JPS59501867A - キレ−ト化磁気イオンを用いる磁気分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キレート化磁気イオンを用いる磁気分離本発明は、生物学的細胞及びその他の小 粒子の磁気手段によるキャリヤからの分離に関するものである。特に、本発明は 、極めて低レベルの固有の常磁性若しくは反磁性の感受性を有するが、水性懸濁 物において正味の陰表面電荷を有するこの種の細胞または粒子の磁気分膝に関す るものである。これらの条件を満たす粒子の例は、血液形成体、上皮ａ胞（単離 されているか又は個々の細胞のクラスタのいずれか）、殆んど全ての他の動物及 び細菌ｄ　ｉＦ（’４並びに多くのウィルスを包含する。その他の小粒子の例は 、たとえば組織断片のような荷扱物質並びにたとえは砂、酸化鉄の沈降物などの 丼哉物質を包含する。

無哉物追の粒子寸法は、０１〜１０μ若しくはそれ以上の範囲とすることができ る。

反磁性白血球及び成る純のその他の唄乳動物１１１１胞をキャリヤから労組する ために磁気ン乏術を使用することが仰られている。これらの筏術は、硅１．抱が 磁気粒子を捕共するか或いは元方りｄ註のある柁子洗だ合されて、外側磁場が細 胞を除去すると共にその・、＋２！牲粒子ケ同部化させ又は狛合さセることを必 妥とする。こｎらの方法は少なくとも２つの欠点を有する。佃英文はｉ合ケ生せ しめてその間に細胞ρ・乍烏を受けろような培養期間ケ必要とする。

さらに、捕食されない又は結合されない粒子は処理試料において遊離状態に留ま り、或いはその後の試料処理の結果遊離状態となり、たとえばクールクー容曾分 析のような細胞測定技術による分析が複雑化し又は不可能となる。さらに、可能 であるとしてもこの種の分析は、細胞を磁性粒子と相互作用させるのに必要とさ れる培養によって生する細胞劣化により悪影響を受ける。しかしながら、これら の従来の方法は、キャリヤからの実際の細胞分離を達成するため実験室磁石から 得られる磁場強さの使用を可能にする。

キャリヤから赤血球を分離する磁気技術の使用も当業界で知られている。この分 離は、これら細胞の細胞内ヘモグロビンにおける常磁性状態の誘発に基づいてい る。

幾種かのヘモグロビン又はヘモグロビン誘導体は常磁性であり、その高スピン第 一鉄デオキシヘモグロビン若しくは第二鉄メテモグロピンは生物学的に最も重要 である。

前者のヘモグロビン徨は、赤血球を１０ミリモルのジチオン酸ナトリワムを含有 するキャリヤによって生理食塩水中で処理して誘発させることができ、また後者 は赤血球を２０ミリモルの亜５ｇ喫ナトリウムで同様に処理して誘発することか できる。たとえばエム・ティー・グラハム、ジャーナル・アプライド・フィジッ クス、第５２＋３を巻、第２５７８−８０頁、（１９８１）参照。

これらの方法は赤血球の有利な分融を可能にするが、比較的強力な卵生Ｗ　手Ｂ ’Ｊ　’４品を必要とし、これらの薬品は縄■ηをたとえば涙液中における白血 球または保持赤血球が代謝的に正常であることを必要とするような成る種の用途 に使用する際悪影響を与える。さらに、分離自体は、永久磁石、半導性ソレノイ ド又は実験室電磁石を含む大型かつ高価な磁気回路と共に使用して必要な高勾配 磁場（ＨＧＭ）を生成させることにこれらのヘモグロビン変換技術を限定するよ うな磁気強度と勾配との積を必要とする。さらに、常磁性細胞を除去するのに使 用するフィルタの充填は慎重に制御せねばならず、或いは赤白球だ作用する磁力 の弱さのためその磁化マトリックスの相互作用雌門内に入ることなく細胞がフィ ルタを通過せねばならない。最後に、低いキャリヤ流速を使用せねばならず、或 いは粘性流動力が弱い磁力に打勝って、細胞をフィルタに通過させねばならない 。実際上、キャリヤの流速は充分低いレベルに保たねばならず、したがってこれ ら試料はたとえば自動化細胞計数器による効率的分析に対し迅速に処理すること ができない。

引用文献における第１図は、１０ミリモルのジチオン酸埴若しくは２０ミリモル の亜硝酸塩を含有するキャリヤに懸濁された赤白球に関し一気分離効率の磁場依 存性を示し７て℃・る。１．０テスラの＆ｋｊｊ％強さおよびｔＯｍｌ：７分の キャリヤ流速において、約７０％の細胞分離を達成するには１分間より長い涙過 時間が必要とされた。近代装置につぎ使用するには、この分離効率は低過ぎ、か っ濾過時間は長過ぎる。８５％を越える分離動車が２ｏテスラの磁場強さにおい て得られるが、試料毎に著しく変動する。さらに、０８テスラを趣える磁場強さ は、実用的実験用途としての充分小肩のフィルタ装置においては極めて達成困難 である。キャリヤ流速を増大させて濾過時間を短縮しようとすれば、磁気分離効 厘はさらに低下し、或いはずっと強い磁場を使用せねばならない。したがって、 細胞内ヘモグロビンを常磁性種に変化させうるキャリヤの使用によって常磁性を 赤血球に誘発させる場合、基本的技術問題は永久磁石若しくは小型電磁石から得 られる磁場強さによって達成しうる分離レベルな徒Ｊ約する。

他の血液形成体である血小板は、上記の２つのメカニズムのいずれによっても磁 気分離しえないことが知られている。その他の＠胞型のうち、末梢血液中に一般 に見られない成る種の細胞は、細胞懸濁物へ磁性粒子乞添加しかつこれを培養し て細胞混合物から分離するために便にする上記したような特徴の粒子を捕食する ことが知られている。上皮細胞を含む他の哺乳動物細胞は、如何なるメカニズム によっても磁気分離し得ないことが示されている。細菌独胞は、これらを磁性粒 子を含有する凝集剤に入れて公知の磁気濾過法を応用することにより凝果吻簑を 分離して、磁気分、侮しうろことが仰られている。

ウェストコント等に係る米国特許第４，０４７．８１４号、？、’Ｅ、　４．１ ８　Ｚｌ　７０　号及びジャーナル・バイオケミ刀ル・アンド・バイオフィシ刀 ル・メソッド、早２巻、第１１〜１８貞、（１ソ８０）は、興味ある一２１質を バンクグランド物質から磁気分離するため２つの方法を記載している。

１つの方法において、「本質的に非磁性であり、かつしたがってそれ目体では磁 場に対し充分に反応せず、バックグランド物質から分離しえない」物質（細菌を 含む）を、磁性元素の塩を含有する磁化溶液と組合せる。磁性元素の原子は非磁 性材料の分子における可使部位に結合して、その物質中に磁気感受性を発生する といわれる。

複合試料を＠場に通すと、この物質はこれを分析しかつ回収しうる領域まで趣ば れる。この方法は、特に磁性原子の有用な塩として塩化第二鉄、塩化マンガン、 塩化エルビウム、塩化ジスボロシウム、塩化テレビラム及び塩化ホルミウムを使 用する。

第２の方法において、低い陽性若しくは陰性の磁気感受性を潰しかつ磁性素子と 容易に（又は全く）結合を形成しないたとえば澱粉の賜金のような物質を、磁場 の吸引力にかけられた際吸引力の差を生ずるような磁性塩溶液に懸濁して分離す る。この液体自身は陽性の磁気感受性を有して磁場に吸引され、圧力（若しくは 密度）勾配を発生し、かつ粒子を磁力から引き離す、この揚台、磁力に液体を・ 狭小しかつ分遣すべき昇磁性若しくは弱毎牲枚子は迅礪力・ら離脱される。粒子 に作用する正味の力は、流体と粒子との感受性の差に比例する。この方法には、 塩化鷹二沃と塩化マンガンのみが１男用される。

上記方法のいずれも動物訓胞の分離には有用でなく、また赤血球の分離にも有用 でないといわれる。事実、たとえばウェストコツト等により開示された塩を水中 に溶解して生成されるような二価若しくは三価のイオンは架橋メカニズムによっ て細胞を炭画させることが周知されているので、単離された細胞がこの方法によ り分離されつるとは思われない。さらに、ウェストコント等により教示されたよ うな塩は、水中に溶解した場合、１ｆｆｌＬａの完全性には不適当な低い溶液ｐ Ｈを与える傾向がある。さらに、幾つかの塩、特にランタニド金属の塩は水に対 する低い溶解度を有し、生理学的ｐＨの溶液中で沈澱し、或いは多くの一般的緩 衝剤を用し・て溶＃ｐＨをそのようなレベルまで復帰させる。

ランタニドイオンは、膜における移動過程を特徴とする研究、すなわち高親和性 結合を示す用途において、カルシウム同族体として広く使用されている。螢光又 は核磁気共鳴グローブとして使用するためのランタニドの結合も知られている。

カルシウム同族体及び膜グローブの研究は、完全細胞についてではすく細胞から 誘導された膜について行なわれてきた。その結果、この従来技術においては細胞 完全性に関係がなく、また必然的に悪影譬のある膜間の架橋にも関係がない。し かしなから、生物学的＠胞に対する日録分離法の応用においては、細胞１完全性 の維持と細胞涙量の不存在とが重要である。

ウェストコツト等により教示されたものを含む常磁性のキャリヤ液が、少なくと も２０年間にわたり無機反磁性及び弱常磁性物質の分離に対する磁気調整密度媒 体として考えられてきた。極く最近、鉱物質及び非鉄金属粒子並びに酸化物を分 離するためのＨＧＭ系におけるこの種のキャリヤの使用が検討されてきた。ラン タニドは、常硅・性モーメントを有するため、たとえばウェストコツト等の第２ 方法に記載されたような磁気重力系として考えられており、塩化マンガンがＨＧ Ｍ分離法に使用されてきた。これらの努力は、キャリヤ液よりも常磁性の低い、 すなわち、比較的反磁性である粒子に依存する。

発明の要点 今回、常磁性金属イオンのキレートは除帯電表面、特にたとえば細胞表面のよう な生物学的表面を有する粒子に吸引されて、これら粒子にキャリヤ液の磁気感受 性よりも相当太き（・磁気感受性を付与することが見出された。

さらに詳細には、キレート化常磁性イオンのこの種の粒子懸濁物への添加は、粒 子とバックグランド液との磁気感受性の間の差を従来技術に比較して顕著に増大 させることが見出された。したがって、比較的弱い磁場を用いて又は比較的窩い 流速にて有効な磁気分離が可能である。

この種の系におけるキレート化剤の使用は、多種類の常磁性イオンからの退択を 可能にし、常磁性金属イオンの有効な溶解度を高め、かつ溶液ｐＨに対する分離 工程の感受性を低下させることができる。最も重要なことに、恐らくキレート化 常磁性金属イオンの使用は、血液試料における細胞（又は他の＠物細胞）が多価 金属イオンに露呈された場合に１凝固する傾向を完全に除去しうろことである。

したがって、広義において、本発明の方法は、陰表面電荷を有する粒子のキャリ ヤ液からの分離を可能にし、この方法は粒子をキレート化常磁性金属イオンと接 触させてこれらの粒子に関しキャリヤ液の磁気感受性よりも大きい磁気感受性を 発生させ、次いでこれら粒子とキャリヤ液とに磁場をかけて粒子の一部を液から 分離する工程からなっている。

好適具体例においては、たとえばジヌボロジウム、エルビウム、ホルミウム、テ ルビウム、ツリウム、ガドリニウム、鉄、コバルト、マンガン若しくはその混合 物のような常磁性イオンを、たとえばエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ） のようなポリアミノポリカルボン酸キレート化剤でキレート化させる。他の有用 なキレート化剤はジエチレトリアミンーペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、トリエチレン −テトラアミンヘキサ酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチレンジアミンヘキ サαｐ　酸（ＨＥ　Ｄ　ＨＡ）、エチレングリコールビス（β−アミノエチルエ ーテル）　−Ｎ、Ｎ’−テトラ酢嘔（ＥＧＴＡ）、１．４．７−トリアザシクロ ノナンーへ、Ｎ１ハ１１−トリ酢酸（Ｎ０ＴＡ　）、１、４．７．１’　０−テ トラアザシクロドテカンーＮ、Ｎ、’、Ｎ”、Ｎ”’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ　 ）及ｖ　Ｎ＋−ヒドロキシエチレンジアミン−へ、へ、Ｎ’−）り酢酸（ＨＥ　 Ｄ　Ｔ　Ａ　）を包含する。

現在好適な常磁性金属イオンは鶴磁性ランクニドであり、特に好ましくはエルビ ウム及びジスボロジウムである。

現在好適なキレート化剤はＥＤＴＡである。ランタニドは稀土類金属の種類に属 し、高価である。ランクニドのキレート化合物を形成することにより、所定レベ ルの結合をうるのに必要とされる稀土類金属の舌が減少し、したがってこの方法 がより経費的に有利となる。

分離を行なう１方法は、懸濁粒子と吸着金属キレート化物とを有するキャリヤ液 を磁場内に配置されたマトリックス（たとえば磁鉄材料のフィルタ部材）に通し て、これら粒子の実質的部分をマトリックス内に保持することである。次いで、 粒子は、マトリックスをキレート化剤を含まない溶液、異なるキレート化剤を含 有する浴液、最初に用いた製産とは異なるＱ度にて同じキレート化剤を有する溶 液、又は粒子と関連する常磁性金属イオンと競合し或いはこれを除去させる、た とえば金属イオン若しくは成る種の染料のような物質を含有する溶液によって洗 浄することにより回収することができる。

本発明を実施する他の方法は、懸濁粒子及びキャリヤ液を含む液体カラムを１つ 若しくはそれ以上の磁場に又は同じ磁場に反復して通し、粒子の速度をキャリヤ 液の速度よりも掛売して変化させろことである。本発明のこの具体例を実施する １方法とおいて、粒子及びキャリヤ液を典型的には２０〜５００μｍの紳１囲の 内径を有する導管中に９制通過させて、粒子の流れを磁場、２！数の磁場に指向 させ、又は反復して同じ磁場に通す。これにょリ、クロマトグラフ状の工程が得 られ、常磁性金属キレート化物に対する親和性に関し実質的に均質である粒子の 多い複数のフラクションが得られる。

したがって、本発明の方法は、粒子の表面に対する常磁性金属キレート化物の濃 度に基づき、キャリヤ液に比較して正味の常磁性を発生する分離すべき粒子に依 存する。この正味の常磁性は、ＨＧ　Ｍ　Ｉ濾過法又は関連する磁気分離法を用 いて粒子の分離を可能にするが、そＱ大きさがチャリヤ液（（おける常磁性今風 キレート化物の濃度の関数であるため、有利な亦離は現存する分離性と比較ｌ− て高−・ギヤリヤ流速にて達成され、したがってより短いＥ適時間或いはより低 −・磁賜強さにて達成することができる。特に磁場源として永久磁石を組込んだ 小型ＨＧＭ７ｐ過系を本発明の方法で使用することができる。例として１インチ ×１インチかつ厚さμインチのサマリウム−コバルト磁石をフェライトフィルタ マトリックスと一緒に使用して、１立方インチ未満の高勾配磁気沖過系から３５ ミリモルのジスボロジウムキレート化物につき９７先の分離効率を得た。

この方法は、従来達成しえなかったような反後再現性と効蘂とをもって、全血か ら細胞を磁気分離することを可能にする。この曖秀な磁気分離効率ば、現存する 方法で可能であるよりも低い磁場にて実用的分離を可能にし、かつこの！ｒ　親 方法は細胞の光合性を肉眼的に変化させない。不妃明を使用して、宮磁性亦血球 ヘモグロビンにつき得られるよりも相当大きい磁気分離効率が１回の通過で可能 であり、たとえば［］３テスラかつｏ、７５ｒｒｔ／分の流速にて９０％対３７ ％である。この方法は長時間の細胞培養を必要とセず、かつ技術的に複雑でない 。さらに、未結合若しくは脱離したキレート化常磁性金属イオンに基づく細胞計 数の阻吾がない。フィルタ中へのマトリックスの充填は、結合した常磁性金属キ レートを有する細胞とマトリックス材料との間の強力な相互作用に基づ〈従来の 分離法におけるよりも重要住がすっと低し・ことが不発明の方法によれば、懸濁 物の場合に正味の陰表面電荷を有する生物学的細胞又はその他の小粒子がそのキ ャリヤ液から磁気分離される。血液試料の場合、この試料はたとえば等張食塩水 で希釈することができ、かつ常磁性金属イオンキレート化物のＭ液をこの希釈細 胞懸濁物へ加えることができる。或いは、キレート化物を予備希釈した試料中で その場で生成させるか、或いは試料をキレート化常磁性金属イ万ンの既知温度を 有する予備生成弓液にて単一工程で希釈することもできる。常磁性金属イオンキ レート化物は直ちに細胞又はその他の陰帯屯控子と結合して、粒子内にキャリヤ 液の磁気Ｉ感受性よりも大きい磁気感受性を発生する。この懸濁物に磁場をかげ ると、この−場により粒子が優先的に作用を受け、この現象を用いて有効に磁気 分板を行なうことができる。

この分離は、好ましくはフェライト物質を含むフィルタを用いて、或いは１つ若 しくはそれ以上の磁場に１回若しくはそれ以上通過させる液体カラムとして懸濁 物を形成することにより行なうことができる。分離しうる粒子の例は血液形成体 、上皮細胞（単離されていても或いは個々の細胞のクラスタでもよい）並びに殆 んど全ての他の動物及び細菌細胞及びウィルス粒子を包含する。他の小粒子の例 は、たとえば細胞器官若しくは組織断片のような有機物質及びたとえば砂、酸化 鉄の沈降物などの無＠、物質を包含する。

ＥＤＴＡキレート化エルビウム（塩化物）を用いたヒト血球の沖過に関する実、 験データを第１表に示す。エルビウム及びジスポロジウムのキレート化物の両者 を使用した。

静脈血試料を、志願者から、１ｏ、ｓｍ９の二ナトリウムＥＤＴＡを含有する減 圧チューブ（６４５１バキュテナー：ベクトンージキンソン社）中へ抜取った。

これら試料を、抜取り当日に常態につき証明しくクールターカラｙ　ターＳ　− ７’ラス型；クールター・エレクトロエックス・インコーポレーション社）、そ の後に使用した。ポリスチレンフラスコ中で手により１：１０１の希釈な行ない 、ヘラ相に振とうして均質前５胞徹濁吻を得た。

千ヤリャ液からの５！１ｊ胞の分離性は、高勾配砥気分姐（ＨＧＭＳ）系を用い て頂宣した。フィルタは長す１３ゴ２つ断面軸１１８ｗｎ２　のＤｆｉプラスチ ックチャンバであって、ステンレス鋼ワイヤを充填した。充填はランダムに行な ったが、主成分を流れ方向に対し平行にした。

フィルタを１０ｃＴＬ電磁石（Ｖ−４００５、供給電圧Ｖ２９０１　；パリアン ・アソシエーツ社）上の５０１％　片の間に装着し、ホール効果ガウス計（６１ ５、ＨＴＢｌ−０（５０８プローブを有する；エフ・ダブりニー・ベル・インコ ーホレーテッド社）により測定して２テスラ（Ｔ）までの磁場にかけた。フィル タ中を上昇する懸濁物の流れを可変速注射ポンプにより制御し、このポンプには 細胞懸濁物を含有する３−の注射器を装着した。

特記しない限り、マトリックスを清浄しかつ空気回路を清浄するには、フィルタ を手動操作で各分離測定を行なう前に１５ｍｒの実験キャリヤ溶液で洗浄した。

電磁石がまだ減勢されている間に、回路へ対応の細胞ｍＡ液を迅速に満たし、そ して注射ポンプを付勢した。ｔ２ｄの細胞懸濁液が選択流速にて供給された後、 １ｍ１（ＡＩ）のフィルタ流出アリコートを回収して、根株的濾過レベルを訂具 するのに使用した。フィルタの逆流を防止しなから、ポンプ注射器に丹充填し、 ・β石ケ所足磁堝強さに付勢し、そして供絶及び回収（アリコートＡ２）よりｋ 反復した。この順序を、流速及び磁揚鍾さの谷透択組合せにつき反復した。２． 恥の対照アリコート（Ａ３）を、フィルタ及び注射ポンプに充填するのに使用し た貯槽から、′８患濁液につき採椴した。アリコートをＡ　Ｊ１／−１数及び容 積につき分析し、数示−テーク（ＡＩ、Ａ２、Ａ３）を１史用して次のようにフ ィルタ特性を計算した（％にっき１００をかげる）： 機械的濾過、Ｆ＝（Ａ３−ＡＩ）／Ａ３磁気濾過、Ｍ＝（ＡＩ−Ａ２）／Ａ３ 磁気効率、Ｅ二（ＡＩ−Ａ２）／Ａ１＝Ｍ／（１−Ｆ）全瀘過、Ｔ＝（Ａ５−Ａ ２）／Ａ３’＝Ｍ＋ＦｇＩ表には、エルビウムキレートを含む示した濃度の操作 溶液で１：１０１に希釈した全血につきｏ、７−５ｒｔｕｔ７分における濾過デ ータを示す。マトリックス材料は直径３５μのアニールされてない３１６Ｌオー ステナイトステンレス針金とし、これをフィルタ容積の１１．４Ｘまでランダム に充填した。第１表はキャリヤ溶液におけるＥｒ（ＥＤＴＡ）−の濃度にしたが う実験濾過データを要約し、かつ比較目的でキレ−１化ランタニドの置換物とし て１０ミリモルの最終濃度のジチオン酸す）　ＩＪウムをも包含する。この浴液 の浸透圧は、塩化す）　ＩＪウムの添加により４０ミリモル塩化エルビウムの浸 透圧に調整した。

第２の実験に８いては、徊酸塩で緩衝した等張食塩水における１０ミリモルジチ オン酸ナトリウムを使用した。両者の場合、脱酸素化を分光光度法で確認した。

各磁場強さに対するデータを、全て０．７５　ｍＡ　７分の一足流速にて高キレ ート―度につき示す。示した濃度のランタニドキレートのそれぞれに使用したキ ャリヤ溶液は、例１に記載したように調製した。

第１表 （Ｅｒ３”）　磁場（Ｔ）　Ｅ（％）　Ｍ（％）　Ｆ（％）　Ｔ（Ｘ）１ミリモ ル　２．０３　３ｔ６２４６２２．２　’　４６．８５ミリモル　２．０３　Ｂ ３．２　−−−　−−−　−−−１０ミリモル　２．０３　９６．６　９０．８ 　６，０　９６．８１００　８５．２　−−−　−一−−−−２０ミリモル　１ ．００　９４．２−−一−−−−−−４０ミリモル　１．００　９４．８　９３ ．１　１７　９４．３０．４８　９２．４　８　＆８　６．０　９２ＢＯ，２８ ７１，７６７，４６，０７３，４５０ミリモル　ｔｏｎ　９８．７　９２．９　 ５．９　９８．８０．４８　９１．１　８５．７　５．９　９ｔ５５０ミリモル ”　１．００　９８．４　９４．１　４．３　９８．４Ｇ、４８　９２．２　８ ８．２　４３　９２．５１０ミリモル”　１．００　７６．９　６Ｂ、４　１　 ｔｏ　７９．４０．３０　１３．０　１１６１　ｔｏ　２２．６１塩化エルビウ ム及びＥＤＴＡの代りに使用したジチオン酸ナトリウム。

同一のＨＧ　Ｍ条件において、１０ミリモルのエルビウムキレートは、−″ｌＦ 胸ヘモグロビンの完全な脱酸素化を与えることが知られたンａ　Ｗより充分萬い 濃度である等モルのジチオン酸塩に対する分備よりも高い分能を与えた。

このデータは、半値性血球が常磁性キャリヤ浴液に比べて可益な常磁性コントラ ストを示し、５　ｍ　Ｍ　廓、囲にてＥｒ　（ＥＤＴＡ　）−濃度を含有する全 血懸濁液から細胞を２テスラにて実際に分離したことを示している。゛かくして 、ＥＤＴＡによりキレート化して一般にＬｎ（ＥＤＴＡ）−を形成したキレート 化ランタニド、エルビウム若しくはジスボロジウムのセンチモル濃度を含有する キャリヤにおいて、全面からの細胞の分離が比較的低い磁場において可能であっ た。

３１６Ｌステンレスマトリツクスを使用して、４０ミリモルＬｎ　（ＥＤＴＡ　 ）−又は１０ミリモルジチ芽ンやナトリウムに懸濁した血球につき、２．２５及 び３．　Ｏｍｌ　／　ｍｉｎにおける比較流速データを含めｏ、　７５　ｍｌ　 ／　ｍｉｎの流速における分離効率の磁場依存性に冒するデータを得た。その他 のデータは、直径５０μの針金の４３０ステンレスメツシユ織物でフィルタの１ ５５％充填したものについて得た。

表のデータは、この技術の重要な利点を示している。

細胞ｔ！ａ気コントラストは制限濃度としたが、操作範囲はヘモグロビン変換メ カニズムについてと同様に固有の細胞成分の４度ではなく、外来キレートを結合 する細％９面における部位の鋲度である。したかつて、現在使用しうる効率より 商い磁気分、に勤皇が、生理浸辺圧を与えるキレート化常磁性金属礎すで容易に 得られる。さらに、細［ぼＩ以外の粒子の場合、或いは高浸透圧の細胞シフエラ が認められれば、３５ミリモル以上の金属キレート化濃度を使用して、変換メカ ニズムでは容易に得られないよう１．１：１回通過での分離効率を実現すること かでき、かつ第１図に示したように著しく低い磁場の使用を可能にする。さらに 、より高い流速も使用することができる。

ｔＯテスラにおける流速依存性の検討（第１図参照）は、４０ミリモルＥｒ（Ｅ ＤＴＡ）−の多度につきそれぞれ０．７５．１．５．２．２５及び３．０　；ｙ ｅ　／　ｍｉｎ　ノ流速にてｑ　４．８　Ｘ　ｓ９４．６％、８３．５％及び７ １３％の分離を示した。

４０ミリモルのエルビウム及びジスホロシウムキレート溶液における赤血球゛佇 濁物は、それぞれ２９．５　Ｘ　１０−６ＭＫＳｕ及び３４５　Ｘ　１０　’　 ＭＫＳｕの比細飽磁気感受性（磁気コントラスト）を示した。これらの数値は、 それぞれ５．１７　Ｘ　１０−６ＭＫＳｕ　（デオキシヘモグロビンにつき）及 び２．８１　Ｘ　１０−６ＭＫＳｕ　（メテモグロピンにつき）の対応コントラ ストを与えるヘモグロビン変換メカニズムで得られる比常磁性よりも約５〜７倍 太きい。

さらに、分離効率で観稿される一致性についても第工表に示す。この場合、５０ ミリモルのエルビウムキレート濃度につぎ２つの試験を比較する。これらは、同 じバッチのキャリヤ溶液を用いるが、異なる供与体からの血液を用いて連続した 日について行なった。同様に４０ミリモル、１．０テスラの流速依存性かつ濃度 依存性試験において、異なる供与体につき異なる日に行なったが、９４．８％の 同一の効翠が得られた。イオン一度と１戯場ゴさとの一足積、たとえば２０テス ラにおける５ミリモル及びｔＯテスラにおける１０ミリモル、或いＱ工２ｏテス ラに忘げる１０ミリモル、ｔＯテスラにおける２０ミリモル及び０，４８テスラ における４０ミリモルにおいて分離効率の飽和以下の一致性も特記される。分離 効率は、ジチオン酸ナトリウム脱酸素化又は特に亜硝酸酸化（引例の第２図）に つき従来報告されたものよりもずつと反磁性かあった。さらに、金属キレート溶 液はジチオン酸ナトリウム溶液よりも安定であった。

細胞ヘモグロビンは、分離工程の全体を通じて酸素化された状態（したがって括 抗的な反磁性状態）に留まった。細胞溶解は検出されなかった。細胞形態学は肉 眼的に変化せず（可逆的浸透圧効果を越えた変化）、重金属の存在による細胞凝 固は生じなかった。Ｎ胞は、等張食塩水（金属キレート化物を含有しない０．９ 重量ＸＮａＣＩ）で洗浄することにより、マトリックスから容易に除去された。

分離した細胞は主として赤血球であり、天然に生ずるよりも１０００倍優秀であ り、さらに他の血液形成体も常磁性キレート化物を結合して保持された。特に、 軟膜濃厚物における白血球の磁気効率は全血に対するものに匹敵し、血漿板は約 ２７％の効率で血漿板リッチな血漿から分離することができた。

洗浄用塩水が常磁性金属キレート化物のキャリヤ濃度５０％を有する場合、保持 細胞の６２％が除去された。

ギヤリヤ金属キレートａ度２５％を洗浄用塩水に使用した場合、保持細腕の９０ ５Ｃが除去された。これは、保持細胞の分別の是が結合親和性に基づくことを示 している。

４３０裡のフェライトマトリックス忙つき３１６Ｌマトリックスで見られたパタ ーンが得られ、ただしエルビウムキレートに好適な差が、より容易に磁気化され た４５０合金により強調された。エルビウムキレートの場合、９０％を越える分 離が０．３テスラの磁場で達成され、この磁場においてジチオン酸ナトリウムに ついては僅か３７％の分離が示された。同一の流速にて、ジチオン酸ナトリウム は９０Ｘの効冨をうるには０７テスラの磁場を必要とした。エルビウムキレート につきｔＯテスラの場合、１回の通過で９９％以上の磁気効率が０．７５ｍ１／ ｍ　ｉ　ｎの流速にて得られた。このような効率における反τυ性のある分、＠ は、ジチオン酸ナトリウムでは実現されない。

Ｄｙ（ＥＤＴＡ）−は常に、Ｅｒ（ＥＤＴＡ）−より約５％太きい、すなわち飽 和レベルより低い８気分離効率を与えた。

両キレート化常磁性金属イオンによる分離メカニズムは、明らかに公知の磁気分 離技術よりも優れている。

たとえばＥＤＴＡのようなポリアミノポリカルボン暇キレートが、金属イオンに 対する強力なキレート化剤であって、安定なキレートＩＪングを形成する。通ず るｐＨにおいて、成るものはアルカリ土類金属、ランタニド及び主として非イオ ン型における他の金属イオンを！合するが、キレ−）　ＩＪソングおける金属イ オンの位置に基づき一価の＠牡をある程度有するものと結合する。したがって、 この種のキレート化物は酋楓イオンの二１曲若しくば三価の性質を眞少さセ、ぼ たは効果的に除去することができ、かつ細胞膜の間のイオン結合に対する傾口を 除去して細胞凝固が起こらないようにする。さらに、金属キレート化物の溶解度 は生理学的ｐＨにおいて遊離イオンの溶解度よりも大きく、したがって、より大 きい有効な常磁性金属イオン濃度が溶液中に推持される。キレート溶液は％　ｌ Ｉｉの緩衝液の存在下で安定であり、辱液ｐＨを生理学上許容しうる範囲となし かつその範囲に維持することができる。

以下の非限定的実施例により、本発明をさらに説明する。

実施例１ 塩化エルビウムを、ＥＤＴＡとのキレート化により水中に溶解させた。それぞれ ２ミリモル、５ミリモル、１０ミリモル、２０ミリモル、４０ミリモル及び５０ ミリモルの＠度にて塩化エルビウムを含有しかつ塩化エルビウムに対しｔｌ：１ ０モル比にてＥ　Ｄ　Ｔ　Ａを含有するキャリヤ溶液１００筋を次のように論製 して、第１衣に示したテークをうる際に使用した。

脱イオン刀（を使用して６棹の保Ｗ−Ｍ液を作成した＝１２２０ミリモルの二ナ トリウムＥＤＴＡ　（Ｓ　−３１１；フィッシャ・サイエンティフィック・カン ノくニー社）。

２２００ミリモルｐＩＰｇｓ、すなわち１，４−ヒ°ペラジン−ビス（エタンス ル不ンＵ　）　、Ｍ刷ｇ、（Ｐ６７５７；シグマ・ケミカル・カンノくニー社） 、水４．２化ナトリウムによりｐＨ７１に調整して緩衝液として使用する。

五　３モル塩化ナトリウム（Ｓ−２７０；フィッシャ・サイエンティフィック・ カンノくニー社）。

それぞれ第１表に示したモル良度につぎ１００ｗＬｌのキャリヤ溶液を作成し、 その際デシケータから所要量の固体塩化エルビウムろ水和物（２０，３２１、− １；アルドリッチ・ケミカル・カンノくニー社）を取出しかつＥＤＴＡ対塩化二 塩化エルビウム　１　：　１のモル比を与えるのに必要な前記２種の保存溶液を それぞれ加えた。次〜・で、脱イオン水により容積を７５蛯にし、そしてこの材 料をプラスチック容器中で混合した。溶＃ｐＨを水酸化ナトリワム溶液の添加に よりＺＯ〜Ｚ１に調整した。次（・で、浸透圧を約３００±１０　ｍｏｓ　／　 Ｌの生理学レベルに調整し、脱イオン水で１０　ｏ、ｍｇの容積に完成した。各 実験の２時間以内に保存１週間以閂の保存溶液からキャリヤ浴７夜を作ｉ曳した 。

実施例２ 塩化エルビウムの代りに均等量の塩化ジスボロジウムを用いて上記の手ｊ、具を 反復した。

上記実画１多・Ｉのそれぞれにおいて、均等量の他の常磁性金輿、特にランタニ ド、たとえばテルビウム、７］χルミクム、ソリツム及びガドリニウムの塩化物 又はその他の塩を塩化エルビウムの代りに使用した。何重なら、これらの塩は高 いター３性を有するからである。

実施例４ ８．０ｇのＭｎＣ］□・４　Ｈ２Ｏを実施例１に示したようにＥＤＴＡでキレー ト化させ、そしてキレート化マンガンのｉ％　Ｉｔが４０ミリモルとなるように 希釈全血試料に添加した。この試料を４３０ステンレス針金のマトリックスを含 有する上記種類のフィルタ部材に０．７５部ｍｉ　／　ｍｉｎの流速にて上方へ 通すと、次の磁場強ざにて次の分離効率がｏ、ｓＴ　８９．８％ これらの細胞は、キャリヤ溶液の同一浸透圧にも拘わらす、ランタニドキレート 化物では見られない異常な形態の徴候を示した。この実施例は、ランタニド以外 の常磁性イオンを本方法に使用しうることを示している。

細胞とバックグランド液との間の磁気巻受注コントラストの発生は、常磁性金属 イオンキレートと粒子表面における陰電荷か位との相互作用を含むと思われ、こ の相互作用はキレートリングの近接雌面の双極性７１）ら生ずる一価の機能によ るものと思われる。キレートが粒子に結合されると、明らかにこの粒子が他の粒 子とさらに結合を形成する傾向を失なう。何故なら、キレートリングの比奴的拡 散性のへ帯電領域は結合部位からタト万に発回し粒子を排折するからである。キ レートリングの陰帯電域における拡散性は、さらに陰帯電部位に対するリングの 結合を好適にする。理由の如何を問わす、粒子が有機であっても無機であっても 、粒子の、疑固に対する傾向は認められない。

細胞、組織、組織から得られる細胞、その断片及び無機物質の粒子を包含する大 抵の生物学的物質は、水性懸濁物において陰表面電荷を有することが知られてい る。

したがって、常磁性金属キレートにより示される結合は、広節囲の物質に一般に 適用して磁気手段による分離を可能にするものである。さらに、多くの承田胞同 構造は陰性結合部位を有することが帰られている。成る種の細胞、■、或いは成 る種の無機粒子に関し、″ｌｖ＠性金属扼レートの結合は、キャリヤ液における その濃度及び化学環境に依存する。

ランタニドキレートは一般に細胞膜に浸透せず、高浸透圧衝撃により或いは透過 剤による細胞の処理により細胞処理技術で周知されているように細胞内部に捕捉 することρ・でざる。したがって、第２の分離メカニズムは、磁気濾過若しくは 分離の前に常磁性金属キレートを内部仕丁べく袖胞を咋ｖ：、１−ろ生物学χ田 胞につき可能である。

息子をキマリャから分離した後、これら粒子はフィルタを全くキレートを含有し ない塩水溶液で洗浄することにより容易にフィルタから除去することができる。

或℃・ば、さらに保持粒子をたとえはその結合液相性によって分別することが望 ましい場合、順次減少する量のキレート又は他の金属キレート化物を含有する一 連の溶液でフィルタを洗浄することにより、或いはたとえばキレート化剤に競合 する、たとえにカルシウムのような各種の電解質の溶液を用いてフィルタを洗浄 することにより行なうことができる。

これらの方法は、常磁性金男キレートを高浸透圧ショック若しくは浸透剤により 内部化させかつ細胞内構造に結合させるものと組合せることができる。浸透化技 術の選択により、キャリヤ液を成る種の細胞中に選択的に内部化させうろことが 知られており、かつこの研究におし・て保持細胞は外表面に結合された常磁性キ レートの結合親相・註により分別しうろことが示され℃いる。かくして、濾過前 のｊ−ｌｔｈ造列と洗浄イ）液との組合せを選択してキレートを吸収する保持細 胞を選択的に除去することにより、明確なフラクションを得ることができる。キ レートを茨面上にのみ結合するようなｆＦｄ　’ｊＢＪは、たとえばキレートを 含有しない洗浄溶液を使用すれば放出されるであろう。

或いは、洗浄溶液におけるキレートの濃度を上記したように１節することにより 分別することもできる。内部化キレートを含有する細：拍Ｊは、次（・でたとえ ば高速度洗浄のような周知の方ｒｔ用い℃除去することができる。

常磁性金属キレートは可耐性であり、それら目身は粒子でな（・ため、これら粒 子に結合する響憫はその後の処理によって容易に脱岨せず、未結合物質は珠付殺 子若しくは溶液を細艙若しくは粒子数につぎ分析するを合僅かの計数も与えない 。

叛血球の他、上皮細胞及び砂粒子も元号なランクニドキレートを結合することが 示されており、これは血球につき使用されると同じキャリヤ液シこ浸漬しかつ１ ．　Ｏテスラの磁場に露出したフェライト針金に吸引される。上反岬胞をキャリ ヤ液に懸濁させ、かつ混合物を血球につき使用したと同じフィルタに通すと、８ ３％以上の磁気分離が口腔上皮細胞につき得られ、また子宮頚管上皮細胞につい ては７８％以上であった。これら大型ａ胞はフィルタを閉基する傾向を有し、そ の結果は球の場合よりも変動が太きい。建築川砂からの倣細な沈降物を１，０テ スラの磁場において６２３σの磁気分離レベルにて分離することができ、これは 適切なフィルタ設計により改良しうると信じられる。これらの例は、結合メカニ ズムの一般性を示しかつこの新規方法により分にｌしうる種々の物質を示してい る。

さらに、本発明は、常磁性省腐キレート処理されたれ子苫陶子刀の数体カラムを １つ若しく（工それ以上の磁場に１回若しくはそれ以上）ｆ４　して実施するこ ともできる。その結果、液体からの息子の少なくとも１部の公比を行なうために 使用しうるキャリヤ液に幻しカラム甲の粒子の速呟力・変化する。この技術の現 ′ｆＥ好適な具俸例は、点ミ満物を内径２０〜５００μの如了しくにフェライト 物質を含み、或いはフェライト針百を収ｇした等管に通す。この導管を、磁場強 さを変化さぜうる１つ若しくはそれ以上のｉ％に又は同じ磁場（（反復して懸濁 液のカラムを相同させるように配置する。この技術を行なうことにより、キャリ ヤ液に対する導管中の粒子の速明を遠延させ、その結果液体そヤリャからの粒子 の１部を分離することができる。この技術は、さらに次の実施例から理解される 。

実施例５ 実施例１に示したような常磁性金属キレート化物で処理した希釈全血を、内径１ ２０μのガラス毛細管に重力およびダイヤフラムポンプを用いて数μｌ／分の流 速にて通した。この毛細管をループ状にして４つの実質的に同軸のコイルを形成 し、これらコイルを笑験室電磁石の極片の間で周囲の半分に巻付けた。導管に１ 囃す際、液体カラムは磁場勾配を８回通過した。この磁場は２０テスラに設定し た。フェライト物質・が毛細官に結付しない場合、１８％の分離効率が観察され た。５０μのステンレス針金を毛ＣＢ管の内部に存在させた場合、３１％の分配 効率が観察された。このよ５１Ｃして、本発明を実施する場合、磁場を周期的に 遮断するのが有利であろう。

他の具体例につき、以下の請求の範囲に記載する。

手続補正書（方式） ％式％ 補正をする者 事件との関係　特許出願人 〒１０３ 住　所　東京都中央区日本橋３丁目１３番１１号油脂工業会館同 住　所　同　ト 補正の対象 一小白　−バー　− 一咽剌書例胛捜古齢背ｍ肋（資）宥郊溌勢橢鴨隆Ｗ別■トズ−’、　１　．１ｆ ｉ −−□□−□□　→−・ 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の特許出願人℃欄明細書及び請求 の範囲の翻訳文　各１通委任状及び翻訳文　各１通 補正の内容　別紙の通り 明細書及び請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし）国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔ　陰表面電荷を有する粒子をキャリヤ液から分離するに際し、 Ａ、前記粒子をキレート化した常磁性金属イオンと接触させて、前記キャリヤ液 の磁気感受性よりも大きい前記粒子に関する磁気感受性を発生させ、かっＢ、前 記粒子及びキャリヤ液に磁場をかけて、前記粒子の一部を前記キャリヤ液から分 離する工程から成る分離方法。 ２　粒子が有機粒子からなる請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　粒子が細胞からなる請求の範囲第２項記載の方法。 ４、　常磁性金属イオンがランタニド金属イオンである請求の範１囲第１項記載 の方法。 ５　キレート化常磁性金属イオンなＥＤＴＡでキレート化する請求の範囲第１項 記載の方法。 ６、　キレート化常磁性金属イオンをポリアミンポリカルボン酸キレート化剤で キレート化する請求の範囲第１項記載の方法。 Ｚ　キレート化剤をＥ　ｌ）　Ｔ　Ａ　、　Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ　、　１”　Ｔ　Ｈ Ａ、Ｄ　ＴＡよりなる評から選択する請求の範囲第６項記載の方法。 ８　常磁性金属イオンをンスボロジヮム、エルビウム、ホルミワム、テルビウム 、ツリウム、ガドリニウム、鉄、マンガン、コバルト及びその混合物のイオンよ りなる群から選択する請求の範囲第１項記載の方法。 ９　常磁性金属イオンをジスポロジウム及びエルビウムのイオンよりなる群から 選択する請求の範囲第１項記載の方法。 １０、粒子及びキャリヤ液を磁場内に配置されたマトリックスに通して、前記粒 子の実質的部分を前記マトリックス内に保持することにより工程Ｂを行なう請求 の範囲第１項記載の方法。 １１　粒子が細胞からなり、細胞の１部をキレートを含有しない溶液、工程Ａか ら生ずるキレート溶液とは異なるキレートｓ度におけるキレートの溶液、キレー ト化部位につき常磁性金属イオンと競合する勧賞を含有する溶液及びその組合せ で洗浄することによりマトリックスから除去する工程をさらに含む請求の範囲第 １０項記載の方法。 １２　工程Ｂの前にキレート化常磁性金属イオンを細胞中へ移動させる請求の範 囲８３項記載の方法。 １３　細胞及びキャリヤ液を磁場内に配置されたマトリックスに通して、細胞の 実質市部分をマトリックス内に保持することにより工ＱＢを行なう請求の範囲第 １２項記秋の方法。 １４　キレートを含有しない溶液、工程Ａから生ずるキレート溶液とは異なるキ レート０度におけるキレートの浴液、キレートｄ１．１立につぎ冨砒性金属イオ ンと視会する物質を含有する溶液及びその組合せよりなる群から選択される物質 で洗浄することにより、細胞の１部をマトリックスから除去する工程をさらに含 む請求の範囲第１３項記載の方法。 １５　粒子とキャリヤ液とからなる液体カラムを磁場に通して優先的に粒子の速 度を変化させることにより工獅Ｂを行なう請求の範囲第１項記載の方法。 １６　カラムを複数の磁場に通す請求の範囲第１５項記載の方法。 ＩＺ　液体カラムを磁場中に指向させる導管に、前記カラムを通す請求や範囲第 １５項記載の方法。 １８　導管がフェライト材料からなる請求の範囲第１７項記載の方法。 １９　導管がフェライト針金を包囲する請求の範囲第１７項記載の方法。 ２０、導管が、液体カラムを磁場中に反復して指向させるような形状である請求 の範囲第１７項記載の方法。 ２ｔ　細胞外の水性液から細胞を分離するに際し、Ａ、細胞をキレート化常磁性 金属イオンと接触させて、前記細胞を凝固させることなしに前記細胞外液よりも 前記細胞の磁気感受性を増大させ、かつす、前記細胞及び細胞外液に磁′場をか けて、前記細胞の一部を前記細胞外液から分離する 工程から成る細胞の分離方法。 ２２　常磁性金属イオンがランタニド金属イオンである請求の範囲第２１項記載 の方法。 ２＆キレート化常磁性金属イオンをＥＤＴ、Ａでキレート化する請求の範囲第２ １項記載の方法。 ２４、工程Ａに使用するキレート化常磁性金属イオンを生理学上達するキレート でキレート化させ、かつ工程Ｂで分離される細胞が実質的に損傷されない請求の 範囲第２１項記載の方法。 ２５、常磁性金属イオンをジスボロジウム、エルビウム、ホルミウム、テルビウ ム、ツリウム、ガドリニウム、鉄、マンガン及びその混合物のイオンよりなる群 から選択する請求の範囲第２１項記載の方法。 ２６　常磁性金属イオンをジスボロジウム及びエルビウムよりなる群から選択す る請求の範囲第２１項記載の方法。 ２Ｚ　細胞及び細胞外液を磁場内に配置されたマ）　ＩＪソックス通して、前記 細胞の実質的部分を前記マトリックス内に保持することにより工程Ｂを行なう請 求の範囲第２１項記載の方法っ ２＆キレートを含有しない溶液、工程人から生ずるキレート溶液とは異なるキレ ート７Ｍ度のキレートａ液、キレート化部位につ門常磁性金属イオンと競合する 物質を含有する浴液及びその混合物よりなる評から選択される：＋１７．　質で 洗浄することにより、細胞の１部をマトリックスから除去する工程をさらに含む 請求の範囲第２１項記載の方法。 ２９　縄じυとキャリヤ液とからなる液体カラムを磁場に通して細胞の速度を′ 全光的に変化させることにより工程Ｂを行なう請求のｉ黄：同第２１項記載の方 法。 ３０　カラムを複数のご場に通す請求の範囲第２９項記位の方法。 ３ｔ　液体カラムをイ＝＝１堀中に指向させる導管に、前記カラムを通す請求の 範囲敏２９項記載の方法。 ３２　Δ管が、フェライト材料からなる請求の範囲第３１項記載の方法。 ３３等管がフェライト針金を包囲する請求の範囲第６１項記載の方法。 ３４　導管か、前記カラムを磁賜中（Ｃ反役して指向させるような形状である請 求の範囲車３１項記載の方法。 ｊ’３・−：：；（内５：こ褒更なし）