JPS594999B2 - 検体中の微量成分分析方法および装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は検体中の微量成分分析方法卦よび装置、特にペ
ルオキシダーゼを含む検体中の微量成分を分析する改良
された方法卦よび装置に関する。

有機物の酸化を触媒する酵素としてペルオキシダーゼが
種々の生化学的分析に用いられ、特に抗源の分析に広範
囲に用いられている。このような酵素を用いた分析時に
検体中の微量成分を良好な感度で分析する必要があるが
、従来の方式では、良好な感度でかつ短時間にペルオキ
シダーゼを含む検体あるいはペルオキシダーゼで標識さ
れた検体中の微量成分を分析することができないという
問題があつた。本発明は上記従来の課題に鑑みなされた
もので、その目的良好な感度で迅速に微量成分の分析を
行うことのできる改良された方法卦よび装置を提供する
ことにある。

上記目的を達成するために、本発明はペルオキシダーゼ
を含む検体にペルオキシダーゼと反応して発光現象を生
じる発光試薬を加えて発光させ、この発光量を測定して
発光量に比例した検体中の微量成分を分析することを特
徴とする。

本発明は更に前述した検体卦よび発光試薬の混合物を暗
箱中に収容し、暗箱内での発光を暗箱内に対向する受光
面を有する光電子倍増管により光電変換して電気信号と
して取り出し、この電気出力により発光量に比例した検
体中の微量成分を分析することを特徴とする。

本発明に卦いて、発光試薬としては、ルミノール訃よび
過酸化水素が好適であり、また本発明に卦いては、ペル
オキシダーゼ自体あるいはペノレオ３キシダーゼにて標
識された検体中の微量成分を競合反応させ、このときの
標識酵素量を発光試薬の添加による発光量によう分析す
ることができる。

また本発明によれば、前述した標識酵素量から酵素の活
性度を測定することが可能となる。本発明に卦いて、検
体卦よび試薬の混合物は直接暗箱内の収容部に挿入され
てもよく、また混合物が注入されたバイヤルを暗箱の収
容部に保持することも可能である。本発明に卦いて、暗
箱の混合物収容部はその底部に透明な合成樹脂等の透明
膜あるいは透明板（以下透明板という）を有し、光電子
増倍管の受光面を透明板に対向配置することにより、収
容部に卦ける発光量を効果的に光電変換することが可能
となる。

本発明に卦いて、光電子増倍管への外光入射を防止する
ため、暗箱には光シヤツタを設けることが好ましく、ま
た暗箱の混合物収容部には発光反応を促進するための振
とう装置が設けられることが好適である。

本発明に卦いて、光電子増倍管の電気出力は所定の反応
時間中計数され、また混合物の反応開始から所定の遅延
時間経過後に、計数作動を開始することが好適である。

以下本発明の好適な実施例を説明する。

ペルオキシダーゼを含む検体あるいはペルオキシダーゼ
にて標識された検体はルミノール卦よび過酸化水素から
成る発光試薬の添加により発光現象を生じ、この反応に
卦いて、ペルオキシダーゼは触媒として作用し、このと
きの反応が以下に示されている。

上記の反応から明らかなように、検体中のペルォキシダ
ーゼは発光量に比例した計数値として定量測定され、こ
の発光量は光電子増倍管等により電気的に高精度でかつ
迅速に測定することが可能である。

第１図には、ペルオキシダーゼの標識溶液をルミノール
卦よび過酸化水素から成る発光試薬により検量したとき
の検量線が示され、横軸にとつた種々のペルオキシダー
ゼ濃度に対して、縦軸の発光量が光電子増倍管の電気出
力による計数値として示されている。

まず任意に選択された濃度のペルオキシダーゼ標準溶液
を０．５ｍ１とわ、これをバイヤル中に注入し、これに
ルミノールの１０−４Ｍ溶液を０．２ｍ１そして過酸化
水素の１０−４溶液０．２ｍ１から成る発光試薬を注入
混合する。

前述した反応から明らかなように、この検体と試薬との
混合により、第２図の特性図で示される発光現象が生じ
る。すなわち、混合時点（ｔ１）から発光量Ｌが急激に
増大し、最大点を経て反応物質の減少とともに発光量が
減衰する特性を示す。第１図に卦いては、混合時点（ｔ
１）から１５秒経過した後の３０秒間の発光量を光電子
増倍管により光電変換して、このときの電気出力を計数
した結果が示されている。第１図の特性から明らかなよ
うに、実施例によれば、１０−５ｕ／バイヤルの微量ペ
ルオキシダーゼを良好な感度で測定することができ、ま
たペルオキシダーゼ濃度変化に対して良好な直線性で分
析作用を行うことが可能となる。以上のように、本発明
によれば、ペルオキシダーゼを含む検体からペルオキシ
ダーゼと反応する微量成分の分析を正確に行うことが可
能となり、種々の応用分野に適用することが可能となる
。本発明の好適な実施例として、コルチゾールにペルオ
キシダーゼを標識して検体中の微量成分と競合反応させ
、コルチソールの分析を行うエンザイムイムノアツセイ
法に｝いて、ペルオキシダーゼの標識酵素量を本発明に
基づいて分析した実施例を第３図を参照しながら説明す
る。

このときの分析は以下の手順により行われる。１．エル
チゾール第２抗体（１０００倍稀釈液）をポリエチレン
バイヤルに１ｍ２注入する。

２．４℃でインキユベーシヨンを行う。

３．上澄みを捨て洗浄し、バィヤルにコルチゾール第２
抗体を吸着させる。

４．コルチゾール第１抗体（５００倍稀釈液）０．１ｍ
１１コルチゾール試料０．１ｍ１卦よびコルチゾールに
ペルオキシダーゼを標識した液（５０００倍稀釈液）０
．５ｍ１をバイャルに入れ混合する。

５．４℃でインキユベーシヨンを行う。

６．上澄みを捨て、試料のコルチゾールとペルオキシダ
ーゼで標識したコルチゾールとを競合反応させ、バイヤ
ルに固定させる。

７．ルミノールの０．０１Ｍ溶液０．２ｍ１卦よび過酸
化水素の０．０１Ｍ溶液０．２ｍ１から成る発光試薬を
バイヤルに注入して、標識ペルオキシダーゼに発光試薬
を混合させる。

８．混合後３０秒から６０秒までの３０秒間の発光量を
光電子増倍管により測定する。

第３図の検量線から明らかなように、本実施例によれば
、１０−２ｎｇ／バイヤルのコルチゾールを測定するこ
とができ、極めて微量の標識酵素量の分析を良好な感度
で行うことが可能となる。

本発明によれば、標識酵素量の分析により、酵素の活性
度をも正確に測定することが可能となる。以上説明Ｌ２
たように、本発明によれば、ペルオキシダーゼを含む検
体中の微量成分が発光試薬の添加による発光現象によ如
正確に分析することができるが、発光測定時に外光の影
響を避けるために、発光量の測定は暗所で行わなければ
ならず、このための好適な分析装置を以下に説明する。
第４図には、本発明に係る微量成分分析装置の好適な実
施例が示されている。暗箱１０はその内部にペルオキシ
ダーゼを含む検体卦よびペルオキシダーゼと反応して発
光現象を生起する発光試薬の混合物を収容する収容部１
２を有し、図示した実施例に卦いては、収容部１２はバ
イヤル等の容器保持部から形成されている。第４図には
、検体卦よび試薬の混合物が注入されたバイヤル１４が
保持部に保持された状態が示され、バィヤル１４は暗箱
１０の収容口１６から収容部１２内に挿入され、収容口
１６には、収容部１２内に外光が入射されることを防止
するために、第１のシャッタ１８が開閉自在に設けられ
ている。収容部１２の底部には合成樹脂等から成る透明
板２０が固定され、バイヤル１４は透明板２０上に載置
される。暗箱１０の下部にはしや光室２２が設けられ、
しや光室２２内には光電子増倍管２４が固定配設されて
いる。光電子増倍管２４の受光面２４ａは暗箱１０の内
部に対向して設けられ、図示した実施例に卦いては、収
容部１２と受光面２４ａとの間には第２の光シヤツタ２
６が開閉自在に設けられている。前記両シヤツタ１８，
２６は図示しない連動装置により連動制御され、第１の
シヤツタ１８を開放する時には第２のシヤツタ２６が閉
止され、また第１のシヤツタ１８が閉止する時には第２
のシヤツタ２６が連動して開放制御される。光電子増倍
管２４にて光電変換された電気出力は増幅計数回路２８
に導かれ、その計数値が表示部３０にて表示される。実
施例において、増幅計数回路２８の計数作用は時間設定
回路３２から印加される計数ゲート信号により制御され
、バイヤル１４内の混合物の所定の反応時間中光電子増
倍管２４からの電気出力が増幅計数される。時間設定回
路３２はタイマ卦よび遅延回路を含み、スイツチ３４の
反応開始信号から所定の遅延時間経過後、タイマにより
定められる所定時間の計数ゲート信号が増幅計数回路２
８に供給される。スイツチ３４はバイヤル１４内での混
合物の反応開始とともにオン作動される足踏みスィツチ
等の手動スイツチもしくは反応開始により自動的にオン
作動される連動スイツチから成り、時間設定回路３２に
反応開始信号を供給する。本発明の好適な実施例は以上
の構成から成り、以下にその作用を説明する。

分析開始以前には、第１の光シヤツタ１８が開放され、
そして第２の光シヤツタ２６が閉止されている。

従つて、光電子増倍管２４へは外光が入射されることな
く、その電気出力が零値を示し、増幅計数回路２８の計
数作用が行われないため、表示部３０の表示も零値を示
す。次にペルオキシダーゼを含む検体｝よび検体に加え
られて発光現象を生起するルミノール卦よび過酸化水素
等の発光試薬が暗箱１０の外でバイヤル１４に注入混合
され、検体卦よび試薬の混合と同時にスイツチ３４がオ
ン作動される。

前記混合により、検体と試薬とは化学的もしくは生化学
的な反応を開始し、，このとき検体中の微量成分に対応
する発光現象が生起する。バイヤル１４は直ちに暗箱１
０の収容部１２に挿入され、この後第１の光シヤツタ１
８が閉止されるとともに、第２の光シヤツタ２６が開放
される。前述した時間設定回路３２の遅延時間は反応開
始から両シャッタ１８，２６の開閉制御が行われるまで
の経過時間より大きく設定されて卦り、前述したバイヤ
ル１４の収容部１２への保持卦よび両シヤツタ１８，２
６の開閉作動が完全に完了した後に、増幅計数回路２８
の計数作用が行われる。バイヤル１４内の発光は透明板
２０を通して光電子増倍管２４の受光面２４ａに入射し
、光電子増倍管２４からは発光量に比例した電気出力が
得られる。

この電気出力は増幅計数回路２８により計数され、この
計数時間は時間設定回路３２のタイマによ）定められた
所定時間で制御されるので、検体卦よび試薬の混合によ
る発光量は発光開始から所定時間経過後の所定の反応時
間だけ計数されることとなる。増幅計数回路２８の計数
値は表示部３０により直ちにデジタル表示され、発光量
に対応する検体中の微量成分を分析表示することができ
る。第５図には、第４図の実施例に卦ける経過時間ｔに
対する発光量Ｌの一般的な特性が示され、検体と試薬と
を混合した時点（Ｔ，）から発光置Ｌが急速に増加し、
最大点を経て反応物質の減少とともに減衰する特性とな
ることが理解される。

前述した実施例に卦いて、時間設定回路３２の遅延時間
はＴ１に、そしてタイマの計数時間がＴ２に設定されて
いる。従つて、増幅計数回路２８は時刻Ｔ２から計数作
用を開始し、時刻（Ｔ２）よ如以前に暗箱１０内では前
述したシヤツタ１８，２６の連動作用が完了している。
そして、増幅計数回路２８はＴ２期間の光電出力を積分
計数し、発光量すなわち検体中の微量成分量に比例した
計数値を表示部３０へ供給することができる。図示した
実施例に卦いては、時間設定回路３２により反応開始時
点（Ｔ，）から計数開始時点（Ｔ２）までの期間を一定
値に定めているので、バイャル１４中に検体訃よび試薬
を注入してからバイヤル１４を収容部１２に収容するま
での時間にばらつきがあつても、常に安定した良好な精
度の計数値を得ることが可能となる。実施例に卦いて、
反応開始信号はスイツチ３４のオン作動により得られ、
このために、スイツチ３４は足踏みその他の手動スイツ
チから形成することができ、また検体と試薬との自動混
合装置を用いる場合には、自動混合装置と連動する連動
スイツチにより正確な反応開始信号を得ることができる
。

図示した実施例に卦いて、暗箱１０の収容部１２の底部
に設けられた透明板２０は光電子増倍管２４への発光入
射路を形成するとともに、収容部１２内で混合物が漏洩
した場合に、光電子増倍管２４を保護するためにも好適
である。

第４図の実施例に卦いては、暗箱１０の外で検体卦よび
試薬がバイヤル１４中に注入され、このバイヤルが収容
部１２に収容されるが、暗箱１０の収容部１２自体に直
接検体もしくは試薬を注入することも可能であう、この
ための好適な実施例が第６図に示されている。

第６図において、暗箱１０の収容口１６には袋ナツト３
６によりゴム板３８が固定され、外光が収容部１２内に
入射されることが確実に防止されている。収容部１２内
にはバイヤル１４が予め設置され、検体または試薬はシ
リンジの針４０でゴム板３８を貫通させることにより、
シリンジからバイヤル１４へ注入される。第６図の実施
例によれば、第４図に卦けるシヤツタ１８，２６の連動
構造を必要とすることなく、外部からの外光入射を防止
しながら検体または試薬を収容部内に注入することがで
きる。

更に第６図の実施例によれば、第４図に卦ける時間設定
回路３２の遅延時間を零に設定することにより、反応開
始とともに光電子増倍管２４の電気出力計数二を行うこ
とができる。第７図には、遅延時間を設けることなしに
、反応開始時点（ｔ１）からタイマにより定められた所
定時間Ｔ経過後の時点（Ｔ３）までの計数を行う状態が
示され、検体卦よび試薬の混合と同時に発光Ｃ量Ｌの積
分作用が行われる。

第８図には、本発明の更に他の実施余が示され、検体容
器４２卦よび試薬容器４４から分注器４６，４８にて検
体卦よび試薬力哨動的に暗箱１０の収容部１２内に設け
られたバイヤル等の反応容器に注入される自動化された
分析装置が示され、多種類の検体卦よび試薬から任意の
組合せで混合物を得ることができ、極めて迅速にかつ正
確な分析作用を行うことができる。

この自動分析装置においては、反応容器１４の底部から
分析済み混合物が３排出ポンプ５０によ勺排出される。
以上の各実施例に卦いては、光電子増倍管が暗箱の下部
に設置されているが、本発明に卦いては、光電子増倍管
の受光面を暗箱内部に対向設置すればよく、周知の光フ
アイバ等を利用して間接的に受光面を暗箱内部に対向さ
せることも可能である。

更に本発明に｝いては、検体訃よび試薬の混合を促進す
るために種々の振とう装置を収容部に設けることが好適
であわ、検体卦よび試薬の注入後の両者の混合拡散時間
遅れを生じることなく分析結果のばらつきを減少するこ
とができ、振とう装置としては、バイヤル等の反応容器
を回転、振動する方式、反応容器に攪拌気体を供給する
方式あるいは反応容器に超音波を印加する方式等が好適
である。以上説明したように、本発明によれば、ペルオ
キシダーゼと発光試薬との反応により生じる発光を光電
変換して電気的に微量成分の分析を行うので、極めて高
精度の分析を短時間に行うことができ、種々の分析に適
用可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る微量成分分析方法によるペルオキ
シダーゼの標準溶液の検量線を示す特性図、第２図は本
発明の分析に用いられる発光現象を示す特性図、第３図
は本発明の分析方法によりコルチゾールを検量した特性
図、第４図は本発明に係る微量成分分析装置の好適な実
施例を示す概略構成図、第５図は第４図に卦ける分析作
用を示す発光特性図、第６図は本発明に係る分析装置の
の他の実施例を示す要部断面図、第７図は第６図図の実
施例に卦ける発光特性図、第８図は本発明に係る分析装
置の好適な他の実施例を示す概略構成図である。 １０・・・・・・暗箱、１２・・・・・・収容部、１４
・・・・・・バイヤル、１６・・・・・・収容口、１８
・・・・・・第１のシヤツタ、２０・・・・・・透明板
、２４・・・・・・光電子増倍管、２４ａ・・・・・・
受光面、２６・・・・・・第２のシヤツタ、２８・・・
・・・増幅計数回路、３０・・・・・・表示部、３２・
・・・・・時間設定回路。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ペルオキシダーゼを含む検体にペルオキシダーゼと
   反応して発光現象を生じる発光試薬を加えて発光させ、
   この発光量を測定して発光量に比例した検体中の微量成
   分を分析することを特徴とする検体中の微量成分分析方
   法。 ２ 特許請求の範囲１記載の方法にひいて、発光試薬と
   してルミノールおよび過酸化水素が用いられていること
   を特徴とする検体中の微量成分分析方法。 ３ 特許請求の範囲１、２のいずれかに記載の方法にお
   いて、検体をペルオキシダーゼにて標識し、検体中の微
   量成分と競合反応させ、この標識酵素量を発光試薬の添
   加による発光量により分析することを特徴とする検体中
   の微量成分分析方法。 ４ 特許請求の範囲１、２、３のいずれかに記載の方法
   において、酵素の活性度を測定することを特徴とする検
   体中の微量成分分析方法。 ５ ペルオキシダーゼを含む検体およびペルオキシダー
   ゼと反応して発光現象を生起する試薬の混合物を収容す
   る暗箱と、暗箱内に対向する受光面を有する光電子倍増
   管と、を含み、光電子倍増管の電気出力により発光量に
   比例した検体中の微量成分を分析することを特徴とする
   検体中の微量成分分析装置。 ６ 特許請求の範囲５記載の装置において、暗箱の混合
   物収容部は混合物が注入された容器を保持する保持部か
   ら形成されていることを特徴とする検体中の微量成分分
   析装置。 ７ 特許請求の範囲５、６のいずれかに記載の装置にお
   いて、混合物収容部はその底部に透明板を有し、光電子
   倍増管の受光面が透明板に対向配置されていることを特
   徴とする検体中の微量成分分析装置。 ８ 特許請求の範囲５、６、７のいずれかに記載の装置
   において、暗箱には混合物の収容口に設けられた第１の
   光シャッタおよび収容部と光電子増倍管との間に設けら
   れた第２の光シャッタが設けられていることを特徴とす
   る検体中の微量成分分析装置。 ９ 特許請求の範囲８記載の装置において、第１の光シ
   ャッタおよび第２の光シャッタは互いに連動制御されて
   いることを特徴とする検体中の微量成分分析装置。 １０ 特許請求の範囲５、６、７、８、９のいずれかに
   記載の装置において、光電子倍増管の電気出力は混合物
   の所定の反応時間中計数されることを特徴とする検体中
   の微量成分分析装置。 １１ 特許請求の範囲１０記載の装置において、光電子
   倍増管の電気出力は混合物の反応開始から所定の遅延時
   間経過後その計数作動が開始されることを特徴とする検
   体中の微量成分分析装置。 １２ 特許請求の範囲５、６、７、８、９、１０、１１
   のいずれかに記載の装置において、暗箱の混合物収容部
   には混合物振とう装置が設けられていることを特徴とす
   る検体中の微量成分分析装置。