻止
像から凝集像への移行が明瞭でありかつその移行濃度巾
がせまく定量性が高い。妊婦の胎児胎盤機能を反映する
尿中エストロゲンは主としてエストリオール一１６−グ
ルクロナイトである。このエストリオール一１６−グル
クロナイドをグリシン緩衝化食塩水で第２表に示す標準
溶液を調製し（エスロオール換算濃度）、凝集阻止像か
ら凝集像への移行の明瞭性を従来法と比較し表に示した
。なおこの比較例に用いた本発明の方法４はエストリオ
ール一１６−グルクロナイドーリジン結合ポリアクリル
酸結合リジンラテツクスと抗エストリオール一１６−グ
ルクロナイド抗体結合ラテツクスを、（日は該結合ラテ
ツクスと希釈抗エストリオール一１６−グルクロナイド
抗血清を用いた例であり、従来法はエストリオール一１
６−グルクロナイド一ＲＳＡ感作ラテツクスと希釈抗エ
ストリオール一１６−グルクロナイド抗血清とを用いた
例であり、いずれの方法も感度０．１μ９／ｄに調整し
て比較を行なつた。なおこの表では、凝集像の強さを比
較するために凝集像を＋として表示した。表に示す如く
、同一感度に調整した三測定法において従来の方法では
エストリオール一１６−グルクロナイドを含まない緩衝
液のみでも凝集像は弱く、阻止像から凝集像を呈する濃
度巾が大であつた。

本発明の方法８ではかなり明瞭に従来法より移行巾がせ
まくなり、本発明の方法４は０．０２μ９／ｍｌの濃度
巾でクリアーに阻止像から凝集像への移行が認められた
。この発現機序も前記のごと≦水溶性カルボキシル基含
有モノオレフイン系高分子を用いたための効果と考えら
れる。従来行なわれてきたハプテンのラテツクス凝集阻
止反応による測定においては、ハプテンの定義に示した
如く、それ自体抗原性を持たぬため、抗体を得るのに抗
原性の強い蛋白質等に結合して咄乳動物に免疫してはじ
めてハプテンに対する抗体を得ることができるようにな
つたことから、ラテツクスに感作する場合、同様な抗原
性の強い蛋白等にハプテンを結合して感作することが必
須のごとく考えられてきた。

本発明において、ハプテンに対する抗体の作成には、常
法通り抗原性の強い物質に結合することが必要であるが
、ラテツクスに結合するハプテン結合物は、必ずしも抗
原性の強弱に関係なく、天然に存在しない全く異質なカ
ルボキシル基含有水溶性モノオレフイン系高分子にハプ
テンを結合させて用いることにより、前記の如く、従来
法にはない特徴及び利点を得ることができ、さらに、対
応する抗体もラテツクスに結合（又は感作）、特に好適
には結合して用いることにより、その有用性がさらに増
大することが明らかとなつた。以下の実施例は本発明を
具体的に示すものであるが、これに限定されるものでは
ない。

実施例 １ 妊婦尿中エストロゲンの漣淀 （ａ）エストリオール一１６−グルクロナイド一ＢＳＡ
の製造エストリオール一１６−グルクロナイド４０ηを
ジメチルホルムアミド１７ｎ１に溶解し、これに４℃以
下でトリ−ｎ−ブチルアミン２０．６μｔを添加したの
ち、イソブチルクロロカーボネート１１．２μｔを加え
３０分間攪拌した。

これに予めＢＳＡ（牛血清アルブミン）１１７即を２．
８ｍ１の水に溶解したものに１Ｎ水酸化ナトリウム液１
５０μｔを加えたのちジメチルホルムアミド２．０ｄを
加え、８℃に保たれた液を混合した。次いでこれを８℃
で攪拌し、１時間後に１Ｎ水酸化ナトリウム液１６．６
μｔを加え、さらに３．５時間攪拌したのち、セフアデ
ツクスＧ−２５で未反応のエストリオール一１６−グル
クロナイド及びトリ−ｎ−ブチルアミン等の低分子試薬
を分離した。さらにこれを透析（精製水に対し）したの
ち凍結乾燥すると、エストリオール一１６−グルクロナ
イド一ＢＳＡが得られた。この抗原の凍結末についてコ
ーベル反応により、ＢＳＡｌモル当りエストリオール一
１６−グルクロナイド２７〜３０モルの結合が確認され
た。（ｂ）抗エストリオール一１６−グルクロナイド抗
体の製造上記（ａ）で製造したエストリオール一１６−
グルクロナイド一ＢＳＡ２ηを１ｍ１の生理食塩水に溶
解し、同量のコンプリートフロインドアジユバントで乳
化し、成熟家兎の足跪および皮下に注射した。

この注射を１ケ月間隔で行ない、抗体価の土昇を確認後
全採血を行ない抗血清を得た。この抗血清を５６℃３０
分間非働化後ＢＳＡで吸収し、ついで硫酸アンモニウム
による塩析で抗エストリオール一１６−グルクロナイド
抗体を製造した。（ｃ）抗エストリオール一１６−グル
クロナイド抗体感作ラテツクスの製造上前（ｂ）で製造
した抗エストリオール一１６一グルクロナイド抗体４〜
を５ｍ１のグリシン緩衝化艶塩液に溶解し、これに１０
％ポリスチレンラテツクス１ｍ１を加えて混合し、５６
℃で３０分間処理した。

この後、遠心分離して得た沈殿をグリシン緩衝化食塩液
（ＰＨ９．６）にて遠心洗浄し、沈殿を０．０５％にＲ
ＳＡ（ウサギ血清アル小フミン）を含むグリシン緩衝化
食塩液１５ｍ１にて懸濁させ、抗エストリオール一１６
−グルクロナイド抗体感作ポリスチレンラテツクスを製
造した。

ト）反応性高分子ラテツクスの製造 （ｄ−１） リジン・ラテツクス カルボキシルモデイフアイドポリスチレンラテツクスの
１０％懸濁液５ｍ１にε一第三ブチルオキシカルボニル
リジンメチルエステル２６０〜をジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）３ｍ１に溶かした液を加え、０℃に冷却した
のち攪拌しつつ水溶性カルボジイミド、〔１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩〕２４３ηを加える。

０℃にて１時間、室温にて３時間攪拌をつづけたのち室
温に一夜放置し、遠心分離する。

上清を捨て、沈降物を５０（ｆｌ）ＤＭＦ水溶液、つい
で水で洗浄する。これに氷冷した濃塩酸５ｍ１を加え、
ときどきふりまぜつつＯ℃に１５分間放置したのち氷水
で約倍量にうすめ遠心する。

沈降物を洗液が中性になるまで洗浄し、ついでトリエチ
ルアミンの１０％水溶液１０ｄを加えて室温で１５分攪
拌後遠心し、洗液が中性になるまで水洗をくり返す。最
後に１００ｔ）懸濁液になるように濃度を調整し所望の
リジン・ラテツクスを得る。本品はニンヒドリン反応陽
性である。生成物の構造は にて表わされる。

（ｄ−２） ジアミノヘプタン・ラテツクスカルボキシ
ルモデイフアイドポリスチレンラテツクスの１０％懸濁
液２．５ｄを遠心し、沈降したラテツクスに０．０１Ｍ
ジアミノヘプタン水溶液１７．５ｗＬ１を加えて懸濁さ
せる。

４℃に冷却したのち攪拌しつつ１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩３３．
４〜を加え、反応温度を４℃に保ちつつ一夜攪拌をつづ
ける。

反応後遠心と水浮遊による洗浄を三回くりかえし、最後
に濃度を調整して１０％懸濁液とする。

本品はニンヒドリン反応陽性で、構造は下式により表わ
される。（ｅ）エストロゲン変性物結合カルボキシル基
含有水溶性モノオレフイン系高分子の製造（ｅ−１ ）
１７−アミノ−１，３，５（１０）一エストラトリエ
ン一３−オール結合ポリアクリル酸の製造表記アミノス
テロイド１０．５７１！Ｆｉ７、ポリアクリル酸（平均
分子量約２００万）１００〜をジメチルホルムアミド（
ＤＭＦ）５ｍ１に溶かし、シンクロヘキシルカルボジイ
ミド（ＤＣＣ）９〜を加えて室温に３０時間放置する。

反応液をセロフアンチユーブに移し、蒸留水２ｔ中で８
０時間透析する。

内液をＰ過したのち沢液を濃縮して表記の目的物の水溶
液を得る。液量８．０ｍ１に濃縮したときのアミノステ
ロイド含有量は波長２８０ｍμの光で定量した結果１．
２６Ｔｎ９／ｍｌ！，であつた。

（ｅ−２） １７−アミノ−１，３，５（１０）一エス
トラトリエン一３−オール結合ビニル婚メチルエーテル
無水マレイン酸共重合体（ＰＶＭＭＡ）の製造 ＰＶＭＭＡＩＯＯｍｆ７をＤ狙゛５ｍｊに加温して溶解
し、表記アミノステロイド３０Ｔｒ９を加え、溶液を室
温に４日間放置する。

反応液をセロフアンチユーブに移し、蒸留水２ｔ中にて
８０時間透析し内液をＰ過し表記の目的物の水溶液を得
る。

Ｐ液の液量を５０ゴに調整したときのアミノステロイド
の含有量を波長２８０ｍμの光で定量した結果は０．４
４ｍｙ／ゴであつた。

（ｅ−３） エストリオール一１６−グルクロナイド結
合ポクリル酸の製造（Ｉ）印 エストリオール一１６−
グルクロナイドーリジン誘導体エストリオール一１６−
グルクロナイド ２３２〜，ε−ベンジルオキシカルボニルリジンメチル
エステル・ トルエンスルホン酸塩２３３ｍｆ７をＤＭ
Ｆｌ５ｍｌに溶かし、氷冷下攪拌しつつジフエニルホス
ホリンアジド１６４Ｔｆ１９、ついでトリエチルアミン
０．１４ｍ１を加える。

ｏ℃で１時間攪拌したのち室温に４８時間放置、次いで
反応液を４０℃以下にて減圧乾固し、残渣をプレパラテ
イフ薄層クロマトグラフイに付し、目的とする化合物− ２４０ｍ９（対理論収率６５％）を得る。

本品は結晶し難いが、シリカゲルの薄層クロマトでＲｆ
＝０．５５（クロロホルム−メタノール５：１）の単一
スポツトを与え、硫酸で紫色に、ニンヒドリンで橙赤色
に発色する。

向 上記（至）で得たエストリオール一１６−グルクロ
ナイドーリジン誘導体３７即を第三級ブタノールー水（
９：１ ）１５ｍＩ！に溶かし、１０％パラジウム炭素
１０Ｗ９を加え、常温常圧で水素気流中で攪拌する。

反応の状態を薄層クロマトで追跡すると１．５時間で原
料は消失するから、触媒を濾別、洗浄し、Ｐ液および洗
液を減圧乾固する。

生成物をポリアクリル酸１００〜とともにジメチルホル
ムアミド７ａに溶かし、シンクロヘキシルカルボジイミ
ド（ＤＣＣ）１２．４〜を加えて室温に４８時間放置し
たのち（ｅ一１）項に従つて処理し、エストリオール一
１６−グルクロナイド含量２．０１η／ｄのエストリオ
ール一１６−グルクロナイド結合ポリアクリル酸水溶液
１０ｍ１，を得た。

（ｅ−４） エストリオール一１６−グルクロナイド結
合ポリアクリル酸の製造（）（イ）エストリオール一１
６−グルクロナイドーヘキサメチレンジアミン誘導体エ
ストリオール一１６−グルクロナイド ９３即とＮ−ハイドロキシコハク酸イミド２５ηをＤＭ
Ｆｌ．５ｍｌに溶かし、氷冷下攪拌しつつＤＣＣ４ｌ〜
を加える。

３０分後 モノペンジルオキシカルボニルヘキサメチレンジアミン
塩酸塩５５風 トリエチルアミン０．０３Ｔ！ＬｌをＤ
ＭＦｌｄに溶かした溶液を加え、氷冷下で２時間、室温
で１２時間攪拌をつづける。

全体を減圧乾固し、残渣をプレパラテイブ薄層クロマト
に付して目的の標記化合物、 ８２Ｗ９（対理論収率５５％）を得る。

本品はシリカゲルの薄層クロマトでＲｆ ＝０．４２（クロロホルム−メタノール５：１）を示し
た。

（ロ）上記（イ）で得たエストリオール一１６−グルク
ロナイドーヘキサメチレンジアミン誘導体５０７！！ｙ
をメタノール３１！１１に溶かし、パラジウム黒１０Ｗ
９を加え、常温常圧で水素気流中で攪拌する。

２時間で反応は終了し、．：触媒を沢別し、沢液を減圧
濃縮し、残渣にエーテルを加えると カルボベンジルオ
キ基が脱離した目的物３５〜を粉末として得た。

この生成物１０ｍｆをポリアクリル酸１００こ即ととも
にＤＭＦ２ｍｌに溶かし、ＤＣＣ４ｍｆを加え、室温に
５０時間放置する。

反応液を透析し、内液をＰ過後凍結乾燥すると、エスト
リオール一１６−グルクロナイド結合ポリアクリル酸９
５〜を白色粉末として ４得た。

（ｆ）エストロゲン変性物結合カルボキシル基含有モノ
オレフイン系高分子結合ラテツクスの製造ナイト結合ポ
リアクリル酸結合ラテツクスの製造前記（ｄ−１）で製
造したリジンラテツクス０．１９を１ｄの蒸留水にて懸
濁させ、これに前記（ｅ−３）で製造したエストリオー
ル一１６−グルクロナイド結合ポリアクリル酸水溶液１
ｄ（エストリオール一１６−グルクロナイド０．３〜相
当量）を加えて混合し、ついで１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１０ｍ
ｇを加え、攪拌下一夜反応を行なう。

反応終了後遠心分離して得た沈殿をグリシン緩衝化食塩
液１０ａで３回洗浄後、沈殿を０．０５％にＲＳＡ（ウ
サギ血清アルブミン）を含むグリシン緩衝化食塩液３０
ＷＬＩにて懸濁させて、エストリオール一１６−グルク
ロナイド結合ポリアクリル酸結合ラテツクスを製造した
。

（ｆ−２） １７−アミノエストロゲン結合ポリアクリ
ル酸結合ラテツクスの製造前記（ｄ−１）で製造したリ
ジンラテツクスと前記（ｅ−１）で製造した１７−アミ
ノエストロゲン結合ポリアクリル酸を用い（ｆ−１）と
同様な方法で１７−アミノエストロゲン結合ポリアクリ
ル酸結合ラテツクスを製造した。

（ｆ−３） １７−アミノエストロゲン結合ＰＶＭＭＡ
結合ラテツクスの製造前記（ｄ−１）で製造したリジン
ラテツクスと前記（ｅ−２）で製造した１７−アミノエ
ストロゲン、結合ＰＶＭＭＡを用いて、（ｆ−１）と同
様な方法で、１７−アミノエストロゲン結合ＰＶＭＭＡ
結合ラテツクスを製造した。

（ｆ−４） エストリオール一１６−グルクロナイド結
合ポリアクリル酸結合ラテツクスの製造前記（ｄ−２）
で製造したジアミノヘプタンラテツクスと前記（ｅ−４
）で製造したエストリオール一１６−グルクロナイド結
合ポリアクリル酸を用いて、（ｆ−１）と同様な方法で
、エスロオール一１６−グルクロナイド結合ポリアクリ
ル酸結合ラテツクスを製造した。

（ｍｌ尿中エストロゲンの測定 妊婦尿５検体をグリシン緩衝化食塩液で５０倍、１００
倍、２００倍および４００倍に希釈し、各希釈尿の１滴
（０．０３ｍ１）を反応スライド板上に滴下し、これに
（ｃ）で製造した抗エストリオール一１６−グルクロナ
イド抗体感作ラテツクスを１滴ずつ滴下し、ついで（ｆ
−１）で製造したエストリオール一１６−グルクロナイ
ド結合ポリアクリル酸結合ラテツクスを１滴ずつ滴下す
る。

この三者を均一に混合し、２分間揺動後肉眼で凝集像、
凝集阻止像を観察した。なお この実施例においては試
薬の感度を０．１μｇ／Ｔｆｌｌに調整してあるので、
各妊婦尿のエストロゲン濃度は第３表に示す値であつた
。

判定基準−：明瞭な凝集像廿：完全な凝集阻止像 なお測定例において、エストロゲン変性物結合カルボキ
シル基含有モノオレフイン系高分子結合ラテツクスとし
て前記（ｆ−２），（ｆ−３），（ｆ−４）を用いた場
合も上記（ｆ−１）を用いた場合と同様の結果が得られ
た。

実施例 ２ 尿中プレグナンジオールの測定 （ａ）プレグナンジオール一３−グルクロナイド一ＢＳ
Ａの製造プレグナンジオール一３−グルクロナイドとＢ
ＳＡを用いて実施例１（ａ）と同様の方法でプレグナン
ジオール一３−グルクロナイド一ＢＳＡを製造した。

（ｂ）抗プレグナンジオール一３−グルクロナイド抗体
の製造上記（ａ）で製造したプレグナンジオール一３−
グルクロナイドＢＳＡを用い、実施例１（ｂ）と同様な
方法で山羊に免疫して抗血清を得ることにより抗プレグ
ナンジオール一３−グルクロナイド抗体を製造した。

（ｃ）抗プレグナンジオール一３−グルクロナイド抗体
感作ラテツクスの製造上記（ｂ）で製造した抗プレグナ
ンジオール一３−グルクロナイド抗体を用い、実施例１
（ｃ）と同様な方法で、抗プレグナンジオール一３−グ
ルクロナイド抗体感作ポリスチレンラテツクスを製造し
た。

（ｄ）プレグナンジオール一３−グルクロナイド結合Ｐ
ＶＭＭＡの製造（イ）プレグナンジオール一３−グルク
ロナイドーリジン誘導体プレグナンジオール一３−グル
クロナイド９９η，εベンジルオキシカルボニルリジン
メチルエステル・トルエンスルホン酸塩１４０ワをＤＭ
Ｆｌ２ｍｌに溶かし氷冷下攪拌しつつジフエニルホスホ
リルアジド６５η、ついでトリエチルアミン０．０５６
７ｎ１を加えたのち、実施例１（ｅ−３）と同様にして
下記構造式で表わされる目的のリジン誘導体１００ｍｇ
（対理論収率５８％）を得た。

（ロ）上記（イ）で得たプレグナンジオール一３−グル
クロナイドーリジン誘導体３８ηを実施例１（ｅ−３）
と同様にして接触還元した生成物をＰＶＭＭＡｌＯＯＴ
ｎｙとともにＤ゛６ａに加温溶解したのち、室温に４日
間放置した。

反応液を実施例１（ｅ−２）と同様に処理し、プレグナ
ンジオール含量０．４６η／ｍｌ（硫酸発色による定量
）のプレグナンジオール一３−グルクロナイド結合ＰＶ
ＭＭＶの溶液３０ｍ１を得た。（ｅ）プレグナンジオー
ル一３−グルクロナイド結合ＰＶＭＭＡ結合ラテツクス
の製造実施例１（ｄ−１）で製造したリジンラテツクス
と前記（ｄ）で製造したプレグナンジオール一３−グル
クロナイド結合ＰＶＭＭＡを用い、実施例１（ｆ）と同
様の方法でプレグナンジオール一３−グルクロナイド結
合ＰＶＭＭＡ結合ラテツクスを製造した。

］ｆ）尿中プレグナンジオールの測定 妊婦尿５例をグリシリン緩衝化食塩液で５０倍、１００
倍、２００倍、４００倍および８００倍に希釈し、前記
（ｃ），（ｅ）を用い、実施例１（ｇ）と同様な操作で
尿中プレグナンジオールを測定した。

なお、この実施例においては、試薬の感度を０．０５μ
９／ａに調整してあるので各妊婦尿のプレグナンジオー
ル濃度は第４表に示す値であつた。実施例 ３ 尿中プレグナントリオールの測定 （ａ）プレグナントリオール一３−グルクロナイド一Ｂ
ＳＡの製造プレグナントリオール一３−グルクロナイド
とＢＳＡとを用いて実施例１，（ａ）と同様にしてプレ
グナントリオール一３−グルクロナイド一ＢＳＡを製造
した。

】）抗プレグナントリオール一３−グルクロナイド抗体
の製造上記（ａ）で製造したプレグナントリオール一３
−グルクロナイド一ＢＳＡを用い、実施例Ｌ（ト）と同
様な方法で家兎に免疫して抗プレグナントトオール一３
−グルクロナイド抗体を製造した。

）抗プレグナントリオール一３−グルクロナイ上記（ｂ
）で製造した抗プレグナントリオール一３−グルクロナ
イド抗体を用い、実施例１（ｃ）と同様な方法で、抗プ
レグナンロオール一３−グルクロナイド抗体感作ポリス
チレンラテツクスを製造した。（ｄ）プレグナントリオ
ール一３−グルクロナイド結合ポリアクリル酸の製造（
イ）プレグナントリオール一３−グルクロナイドーヘキ
サメチレンジアミン誘導体プレグナントリオール一３−
グルクロナイド１０２ηとモノベンジルオキシカルボニ
ルヘキサメチレンジアミン塩酸塩６３〜とをＤＭＦ４ｍ
ｌにとかし、氷冷したのち攪拌しつつジフエニルホスホ
リルアジド５５〜、ついでトリエチルアミン０．０６Ｔ
１Ｌｅを加えた。

００Ｃで２時間攪拌をつづけたのち室温に７２時間放置
し、反応液を減圧乾固して残つた生成物をプレパラテイ
ブ薄層クロマトにかけて、目的のプレグナントリオール
一３−グルクロナイドーヘキサメチレンジアミン誘導体
６１Ｔｆ１９（対理論収率４１％）を得た。

（ロ）上記（イ）で得たプレグナントリオール一３グル
クロナイドーヘキサメチレンジアミン誘導体５６ワを実
施例１（ｅ−４）と同様にして接触還元したのち、ポリ
アクリル酸２００ηとともにＤＭＦ２Ｏｄに溶かし、Ｄ
ＣＣｌ６ηを加え室温に５日間放置した。

反応液を実施例１（ｅ−４）と同様に処理し、プレグナ
ントリオール一３−グルクロナイド結合ポリアクリル酸
の凍乾末１６８ηを白色粉末として得た。０プレグナン
トリオール一３−グルクロナイド結合ポリアクリル酸結
合ラテツクスの製造実施例１（ｄ−１）で製造したリジ
ン・ラテツクスと、上記（ｄ）で製造したプレグナント
リオール一３−グルクロナイド結合ポリアクリル酸とを
用い、実施例１（ｆ）と同様な方法で、プレグナントリ
オール一３−グルクロナイド結合ポリアクリル酸結合ラ
テツクスを製造した。

ｒ）尿中プレグナントリオールの測定 新生児または乳児の尿もしくはオシメに一定の大きさの
脱脂タンホンを挿入して尿を吸着させ乾燥したものを集
める。

このタンホンを一定量の蒸留水で浸出して検体とした。
この検体を生理食塩水で原尿換算２５，５０，１００，
２００および４００倍に希釈し、前記（ｃ）と（ｅ）を
用い、実施例１（Ｏと同様な操作で尿中プレグナントリ
オールを測定した。なおこの実施例では試薬の感度を０
．１μ９／ｄに調整してあるので各検体中のプレグナン
トリオール量は第５表の通りである。この方法で第５表
に示すように生れつき副腎過形成の疾病の有無が判定で
きるから、早期に副腎皮質ホルモン治療することで正常
に成長でき、婦人ならば妊娠、分娩も正常にできる。実
施例 ４尿中１７−０ＨＣＳの測定 （ａ） ３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキ
シプレグナン一２０−オン（ＴＨＦ）−３−グルクロナ
イド一ＢＳＡの製造ＴＨＦ−３−グルクロナイドとＢＳ
Ａを用い、実施例１（ａ）と同様な方法でＴＨＦ−３−
グルクロナイド一ＢＳＡを製造した。

ｂ）抗ＴＨＦ−３−グルクロナイド抗体の製造上記（ａ
）で製造したＴＨＦ−３−グルクロナイド一ＢＳＡを用
い実施例１（ｂ）と同様な方法で家兎に免疫して抗血清
を得ることにより抗ＴＨＦ−３グルクロナイド抗体を製
造した。

（ｃ）抗Ｔ゛−３−グルクロナイド抗体感作ラテツクス
の製造上記（ｂ）で製造した抗ＴＨＦ−３−グルクロナ
イド抗体を用い、実施例１（ｃ）と同様な方法で、抗Ｔ
ｌＩＦ′−３−グルクロナイド抗体感作ポリスチレンラ
テツクスを製造した。

（ｄ） ＴＨＦ−３−グルクロナイド結合ポリアクリ
１ル酸の製造（イ）ＴＨＦ−３−グルクロナイドーリジ
ン誘導体実施例１（ｅ−３）に従い、ＴＨＦ−３−グル
クロナイド５３η，ε−ベンジルオキシカルボニルリジ
ンメチルエステル・トルエンス １ルホン酸塩５９ｍ９
、ジフエニルホスホリルアジド３３η、トリエチルアミ
ン０．０２７ｗＬ１とから所望のリジン誘導体５７〜（
対理論収率７１９１））を得た。

（ロ）上記（イ）で得たリジン誘導体４０〜を実施例
２１（ｅ−３）と同様にして接触還元後ＤＣＣｌ４ηお
よびポリアクリル酸１００ηと反応せしめ、後処理し、
ＴＨＦ−３−グルクロナイド結合ポリアクリル酸溶液１
５ｍ１（ＴＨＦ含有量０．９６Ｔｎ９／ＭＯを得た。

（ｅ） ＴＨＦ−３−グルクロナイド結合ポリアクリル
酸結合ラテツクスの製造前記実施例１（ｄ−２）で製造
したジアミノヘプタンラテツクスと前記（ｄ）で製造し
たＴＨＦ−３−グルクロナイド結合ポリアクリル酸へ用
い、実施例１（０と同様な方法でＴＨＦ−３−グルクロ
ナイド結合ポリアクリル酸結合ラテツクスを製造した。

ｆ）尿中１７−０ＨＣＳの測定 正常男子尿及び正常女子尿をそれぞれ１０倍、１５倍、
２０倍、２５倍、３０倍および４０倍にグリシン緩衝化
食塩液で希釈し、前記（ｃ），（ｅ）を用い実施例１（
ｇ）と同様な操作で尿中１７一０ＨＣＳ゛を測定した。

その結果を第６表に示した。この実施例における測定感
度は０．２μｆｌ／ｄに調整してあるので、正常男子尿
中には５μ９／Ｍｌｌ正常女子尿には４μ９／ｍｌの１
７−０ＨＣＳが含まれていることがわかつた。実施例
５ モルフインの測定 （ａ）カルボキシメチルモルフイン一ＢＳＡの製造１０
０ｍｆ０）ＢＳＡを２５ｄの蒸留水に溶解し、この溶液
にカルボキシメチルモルフイン８０〜を溶解させ、ＰＨ
５．５に調整後８０ηの１−工 こチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を添加溶
解し、室温で一夜攪拌下反応し、反応液を蒸留水に対し
て透析し、透析内液を凍結乾燥して、カルボキシメチル
モルフイン一ＢＳＡを製造した。

（ｂ）抗カルボキシメチルモルフイン抗体の製造上記（
ａ）で製造したカルボキシメチルモルフイン一ＢＳＡを
用い、実施例１（ｂ）と同様に家兎に免疫して抗血清を
得、抗カルボキシメチルモルフイン抗体を製造した。

→ 抗カルボキシメチルモルフイン抗体感作ラテツクス
の製造．上記（ｂ）で製造した抗カルボキシメチルモル
フイン抗体を用い、実施例１（ｃ）と同様な方法で抗カ
ルボキシメチルモルフイン抗体感作ラテツクスを製造し
た。

０カルボキシメチルモルフイン結合ポリアクリル酸の製
造（イ）カルボキシメチルモルフイン−リジン誘導体カ
ルボキシメチルモルフイン５１．５Ｗ９，ε−第三ブチ
ルオキシカルボニルリジンメチルエステル酢酸塩６１〜
，ＤＭｌｌｌ′１０ｄ１ジフエニル土ス土リル了ジドＡ
ｑｍａＦ．ｌｌ丁羊ル了ミン０．０４２Ｔ１１１から実
施例１（ｅ−３）と同様にしてカルボキシメチルモルフ
イン−リジン誘導体６６，７Ｗ！（対理論収率７８％）
を得たＯ（ロ）上記（イ）で得たリジン誘導体４０ηを
９８％蟻酸５ｄに溶かし室温に２時間放置したのち４０
℃以下で減圧乾固する。

更に苛性カリ上に２４時間減圧に保つ。これをＤＭＦ５
ｍｌにとかし、トリエチルアミン０．０２Ｔ１Ｌ１を加
えたのち、ポリアクリル酸１００〜とＤＭＦ３ｄを加え
たのち、ポリアクリル酸１００Ｗ９とＤＭＦ３ａを加え
更にＤＣＣ２ｌＷ！９を加えて４８時間反応させた。実
施例１（ｅ−３）と同様に処理し、カルボキシメチルモ
ルフイン結合ポリアクリル酸溶液１０ｄ（カルボキシメ
チルモルフイン含有量２．０ｍ９／ＴＩＬＩ）を得た〇
（ｅ）カルボキシメチルモルフイン結合ポリアクリル酸
結合ラテツクスの製造実施例１（ｄ−１）で製造したリ
ジンラテツクスと上記（ｄ）で製造したカルボキシメチ
ルモルフイン結合ポリアクリル酸を用い、実施例１（ｆ
）と同様の方法でカルボキシメチルモルフイン結合ポリ
アクリル酸結合ラテツクスを製造した。

（ｆ）モルフインの測定モルフインを生理食塩水および
モルフインを含まない尿で第７表に示す濃度に溶解し、
前記（ｃ），（ｅ）を用いて実施例１（ｇ）と同様な操
作でモルフインを測定した。

結果を第７表に示した。本実施例の測定感度は５０ｎｇ
／Ｍｊであり、この感度は尿成分の影響を受けないこと
が判つた。実施例 ６１７−ＫＳの測定 （ａ）エチオコラノロン一３−ヘミサクシネートＢＳＡ
の製造エチオコラノロン一３−ヘミサクシネートを用い
実施例１（ａ）と同様な方法によりエチオコラノロン一
３−ヘミサクシネートＢＳＡを製造した。

１）抗エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗血清
の製造上記（ａ）で製造したエチオコラノロン一３−ヘ
ミサクシネートＢＳＡを用い、実施例１（６）と同様に
して、家兎に免疫し抗血清を得、ＢＳＡで吸収して抗エ
チオコラノロン一３−ヘミサクシネート抗血清を得た。

ｃ）エチオコラノロン一３−ヘミサクシネート結合ポリ
アクリル酸の製造（イ）．エチオコラノロン一３−ヘミ
サクシネート−リジン誘導体エチオコラノロン一３−ヘ
ミサクシネート７８７１９とε一第三ブチルオキシカル
ボニルリジンメチルエステル酢酸塩６４ワおよびＮ−ハ
イドロキシコハク酸イミド２５ηをＤＭＦ２ｄにとかし
、トリエチルアミン０．０３ｗＬ１を加えたのち氷冷し
、攪拌しつつＤＣＣ４ｌ即を加え氷冷下３時間、室温で
１０時間反応させた。

全体を減圧乾固したのち残渣をプレパラテイブ薄層クロ
マトで精製し、下式で示される目的化合物６４Ｗ９（対
理論収率５１％）を得た。

本品はシリカゲルの薄層クロマトでＲｆ＝０．６４（ク
ロロホルム−メタノール１０：１）に単一スポツトを与
えた。（ロ）上記（イ）で得たエチオコラノロン一３−
ヘミサクシネート−リジン誘導体３０ηを９８％蟻酸３
ｄに溶かし室温に３時間放置したのち４５℃以下で減圧
乾固した。

これをポリアクリル酸１００ηとともにＤＩＶＦ′５ｄ
にとかし、トリエチルアミン０．０３ｗ１１を加えたの
ちＤＣＣ２Ｏ即を加え室温に５０時間放置した。反応液
を実施例１（ｅ−４）に従つて処理しチオコラノロン一
３−ヘミサクシネート結合ポリアクリル酸の凍乾品１０
０ワを白色粉末として得た。（ｄ）エチオコラノロン一
３−ヘミサクシネート結合ポリアクリル酸結合ラテツク
スの製造実施例１（ｄ−１）で製造したリジンラテツク
スと、上記（ｃ）で製造したエチオコラノロン一３−ヘ
ミサクシネート結合ポリアクリル酸を用い、実施例１（
ｆ）と同様な方法でエチオコラノロン一３−ヘミサクシ
ネート結合ポリアクリル酸結合ラテツクスを製造した。

（ｅ）尿中１７−ＫＳの測定 前記（ｂ）で製造した抗血清をグリシン緩衝化食塩液に
て希釈し、上記（ｄ）を用いて、測定感度を０．５μ９
／ａに調整して尿中１７−ＫＳを測定した。

正常男子尿２例を２，４，８，１６倍に トリン酸緩衝
化食塩液にて希釈し、実施例１（ｇ）における抗体感作
ラテツクスの代りに上記希釈抗血清を用いて、同様な操
作で測定した結果、２例とも４．０μ９／ｍｌの１７−
ＫＳが含まれていることが分つた。実施例 ７ サイロキシン（Ｔ４）の測定 （ａ）サイロキシン一ＢＳＡの製造 ＢＳＡ５Ｏ〜を２５ｍ１の蒸留水に溶解し、この溶液に
５Ｔ１Ｌ１０）Ｄ゛に溶解したサイロキシン こを加え
、攪拌下３０ηの１−シクロヘキシル−３−（２−モル
ホリル一４−エチル）カルボジイミドメト一ｐ−トルエ
ンスルフオネートを加え、室温にて一夜反応を行なつた
。

反応液を蒸留水に対して透析後、凍結乾燥を行なつてサ
イ ３０キシン一ＢＳＡを製造した。（ｂ）抗サイロキ
シン抗体の製造 上記（ａ）で製造したサイロキシン一ＢＳＡを用い、実
施例１（ｂ）と同様な方法で家兎に免疫して抗血清を得
ることにより抗サイロキシン抗体を製造 ４した。

（ｃ）抗サイロキシン抗体結合ラテツクスの製造上記（
ｂ）で製造した抗サイロキシン抗体５〜を５ａの蒸留水
に溶解後、これにカルボキシル・モデイフアイド・ラテ
ツクスの１０％懸濁液１ｍ１を混合し、ついで１０ηの
１−エチル−３−（３−ジミチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩を加え攪拌下一夜反応を行なつた。

反応終了後、遠心分離して得た沈殿をグリシン緩衝化食
塩液で洗浄し、沈殿を０．０８％に家兎血清アルブミン
を含むグリシン緩衝化食塩水１５ｍ１にて懸濁させて、
抗サイロキシン抗体結合ラテツクスを製造した。（ｄ）
サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸
共重合体（ＰＶＭＭＡ）の製造実施例１（ｅ−２）と全
く同様にしてＰＶＭＭＡとサイロキシンとから製造し、
透析内液を凍結乾燥して白色粉末として得た。

（ｅ）サイロキシン結合ＰＶＭＭＡ結合ラテツクスの製
造前記（ｄ）で製造したサイロキシン結合ＰＶＭＭＡと
実施例１（ｄ−１）で製造したリジンラテツクスを用い
て実施例１（ｆ）と同様な方法でサイロキシン結合ＰＶ
ＭＭＡ結合ラテツクスを製造した。

（ｆ）２Ｔ４の測定正常男子血清４例について、８−ア
ニリノ−１−ナフタレンースルフオン酸を添加後、生理
食塩水で１．５，２，３倍に希釈し、実施例１（Ｑと同
様な操作によりＴ４を測定した。

本実施例における試薬の測定感度は３０ｎ９／ｍｌに調
整してあるので、測定値は第８表に示す値であつたＯ実
施例 ８ カテコールアミンの測定 （ａ）メタネフイリン一ＢＳＡの製造 メタネフイリンとＢＳＡとを用いて実施例１−（ａ）と
同様な方法でメタネフイリン一ＢＳＡを製造した。

（ｂ）抗メタネフイリン抗体の製造 上記（ａ）で製造したメタネフイリン一ＢＳＡを用いて
、実施例１（ト）と同様な方法で家兎に免疫して抗血清
を得、抗メタネフイリン抗体を製造した。

（ｃ）抗メタネフイリン抗体感作ラテツクスの製造上記
（ｂ）で製造した抗メタネフイリン抗体を用いて実施例
１（ｃ）と同様な方法により抗メタネフイリン抗体感作
ラテツクスを製造した。

（ｄ）メタネフイリン結合ポリアクリル酸の製造実施例
１（ｅ−１）と全く同様にしてポリアクリル酸とメタネ
フイリンとからメタネフイリン結合ポリアクリル酸を製
造した。

（ｅ）メタネフイリン結合ポリアクリル酸結合ラテツク
スの製造実施例１（ｄ−１）で製造したリジンラテツク
スと上記（ロ）で製造したメタネフイリン結合ポリアク
リル酸を用いて、実施例１（ｆ）と同様の方法でメタネ
フイリン結合ポリアクリル酸結合ラテツクスを製造した
。

（ｆ）メタネフイリンの測定 正常男子尿３例について生理食塩水で１、５，２および
３倍に希釈し、実施例１（鯵と同様な操作により尿中メ
タネフイリンを測定した。

本実施例における試薬の測定感度は０．０２μ９／ｍｌ
に調整してあるので測定値は第９表に示す値であつた。
以下に示す参考例は本発明でスペーサーとして用いるカ
ルボキシル基含有水溶性モノオレフイン系高分子化合物
及びこれにハプテン又はその化学的変性物を結合させた
ものが、免疫的に実質的に不活性であることを示す。

参考例 １（スペーサーの抗原性） （ａ）免疫 スペーサーとしてポリアクリル酸（ＰＡＡ）（分子量２
００万）、ＰＡＡ（分子量２５万）、ＰＡＡナトリウム
塩（分子量約１５０万）および２対照としてＢＳＡにつ
いて、各２Ｗ９を生理食塩水１ｄに溶解し、同量のコッ
プリード・フロインド・アジユバントで乳化し、成熟家
兎の皮下および足耶に注射した。

各群２羽について２週間隔で８回投与し、試験採血は投
与後７日目に３回投与後から行い、血清を分離した。（
ｂ）抗体の検索 （ａ）で得られた各血清について寒天ゲル内沈降反応（
オクテロニ一法および免疫電気向流法（ＣＩＥ法））に
より抗体の有無を観察した。

結果は第１０表に示す通り、対称のＢＳＡでは第１回の
試験採血時よりオクテロニ一法、ＣＩＥ法とも明瞭な沈
降線の形成が認められ抗ＢＳＡ抗体の産生が認められた
が、稈Ａはいずれも沈降腺形成が認められず抗ＰＡＡ抗
体は検出されなかつた。表中、−は沈降線非形成、＋は
沈降線形成を示す。

参考例 ２（ハプテン・スペーサーの抗原性）（ａ）免
疫後述の実施例１（ｅ−２）と同様にして製造したエス
トリオール一１６−グルクロナイド一ＰＡＡ（分子量２
５万）結合物をハプテン・ス ニペーサ一結合物の例と
して、又、実施例１（ａ）と同様にして製造したエスト
リオール一１６−グルクロナイド一ＢＳＡを対照として
以下の方法で家兎に免疫した。

各２１１ｆを生理食塩水１Ｔｎ１に溶解し、コンプリ
ニート・フロインド・アジユバント１ａで乳化し家兎の
背部に皮下投与した。

各群２羽について投与間隔は２週とし、１０回まで投与
した。試験採血は投与後７日目に３回投与後から行い血
清を分離した。 ５
（ト）抗エストリオール一１６−グルクロナイド抗体の
検索（ａ）で得られた各血清について抗エストリオール
一１６−グルクロナイド抗体の有無を３Ｈ−エストリオ
ール一１６−グルクロナイドを用いた ３ラジオイムノ
アツセイで検討した。

各試験採血血清ごとに硼酸緩衝液（０．０６％ＢＳＡ，
Ｏ．Ｏ５％ウシγ−グロブリン含有）ＰＨ８．Ｏで１０
倍、５０倍、１００倍、２００倍以後倍数希釈で２０４
８００倍まで希釈し、これ ４らについて以下に示す方
法によつて力価を求めた。

３Ｈ−エストリオール一１６−グルクロナィドのメタノ
ール溶液の一定量（１０，０００ｄｐｍ）を試験管にと
り、窒素気流下、蒸発乾固し、これに上記希釈血清の０
．２５ｍ１を入れ、よく振盪したのち、室温で３０分間
反応させ、次いで飽和硫酸アンモニウム０．２５ａを加
えてよく混合し、１０分間放電後３０００ｒｐｍ１０分
間の遠心分離を行ない上清の０．２ｄをバイアルピンに
とり、１０Ｗ１ｔのジオキサンシンチレータ−を入れて
、液体シンチレーシヨンカウンタ一にて放射能を測定し
、 Ｈ−エストリオール一１６−グルクロナイドの結合
率を計算した。

エストリオール一１６−グルクロナイド一ＢＳＡ投与群
は、１回目の採血時より７０％以上の結合率を示した。

この時の希釈倍数は３，２００倍以上であつたが、エス
トリオール一１６−グルクロナイド一ＰＡＡでは１０倍
希釈血清でも１０％前後であり、正常家兎血清（ＮＲＳ
）を同様に希釈して反応させた場合と同程度であつｔら
第１図に１０回投与後の血清についての力価を示した。

第１図に示した通り、工ストリオール一１６−グルクロ
ナイド一ＢＳＡを投与した２羽はいずれも高い力価を示
したが、エストリオール一１６−グルクロナイド一稈Ａ
を投与した２羽は、１回目と同様に力価の上昇は認めら
れずＮＲＳと同程度であつたＯしたがつて、エストリオ
ール一１６−グルクロナイド一ＰＡＡ投与ではハプテン
であるエストリオール一１６−グルクロナイドに対する
抗体は産生されておらず稈Ａのキヤリヤ〒幼果は認めら
れなかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例２（ｂ）における抗エストリオール一１
６−グルクロナイド抗体の検索の実験結果をグラフに示
したもので、横軸を希釈倍数、縦軸を結合率とした時の
エストリオール一１６−グルクロナイド一ＰＡＡ抗血清
（破線）及びエストリオール一１６−グルクロナイド一
ＢＳＡ抗血清（実線）の各希釈倍数における力価を表わ
し、三角印をつけた実線はＮＲＳの力価を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ハプテン又はその化学的変性物を化学的に結合せし
   めたカルボキシル基含有水溶性モノオレフィン系高分子
   化合物が、約０．０１〜約２ミクロンの粒径の高分子ラ
   テックスに化学的に結合していることを特徴とする新規
   な免疫化学的測定試薬。 ２（Ａ）ハプテン又はその化学的変性物を化学的に結合
   せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフィン系高
   分子化合物が、約０．０１〜約２ミクロンの粒径の高分
   子ラテックスこ化学的に結合しているハプテン担持ラテ
   ックスと、（Ｂ）ハプテン抗体を約０．０１〜約２ミク
   ロンの粒径の高分子ラテックスに感作し又は化学的に結
   合した抗体担持ラテックス或はハプテン抗体（抗血清）
   とを別々に用意し、これら両者を組合わせて使用するこ
   とを特徴とするハプテンの免疫化学的測定試薬。 ３ （Ａ）ハプテン又はその化学的変性物を化学的に結
   合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフィン系
   高分子化合物が、約０．０１〜約２ミクロンの粒径の高
   分子ラテックスに化学的に結合しているハプテン担持ラ
   テックスと、（Ｂ）ハプテン抗体を約０．０１〜約２ミ
   クロンの粒径の高分子ラテックスに感作又は化学的に結
   合した抗体担持ラテックス或はハプテン抗体（抗血清）
   とを用い、被検体中のハプテンによる上記（Ａ）、（Ｂ
   ）両試薬の凝集阻止反応を測定することを特徴とするハ
   プテンの免疫化学的測定方法。