JPS59501535A - γ−グルタミルトランスフエラ−ゼの活量の定量法および該法用新規の基質溶液を含むキツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｒ−グルタミルトランスフェラーゼの活量の） 定量法および該法用新規の基質溶液を含むキ、　技術分野 ぽ　この発明はγ−グルタミルトランスフェラーゼの活ｒ　量の定量法並びに該 活量定量法に使用する新規基質溶液を含むキットに関する。

背景技術 １９５０年に・いンズら（Ｈａｎｅ８　ｅｔａｌ）　””）によって発見さ・ｎ たγ−グルタミルトランスフェラーゼ〔（ｒ−グルタミル）−ペプチド、アミノ 酸・γ−グルタミルド７ンスフｚラーゼ（Ｅｃ２．３．２．２）’）は、ｒ−グ ルタミル・ペプチドからアミノ酸または他のペプチドへのｒ−グルタミル基の転 移の触媒作用をする。

γ−グルタミルトランスフェラーゼは人間の器官に広く分布しているけれども、 血清におけるその活量の増加は肝坦管の病気或いは一次要素における肝関係の病 気の殆んど確定的な指標である。

ｒ−グルタミルトランスフェラーゼの活量を定量するために、現在はＬ−γ−グ ルタミルーｐ〜ニトロアニリド（８″が殆んど常に基質として使用されている。

それは、タンパク質の除去または開裂生成物のｐ−ニトロアナリンの化学処理を 行うことなく反応速度を直接測定することができるためである。最近、さらに可 溶リドの先行技術の溶液は、現在用いらしている水性環境では安定性および溶解 度の問題に苦しんでいる。例えば、貯蔵寿命の比較的短いＬ−γ−グルタミルー ５−カルボキシーｐ−ニトロアニリドおよびＬ−ｒ−グルタミル−ｐ−ニトロア ニリドの水溶液は、これら製品の貯蔵寿命を長くするために凍結乾燥をする必要 がある。その凍結乾燥品を戻すためには、水に入ｆ’＋、−得られた混合体を約 ５０℃まで加熱する必要がある。この戻し工程は２時間の浪費であって、得らｎ た試薬の変動並びに基質の減損を増すことになる。その上、凍にみらｎる溶解度 の問題を解決するように基質溶液がマトリックスに溶解した基質からなるところ のγ−グルタミルトランスフェラーゼ分析用の新規基質溶液を開発することは極 めて有利である。

発明の開示 本発明によって、ｒ−グルタミルトランスフェラーゼの分析用の安定化された新 規の基質溶液が提併される。さらに詳しくは１本発明は、　（ａ）　Ｌ　”　ｒ −グルタミル−ｐ−ニトロアニリド塩およびＬ−ｒ−グルタミル−５−カルボキ シ−ｐ−ニトロアニリド塩からなる群から選んだ基質；および（ｂｌ炭素原子２ 〜１０個と水酸基２〜１０個を有するアルキル・ポリオールおよび平均分子量が 約２００〜６００のポリエチレン・グリコールからなる群から選んだポリオール からｌる基質溶液を包含する。

さらに、本発明はγ−グルタミルトランスフェラーゼの活量を定量するキットを 包含する。本発明のキットは、（ａ）緩衝剤とγ−グルタミル残基受容体からな る緩衝化媒質と、（ｂ）基質溶液からなる種類のものである。

その緩衝化媒質および基質溶液は、その予め選んだアリコートがγ−グルタミル トランスフェラーゼの存在下で反応して吸収性の開裂生成物を生成できるように なっている。本発明のキットは前記の新規基質溶液が使用されていることを特徴 とする。

さらに、本発明はγ−グルタミルトランスフェラーゼの活量の定量法も包含する 。本発明の方法は、（ａｌ緩衝剤とγ−グルタミル残基受容体からなる緩衝化媒 質のアリコートと、基質溶液のアリコートと１分析せんとする試料のアリコート を所定の順序で接触させて、開裂生成物全生成させ、（ｂ）その開裂生成物の吸 光度を測定する形式のものである。本発明の方法は、前記の新規基質溶液が使用 されることを特命とする。

発明を実施するための最良の形態 本発明の新規基質溶液は基質とポリオールからなる。

Ｌ、　−ｒ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドおよびＬ−γ−グルタミルー５− カルボキシー４−ニトロアニリドの実質的に全ての塩が本発明における基質とし て使用することができる。その基質は、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリ ド・ヒドロノ＼ライド（ハロゲン化水素酸塩）およびＬ−γ−グルタミルーキン −４−ニトロアニリド・モノアンモニウムの塩類からなる群から選ぶことが望ま しい。その基質は，Ｌ−ｒ−グルタミル−ｐ−二トロアニリドの塩酸塩、臭化水 素酸塩，ヨウ化水素酸塩の塩類からなることがさらに望ましい。Ｌ−Ｔ−グルタ ミル−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩の塩がえり抜きの基質である。

本発明の基質溶液は基質１４当り約２５〜２５０ミリモルからなることができる 。重重しくに、本発明の組成体は基質１７！当り約１１Ｏ〜１００ミリモル、最 適には約５　０　ミＩＪモルからなる。

本発明の基質溶液に使用されるポリオールは一炭素原子２〜ｊＯ個とヒドロキシ 基２〜１０個全有するアルギル・ポリオールおよび平均分子量約２００〜６００ を有するポリエチレン・グリコールからなる群から選ぶ。望ましくは，そのポリ オールは、炭素原子２〜５個と水酸基２〜１１個を含むアルキル・ポリオールお よび平均分子量約２００〜ｌＩｏｏ’ｌ有するポリエチレングリコールからなる 群から選ぶ。さらに望ましくは、そのポリオールは、グリセロール、エチレン・ りＩＪコール、フロピレン・クリコール、１．５−７’ロパンジオール、ブチレ ン・グリコール、ペプタンジオール。

ポリエチレン・グリコール２００、およびポリエチレン・グリコールう００から なる群から選ぶ。エチンングリコール，フロピレン・クリコール、ポリエチレン グリコール２００，およびポリエチレン・クリコール５００は本発明の基質溶液 に使用するえり抜きのポリオールである。

本発明の基質溶液は無水系が望ましいが、１０％以下．望ましくは５％（■Δ） 以下の水含量は許容される。

従って，本発明の基質溶液は、任意にさらに２０％（■／′Ｖ）までの不活性の 吸湿性固体からなる。さらに望ましくは、本発明の基質溶液は，さらに５％（Ｖ ／Ｖ）までの不活性，吸湿性固体からなる。任意の不活性．吸湿性固体の作用は 本発明の基質浴液の望ましい無水の実施態様である。その吸湿性固体は不活性で 、有効な吸水剤、そして中性またはアルカリ性のｐＨてなければならない。その 固体は、約２〜１６メツシユの粒径をもった天然または合成の分子ふるいのよう な表面積の大きい吸水剤が望捷しい。表面積の量は、その物質が孔に水を吸収す る作用をするから重要である。

分子ふるいは．正確に均一な大きさの小開口（捷たけ小孔）によって相互に連結 された多数の小空洞が存在するように原子が結晶格子に配列されているゼオライ トである。通常、これらの空洞は水の分子を含むが、真空下で加熱するとこの水 は残りの結晶格子に何んの変化を与えることなく追い出さしる。小空洞および小 孔の網目構造は結晶全体積の５０％を占めることができる。分子ふるいは水およ び他の小分子量液体を再吸収する強い傾向を有する。

２、５０元然ゼロライトは限られた分子ふるいの特性？示す。合成ゼオライトは ．数種のサイズ（小孔の直径つ，鴎および１０に単位）のものが入手でき，高温 で使用したときでも吸収および再生能が高い。

一般に．本発明の基質溶液は，室温でポリオール。

望ましくは無水ポリオール中にてＬ−ｒ−グルタミル−ることによって作ること ができる。

その基質溶液ケ調製するもう１つの方法は，ポリオール（Ｉｔ：　Ｌ　−　ｒ− グルタミル−ｐ−ニトロアニリド遊離塩基ケ添加し２さらに・・ロゲン化水素酸 （水溶液中）ヶ添加して・・ロゲン化水素酸塩を生成する方法である。

無水の基質溶液が必要な場合ｌこば．この方法は分子ふるいを添加し，て添加７ Ｆ．　ｆｆ：除去する必要がある。

本発明の基質溶液を調製する望ましい方法は、室温で無水プロピレン・グリコー ルにＬ−ｒ−グルタミル−Ｄ−ニトロアニリド塩化水素酸塩ケ添加して絶えず混 合しながら所望の溶液を生成する必要がある。

本発明のキットの緩衝化媒質に使用できる緩衝剤は。

限定ではないが、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび所望のｐＨ、 望甘しくンま約８１±０２ＯｐＨを維持できて、γーグルタミルトランスフェラ ーゼの活量のリカバリーの妨げにならない他の緩衝剤を含む。重重しい緩衝剤は トリス（ヒドロキシ）アミノメタンである。

適当なγーグルタミル残基受容体は．限定ではないが、グリノルグリシンおよび Ｓ−メチル−Ｌ−システィンを含む。望ましいγーグルタミル残基受容体はグリ ノルグリシンである。

作用試薬は基質溶液のアリコートと緩衝化媒質のアリコートヲ混合することによ って調製することができる。望ましく　ｆｄ、作用試薬は緩衝化媒質約１０部に 基質溶液約１部を添加して．得らｆｌ−た溶液を混合することによって調製する 。

基質溶液と緩衝化媒質は，基質溶液のアリコートと。

緩衝化媒質のアリコート全約１゛５〜約１　５０の割合で混合した後．作用試薬 における基質のａ度か約１〜１０ミリモル／ｌとなるように混合する８安がある 。

試料と全体積の割合は変えることができるが、その割合は１：２１が極めて望ま しいことがわかった。

次の実施例は発明をさらに説明するたぬのものであって、開示した発明を限定す るものではない。

実施例１ 望ましいγ−グルタミルトランスフェラーゼ試薬キットは次の混合体を有する： 緩衝化媒質　望ましい値　さしで望まし１直　最適値グリンルグリノン（ミリモ ル）　１５０〜１１！０　１６０〜１７０　１６５アジ化ナトリウム（％）　０ ８〜Ｌ２　０９〜１．１１精製氷　所望の体積にするのに十分な量基質溶液 プロピレン・グリコール無水物　所望の体積にするのに十分な量実施例１の最適 γ−グルタミルトランスフェラーゼ試薬キットおよび市販のγ−グルタミルトラ ンスフェラーゼ試薬キットヲ使用した相関研究において１種々の対照試料および 患者血清試料を遠心分離迅速分析装置で分析した。得られた結果を第工表に示す 。

直線性対照　１　１７　１ｉｔ ｐ　１１　１２う　１２０ ｔｔ　５　２　ｕ　Ｏ２５８ １／　６　３５７　５５４ １／　７　１４１！５　ｕｇ。

ａ　Ｆ！　５９２　５　ｇ９ 患者の血清　１　９　８ 第Ｉ表に示したデータばＹ＝０．９９３Ｘ−０，５ＩＵ／ＬｆＺる相関と、相関 係数（ｒｌ　０．９９９　ｋ与える。従って、このデータは、本発明の範囲内の γ−グルタミルトランスフェラーゼ試薬を介して得られた結果が市販のキットで 得られたものと良く相関していることを示す。

本発明の範囲内で例１の「最適値」の欄に示した混合体を有する新しい試薬を使 用して多数の決定ＴＭ対照試料および直線性対照材料系列の割り当てを評価した 。これらの値の割り当てを第π表に示す。

その新しい試薬は５次に包装して、５℃で１年の貯蔵に近似させるために４１℃ で２日間装置した。

１１１℃で２日経た後１次にその試薬を２組に分けた。

そして１組は５０℃の装置温度で貯蔵し、１組は５７℃で貯蔵した。両方の組か らのアリコートを定期的に採ってｒ−グルタミルトランスフェラーゼの分析に使 用した。得られた結果も第π表に示す。

第■表に示すデータは本発明のγ−グルタミルトランスフェラーゼ試薬の高安定 性を示す。

この開示に基づいて、当業者には多くの他、っ変更および分岐が当然示唆される であろう。そｎらは本発明の範囲内に包含されるものである。

引用文献 ６、Ｍａｙｒ、Ｗｉｅｎ、Ｋ１１ｎ、Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ、、ｇ５＋ｇう−８ ７（１９７う）。

手　続　補　正　書（方式） ％式％ １　事件の表示 ２−　発明８輪０の名称、指定商品の区分子−グルタミルトランスフェラーゼの 活量の定量法および該法用新規の基質溶液を含むキット う、　補正する者 事件との関係　特許用、願人 明　測　書 ｒ−グルタミルトランスフェラーゼの活量の定量法および該法用新規の基質溶液 を含むキット 技術分野 この’Ｍ明はｒ−グルタミルトランスフエラ・−ゼノ活量の定量法運びに該活量 定量法に使用する新規基質溶液を含むキットに関する。

背景技術 （１，２） １９５０年にハーンズら（Ｈａｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ）　によって発見されたｒ− グルタミルトランスフェラーゼ〔（ｌ−グルタミル）−ペプチド：アミノ酸・７ −グルタミルトランスフェラーゼ（ＥＣ２、う、２．２）］は、］ｒ−グルタミ ンペプチドからアミノ酸または他のペプチドへのｒ−グルタミル基の転移の触媒 作用をする。

ｒ−グルタミルトランスフェラーゼは人間の器官に広く分布しているけれども、 血清におけるその活量の増加は肝坦管の病気或い、は−次要素における肝関係の 病気の殆んど確定的な指標である。

ｌ−グルタミルトランスフェラーゼの活量を定量するために、現在は丁−、−ｒ −グルタミル−Ｐ−ニドロア＝　ＩＪド（”）が殆んど常に基質として使用され ている。それは、タンパク質の除去または開裂生成物のｐ−ニド国際調査報告

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　（ａｌ　Ｌ−ｒ−グルタミル″′ｐ−ニトロアニリドおコ、びＬ−γ−グ ルタミルーう−カルボキシーｐ−二トロアニリドの塩類からなる群から選んだ基 質と；（ｂ）　２〜１０個の炭素原子と２〜ｌＯ個の水酸基に含むアルキル・ポ リオール、および約２００〜６００の平均分子量を有するポリエチレン・グ１ｊ コールカらなる群から選んだポリオールからなる基質溶液。 ２（ａ）　前記基質は、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド・・・ロゲン 化水素酸塩およびＬ−γ−グルタミノ啄・−５−カルボキシ−ｐ−ニトロアニリ ド・モノアンモニウム塩からなる群から選び；（ｂｌ　前記ポリオールは、２〜 ５個の炭素原子および２−１１個の水酸基を有するアルキルポリオール。 および約２００〜ＵＯＯの平均分子量を有するポリエチレン・グリコールからな る群から選ぶことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の基質溶液。 ５（ａ）　前記基質は、Ｌ−ｒ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド・ハロゲン化 水素酸塩、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド臭化水素酸塩、およびＬ− ｒ−グルタミル−ｐ゛−ニトロアニリド・ヨウ化水素酸塩からなる群から選び。 （ｂ）　前記ポリオールは、グリセロール、エチレン・グリコール、プロピレン ・グリコール＋　１１う一プロパンジオール、フチレン・グリコール、ベンタン ジオール、ポリエチレン・グリコール２００＋およびポリエチレン・グリコール うＯＯからなる群から選ぶことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の基質溶液 。 ヰ、（ａ）　前記基質は、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド・塩化水素 酸塩であり； （ｂｌ　前記ポリオールは、エチレン・グリコール。 プロピレン・クリコール、ポリエチレン・クリコール２００．およびポリエチレ ン・グリコール５００からなる群から選ぶことを特徴とする請求の範囲第１項に 記載の基質溶液。 ５、　約２５−２５０ミリモル／ｌ基質からなることを特徴とする請求の範囲第 １項、第２項、第５項、または第４項のいずれか１項に記載の基質溶液。 ６　約ＩＩＯ〜１００ミリモル／７！基質からなることを特徴とする請求の範囲 第１項、第２項、第う項、または第４項のいずれか１項に記載の基質溶液。 ７　約５０ミリモル／ｊ基質からなることを特徴とする請求の範囲第１項、第２ 項、第う項または第４項りいずｎか１項に記載の基質溶液。 ８　さらに、２０％Ｖ／Ｖまでの不活性、吸湿性固体からなることを特徴とする 請求の範囲第１項、第２項、第５項または第４項のいず牡か１項に記載の基質溶 液０ ９　さらに、５％Ｖ／Ｖまでの不活性、吸湿性・固体からなることを特徴とする 請求の範囲第１項、第２項。 第５項または第４項のいずれが１項に記載の基質溶液。 １０　約２５〜２５０ミリモル／ｌ基質からなシ、さらに２０％ｖ７ｖまでの不 活性、吸湿性固体からなることを特徴とする請求の範囲第１項、第２項、第５項 。 または第４項のいずれか１項に記載の基質溶液。 珪　約ｌＩＯ〜ｉｏｏミリモル／ノ基質からなり、さらに２０％Ｖ／Ｖまでの不 活性、吸湿性固体からなることを特徴とする請求の範囲第１項、第２項、第５項 。 または第４項のいずれが１項に記載の基質溶液。 ■２　約５０ミリモル／ｌ基質がらなり、さらに５％Ｖ／Ｖまでの不活性、吸湿 性固体からなることを特徴とする請求の範囲第１項５第２項、第う項、または第 ４項のいずれか１項に記載の基質溶液。 １５、ｆａｌ　緩衝剤とγ−グルタミル残基受容体からなる緩衝化媒質と； （ｂｌ　基質溶液からなり： 前記緩衝化媒質および基質溶液は、それらの予め選択したアリコートがγ−グル タミルトランスフェラーゼの存在下で反応して吸収性の開裂生成物を生成するの に適したタイプのγ−グルタミルトランスフェラーゼの活量を定量するキットに おいて：前記基質溶液が、 （ａｔ　Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド訃よびＬ−γ−グルタミルー う−カルボキシ−ｐ−ニトロアニリドの塩類からなる群から選んだ基質と：（ｂ ）２〜ｌＯ個の炭素原子と２〜１０個の水酸基を含むアルキル・ポリオール、お よび約２ｏｏ〜６００１７）平均分子量を有するポリエチレン・グリコール力ら なる群から選んだポリオールからなることを特徴とするγ−グルタミルトランス フェラーゼ（Ｄ　活ｔ　ｆ：定量するキット。 ｉｌｌ、（ａｌ　前記基質は、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド・ハロ ゲン化水素酸塩およびＬ−γ−グルタミルー５−カルボキシーｐ−ニトロアニリ ド・モノアンモニウム塩からなる群がら選び；（ｂｌ　前記ポリオールは、２〜 ５個の炭素原子および２〜１４個Ｏ水酸基を有するアルキル・ポリオール、およ び約２００〜ＵＯＯの平均分子量を有するポリエチレン・グリコールからなる群 から選ぶことを特徴とする請求の範囲第１５項に記載のキット。 １５、（ａｌ　前記基質は、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド・ハロゲ ン化水素酸塩、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド臭化水素酸塩、および Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド・ヨウ化水素酸塩からなる群から選び ； ｆｂｌ　前記ポリオールは、グリセロール、エチレン・グリコール、フロピレン ・クリコール、１．３−７’ロパンジオール、フチレン・グリコール、ベンタン ジオール、ポリエチレン・クリコール２００．およびポリエチレン・グリコール う００からなる群から選ぶことを特徴とする請求の範囲第１５項に記載のキット 。 １６、　（ａｌ　前記基質は、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド・塩化 水素酸塩であり； （ｂｌ　前記ポリオールは、エチレン・グリコール。 プロピレン・グリコール、ポリエチレン・ｙｖ−ｙ−ル２００．およびポリエチ レン・グリコール５ｏ。 からなる群から選ぶことを特徴とする請求の範囲第１５項に記載のキット。 １７、前記基質溶液が約２５〜２５０　ミＩＪモル／ｌ基質からなることを特徴 とする請求の範囲第１５項７第ｉ１１項、第１５項、または第１６項のいずれか １項に記載のキット。 １ｇ　前記基質溶液が約ｕｏ−ｚｏｏミ＋７モル／ｌ基質からなることを特徴と する請求の範囲第１３項、第１４項、第１５項、または第１６項のいずれか１項 に記載のキット。 １つ　前記基質溶液が約５０ミリモル／ｊ基質からなることを特徴とする請求め 範囲第１５項７第ｉ１１項。 第１５項または第１６項のいずれか１項に記載のキット。 ２０　前記基質溶液がさらに、２０％ｖ７へ′までの不活性。 吸湿性固体からなることを特徴とする請求の範囲第１５項、第１１１項、第１５ 項または第１６項のいずれか１項に記載のキット。 ２Ｌ　前記基質溶液がさらに、５％Ｖ／Ｖまでの不活性。 吸湿性固体からなることを特徴とする請求の範囲第１３項、第１１１項、第１５ 項または第１６項のいずれか１項に記載のキット。 ２２、前記基質溶液が約２５〜２５０　ミＩＪモル／ｌ基質からなり、さらに２ ０％ｖ、ｌｖまでの不活性、吸湿性固体からなることを特徴とする請求の範囲第 １う項、第１１１項、第１５項、または第１６項のいずれが１項に記載のキット 。 ２５　前記基質溶液が約ｌＩｏ〜１ｏｏミリモル／ｌ基質からナシ、さらに２０ ％Ｖ／’Ｖまでの不活性、吸湿性固体からなることを特徴とする請求の範囲第１ ５項、第１４項、第１５項、または第１６項のいずれが１項に記載のキット。 ２＋＋　前記基質溶液が約５０　ミＩＪモル／Ｅ基質がらなり、さらに５％Ｖ／ Ｖまでの不活性、吸湿性固体からなることを特徴とする請求の範囲第１３項、第 １１１項。 第１５項、または第１６項のいずれが１項に記載のキット。 ２５　前記基質溶液が約５　Ｑ　ミＩＪモル／ｌ基質がらなり、さらに５％■Ａ までの不活性、吸湿性固体がらなり；前記緩衝化媒質が約８８ミリモルの塩化マ グネ／ラムと、約１００ミリモルのトリス（ヒドロギシメテル）アミン・メタン と、約１６５ミリモルのグリシルグリシンと、約１１７ｉアジ化ナトリウムから なり、かつ室温で８１士０１のｐＨを有することを特徴とする請求の範囲第１５ 項５第１１１項、第１５項または第１６項に記載のキット。 ２６　前記基質溶液のアリコートと前記緩衝化媒質とを約１５〜１５０の割合で 混合して作用試薬を生成した後の該作用試薬における前記基質の！ｉ度が約１〜 １０ミリモル／ｌとなるように混合することを特徴とする請求の範囲第１３項、 第１１１項５第１５項または第１６項のいずれか１順に記載のキット。 ２７、（ａｉ　緩衝剤とｒ−グルタミル残基受容体からなる緩衝化媒質のアリコ ートと、基質溶液のアリコートと、分析せんとする試料のアリコートを所定の順 序で混合して開裂生成物を生成し。 （ｂｉ　前記開裂生成物の吸光度を測定するタイプのγ−グルタミルトランスフ ェラーゼの活量の定量法において。 前記基質溶液が。 （ａｌ　Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドＤよびＬ−γ−グルタミルー う−カルポキンーｐ−二トロアニリドの塩類からなる群から選んだ基質と。 （ｂ）２〜１０個の炭素原子および２〜１０個の水酸基を含むアルキル・ポリオ ール、！：、約２００〜６００の平均分子量を有するポリエチレン・グリコール からなる群から選んだポリオールからなること を特徴とするｒ−グルタミルトランスフェラーゼの活量の定量法。 ２ｇ、　（ａ）　前記基質は、Ｌ−７’−グルタミル−１〕−ニトロアニリド・ ・・ロゲン化水素酸塩および■、−γ−グルタミルー５−カルボキン−ｐ−ニト ロアニリド・モノアンモニウム塩からなる群から選び。 （ｂｉ　前記ポリオールは、２〜５個の炭素原子および２〜断個の水酸基を有す るアルキルポリオール。 および約２００〜ｌｌ００の平均分子量を有するポリエチレン・グリコールから なる群から選ぶことを特徴とする請求の範囲第２７項に記載の方法。 ２’ｌ　（ａｉ　前記基質は、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド・ハロ ゲン化水素酸塩、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド臭化水素酸塩、およ びＬ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド・ヨウ化水素酸塩からなる群から選 び。 ｉｂｌ　前記ポリオールは、グリセロール、−１−チレンクリコール、フロピレ ン・グリコール、１．５−プロパンジオール、フチレン・クリコール、ベンタン ジオール、ポリエチレン・グリコール２００．およびポリエチレン・グリコール ５００からなる群から選ぶことを特徴とする請求の範囲第２７項に記載の方法。 ５０、ｆａｌ　前記基質はＬ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド塩化水素酸 塩であり： （ｂｌ　前記ポリオールは、エチレン・グリコール、プロピレン・グリコール、 ポリエチレン・グリコール２００、およびポリエチレン・グリコール３００から なる群から選ぶことを特徴とする請求の範囲第２７項に記載の方法。 ５１　前記基質溶液が約２５〜２５０　ミＩＪモル／ｌ基質からなることを特徴 とする請求の範囲第２７項、第２８項、第２９項または第５０項のいずれか１項 に記載の方法。 うど　前記基質溶液が約）↓０〜ｌ　００　ミＩＪモル／ｌ基質からなることを 特徴とする請求の範囲第２Ｙ項、第２８功５第２９項または第５０項のいずれか １項に記載の方法。 ５う　前記基質溶液が約５０ミリモル／ｌ基質からなることを特徴とする請求の 範囲第２７項、第２８項。 第２９項吐たは第５０項のいずれか１項に記載の方法。 う］１　前記基質溶液がさらに２０％Ｖ７’Ｖまでの不活性。 吸湿性固体からなることを特徴とする請求の範囲第２７項、第２８項、第２９項 、または第５０項のいずれか１項に記載の方法。 う５　前記基質溶液がさらに５％Ｖ／Ｖまでの不活性、吸湿性固体からなること を特徴とする請求の範囲第２７項、第２８項、第２９項または第５０項のいずれ か１項に記載の方法。 ５６　前記基質が約２５〜２５０　ミＩＪモル／ｌ基質からなり、さらに２０％ Ｖ／Ｖまでの不活性、吸湿囲固体からなることを特徴とする請求の範囲第２７項 、第２８項、第２９項または第３０項のいずれか１項に記載の方法。 う７　前記基質溶液が約ＩＩＯ〜１００　ミＩＪモル／ｌ基質からなり、さらに ２０％Ｖ、’Ｖ−Ｅでの不活性、吸湿性固体からなることを特徴とする請求の範 囲第２７項。 第２８項、第２９項、丑たは第３０項のいずれか１項に記載の方法。 ５８　前記基質溶液が約５０ミリモル／ｌ基質からなり、さらに５％Ｖ／Ｖまで の不活性、吸湿性固体からなることを特徴とする請求の範囲第２７項、第２８項 ４第２９項または第５０項のいずれか１項に記載の方法。 ５つ　前記基質溶液が約５０ミリモル／ｌ基質からなり。 さらに５％Ｖ／Ｖの不活性、吸湿性固体からｌす；前記緩衝化媒質が８８ミリモ ルの塩化マグネシウムと５約１００ミリモルのトリス（ヒドロキシメチル）アミ ノ　メタンと、約１６５ミリモルのグリシルグリシンと、約１１１／ｌのアジ化 ナトリウムからｚＢ、かつ室温で８１±０１のｐ　Ｈを有することを特徴とする 請求の範囲第２７項、第２８項、第２９項、または第５０項のいずれか１項に記 載の方法。 ｉ＋ｏ　前記緩衝化媒質および基質溶液は、前記組成物のアリコートと前記緩衝 化媒質のアリコートを約に５〜１：５０の割合で混合した後の前記混合体におけ る前記基質の濃度が約１〜１０ミリモル／ｌであるように混合されることを特徴 とする請求の範囲第２７項、第２８項、第２９項または第５０項のいずれか１項 に記載の方法。