JPS59500352A - Ｍｈｃ遺伝子によりコ−ドされる組織タイプの決定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＭＣ遺伝子によυコードされる組織タイプの決定方法本発明は、ヒトのＭＨＣ による組織のタイプ分けの決定あるいは遺伝子地図作成の方法および手段、換言 すればヒトのＭＭＣの多形性の決定の方法および手段に関する。

ｒＭＨｃ」（Ｍａｊｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｊｌｉｔｙ　Ｃｏｍｐｌ ｅｘ）すなわち（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ａ）すな わちヒト白血球、Ｉ％Ａとも呼ばれる。ＭＨＣおよびＨＬＡ−Ｃｏｍｐｌｅｘは 共に一般的に受容されている用語である〔例えばＣ，Ｗ、　Ｐａｒｋｅｒ氏編ｒ Ｃ］ｊｎ−■ｍｍｕｎｏ１．Ｊ第１巻第６３〜８０頁、（Ｗ、　Ｂ、サランダー ス社１９８０年刊）参照〕。

ＭＨＣはヒトの第６染色体上に存在する１区域で、真宗移植拒絶反応その他の免 疫的および体液的応答を含む多くの免疫学的現象に関与する生産物をコードする 遺伝子を含んでいる。現在知られているＨＬＡ遺伝子は、２種類の主要なカテゴ リーに分けられる。すなわちＨＬＡ−Ａ、　ＢおよびＣ組織抗原は、大多数の有 核細胞について発現される糖蛋白質（抗原）の生成を支配する少なくとも５か所 の異なる遺伝子座の存在を反映する。これらの抗原は「第１群抗原」と呼ばれる 。他のセットの遺伝子例えばＨＴ、Ａ−ＤまたはＤＲ（Ｄ−関連）およびＤＣ遺 伝子（以下総括的にｒ　ＨＬＡ−Ｄ遺伝子」と呼ばれる）は、いわゆる「第■群 抗原」の形成を支配する。これらの抗原は限定された組織分布を有する。すなわ ち第■群抗原はそれらが主として免疫系の細胞上に現われるであろう点において 第１群抗原と異なる。数種類の補体成分もまたＭＨＣにおいてコードされる。こ れらの成分は「第■群分子」と呼ばれる第３のグループの物質類を構成する。

ヒトの第６染色体の短腕上にあるＭＨＣの模式的構成を下記に示す。

Ｃｅ　Ｄ　Ｃｆ　Ｂ　Ｃ ｏ　−−−−−−−−−− セントロメア（Ｃｅ）は左方にある。Ａ、　Ｂ、　Ｃおよびその他の未確認の遺 伝子座はすべて第１群抗原の重い鎖をコードするのに対し、Ｄ遺伝子座はＤＲ， ＤＣおよびその他の第■群抗原のαおよびβ鎖をコードする。

ＨＬＡ抗原の構造および組織分布 ＭＨＣのＡ、ＢおよびＣ遺伝子座においてコードされる第１群抗原は、はとんど すべての有核細胞上に現われる。

しかし量的な発現度はタイプの異なる細胞の間で著しく異なる。

第１群抗原の構造は詳細にわたって解明されている。

すべての第１群抗原は１本の重い鎖と１本の軽す鎖よりなる。ＭＨＣにおいてコ ードされる重い鎖は、グリコ／ル化されたポＩＪ　６プチドであり、それは原形 質膜にまたがり、そのＣ０ＯＨ末端部の一部を膜の細胞質側に提示する。

第１群抗原の軽い鎖は、どの対立遺伝子産物と結合していようとも差異はない。

β２−ミクロクロプリンとも呼ばれる軽い鎖は、ヒトの第１５染色体によりコー ドされ、従ってその遺伝子はＭＨＣには属しない。

第１群抗原の蛋白質構造、生合成およびゲノム構造は第１群抗原に関するほど詳 細には知られていない。しかし第１群抗原はα鎖およびβ鎖とよばれる２本の不 同で非共有結合的に結合され、膜にまたがるグリコポＩＪ　６プチドよりなる。

これらのポリはプチドをコードする遺伝子がＭＨＣの９区域の一部であることは 非常に可能性が大きい。ともあれ、ＤＲおよびＤＣ遺伝子座のα鎖とβ鎖が共に ＭＭＣにおいてコードされることは決定的に確立された。

第１群抗原は、第１群抗原よりも限定された組織分布を示す。第１群抗原に富む 細胞は抗原を造成する樹状細胞、・マクロファージ、抗体を産生ずるＢ−淋巴球 および活性化Ｔ細胞である。さらに第１群抗原は数種類のタイプの上皮細胞の表 面に出現する。

ＨＬＡ遺伝子座の多形性 ＨＬＡ抗原は、補体成分を支配する遺伝子は第１群および第１群抗原をコードす る遺伝子よりも多形性の程度は低いが、それでも大部分の遺伝子座において広範 囲に遺伝的多形性を示す。ＨＬＡ抗原の多形性は、多数のＨＬＡ半数体タイプの 出現によシ細胞集団レベルにも反映されている。それぞれのＨＬＡ半数体タイプ は、遺伝子の一定のセットを表わし、そのすべてはメンデルの法則に従って遺伝 する。ＨＬＡ半数体タイプの多様なことは、実質的にすべてのＭＢＣ遺伝子座は 多数の対立遺伝子を表現するという事実からの帰結である。対立遺伝子は類似で はあるが互いに異なり、しかし異なるＨＬＡ半数体タイプにおいて同じ位置を占 める。正常な個体は１箇所の遺伝子座において２個の対立遺伝子を発現するのみ である。しかし細胞集団全体ではそのような遺伝子座において多数の対立遺伝子 を発現し得る。現在のところ約２５の対立遺伝子がＨＬＡ−Ａ遺伝子座において 同定され、Ｂ遺伝子座において約同数、Ｃ遺伝子座において約１０、そしてＤ遺 伝子座において合計約１５が同定された。［Ｗ、Ｆ、　Ｂｏｄｍｅｒ氏編ｒＢｒ １ｔ、　Ｍｅｄ、　Ｂｕｌｌ、Ｊ第３４巻第６頁（１９７８年）参照〕。組換え ＤＮＡ法は、ＤＲ遺伝子座のただ１種類のα鎖のみが同定されたのに対してＤＲ 遺伝子座に由来するβ鎖は遺伝的に多形性であることを示した。対照的にＤＣ遺 伝子座のα鎖およびβ鎖は共に遺伝的に多形性であるらしい。

新たな対立遺伝子が数多く発見されるので、対立遺伝子の確定的な数は示され得 ない。さらにまた新たな対立遺伝子を定義するために用いられる特別な血清学的 試薬の特異性を検討する面倒をいとわぬ国際的協力が確立されるにつれて最近発 見された対立遺伝子が以前に発見されたものと同一であると判明することもあり 得る。しかしながら、細胞集団中における数多くの対立遺伝子およびそれらの頻 度分布からすれば、同一の遺伝子のセットを共有する遺伝的に関係のない２個体 すなわち同一のＨＬＡ半数体タイプｔ−表わす個体を見出すことは異例である。

１対の対立遺伝子は、ポリｇプチド鎖として発現されるに必要なすべての遺伝情 報を包含するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）　（Ｄ断切（セグメント）よりなる。

すなわちヌクレオチド配列の異ガる対立遺伝子は、異なるホＩＪ　ｇプチド鎖を 生成せしめ得る。しかしながら、もしヌクレオチド配列の差異が翻訳のレベルに おいて「サイレント」（無言である場合には、同一のホリ×プチド鎖が異なる対 立遺伝子から由来することもあシ得る。さらにまた対立遺伝子の間のヌクレオチ ド配列の差異は、それがイントロン内またはエクソンの翻訳されない部分内に生 ずる場合には４　ＩＪ　スプチド鎖配列に影響しないであろう。従って、ＤＮＡ のレベルにおいて認められた対立遺伝子が対立遺伝子として出現せず、蛋白質の レベルにおいて同一の遺伝子の産物として出現することもあり得る。ポリｇプチ ド鎖多形性のこの限界にもかかわらず、ＭＭＣの種々の遺伝子座における多数の 対立遺伝子が、対立遺伝子に由来する蛋白質の血清学的分析により発見された。

現況における組織タイプ分けの示唆 ＭＭＣ遺伝子座によりコードされる産物を同定する組織タイプ分けは、生物医学 の多くの分野において多大の重１Ｒ４ｆ有する。本来ＭＨＣにおいてコードされ る蛋白質は移植された組織の拒絶を起す過程に深くかかわっていることが示され た。「移植抗原」という名称はこの知識に根のヲ有する。供与者と被供与者とが ＭＭＣについて適合することが、移植片の生存を予察する上に価値のあることが 速やかに理解された。対立遺伝子を適合させるためには、ＤＮＡでなく蛋白質を 検査する限りにおいては間接的方法が用いられる。この操作は組織のタイプ分け と呼ばれる。

移植抗原に対する興味は、若干のＭＨＣ対立遺伝子とある種の疾患との間に相関 が存在することが認められたときにさらに増大した。すなわちインシュリン依存 性糖尿病は、対立遺伝子Ｄｗ３および／またはＤｗ４を有する個体に広１つてい るのに対し、対立遺伝子Ｄｗ２　ｆ有する個体はこの疾患に対して耐性であるら しい（第１表参胛）。

従って組織タイプ分けは、個体のレベルにおいである種の疾患にかかる相対的危 険度を予察するために用いられ得る。このことは、例えば各個人にある種の職業 的危険物を避けるように助言する上で重要性を有する。組織タイプ分けは、法医 学においてもその全面的価値はまだ理解されていないが、特に父親認知の訴訟に おいて価値が大きい。最終的に若干の自然的流産と父親および母親のある特定の ＨＬＡ半数体タイプとの間に相関が存在することが観察されている。

組織タイプ分けの価値ある場合の３例を下記に詳しく記述する。すなわち １）例えば接値された骨髄、腎臓およびその他の器官の生存可能性は、供与者と 被供与者のＨＬＡタイプに依存する。

２）輸血における血液要素の生存可能性は、供与者と被供与者のＨＬＡタイプに 影響される。

３）ある種の疾患にかかり発病する可能性はＨＬＡタイプに関係がある。

移植 例えば腎臓移植を受ける患者の蛋白質レベルにおけるＨＬＡタイプ分けは、移植 片の生存可能度が供与器官と被供与者のＨＬＡタイプの適合性に依存することを 明らかにした。ＨＬＡが同一である兄第姉妹の間の腎臓移植は、ＨＬＡが同一で ない兄第姉妹の間の移植よりも移植臓器の生存率が高いことがわかった。最近の 結果は、ＨＬＡ−Ｄについての適合が受容された移植片における高率の成功をも たらすことを示唆する。事実、腎臓供与者と被供与者が同一のＨＬＡ−ＤＲタイ プを有する場合には、移植腎臓の９０係の生存が得られることが見出された。Ｈ ＬＡ−Ｄにおける些少な差異でさえも、移植腎臓の拒絶をもたらす免疫応答を引 き起すに足ると考えられる。免疫応答は複合的であり、第■群抗原依存性の機作 においては警報を発しまた細胞分解性の淋巴球および移植された組織に対する抗 体の発達を促進するいわゆるＴ補助細胞の活性化を包含することを指摘すべきで ある。

輸血 ある種の血液細胞欠乏症における輸血もまた蛋白質しくルにおけるＨＬＡタイプ の適合により影響される。ある種の血小板異常症において、輸血による置換療法 はしばしば血小板の表面において発現されるＨＬＡ抗原に対抗する細胞毒性の抗 体の形成をもたらす。この反応は供与者および被供与者の血液のＨＬＡ−ＤＲの 適合により防止され得る。

罹病感受性 発病がある特定のＨＬＡ抗原に関係している可能性をテストするために多くの疾 患が研究された。罹病している個体群中におけるある抗原の頻度が健康な対照個 体群中における同一のＨＬＡ抗原の頻度と比較された。ある特定のＨＬＡ抗原と 疾患との連係の程度を、［相対的危険度Ｊ　（ＲＲ）として表わす。相対的危険 度は、ある特定の抗原を有する個体群において、対照個体群の何倍の頻度で疾患 が発生するかを示す。ある特定のＨＬＡ抗原に関係することが明らかになった多 くの疾患を下記の表に総括する。この主題について数篇の総説が利用可能である ｌＪＩｍｍｕｎｏ１ｏｇ］ｃａＩＲｅｖｉｅｗＪ第７０巻第１〜２１８頁（１９ ８３年）参照〕。

本件特許出願中に提示された結果によれば、これら若干の疾患の進行および発症 はＭＨＣ’ｉｉ７コードするＨＬＡ抗原の１個またはそれ以上の遺伝子の構造お よび発現に関係すると考量され得る。

組織タイプ分けのための現状の方法 組織のタイプ分け、すなわち細胞表面において発現されるある特定のＨＬＡ対立 遺伝子の決定は、従来間接的方来する蛋白質が（ＤＮＡではなく）検査されるか らである。

これは面倒な操作であり、それぞれの移植抗原に対抗して特異な反応をする抗血 清を用意せねばならない。若干のＨＴＪＡ遺伝子座において発現される対立遺伝 子の決定には、同型接合のタイプ分は細胞が用いられる。両者の方法ともしばし ば質が不良でまた直ちには得られない試薬５　を要することが容易に理解される 。

第　１　表 ＨＬＡと疾患との関係 強直性背椎炎　Ｂ２７　Ｂ、６　８９　９０．１ライタ一氏症候群　Ｂ２７　Ｂ 、６．　７７　３５．９急性前部ぶどう膵炎　Ｂ２７　Ｂ、６　４７　９．４リ ウマチ性関節炎　Ｄｗ４　１９．４　４８　３．９多発性硬化症　Ｄｗ２　２５ ．８　６０　４．３重症筋無力症　Ｂ８　２３．７　５６４．１腹　腔　症　Ｄ Ｗ３　２６．３　９６　７５．０ヘルハス様皮膚炎　Ｄｗ３　２６．３　Ｂ５　 １３．５慢性自家免疫肝炎　Ｄｗ３　２６．３　７１　６．８シラ力症候群　Ｄ ｗ３　２６．３　８７　１９．０特発性アジソン氏病　Ｄｗ３　２６．３　７６ ８．８グレ一プス氏病　Ｄｗ３　２６．３　６１４．４インシユリン依存性糖尿 病　Ｄｗ２　２５，８　０　０．０Ｄｗ３　２６．５　４Ｂ　２．５ Ｄｗ４　１９．４　４９　３．９ 亜、伸性甲状腺炎　Ｂ′ｌ１３５　１ろ１　７２　１６．８特発性血色素症　Ａ ３　２６．９　７３　７．４Ｂ１４’　４．５　１９　５．Ｏ Ｃ２欠　乏　症　ＤＷ２、特にＡ２５、Ｂ１８、Ｄｗ２半数体タイプと強く連係 ［ＳｖｅｊｇａａｒｄおよびＲｙｄｅｒ両氏（Ｆ、　Ｈ，Ｂａｃｈ　、　Ｐ、、 Ａ、　Ｇｏｏｄ両氏編）ｒｃ１ｉｎｊｃａｌ工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙＪ第１７３〜 １８１頁にューヨーク、アカデミツク・プレス社１９８０年刊）より〕現状にお いては、Ａ、　Ｂ、　ＣＸＤＲおよびＤＣ遺伝子座の対立遺伝子は、対立遺伝子 に由来する蛋白質とそれに特異的に対抗す−る抗体とを反応させることにょシ同 定される。

すなわちある特定の遺伝子座の１個の対立遺伝子蛋白質のみを認識する注意深く 選ばれた抗血清が微量力価検定用プレートのくぼみ孔に入れられる。組織タイプ 分けすべき個体の細胞を６孔に加える。保温期間の後に補体全加える。細胞と反 応した抗体は補体を固定し、細胞は分解される。どの抗血清が細胞分解を誘発し たがを点検して組織タイプ分けがなされる。しかしながら、まだ発見されない対 立遺伝子に由来するポリペプチドは勿論のことながら検出を免かれる。

ＨＬＡ−Ｄ遺伝子座の対立遺伝子はまた「混合淋巴球反応」と呼ばれる操作によ り同定されつつある。その方法においては、同型接合のタイプ分は細胞がタイプ 分けすべき細胞と混合され、共に培養される。第１群抗原がタイプ分けすべき細 胞と同型接合細胞との間で異なる場合には増殖が起るであろう。この方法および 前に言及した方法の詳細は、Ｃ，Ｗ、　Ｐａｒｋｅｒ氏編ｒｃｈｊｎ、工ｍｍｕ ｎｏ１．Ｊ第１巻第６７〜８９頁（Ｗ、　Ｂ、サランダース社１９８０年刊）に すぐれた記述がある。

現在用いられている組織タイプ分けの方法の短所は下記の通りである。すなわち １）方法は間接的である。

２）疑問の余地のないタイプ分けの結果をもたらす血清学的試薬は容易に手に入 らず、また標準化が困難である。

３）抗血清およびタイプ分は細胞は、長期間貯蔵すれば有効性が低下する。

４）多くの試薬は、１個の対立遺伝子のみを同定するほど充分な選択性を有しな い。

５）未だ同定されていない対立遺伝子は検出されないままに終る。すなわちもし 異型接合の個体がそれに対抗する試薬のないＨＬＡ抗原を発現するならば、その 遺伝子座における同型接合と異型接合とを判別することは不可能であろう。

６）現在の方法は退屈でまた面倒である。

従って、本発明の目的は従来の方法よりも明確な判別をもたらし、また限界にと られれないヒトのＭＭＣの多形性の判定のための簡単化された方法を提供するこ とである。

さらにまた本発明の目的は、ＭＭＣ特異性のヌクレオチド配列を決定し、また高 度の特異性および再現性を有し、しかも低コストで多量に生産され得る探査体（ プローブ）を提供することである。

本発明 本発明は、組織のタイプ分けのためのヒトのＭＭＣ対立遺伝子、好適にはＨＬＡ −Ｄ組織タイプの多形性を判定するための新規な方法を提供する。その方法は、 ＭＨＣにおける塩基配列と交雑し得るプローブが異なる個体からのＤＮＡの制限 酵素切断位置地図に用いられること、および最初の個体に由来しまたプローブと 交雑するＤＮＡ断片のサイズの分布が第２の個体からの対応する断片の分布また は多形性の特定の　を反映する対応する分布と比較されることを特徴とする。比 較が行われたのは、ａ）上記の第１の個体に移植または輸血の目的で組織を供与 する上記の第２の個体の遺伝的適合を判定するため、ｂ）第１の個体がＭＨＣ中 の１個またはそれ以上の対立遺伝子と関係のある疾患にかかる相対的危険を測定 するため、ｃ）第１の個体の生物学的父親認知または母親認知のため、またはｄ ）第１および第２の個体が１個またはそれ以上のＭＭＣ対立遺伝子について同一 の多形性を示すか否かの判定すなわち法医学における利用のためである。特定的 には、そ（１３） の比較は特異的に交雑する断片の存否をしらべるものである。

好適な範囲においては、本発明の方法はＨＬＡ−Ｄ組織タイプをコードするかま たは関係のある遺伝子の構造を分析することに基礎を置き、またプローブはＨＬ Ａ−Ｄ　（第ｎ群）抗原をコードするｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡ、第１群抗原 をコードするかまたはコードしない配列を含む実際の遺伝子（または遺伝子複合 体）を表わすゲノムＤＮＡ　、およびそれらの断片から選ばれることを特徴とす る。この範囲において、１個体からのＤＮＡ断片の分布が、たとえば上記のａ） およびｂ）に言及したところにより比較される。

これに対応して、本発明により好適なプ・ローブはそれがＨＬＡ−Ｄ　（第ｎ群 ）抗原をコードするｍＲＮＡと相補性のＣＤＮＡ　％第■群および第１群抗原を コードするかまたはコードしない配列を含む実際の遺伝子（または遺伝子複合体 ）を表わすゲノムＤＮＡ　、およびそれらの断片から選ばれることを特徴とする 。その他の本発明の範囲は、請求の範囲第１項〜第１９項中に特徴づけられる。

ＤＮＡの単離 ＭＭＣ多形性に関して検査されるべきＤＮＡの単離は、すでによく確立された方 法［Ｎ、　Ｂｌｊｎおよびり、　Ｗ、　５ｔａｆｆｏｒｄ両氏ｒＮｕｃ１ｅｉｃ 　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＪ第５ｅａｒｃｈＪ〜２３０Ｂ頁（１９７６年） 〕により達成される。好適には、ＤＮＡは血液細胞やその他の有核細胞から単離 される。

制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの断片化ＤＮＡの制限酵素切断位置地図の 作成はそれ自体既知であり、１）ヒ）　ＤＮＡの制限酵素による分解、２）得ら れた断片のサイズによる分画化、および３）特定のＤＮＡ断片を核酸ブロー、ブ と交雑させて検出するという諸段階よりなる。

単離されたＤＮＡは、１種類またはそれｖ上のＤＮＡ特異性制限エンドヌクレア ーゼを用いて断片化される。２種類またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを 同一のＤＮＡ標品の別々の一定量に対して用いることができる。また２種または それ以上の制限エンドヌクレアーゼをＤＮＡの同一の一定量の分解のために順次 または同時に用いることができる。それぞれの酵素は、完全な分解を達成するた めに各々特別な条件を必要とする。従って分解のための特定の条件は用いられる 酵素により異なる。しかしながう制限エンドヌクレアーゼの使用の一般的原理に ついては数篇の総説に総括されている［Ｒ，Ｊ、　Ｒｏｂｅｒｔｓ氏ｒＮｕｃ１ ．　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、Ｊ総説第１１７頁（１９８２年）参照〕。

ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼによる分解は常にｐＨ４〜９の範囲に調整され た緩衝水溶液中において行われ、すべてではないがほとんどの場合分解の温度は １５°〜６５℃の範囲である 多種類の制限エンドヌクレアーゼは商業的に入手できる。本発明の操作に適する 制限エンドヌクレアーゼには、２つのグループが認められる。すなわち１）塩基 ４個の特定のＤＮＡ配列を認識する制限エンドヌクレアーゼ、および２）塩基６ 個の特定のＤＮＡ配列を認識する制限エンドヌクレアーゼである。

制限エンドヌクレアーゼのそれぞれのグループは各々異なる塩基配列を認識する 数種類の酵素よりなる。第１グループの制限エンドヌクレアーゼは平均的に第２ グループの酵素よりも多くのＤＮＡ断片を生成する。しかしながらそれぞれの酵 素による特定の塩基配列の認識は、ある酵素により生成されるＤＮＡ断片の数は 別の酵素による断片の数と異なることを意味する。ある個体のＭＨＣ区域内にま たがる特定の対立遺伝子を確立するために使用に適する制限エンドヌクレアーゼ は、Ｅｃｏ　ＲＴ、Ｐｖｕ　ｎ、ＢａｍＨｌ、　Ｂｇｌ　ＩＩ、　Ｐｓｔ　Ｉ等 である。将来新規な制限エンドヌクレアーゼが発見されるであろうから、適当な 酵素のリストは拡大するにちがいない。

ＤＮＡ断片の分離 制限エンドヌクレアーゼによる分解は、分子量従ってサイズの異彦るＤＮＡ断片 を生成する。酵素により生成されるＤＮＡ断片の分子量は、ＤＮＡ断片中の塩基 、燐酸基および炭水化物部分のそれぞれの数と実質上完全に相関する。ｆｆｔｌ Ｊ　限エンドヌクレアーゼにより生成されるＤＮＡ断片のサイズ分画化は、上記 の各成分の数を有利に用いる分画操作よりなる。制限エンドヌクレアーゼ分解に より生成されるＤＮＡ断片を分離するための目下好適とされる方法は、アガロー スまたは、４１Ｊアクリルアミドのいずれかを支持体とする電気泳動である。し かしながらゲルクロマトグラフィー、親和性分離法等の操作によってもＤＮ人断 片の分画化を達成し得る。

交雑の後可視化された制限断片の電気泳動的挙動により、それら断片の分子量、 従ってそれらが含有する塩基の数の決定が可能となる。良好に決定されたＤＮＡ 断片の標準試料を、検査されるべき試料と平行に泳動せしめれば、制限断片の分 子量決定の正確度が商才るのは当然でプローブは制限エンドヌクレアーゼ分解に よりヒトのＭＨＣに由来するＤＮＡ断片と交雑すべきものである。プローブの塩 基配列またはその配列の一部分は、ＭＨＣの塩基配列と相補的でなくてはならな い。そのような配列は、必ずしもポリはプチド鎖をコードしないが、もしコード する場合にはプローブは一層良好に決定される。しかしながらプローブの主要な 必要条件は、それがＭＢＣの塩基配列、好適には多形性り遺伝子座の１個の対立 遺伝子の一部分と全面的または部分的に相補性を有することである。プローブは ＲＮＡ型またはＤＮＡ型の核酸よりなる。

ＤＮＡはＲＮＡよシも安定であるから、ＤＮＡプローブはＲＮＡプローブよシも 好適である。

多形性ＭＨＯ遺伝子座のすべてのまたは若干の対立遺伝子と交雑するプローブの 一つの型は、当初に１４　ｍＲＮＡ分子と相補的なｃＤＮＡより調製される。ｍ ＲＮＡは、第１群および第１群抗原の構成分、ｔ９１７　ハプチド鎖のようにＭ ＭＣ遺伝子座の１個の対立遺伝子に由来するポリハプチド鎖の充分な景を発現す る細胞から集積されるのが常である。所望のｍＲＮＡの集積は既述（Ｓ、　Ｋｖ ｉａｔ氏その他ｒｃｅ１１ｊ第２９巻第６１〜６９頁（１９８２年）〕の通りに 実施される。

単離されたｍＲＮＡ画分は、多くのタイプのｍＲＮＡ分子よりなる。すべてのｍ ＲＮＡ分子種は２重鎖のｃＤＮＡを生成する逆転写のためのテンプレートとして 用いられる。２重鎖のｃＤＮＡ分子は線状化されたプラスミドに別々に連結され 、そしてそれは後に大腸菌の株を形質転換させるために用いられる。形質転換さ れた大腸菌はクローニングされ、ＭＨＣの多形性対立遺伝子に対応するｃＤＮＡ 挿入部を含むプラスミドの複製を支持するものが選出される。その操作はよく知 られており、米国特許第４２３７２２４号明細書中に概説されている。上記の手 法はしばしば対応する蛋白質の一部のみに対応するＣＤＮＡを生成する。

プローブの調製には、例えば短い塩基配列を含むプローブのための合成的経路の ような他の経路もある。−変調製された上は、ｃＤＮＡクローンまたはそのクロ ーンの一部分に対応する合成的ＤＮＡ断片は、そのようなコードするＤＮＡの部 分により側面を守られたゲノムＤＮＡの単離に使用され得る。すなわちコードす る配列とフードしない配列の両者を含む適切な染色体ＤＮＡを精製することが可 能であり、そしてそれは米国特許第４２３７２２４号明細書により多量に生産さ れ、全面的または部分的にプローブとして使用され得る。

ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ遺伝子座の対立遺伝子においてコードされるポリｇ プチド鎖は、著しい配列の類似性を示す。対応する類似性は今や塩基配列レベル においても存在することが見出された。それゆえ数箇所の遺伝子座例えばＨＬＡ −Ａ、　−Ｂ、および−Ｃ遺伝子座の対立遺伝子と交雑するプローブも調製され 得る。そのようなプローブは、ＨＬＡ−Ａ、　−Ｂおよび−Ｃの対立遺伝子に由 来するＤＮＡ断片を検出すると共に、プローブと充分な塩基配列の類似性を共有 する他の遺伝子座の対立遺伝子に由来する断片を検出するのにも用いられ得る。

第１群抗原の遺伝子座の対立遺伝子に関しては、α鎖およびβ鎖の対立遺伝子を 認識するプローブが第１群抗原の多形性を確立するために用いられねばならない 。そのようなプローブが得られ、それらは第１群抗原の遺伝子座の対立遺伝子と 交雑しない。

ある特定の対立遺伝子に特有の配列に由来するプローブは、その特定の対立遺伝 子に由来するＤＮＡ断片のみを検出するために使用され得る。第１群および第１ 群抗原遺伝子について得られる配列情報は、対立遺伝子特異性のプローブは短く なければならないことを示している。

従ってそのようなプローブの大多数は標準的手法を用いる自動化されたヌクレオ チド合成により甚た容易に調製される［Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ氏その他ｒＧｅｎｅ ｔｉｃ　ＥｎｇｉｎｅｅｒｊｎｇＪ第６巻第１〜１７頁（＝ニーー１７り、−？ レナム・プレス社１９８２年刊行）参照〕。１ケ所の遺伝子座の１個または数個 の対立遺伝子に特有のプローブを用いれば、所与のＤＮＡ試料中にどの対立遺伝 子が存在するかの決定が簡単化される。しかしながら多くの場合に同様な情報は 、もＬ適当な制限エンドヌクレアーゼが分解のために選ばれ上記に概括したよう に、対立遺伝子に特異的なプローブは短いものでなければならない。しかしなが られずか数個の塩基よりなるプローブは、ＭＨＣによってつながれていないＤＮ Ａ配列とも交雑し得る。従って１００〜１５００個の塩基よりなるプローブが最 も特異的な結果をもたらす。事実この範囲のサイズの２種類のプローブで第■群 抗原に対応するものは、１５種類以上の抗血清を用いて笑施せねばならない血清 学的分析よりも多くの情報を含む交雑のパターンをもたらす。さらに配置地図作 成技法により発見された対立遺伝子の産物の若干に対抗する抗血清は入手できな い。

使用されるべきプローブは好適には、それ自体既知の方法により分析的に指示可 能な化合物または基により標識される。そのような化合物の例は、酵素的に活性 な物質、酵素の基質、補助因子、補酵素、ならびに螢光性、発光性または放射性 の化合物である。それ自体において指示可能性ではないが分析的に指示可能性の 化合物と反応する特性を有する物質の例は、標識骨ＩｇＧ　Ｉｃ結合する特性を 有する蛋白質Ａ（およびての逆も真である）、標識付アビジンに結合する特性を 有するビオチン（およびその逆も真である）、チオールを含み分析的に指示可能 性の化合物に結合しまたそれと反応する特性を有する活性化されたチオール化合 物（およびその逆も真である）、および標識付抗体に結合する特性を有する不完 全抗原および抗原（およびその逆も真である）である。

交　雑 交雑とは、１重鎖ＤＮＡ断片の塩基と１重鎖ＤＮＡプローブの相補的塩基との間 の水素結合の形成と定義される。

交雑の結果は、交雑するＤＮＡ断片およびＤＮＡプローブよりなる２重鎖ＤＮＡ の形成である。ここに定義される交雑がＤＮＡ断片とプローブの間の完全な相補 性を必要とはしないが相補性がプローブをＤＮＡ断片に選択的に結合せしめるに 足ることを必要とすることは明白である。

プローブを制限エンドヌクレアーゼ断片と交雑するためには、多くの場合１）１ 種類またはそれ以上のプローブ、２）ホルムアミド、および３）０１〜１，５モ ル濃度の塩化ナトリウムを含有する水溶液が用いられる。

さらにその溶液はフィコール、ポリビニルピロリドン、牛血清アルブミンおよび ／または変性された非相同のどのタイプの変性ＤＮＡにも結合する紙上の結合部 位がプローブと非特異的に粘着するのを避けるために用いられる。予備交雑が用 いられる場合には、プローブに接触させるべきシートはプローブとの交雑に先立 って非相同の（２１） 変性されたＤＮＡで処理される。交雑溶液はｐＨ５〜９に調整され、交雑は１８ 〜６５℃で３〜４８時間実施される。プローブと交雑するＤＮＡ断片のサイズは 、下記のような各種要因に依存する。すなわち １、ＤＮＡ断片の生成に用いられる制限エンドヌクレアーゼ。所与のＤＮＡ試料 および所与のプローブについて、交雑するＤＮＡ断片のパターンは用いられる制 限エンドヌクレアーゼの特異性により異なる。これは当然のことに特定の配列に 対する酵素の特異性による。種類の異なる制限酵素は、しばしば単一の対立遺伝 子からサイズの異なる断片を生成する。

２、　分析されるべき試料中のＭＨＣの特定の対立遺伝子。

所与のプローブおよび所与の酵素を用いて、多形性ＭＭＣ遺伝子座の異なる対立 遺伝子はプローブと交雑するサイズの異なる断片を表わす。別途の場合には、若 干の対立遺伝子はプローブとのヌクレオチド配列の同一性により強い交雑を示す のに対して他の若干の対立遺伝子はプローブと交雑するには不充分な程度の配列 の類似しか有しないこともある。

５　使用されるプローブ。所与のＤＮＡ試料および所与の１種類またはそれ以上 の制限エンドヌクレアーゼについて、プローブと交雑する断片は、同一のｃＤＮ Ａまたはゲ゛ツムの断片に由来するがヌクレオチド配列の異なる２種類のプロー ブが同一の制限断片中に存在する配列と交雑し女いことがある通り、用いられる プローブに依存する。

本発明の有用性は、３つの重要な応用分野よりの５つの実施例を示すことにより 、下記において論議されるであろう。これらの実施例は、何等本発明の限定をな すものではなく、平均的専門家はここに示されないその他の応用分野を容易に理 解するであろう。

実施例 すべての実施例は下記よりなる共通の技術を用いる。

すなわち １）ゲ“ツムＤＮＡの抽出および単離 ２）単離されたＤＮＡの制限酵素による分解３）制限断片のサイズによる分離 ４）分離されたすべてのＤＮＡ断片を、ＭＭＣ遺伝子座のコピーまたはゲノムＤ ＮＡに由来する少なくとも１種類の標識付プローブと交雑させること ５）プローブと交雑したＤＮＡ断片の同定６）記録された交雑パターンを他の１ 個体またはそれ以上の個体の／ξグーンと比較すること ここに記述される実施例に適切な実験的操作手順は下記に概説される。

血液細胞 血液（２０ｍ）は、予め血清学的方法によｇ　ＨＬＡ−ｔｌＲ抗原に組織タイプ 分けされた個体から採取された。

ゲノムＤＮＡの調製 典型的な調製物において、白血球が血液２０Ｔｎｌから遠心分離された。細胞は ００１モル濃度のＮａＣ１および９００１モルのＥＤＴＡを含有する０、０５モ ルのトリス−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，５）４０−中に懸濁された。ドデシル硫酸 ナトリウム（水０５−中に０．１　ｆｔ　）およびプロティナーゼＫ（メルク社 製）（水０．４ｄ中４　ｍｙ　）が加えられた。試料は３７℃において振盪しつ つ１６時間保温され、しかる後１ミリモルのＥＤＴＡを含有する２０ミリモルの トリス−ＨＣｔ緩衝液（ｐＨ７，５）で飽和されたフェノール（４０ｍｌりを用 いて抽出された。遠心分離による相の分離後に上相は水飽和フェノール／クロロ ホルム／イソアミルアルコール（容量比２５：２４Ｍ）混合液４０−を用いて抽 出された。生成した上相は最後に水飽和クロロホルム／イソアミルアルコール（ 容量比２４：１）２０−を用いて抽出された。

上相はＥＤＴＡ　１ミリモルを含有する１０ミリモルのトリス−ＨＣ７緩衝液（ ｐＨ７，５）２ｔずつに対して３回４℃において合計２４時間透析された。九量 の３モル酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）および２．５倍量の冷エタノール が透析物に加えられた。ＤＮＡは２５０ｄのガラス管中で一２０℃において１２ 時間沈澱せしめられ、しかる後４℃において６，０ＯＯＸりで３０分間の遠心分 離により沈降せしめられた。

ＤＮＡ沈澱物はＥＤＴＡ１ミリモルを含有する１０ミリモルのトリス−ＨＣ１緩 衝液（ｐＨ７，５）に溶解された。臭化エチジウム（最終濃度８００μ２／−） およびＣ５Ｃｔ（最終密度１．３９７）が加えられた。溶液（全量３０−）はソ ーパル社製Ｔｉ８６５型ローター中において毎分４１，０００回転で２０℃にお いて４０時間遠心分離された。染色体ＤＮＡはしかる後紫外線下で回収されＥＤ ＴＡ　１　ミＵモルを含有する１０ミリモルのトリス−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７， ５）２ｔずつを４回とりかえて透析された。しかる後試料は上記の通りにエタノ ールおよび酢酸す）　ＩＪウムを用いて沈澱せしめられた。沈澱物は氷冷水中７ ０％（ｖ／ｖ　）のエタノールで洗浄され、次に真空中で軽度に乾燥され、最後 にＫＤＴＡ　１ミリモルを含有する１０ミリモルのトリス−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ ７，５）　５００μｔに注意深く懸濁された。

制限酵素分解 ＤＮＡの試料（１０μｆずつ）は別々にＢａｍ　Ｈｌ、　Ｐｖｕ　ＩＩ、Ｅｃｏ 　Ｒ１およびＢｇｔｎのような制限酵素（−ニー・イングランド・／２イオラブ ズ社製品）１０単位を用い２時間３７℃において分解された。分解は６５℃に２ 分間熱することにより止められた。

電気泳動 分解された試料からのＤＮＡ断片は、０．０４５モル濃度のトリス−酢酸塩緩衝 液中０．７％（ｗ／ｖ　）アガロースゲル（ｐＨ８，３）、５０Ｖ　１２時間の 電気泳動により分離された。

電気泳動は室温でアイスパーグＭ１００Ａ型装置により実施された。ＤＮＡ　％ 片は、しかる後５ｏｕｔｈｅｒｎ氏の記述による方法［ｒＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｊ ｏｌ、Ｊ第９８巻第５０８頁（１９７５年）〕ニヨリニトロセルロースフィルタ ー（シュライヘル・アンド、シュル社製Ｂ、Ａ　８５号）上へ移された。しかる 後フィルターは真空中８０℃で２時間乾燥された。

ヒトの第■群移植抗原に対応するプローブの単離ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−Ｄ Ｃのそれぞれのβ鎖に対応するｃＤＮＡクローンの翻訳済みおよび３′−未翻訳 プローブは別別にアガロースゲル電気泳動によシ単離された。ＨＬＡ−ＤＲおよ びＴ（ＬＡ−ＤＣのそれぞれのα鎖の翻訳済み部分に対応するプローブは、同じ 方法により精製された。第１図は各種の異なるプローブおよびそれら−が由来す る元のｃＤＮＡクローンを模式図的に示す。

プローブの放射能標識 使用されるプローブは、いわゆるニック翻訳法［Ｒｉｇｂｙ氏その他「Ｊ、　Ｍ ｏｌ　ｌＨｏ１．Ｊ第１１３巻第２３７〜２５１頁（１９７７年）〕によりαＣ ５２ｐ］ＡＴｐで放射能標識された。プローブの比放射能は約３×１０７Ｃｐψ りＤＮＡであった。使用の直前に、容量１−中のプローブは０．２モル濃度のＮ ａ０ＨＯ５−を加え、１０分間室温において変性され、しかる後１．５　モ＃濃 度の燐酸ナトリウム液（ｐＨ７，５）　０．６２５ｍｌを加えて中和され、氷上 に置かれた。

ニトロセルロースフィルター上における交雑ニトロセルロースフィルターは、ホ ルムアミＩ’（５０％容量）、硫酸デキストラン（１９／ｒｎｌ）、０．９モル 濃度１（ａｃｔ％００４５モル濃度燐酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７，５）、００ ０２モル濃度ＥＤＴＡ、牛血清アルブミン（１Ｍｇ／ｄ）、フィコール（１■／ ｄ）、ポリビニルピロリドン（１ｍ９／−）、００５モル濃度へ×ス、ドデシル 硫酸す）　ＩＪウム（−１Ｑ／ｍｅ　）および−重鎖の超音波処理した鮭精子Ｄ ＮＡ　（８０μｙ／ｍｌ）を含有する液中で４２℃３時間予備交雑された。しか る後、予備交雑液は牛血清アルブミン、フィコールおよびＪ　ＩＪビニルピロリ ドンの量がＡに減らされた以外は予備交雑液と同じ組成で、１０ｒＩｄ！、中に 変性された放射能標識付ゾローブ（Ｕ５Ｘ１０６　ｃｐｍ）を含有する交雑液と 交換された。さらにまたヘズス濃度も予備交雑液中の半分に減らされた。

プローブの交雑は４２℃において２４時間実施された。

しかる後フィルターは下記の通りの操作手順により洗浄された。すなわち １　）　ＩＪａＣＬ　０．３６モル、燐酸ナトリウム０．０１８七ｋ　（ｐＨ７ ，５）、ＥＤＴＡ　Ｏ，００１モル、ドデシル硫酸ナトリウム１１１ｇ／−を含 有する溶液で室温において２回 ２）　ＮａＣ４０，０３６モル、燐酸ナトリウム０．００１８モル（ｐＨ７５） 、ＥＤＴＡ　Ｏ，０００１モル、ドデシル硫酸ナトリウム１１Ｉ９／−を含有す る溶液で１５分間５５℃において２回３）最終的にＮａＣｔＯ，ＯＳ　６モル、 燐酸ナトリウム０．（）［１１Ｂモル（ｐＨ７，５）、Ｔ２ＤＴＡ　０．００１ モルを含有する溶液で室温において１回 オートラジオグラフィー ニトロセルロースフィルターは乾燥され、Ｘ線カセット中にコダック社製ＭＡＲ −５号フィルムおよびデュポン社製クロネツクスライドニングープラススクリー ント共ニー７０℃で３日間置かれた。しかる後フィルムはアグファ／ゲ゛・ぐル ト社製自動現像装置により現像された。

実施例　１ 血清学的組織タイプ分は法は、比較対照となる細胞の入手可能性に依存する。そ のような細胞は、通常１ケ所またはそれ以上の多形性ＭＭＣ遺伝子座において同 型接合である。本発明の方法が従来の方法に優ることを明示するために、同型接 合のタイプ分は細胞のＤＮＡを上述の操作に付した。用いられた細胞は、ＤＲ遺 伝子座において同型接合であり、それぞれ１．２．３．４．５．６．７および８ の特異性を有する第１群抗原を表わした。ＤＣ遺伝子座の第１群抗原に関する血 清学的タイプ分はデータは得られていなかった。

多くの場合第■群抗原のタイプ分けに用いられる抗血清が第１群抗原の鎖の両方 または一方に対抗する抗体を含むか否かは明らかでない。しかしＤＲおよびＤＣ のα鎖およびβ鎖のｃＤＮＡ挿入体が単離されたので、それらはすべて交雑にお けるプローブとして用いられた。

ＤＲのα鎖のｃＤＮＡば、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１またはＰｓｔ　 Ｉが分解に用いられた場合には、ＤＮＡがどのタイプ分は細胞から単離されたか にかかわらず、同一サイズの単一なバンドと交雑した。しかし分解が酵素ＢｇＡ 　ｎを用いて行われた場合にはＤＲタイプ１．３および６を検査したときにＤＲ のα鎖のプローブと交雑する特徴のある断片が得られた。その他すべてのＤＲタ イプについては、単一の交雑する断片はサイズにおいて同一であった（第２図の Ｐ列〜Ｘ列参照）。

酵素Ｂａｍ　ＨｌまたはＰｖｕ　Ｕのいずれかにより分解された同一のＤＮＡ標 品を用いてＤＣα鎖プローブとの交雑が実施された。第２図は異なるＤＲ特異性 を表わす８種類の細胞タイプがすべて独得な交雑パターンを生ずることを示す。

血清学的分析は現在のところ４種類のＤＣ抗原を表わしたのみであるから、ここ に示した分析は改善された分解能を提供すると結論され得る。さらに新規なりＣ α鎖対立遺伝子の発見は明白である。

ＤＲ同型接合細胞よりのＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼＰｖｕ　ＩＩで分解さ れ、サイズ分離の後ＤＮＡ断片はＤＲおよびＤＣのβ鎖プローブとそれぞれ交雑 せしめられた。第３図は、その結果を示す。交雑パターンが、用いられたプロー ブおよび細胞について独得であったことは明白である。

従って本発明は、ＤＲおよびＤＣのβ鎖対立遺伝子を同定する手段を提供し、本 発明の方法はさらに多くのβ鎖対立遺伝子を解像明示する。

第３図のデータは、ＤｐｉおよびＤＣのβ鎖対立遺伝子が用いられたｃＤＮＡプ ローブと交雑する多種類の断片を生ずることを示す。プローブ中の交雑する隣接 の配列部分は、イントロン配列により２回またはそれ以上中断されている対立遺 伝子のゲノム的配列に対応するから、このことは期待された結果である。このよ うなイントロンは、制限酵素切断部位を含むが用いられたプローブとは交雑しな い。しかしプローブと交雑する単一の試料中の多種類のＤＮＡ断片についての観 察は、プローブが１個以上の遺伝子のＤＮＡ断片と反応することを示す。第３図 のデータはＤＲおよびＤＣのβ鎖配列が用いられた条件下でごく僅力・ながら交 差的に交雑することを明らかに示すけれども、そのデータは解明を要する。この 目的のために、第３図の実験は反復され、ｃＤＮＡの翻訳済み区域および３′未 翻訳区域にそれぞれ対応するＤＲおよびＤＣのβ鎖プローブを用いた比較分析が 用いられた（第１図参照）。ＤＮＡ試料は、電気泳動および交雑に先豆ちＢａｍ Ｍｌで分解された。

第４図は２種類のＤＲβ鎖プローブを用いて得られた結果を示す。この制限酵素 を用いた場合にも未翻訳のプｏ　−ブが、翻訳済みプローブが生じさせたような それぞれのＤＲタイプに対する独得の交雑パターンを生じさせないことは明白で ある。しかし制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩを用いてＤＮＡ試料が分解された場合にはプ ローブ中の３′未翻訳のＤＲβ鎖により生ずる配置図は、ＤＲ特異性の異なるそ れぞれの細胞のタイプについて独得である（第５図）。しかしこのプローブと交 雑する制限断片の数は、Ｉ）Ｒβ鎖翻翻訳済プローブと交雑する断片数より少な い（第５図参照）。

第６図は、酵素ＢａｍＨ１で分解され、ＤＣのβ鎖の翻訳済区域および３′未翻 訳区域のそれぞれに対応するプローブと交雑した同型接合のタイプ分は細胞から のＤＮＡの制限パターンを示す。翻訳済区域のプローブが各々の細胞タイプにつ いて独得の制限酵素切断配置図を呈するのに対して３′未翻訳区域のプローブは 大部分の場合単一の断片とのみ交雑し、８種類の細胞タイプ中の５種類について は対立遺伝子を判別し得ながった（第６図のＪ列〜Ｎ列参照）。額面通りに受け 取れば、これらのデータはヒトの半数体ゲノムが単一のＤＣβ鎖遺伝子を含むこ とを示唆する。

第２〜６図に示されたデータは、各種のプローブおよび制限酵素を用いることに より、組織タイプ分けは本発明の方法に従って実施され得ることを明示している 。本方法はＤＣ遺伝子座に関するデータが例示するように、新規な第１群抗原（ ＨＬＡ−Ｄ）対立遺伝子の検出を可能ならしめるのみでなく、またα鎖およびβ 鎖の対立遺伝子を判別に分析する手段を提供し、それは従来がって血清学的手法 によっては達成し得ながったものである。

実施例　２ 本発明の方法の解像分離能を検討するために、ＤＮＡが血清学的タイプ分けでそ れぞれＤＲ７／７　（１個体）、ＤＲ２／７　（゛２個体）およびＤＲ２／２　 （１個）を発現するとタイプ分けされた４個体から単離された。被検者４個体は すべて遺伝的なつながりはなかった。それぞれからの試料は別々に酵素Ｐｖｕ　 （［およびＢａｍ　Ｈｌ　で分解され、ＤＲおよびＤＣのβ鎖のＣＤＮＡクロー ンの翻訳済プローブを用いて制限酵素切断位置地図が確立された。結果は第７図 に総括されている。予期の通りに、ＤＲβ鎖のプローブは用いられた酵素の種類 にかかわりなく２種類の同型接合の試料について特別な・ξターンをもたらした 。しかしながら、同型接合の２個体の合併した制限酵素切断位置地図は異型接合 の個体について記録された位置地図と同一であった。同様にＤＣβ鎖プローブは 、ＤＲ同型接合の個体について独得の位置地図を提供した。しかしながら、異型 接合の２個体についての位置地図は類似ではなく、そのうちの１個体についての み同型接合の個体の合併した位置地図と対応している。ＤＲおよびＤＣ遺伝子座 は、第６染色体上に互に近接して位置する。

この密接な連鎖関係により、所与のＤＲ対立遺伝子はしばしば所与のＤＣ対立遺 伝子と共に存在すると予期される。

しかしながら第７図に示されたデータは、この密接な連鎖関係にもかかわらず、 本発明の方法がＤＲおよびＤＣ遺伝子座をそれぞれ独立に分析し得ることを明示 している。

実施例　３ ＨＬＡ−ＤＲ表現型を評定するための血清学的分析も「混合淋巴球培養法］も共 に多大の熟練を要する。またそのような分析の再現性は容認し得ないほど近い。

本発明の方法の再現性を検討するために、ＤＮＡが２組の単一接合体性（−卵性 ）双生児から単離された。それぞれの試料は別々に扱われ、酵素分解の後に制限 切断位置地図作成に向けられた。第８図は、得られた制限切断位置地図がそれぞ れの組の双生児について同一であったことを示す。

すなわち制限酵素分解も、用いられたプローブもそれぞれの組の双生児に人工的 な差異を生せしめることはなかった。本発明の方法は明らかに再現性が高い。

実施例　４ ５２ｐ標識付のＤＣβ鎖ｃＤＮＡプローブ（以前よ、ｊ：ｌ　ｐＤＲ−β−１と 呼ばれる）　（Ｗｉｍａｎ氏その他ｒＰｒｏｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ　、Ｓｃｊ　 、ＵＳＡＪ第７９巻第１７０３〜１７０７頁（１９８２年）参服〕が合計９２個 体から単離されたＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分解の研究に用いられた。ラ ムダ・ファージのＤＮＡ断片が分子サイズの指示体として用いられた。

ヒトのＤＮＡは制限酵素Ｅｃｏ　Ｒ＋で分解され、生成した断片はゲル電気泳動 により分離され、サウザーン氏法による交雑に付された。

Ｅｃｏ　Ｒ１分解は、少なくとも８種類の異なる断片を生成。

した。すなわちｋｂ（キロベース）単位によるおよそのサイズが、２０．１３． １１．９．６．４．３５および２，２であった。

６ｋｂの断片は９２個体全部に存在した。１１ｋｂの断片は、完全にすべてでは 々いがほとんどすべてに存在した。

その他の断片は可変的に出現した。９ｋｂおよび２．２ｋｂの断片は対になって 出現した。すなわち両方共に出現かまたは不存在かのいずれかであった。

９２の個体はプローブと交雑するＤＮＡ断片について１７種類の異なる切断位置 図を示したが総個体数の２０％を包括する地図はなかった。器官移植または輸血 の供与者は、そのような処置を要する側の個体と同じ地図を示すグループ中から 探しめられる。

この研究において９２個体中の４５個体は健康な対照であり、３１個体はインシ ュリン依存性糖尿病（よりＤＭ　）患者であり、１６個体は非インシユリン依存 性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者と診断された。９　ｋｂ／２．２　ｋｂの同胞断片 の分離を下記に示す。

健康な対照　よりＤＭ　ＮよりＤＭ 断片を有する個体数　２２　３　８ 断片を有しない個体数　２３　２８　８ＩＤＤＭ患者の分析は二重の分析により 確認された。

この観察の意義は、ＩＤＤＭ患者妃は２．２／９ｋｂ同胞断片の欠落が一般の個 体群よりも高い頻度で生ずることである。可能な説明はよりＤＭ患者ではＨＬＡ −ＤＣβ鎖をコードする対立遺伝子中にＥｃｏ　Ｒ１による切断部位が欠けてい るということである。用られたプローブはＤＣβ鎖であυＤＲβ鎖ではな−こと に注目する必要がある。１または２個所の制限酵素切断部位の欠落が、遺伝子に ょクコードされる生成分子に影響を及ぼすことがあり得る。

■ＤＤＭ患者に２．２７９　ｋｂ同胞断片の頻度が低いという観察はまた、より ＤＭ患者ＬＤ１ＤＤ％近くがＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４あるいはＨＬＡ− ＤＲ３／４を発現するという観点からすれば劇的である。これらの対立遺伝子は 健康な個体群中の６０−以下にしか存在しない。

他の研究において発明者はＤＮＡがそれぞれ予めＢａｍＨｌおよびＰｓｔ　Ｉに より分解された場合にプローブと交雑する制限断片を検査した。比較のためにＥ ｃｏＲＩにより分解されたＤＮＡも検査した。個体群は関係のない５４個体で健 康人２５、そしてよりＤＭ患者２９であった。対象は交雑する断片の個体群中に おける頻度を想定するためにすべて無作為に選んだ。どの個体も予めＨＬＡ−Ｄ Ｒについてタイプ分けされていなかった。

健康な個体に比べてＩＤＤＭ恵者は交雑する２、２および９゜ｋｂのＲｃｏＲＩ 断片の予期された通りに低い頻度を示した（ｐ＜０．０１、上記参照）。またＤ Ｃβ鎖プローブと交雑する３、２ｋｂおよび３．７ｋｂの２個のＢａｍＨＩ断片 はよりＤＭ患者のＤＮＡ試料中では健康人に比べて低い頻度であった（ｐｃ＜０ ．００．１、第２表参照）。５８ｋｂのＢａｍＨＩ断片（ｐｃ　＜　０．０５　 ）オヨびＰｓｔ　Ｉ　Ｋ　ヨル４．９　ｋｂ　オヨび６．０ｋｂ（７）断片（１ ）ｃ＜　ｏ、ｏ　５　）はよりＤＭ患者において増大した頻度を示した。

２群の間の制限酵素切断位置地図の差異は、ＩＤＤＭ患者においてＨＬＡ−ＤＲ ３および／またはＤＲ４対立遺伝子が優勢であることにより説明され得る。しか し用いられたプローブはＤＣβ鎖のｅＤＮＡであり・、ＨＬＡ−ＤＲおよび−Ｄ Ｃ遺伝子座の間の正確な連鎖関係はまだ知られていないので、データについて疑 問の余地のない説明はまだ与えられない。

それにもかかわらず、よりＤＭ患者のＤＮＡにおいてＢａｍＨｌによる３、７ｋ ｂ断片の頻度が低下していることはよりＤＭと）（ＬＡ−ＤＲ２との間に確立さ れた負の連結に依存するとは考えられない（第１表参照）。それはＨＬＡ−ＤＲ ２同型接合のタイプ分は細胞のＤＮＡはとのＢａｒｎ　Ｈｌ断片を表わさないか らである（第６図のＢ列参照）。３．７ｋｂ断片の正確な超厚を確定するために はさらに多くの分析を要する（下記参照）。しかし３．７　ｋｂのＢａｍ　ＨＩ 断片はＩＤＤＭ患者の鳳を検査したときにはまれにしか観察されないのに対して 、同じ断片は健康人がＨＬＡ−ＤＲ４を発現している場合にもＤＮＡ中に一層高 い頻度（３０〜４０％）で現われることは多少とも充足を与える。

無作為に選ばれたＩＤＤＭ患者と健康人か・のＤＮＡは、Ｐｓｔｌによる１　８ 　ｋｂの断片の頻度について差異はない。■ＤＤＭ患者と健康人とのＤＮＡ中に おけるこの断片の頻度の差は、同一のＨＴ、Ａ、−ＤＲ表現型を表わす個体の間 で比較が行われた場合に妥当であるらしく思われる。

実施例　５ ＨＬＡ−ＤＲについて同一であるか１ｆｃは無作為に選ばれた健康人および糖尿 病患者からのＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼにより分解されたときに生成する サイズの異なる断片とＨＬＡ−ＤＣβ鎖のｃＤＮＡプローブとが交雑するか否か がテストされた。血清学的にＨＬＡ−ＤＲ４および／またはＶ４とタイプ分けさ れた個体のうちで、インシュリン依存性糖尿病（よりＤＭ　）患者はＰｓｔ　Ｉ による１８ｋｂのＤＮＡ断片の増大した頻度を示した。Ｂａｍ　ＨＩによるろ、 ７ｋｂのＤＮＡ断片は、健康人では頻度が高いが（３０〜４０％）、■ＤＤＭ患 者のＤＮＡ中にはまれにしか検出されなかった（０〜２％）。

スエーデンのリンケピング大学小児科において年令１８才以下で診断され、ＨＬ Ａ−ＤＲ３／−（５人）、ＤＲ４／−（８人）、またはＤＲろ／４（９人）を発 現しているよりＤＭ患者２２人からＤＮＡが単離された。ＨＬＡ−ＤＲ３３／３ 　ｔたは３／−（５人）、ＨＬＡ−ＤＲ４／４または４／−（７人）、あるいは ＨＬＡ−ＤＲ３／４　（１５人）を発現しているよりＤＭ患者２５人とＨＴ、Ａ −ＤＲ３（４人）、ＨＬＡ−ＤＲ４（９人）あるいはＨＬＡ−ＤＲ３／４　（１ ３人）を発現している健康対照人からの追加のＤＮＡ試料が凍結保存し予めＤＲ タイプ分けされた淋巴球から単離された。

第　２　表 無作為に選ばれたよりＤＭ患者および対照における制限断片の分布 ＥｃｏＲＩ　よりＤＭ（２９個体）　対照（２５個体）　ｐ値２．２　３　（１ ０％）　１２（４８％）　０．００２（！３．５　２３（７９％）　１６（６４ ％）　ＮＳ４．０　２６（７９％）　２０（８０％）　ＮＳ９．０　３（１０％ ）　１２（４８％）　０．００２゜１ｇ−ｏ　２１（７３％）　１５（６０％） ＮＳ２０．０　２５（８６％）　１４（５６％）　ｏ、ｏｉａＢａｍＨｌ　＊　 よりＤＭ（２９イ琳）　対照（２５イｌ１Ｂ）３．２　３（１０％）　１５（６ ０％）　ｏ、ｏｏｏｌ（１３，７０（０％）　１０（４０％）　０．０００１ｄ ５．８　２５（７９％）　１０（４０％）　０．００４ｂ６．２　’３（１０％ ）　１０（４０％）　ｏ、ｏｌａＰｅｔ　ｌ”　よりＤＭ（２７個体）　対照（ ２５個体）　ｐ　値４．０　７　（２６％）　３（１２％）　ＮＳ４．９　２１ 　（７８％）　９（３６％）　［１，００３ｂ５．１　１０（５７％）　１Ｂ（ ７２％）　０．０１ａ５．４　４（１５％）　１２（４Ｑ）　０．０１ａ６．０ 　２６（９６％）　１６（６４％）　０．００４ｂ／１．３　１８　（６７％） 　７（２８％）　０．００６ｂ１８．０　２３　（８５％）　１８（７２％）　 ＮＳよりＤＭと対照との間の差（フィッシャー比法により断片数に対して補正し た正確な検定値）　ａｐｃ＞０．０５、　ｐｃ＜０．０５、Ｃｐｃ＜０．０１、 ｄＩ’ｃ＜０．００１ＮＳは有意差なしの意味 傘ＢａｍＨＩ配列片中の３．２ｋｂと３．４　ｋｋ＋　、　４．Ｏｋｂと４．３ に’ｂ、および１０．Ｏｋｂと１２．０に’ｂは分解解像されなかった。個体間 で差のある配列片のみを示す。

傘＊Ｐｓｔｌによる１０ｋｂ、７．２ｋｂおよび６５ｋｂ配列片は調べられなか った。

無作為に選んだよりＤＭ患者（２９人）および対照健康人（２５人）から単離さ れた酵素分解されたＤＮＡの交雑、ξターンも比較された。全部の患者は年令３ ０才以前に診断され、インシュリン処置を受けていた。これらの患者および対照 健康人はすべてコーカサス人種であった。ＤＮＡ試料は別々に３種類の制限エン ドヌクレアーゼで分解さく３８） れた。ＤＣβ鎖ｃＤＮＡのプローブは、テストされた異なる個体におけるＢａｍ ＨＩによる断片５〜９個、ＩＩ！；ｃｏＲＩによる断片４〜７個およびＰｓｔ　 Ｉによる断片４〜８個と交雑した（第２表）。Ｂａｍ　Ｈｌによる配列片１０ｋ ｂ、’８．Ｏｋｂ、、７．０ｋｌ）および５．［ｌｋｂならびにＫｃｏＲＩによ る配列片１１ｋｂおよび６．５に’Ｏは検査された全個体に存在したが、その他 の配列片の存否は一定でなかった。

第９図はそれぞれＢａｍＨｌ（第１〜第６列）、ＥＣＯＲ＋（第４〜第６列）お よびＰｓｔ　Ｉ　（第７〜第９列）により分解された３人の無関係なＨＬＡ−Ｄ Ｒ３／４の対照健康人で検出された制限酵素断片を示す。ＢａｍＨｌによる３、 ７ｋｂおよび１２ｋｂの配列片、ＥｃｏＲＩによる２０ｋｂならびにＰｓｔ　Ｉ による１８ｋｂおよび５．１ｋｂの配列片は個体により存否一定でなかった。

ＢａｍＨＩによる３、７ｋｂおよびＰｓｔ　ｌによる１８ｋｂの配列片の頻度は ＨＬＡ−ＤＲに関して同一と血清学的にタイプ分けされたよりＤＭ患者と健康人 との間で異なっていた（第４表）。

Ｐｅｔ　ｌによる１８ｋｂの配列片は、ＨＬＡ−ＤＲ４およびＤＲＩを発現する ＩＤＤＭ患者において増大した頻度で存在した。

ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現する患者は、ｐ値が観察されたＰｓｔｌ断片の数 について補正された場合でさえも対照と差異があった（ｐ。＜０．０１）。Ｂａ ｍＨＩによる３、７ｋｂの配列片の頻度は、対照に比べてＩＤＤＭ患者において 明らかに低下した（ｐｃ＜ｏ、ｏ　１）。３．７ｋｂの配列片を有するＨＬＡ− ＤＲ３および／またはＤＲ４陽性の８個体のうち６個体はＰｓｔ　Ｔにょる（３ ９） １８　ｋｂの断片を欠いていた。これらの結果は、ＨＬＡ−Ｄ区域のβ遺伝子の ヌクレオチド配列片が存在し、そしてそれがよりＤＭに結びつくことを明示する 。

第　３　表 テストされた個体中のＨＬＡ−ＤＣβ鎖のｃＤＮＡプローブにより検出された制 限断片のうち変動するものと一定のもへ＊）ＫｃｏＲＩ　２０　１３　１１”　 ９．０　６５　４．０　３．５　２２　ｋｂＢａｍＨｌ　１２　１０”　８．０ ”　７．０”　６．２　５．８　５．０”　４．３　３．７　３．２ｋｂＰｓｔ 　ｌ　１８　１０　７．２　６．５　６．３　６．０　５Ａ　５．１　４．９　 ４．０ｋｂＨＬＡ−ＤＲタイプのよりＤＭおよび対照個体中のＨＬＡ−ＤＣ婦プ ローブにより検出されたＰｓｔｌによる１８ｋｂ、Ｉ５−よびＢａｍＨｌによる ３、７ｋｂ制限工ンドヌクレアーゼ切断片ＨＬＡ−ＤＲ３／４ 全個体 （４０）　１８表昭５９−５００３６２（１２）＊　ＩＤＤＭおよび対照個体は 、共にそれぞれＨＬＡ−ＤＲ３（３／３または３／−）およびＨＬＡ−ＤＲ４（ ４／４または４／−）を発現するもののみを選んだ。

ａ　フィッシャー氏の正確な検定法がよりＤＭ個体と対照個体との間の差を検定 するために用いられた。ｐ値に観察された断片数を乗じた結果は、補正されたｐ 値（ｐ。）としてｂｐ。〉００５、Ｃｐｏ〈００１となった。

図　面　の　説　明 第１図　二硫化物（ジスルフイツド）を含むαおよびβ鎖よりなる第■群抗原分 子の模式図（中段）。第■群抗原のα鎖およびβ鎖ｃＤＮＡプローブなもびにそ れらを単離するために用いられた制限酵素切断位置は図の上段および下段に示さ れている。それらのおよその長さは、１００ｂｐ（塩基対）ごとの目盛をつけた 線により推定される。β鎖ｃＤＮＡクローンの翻訳済（ＴＲ）および６′未翻訳 （ＵＴ）プローブが用いられたのに対して、α鎖プローブは両者とも翻訳済部分 に対応する。

第２図　ＤＣα鎖ｃＤＮＡプローブ（第１図参照）とＤＲ特異性（１〜８）につ いて同型接合であると血清学的にタイプ分けされた個体のＤＮＡとの交雑（Ａ列 〜Ｐ列）。ＤＮＡは別々にＢ＠ｍＨＩ（Ａ列〜Ｈ列）およびＰｖｕ　ｎ　（Ｉ列 〜Ｐ列）により分解された。同じＤＮＡはまたＢｇｌ　ＩＩにより分解され、Ｄ Ｒα鎖ｃＤＮＡプローブと交雑せしめられた（Ｑ列〜Ｘ列）。ＤＲ’　１同（４ １） 型接合ＤＮＡはＡ列、１列および。列に出現し、ＤＲ８同型接合ＤＮＡはＰ列、 Ｈ列および、１列に現われている。

第３図　ＤＲ（Ａ列）およびＤＣ（Ｂ列）β鎖翻訳済プローブとＤＲ特異性（１ 〜８）について同型接合であると血清学的にタイプ分けされた個体のＤＮＡとの 交雑（上記の各列）。図には断片のサイズ（ｋｂ）によるバンドの位置を標示し である。

第４図　ＤＲ特異性（１〜８）について同型接合であると血清学的にタイプ分け された個体のＤＮＡとＤＲβ鎖ｃＤＮＡの翻訳済プローブ（Ａ列〜Ｈ列）および ６′未翻訳プローブ（工列〜Ｐ列）との交雑（Ａ列および１列はＤＲＩＤＮＡを 示し、Ｈ列およびＰ列はＤＲ８ＤＮＡを表示する）。ＤＮＡ　ｌ′ｉＢａｍ　Ｈ Ｉにより分解された。

第５図　第４図と同一の実験。ただしＤＮＡはＢａｍ　Ｈｌではな（ＰｖｕＩｌ によシ分解された。

第６図　第４図に記述したのと同様のＤＣβ鎖ｃＤＮＡの翻訳済プローブ（Ａ列 〜Ｈ列）および５′未翻訳プローブ（１列〜Ｐ列）の交雑。ＤＮＡはＢａｍＨＩ により分解された。

第７図　ＤＲ（第１〜第８列）およびＤＣ（第９〜第１６列）β鎖ｃＤＮＡの翻 訳済プローブと、ＤＲβ鎖遺伝子座において表現型的に同型接合である２個体の ＤＮＡとの交雑（ＤＲ７／７は第１、第５、第９および第１３列ならびにＤＲ２ ／２は第４、第８、第１２および第１６（４２） 列）およびＤＲ特異性（ｖ７）を発現すると血清学的にタイプ分けされた２個体 のＤＮＡとの交雑（第２、第６、第１０および第１４列は異型接合の１個体の制 限パターンを示し、これに対して他の１個体のパターンは第３、第７、第１１お よび第１５列に示される）。ＤＮＡの一定量は別々にＰｖｕＩＩ（第１〜第４列 および第９〜第１２列）ならびにＢａｍＨＩ（第５〜第８列および第１３〜第１ ６列）により分解された。

第８図　ＤＣ（第１、第２、第５、第６、第９、第１０．第１６および第１４列 ）およびＤＲ（第３、第４、第７、第８、第１１、第１２、第１５および第１６ 列）β鎖ｃＤＮＡの翻訳済プローブと２組（それぞれ品およびＢＢ）の１卵性双 生児のＤＮＡとの交雑。第１〜第８列は品双生児のＤＮＡを示し、第９〜第１６ 列はＢＢ双生児のＤＮＡを示す。第１〜第４列および第９〜第１２列のＤＮＡは Ｐｖｕ　［１により分解されたのに対して第５〜第８列および第１３〜第１６列 のＤＮＡはＢａｍＨｌにより分解された。

２０　第９図　ＤＣβ鎖ｃＤＮＡの翻訳済プローブと健康で遺伝的に無関係な３ 個体のＤＮＡとの交雑。各個体のＤＮＡ調製物は、別々にＢａｍＨＩ（第１〜第 ３列）、Ｅｃｏ　Ｒ１（第４〜第６列）およびＰｓｔ　ｌ　（第７〜第９列）に より分解された。

国際調査報告 ＋０＋＊ｒｌ＋−＋＋ローａ＋ＡＤ９１１ｅｓｌｌｏｎ＋＋ｅ、ＰＣＴ／５Ｅ８ ３１０００８４第１頁の続き ■出　願　人　ラスタ・ラース スウェーデン国ニス−７５２６３ウプサラ・セーヴエスヴ工−グ１４ ■出　願　人　レルンマーク・オーケ スウェーデン国ニス−２１６１１マルミヨ・ビルイエルヤールスガタン６１ ■出　願　人　オウアーバーク・デイビッドデンマーク国デ・ニー２８２０ゲン トフテ・エアメルンスヴアイ４５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ヒトのＭＭＣの塩基配列と交雑するプローブが制限酵素切断位置地図の作成 に用いられ、第１の個体に由来しプローブと交雑するＤＮＡ断片のサイズ分布が 第２の個体よりの対応する断片の分布または対応する特定のタイプの多形性の断 片分布と比較され、その比較はいずれもａ）上記の他の個体が上記の第１の個体 に移植または輸血の目的で組織を供与する場合の遺伝的適当性、ｂ）上記の第１ の個体が１個またはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子に関係する特定の疾患にかかる 相対的危険度、Ｃ）上記第１の個体の父Ｍまたは母親認知、または、ｄ）法医学 に用いる上で上記の第１および第２の個体が１個またはそれ以上のＭＨＣ対立遺 伝子の同一の多形性を示すか否かをしらべるために行われることを特徴とする、 器官移植、輸血、法医学における利用、父親または母親の認知またはある個人が ある種のＭＭＣ対立遺伝子に関係する疾病にかかる相対的危険度を予察する目的 で組織タイプ分けにおけるヒトのＭＭＣの多形性を決定するための方法。 ２、　プローブがａ）第■群遺伝子産物（抗原）をコードするｍＲＮＡと相補的 なＣＤＮＡ　、　ｂ）実際の第■群遺伝子および／またはそれらの両翼を守る塩 基配列を表わすケ゛ツムＤＮＡ　、およびＣ）それらの断片から選ばれることを 特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ６、　第■群遺伝子がＨＬＡ−Ｄ遺伝子産物をコードする遺伝子であることを特 徴とする請求の範囲第１項および第（４４） ２項記載の方法。 ４、　プローブが第■群抗原のα鎖またはβ鎖をコードするｍＲＮＡのいずれの 部分とも相補的であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。 ５　プローブが実際の第■群遺伝子および／またはそれらの両翼を守る塩基配列 あるいはそれらの断片を表わすゲノムＤＮＡ配列であることを特徴とする請求の 範囲第１項または第２項記載の方法。 ６　ヒトのＤＮＡが１種類またはそれり上の制限エンドヌクレアーゼで処理され 、生成するＤＮＡ断片が分子のサイズにより分離され（好適にはゲル電気泳動に より）　、ＤＮＡを結合するシート（好適にはニトロセルロースシート）に移さ れ、しかる後フィルターがプローブに接触せしめられ、プローブとサイズの異な るＤＮＡ断片の相補性の塩基配列との結合が同定されることを特徴とする請求の 範囲第１項または第２項記載の方法、 ｌ　プローブが分析的に指示可能な基または原子により標識付けられていること を特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。 ８　断片の分布が断片の出現について検査され、その存在または不存在がある個 体が１個またはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子に関係する疾患に罹病する相対的危 険度の指標となることを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。 ９　制限酵素がＫｃｏＲＩであり、ｍＲＮＡが第■群抗原のβ鎖をコードし、断 片の分布が２個の対になった断片９ｋｂおよび２．２１ｃ’ｂの出現について検 査され、個体におけるその不存在はその個体ではインシュリン依存性糖尿病に罹 患する相対的危険度の増大を示すことを特徴とする請求の範囲第４項および第６ 項記載の方法。 １０　制限酵素がＢａｍＨｌであり、断片の分布が３．７ｋｂ断片の出現につい て検査され、個体中にそれが不存在の場合にはその個体がインシュリン依存性糖 尿病に罹患する相対的危険度の増大を示すことを特徴とする請求の範囲第４項お よび第６項記載の方法。 １１　制限酵素がＰｓｔ　Ｉであり、断片の分布が１８ｋｂ断片の出現について 検査され、それが血清学的に定義されるＨＬＡ−ＤＲ４’ｔたはＤＲ３／４を発 現する細巾に存在することはその個体がインシュリン依存性糖尿病に罹患する相 対的危険度の増大を示すことを特徴とする請求の範囲第４項および第６項記載の 方法。 １２、第■群遺伝子産物（抗原）、実際の第■群遺伝子を表わすゲノムＤＮＡお よび／またはその両翼を守る配列片および断片をコードするｍＲＮＡに相補的な ｃＤＮＡがら選ばれることを特徴とする請求の範囲前記各項記載の方法のいずれ かにおいて用いられるプローブ。 １３、第■群遺伝子産物（抗原）をコードするｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡであ ることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のプローブ。 １４、実際の第■群遺伝子および／またはその両翼を守る塩基配列およびその断 片を表わすゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のプロ ーブ。 １５、第■群遺伝子がＨＬＡ−Ｄタイプのものであることを特徴とする請求の範 囲第１２項記載のプローブ。 １６　選ばれた個体群（好適には家族）中の各個体からのＤＮＡの地図が作成さ れ、その地図が患者および健康者の地図中の特定の断片の存在または不存在とそ の個体群中における特定の疾患の出現とが関係づけられることを特徴とする請求 の範囲第１項または第２項記載の方法。 １Ｚ　第■群遺伝子および遺伝子産物がＨＬＡ−ＤＣタイプのものであることを 特徴とする請求の範囲第１２項記載のプローブ。 １８、第■群遺伝子および遺伝子産物がＨＬＡ−ＤＲタイプのものであることを 特徴とする請求の範囲第１２項記載のプローブ。 １９　第■群遺伝子および遺伝子産物がＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＣ区域の ものであることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。