JPS5934883A - 動物に由来する細胞の培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明ｔｉｔ、動物に由来−する細胞の培養法に関する
ものである。

動物細胞を培養することは生物科学的実験研究およびホ
ルモン、ワクチン、酵素などの工業的生産の両面におい
てますます重要になりつつある。

これらの細胞の培養においては、血清の培地中への添加
がほとんどの場合必須であることは良く知られていＺ）
。しかしながら、血清はその供給が不安定であ訪、品質
の一定したものが得られにくく、液体であるＡ：めに保
存・堆扱いが困難で、また非常に高価であるという欠点
を持っている。そのため生物和学的実験研究やホルモン
などの工業的生産における細１ｊ；ｉｊ、培養の発展が
太きく阻害されてさた。このよう若−欠点を１ψｆ決す
るため、これまで各種のホルモンやタンパク質を添加す
ることによって、培養に必要な血清量を低減しようとす
る研究は数多く知られている１、これらの従来の無廂清
搾たは低皿消培地に関する研究は、はとんど樹立細胞株
や異斂体細胞に関するものであり、高疾度廂清添加培地
と回稈度に増殖するに至った例はあまり知られでいない
７、特に、ホルモン、ワクチン、酵素などの工業生産に
通していると考えられているｉＥ常二倍体細胞では、無
血清または低血清境地が確立された例はほとんどない１
、 本発明者らに、この問題を解決すべく、動物に由来する
細胞を無血清または低血清培地で培養する方法について
鋭意研究を重ねた結果、培地中に一般式　　　１も。

／ Ｎ　７　Ｊも、　（式中、塊、鴇、１へは同一１＼ １′Ｌ３ たはｌもなって直鎖状、分岐状、環状アルキル基捷たり
それらの置換アルキル基であるか、または水素原子を表
わし、Ｒ，、Ｈ，、ｌ−は同時に水素原子ではない。）
で示されるアミン誘導体を添加することによって、血清
を全く含−走ないか、または極めて低濃度の血清しか含
咬ない培地で、これらの細胞を著しく向上させることが
できることを兄い出（７た。たマし、こ＼でエタノール
アミンおよびポ７ホご゛タノールアミンを除く。既に本
発明・者らは、生体内に存在することが知らｉｌてぃＺ
・エタノール了ミンｇｎ１本（エタノールアミンお、ｔ
　ヒボスポエタノールアミン）を培地中に添加すること
によつ′〔、正常二倍体細胞の増殖を著しく向上させＺ
・ことを・見い出し先に出願した（特願昭５６−２１２
６１９　）　−、エタノールアミンおよびホスホエタノ
ールアミン以外にも、路、すしも生体成分とは考えかた
い−・般式　　　　　几。

Ｎ−Ｈ，、（式中、）？１．　ｏ、　、　ｎ、、は前掲
と同じ＼、 ＩＮ、。

ものを意味する。）で示きれるアミン誘導体を培地中に
添加することによりて、エタノールアミンおよびホスホ
エタノールアミンと同等のあるいは同等以上の増ηｒ（
促進効果を有すること”５ｒ、を花い出し、この知見に
基ついて本発明をなすに至っｌｒｔ、本発明は、ｌ音養
培地中にエタノールアミンおよびホスホエタノールアミ
ンを除く一般式　　　Ｉｔ。

／ Ｎ　）Ｉ＜、ｉ ＼ １（，３ （式中、ｌ：＋１　、　Ｊ−、塊は前掲と回じものを意
味する。）で示さねるアミン誘導体を培地中に添カける
こＩ、を特徴とする動物に由来する細胞の培ｇＩ法に関
するも（１）である。

本発明にＪ、いて用いられるアミン誘導体とは、メチル
アミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルア
ミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ｎ−プロピ
ルアミン、モロ−クミンル了ミン、トリｎ−プロビルア
ミン、イソブチルアミン、ジイノグロビル了ミノ、ト１
フィッグσビルアミ／、ｎ−ブチルアミン、シバ−ブチ
ルアミントリ１】−ブチルアミン、イソブチルアミン、
ジイノフヂル丁ミン、トリイソブチルアミン、ｎ−ペン
アールーフ゛ミン、ジ１１−ペングールア公ン、トリＩ
＋　−ペンーｆ−ルアミン、７ｆソベンチノ１．アミン
、ジイソベン−１−ル丁ミン、トリインペンチルアミン
、ｒＩ−へ。

キシルアミン、ジｎ−ヘキシノ＋７アミン、トリ１１−
ヘキゾノ＋−ｊ′−）ン、イソヘギンルアミン、シイソ
ー＼ギン／Ｌ’ｆ’ミノ、トリイソブチルアミン、　　
ＩＩ−ヘゾヂル了ミン、モロ−ヘプチルアミン、トＩＩ
　ｎ〜へブーｒ月ｉ゛ミン、イソへフ゛ブール丁ミン、
ジイソ−、ブチルアミン、ジイソオクチルアミン、トリ
Ｉ＋−メクチル゛γミン、イソブチルアミン、ジイソオ
クチルアミン、トリエタノ−ルアミン、シクロヘキシル
アミン、ジシクロヘキシルアミン、トＩＩシクロヘキシ
ル了ミン、メタノールアミン、ジメタツールアミン、ト
リメタノールアミノ１ジエタノールアミン、トリエタノ
ールアミン、ｎ−グｒコバノールアミン、ジｎ−グロバ
ノールアミン、！・すｎ−ソロパノールアミン、イソプ
ロパツールアミン、ジイソプロパツールアミン、トｌｌ
（ツブロバノールアミン、ｎ−ブタノールアミン、ジｎ
〜ブタノールアミン、ｌ−１１ｎ−ブタノールアミ／、
・インブタノールアミン、ジイソオクチルアミン、トリ
インブタ７−）しアミン、ホスホメタノールアミン、ジ
ホスポメタノールアミン、トリボスホメタノ〜ル了ミン
、シ゛ポスホエタノール了ミン、トリホスホエタノール
アミン、ホスホｎ−フロパノールアミン、ジホスホｎ−
グロパノールアミン、トリホスホｎ−プロパノールアミ
ン、ボスポイソグロパノールアミン、ジポスボイソグロ
パノール了ミン、トリホスホイソフ゛ロバノールアミン
、ホスボ■−ブタノール了ミン、ジボスポｎ−ブタノー
ル丁ミ７、トリホスホｎ−ブタノールアミン、ホスホイ
ソブタノールアミン、ジポスホイソプタ７〜ルーｒミン
、）　＋７ホスポイソプタノールアミンエチレンジアミ
ン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン
の中から選ｔＪ’、　ｈたいずれがである、これらは単
独または組合せで用いることができる。

細胞の培養のためには通常炭素源、窒素源および無機塩
類などから成る基本培地が必快である。

本発明においても、この基本培地は必要である。

基本培地には、ミニマムエラセンシャルミディ丁ム（Ｍ
ｉｎｉｍｕｍ　ｊ８ｓｓｃｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｔ＋ｍ
　）、１９９培地、タルベコ改変イーグルミティ了ム（
１Ｊｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＭｏｒＪ山ｅｄＪ４；Ｉｇｌ
ｃ　Ｍｅｄｉｕｍ　）、ハム（１４ａｍ　）のに”−１
０培地、ハムのＩｊ’−１２培地、）ｔＰＭＩ　１６４
０培地など数多くノ種類がある。こｈらの基本培地の組
成は、たとえば１組織培養Ｊ（中井準之助他編集、朝食
書店、１９７６年）Ｋ記載されている。本発明者らは、
前にこの基本培地にエビダーマルグロースファクターと
トランスフェリンを添加することで、血清を全く含まな
いか、または極めで低濃度の血清しか含１ない培地中で
、細胞を効率よく培養できることを見い出している（特
願昭５６−８４２７３号）。該発明ではエビターマルグ
ロースフ了タタートトランクフエリンを同時に添加する
ことで血清を完全に、または大部分代替することができ
るのであるが、本発明によると、エタノールアミン肋導
体をさらＫ　？＋Ｓ加することで動物に由来する細胞の
増殖を著しく向上することができるつアミン誘導体の好
ましい添加濃度ｉｄ細胞の種類によって異なるが、１な
いし１００μＩＩＩすｌ／／−の範囲内である。

本発明に用いられる細胞は動物に由来する樹立細胞株や
異数体細胞および屯営二倍体細胞であれは何でもよく、
このようなものとしては、たとえはマウスミエローマ細
胞、マウスＢ細胞とミエローマ細胞の融合細胞、了フリ
カミトリザル腎細胞、カニクイザル腎細胞、ウシ胎児腎
細胞、ウサギ腎細胞、ウシ胎児肺イ（１１胞、ヒト胎児
皮膚細胞、ヒト胎児肺細胞、ヒト胎児包皮細胞、ヒト胎
児ｎキ細胞、ヒト胎児脳下垂体細胞、ヒト胎児甲状腺細
胞など数多くある。仁の中でも特にヒト胎児肺細胞ｅ」
インターフェロン生産に、ヒト胎児腎細胞はウロキナー
ゼ生産に、アフリカミドリザル腎細胞ｄワクチン生産に
用いることができるため、その工業的応用価値は商い。

その仙の培養条件、方法は通常の細胞培養で用いられる
力ｔｈ、たとえは前に挙けた「組織培養」記載の７７法
を適用する仁とができる。すなわち、培地のｐＨや培養
温度は目的の細胞増殖に通常用いらｉする条件でよく、
Ｉ）Ｈｌｄ　６〜８、培養温ｒｖ　ｉｔ　２　ｓ〜４０
℃が一般的である。

培養容器も通常の培養用ディツユ、培養フラスコ、ロー
ラーボトル、プラスチックバッグ、ら脚状フイルノ・、
ホローファイバー、キャピラリー、マイクロギヤリア−
、ガラスピーズ、多層平板などいずれも本発明の方法に
適用することができる。

動物に由来する糺１）胆を培養する際、多重の血清によ
って除くことができる−１すなわち、血清と比較してア
ミン誘導体は安価であり、長期保右司能であるため、保
存・Ｊ１１２扱いがｒＦＪ屯で、常に一定の品質のもの
を安）ピして入ｆ−ｉることかできる。さらにアミン誘
導体によつ一〇細胞の増殖が著しく向Ｆしたことにより
、培ヨ（期間が短縮され、ホルモンや１ｖｌ素なとの生
産性が高壕ることから、正常二倍体イ（０胞の１業的応
用への寄与が大きい１、次に実施例によって本発明をさ
らに詳＃＋＋１に説明する。

実施例 基本培ｊｔｌｈ　Ｖｃミニマムエツセンシャルミティア
ムを用い、これにエビクーマルグロースファクターを１
５ｒ）ｆ／ｍｅ、トランスフェリンを］ｔｔ？／ｍｅを
加え、さらに各濃度の１１−グロヒルアξンまたはイン
フロビルアミンを力１１えた培地を準備した。これらの
培ｊ１らにマウスミエローマ細胞（１’３Ｘ６３Ａｇ８
Ｕ１）を［賦ｌ’ＪＢ　Ｌ、、組織培養用ディシュｉＣ
ｆｉ　Ｘ　１０”個／−の〃Ｊ１１胞数になるように植
え付けた。３７℃で４日間」１゛＜養したのち、００５
％Ｗ／Ｖのトリフシンを含むリノ酸緩衝牛胛食塩水で処
理しで卸１胞を古懸濁り、　ｌこ。、Ｔｉ１ｌ　Ｉｔト
λ般し」コールタ−・カウンター（コールクー・ｊ−レ
クトロニクス社の登録商標）で計数した。

ｌｆｈ　’、Ｊ”　ｔ、ｎ−プロピル−ｒミンまたのイ
ソプロピ。

ルアミンを含まない対照に対する細胞数σ）比（増殖バ
（）で第１図に図示した。ｒｌ−プロピＪしアミンまた
Ｃ」イソフロビルアミンを５〜１００７ｚｍｏｌ／ｚを
含む培地で如、対照にくら−＼約１，１〜１．２倍の増
５ｉＲ度を７−７、マウスミｚ　ｒ−＋−７＋１（ＩＩ
胞（１’３Ｘ６３Ａｇ８１Ｊ　］　）　ｑｌ増殖が著し
く向、ヒすることか認めら１Ｌｊ（−。

′Ｌ４ノイハ例　２ 基本ｈ’ｔ　Ｊｌｌ＋、にζ、＝マムエツセノシャルミ
ディアノ・を月１い、これＶＣ工ビダーマルグロースフ
了クり−を１５　ηｆ／ｍｒ、トランスフ上１１ン’ｃ
　１　ｎｙ／ｍｅ　ｆｚ（力Ｈえ、′２！ｔ）　ｌ”−
名（ｔ４！ｌ！Ｉ−ｇノンクｒ＋　−、二ｙ　ソ／ｌ、
　−ｒ　６　ｙ　−ｆ　Ｌ　ｒＪ、ジェタノールアミン
を加えた培Ｊ（ρ奮弗侃Ｎｚｌこ０こノド０の　５名　
ηＩＩ＋’を−丁　ソ　リ　力　ミ　　ド　リ　−リ　
ル腎１１飽しり１］　ジ！Ｅ−ｔ　　る　」１−′１信
二倍体細＋１；ｕ　（フロー・ラボラ）１１−社）を懸
濁Ｌ２、組織培養用ディシュに６　Ｘ　１０’　（ｌＶ
ｅｄ　（Ｄ細胞数になるように植え付けた３、３７℃で
４日間培養しグこのち、０．０５チＷ／Ｖのト１１プシ
ンを會む１１ン酸緩爾生理食塩水で処理して細胞を偽懸
濁した。細胞数ハコールター・カウンター（コールクー
・エレクトロニクス社の登録商標）で４赦した。

結果を、シクロヘキシルアミ７またはジェタノールアミ
ンを含まない対照に苅う゛る細胞数の比（増殖度）で第
２図に図示した。シクロ・・キシルアミンまたはジェタ
ノールアミンＺ４：３０〜１０００μｍｏｌ／を含む培
地では、対照にくらべ約１．１〜１．２倍の増殖度を示
し、アフリカミドリザル腎細胞の増殖が著しく向上する
ことが認められた８ 実施例３ 本実施例では、ヒト胎児の肺１１収に由来する正常二倍
体であるＮ）［５細胞（フロー・ラボラ）　１−社）の
増殖に対するジ０−グロヒルゴ°ミン１よびジイソプロ
パツールアミンの効果を述−ζる。

方法は各培地にウシ胎児血消葡０４％Ｗ／Ｗ　７ＪＩＩ
えるＣ−とを除りば実施例１と同様である。

１′３図に矛、！テ果を示し、たよりに、ヒト胎児肺細
胞において、ジ０−フ゛Ｄパノールアミンま／ヒはシイ
１／　７’ロバノールＴミンを添加１−ゐことによって
増殖は著しく向」ニした。

実施例４ 本実施例では、ヒト胎児の腎臓に由来−する正常ニー（
ｉＨ＋沼１（胞（マイクロバイオロジカル・アソシエイ
ツ社）のｊ曽５１１１に利するｎ−オクチルアミン、ジ
Ｉ＋−−メクチルアミンおよび）　ＩＩ　ｎ−＊クチル
了ミンの効果を述へる。

方法は各嘉地ＶＣウシ胎児血ｆｆｒ　’ｊ：　０．４％
貨／νＶ加えることを除ｔｊ　ｒＪ：実施（＋ｌｌ　Ｊ
と同様である。

Ｊ・４図にｈ’ｉ果を示し）こように、ヒト胎児腎細胞
において、１１−、ｉクブール−ｊミン、ジ■１−オク
チル′ｒミンー！Ｉｊ　７’ｉｍ　ｔ、ｉ　）す１１−
　、ｄクチノ１．アミンを添加ノることしくよって、−
それイｉ１至鏑濃度ｅ」異なるもののｊＹ４　Ｗｔ　Ｉ
ｔｊ−著しく向」−シた。

；メごｂｆ＋ｉ　イ引］　５ 木実ｈ１１１例−ｔ’　＋、Ｉ：、ヒト胎児の包皮に由
来する正常二倍体である１＋’ｌｏｗ　７０００細胞（
フロー・ラボラトリ−社）の増殖に対するイソプロピル
アミンおよびシクロヘキシルアミンの効果についで述べ
る。

方法は各培地にウシ胎児血清を０．４％Ｗ／Ｗ加えるこ
とを除けば実施例１と同様である。

３０μｍｏｌ／ｌ　　のイソプロピルアミンを添加シタ
培地および３００μｍｏｌ　／ｌのシクロヘキシルアミ
ンを添加培地で増殖させた細胞数と、これらのアミン類
添加の培地で増殖させた細胞数の比は、それぞれ１．１
８および１．１５であった。ヒト胎児包皮細胞に対する
イソプロピルアミンおよびシクロヘキシルアミンの著し
い増殖促進効果が認められた。

実施例６ 本実施例では、ヒト胎児の腎臓に由来する正常二倍体細
胞（マイクロバイオロジカル・了ソシエイツ社）の増殖
に対する各棟のアルキル基を有するアミン誘導体の効果
につい又述べる。方法Ｖま各培地にウシ胎児血清を０．
４４Ｗ／Ｗ加えることを除けば実施例１と同様である１
、 結果を表１に示した。表中の数値は、種々アルキル側鎖
を有する一級、二級および三級の各種アミン誘導体温７
ｊｌｌ培地で増殖させた細胞級のアミン訪搏体だ添加で
増殖させた細胞数に対する自分率を示す、ｌ’）た、か
っこ内の数字は、アミン誘導体の培地への添加濃度を示
す。炭素が１から８のアル虚ル基を側鎖にイ１するアミ
ン誘導体は５、−級、二級、王級了ミンいずれでも増殖
促進効果を示し７？、　ｒ＋ 衣　　　　１ かっこ内は培地への添加濃度を示１．　＋　−口、　Ｈ
ｒＳ験をしでいないことを示す。

”、□　ｂｉｌｊ　ｊ’−１１７ 本実）＠　Ｉ’ｌｌ　Ｃ１１，＋＝　ｌ−胎児ノｌｌ１
ｌ＋　Ｉｌｉ？、　ｋＣ由来ＪＺ＞　正ｈ；　Ｚ培体で
あるＭｌ（（ニー５細胞、（フロー　・ラボラトリ−利
）　（７）　、１’＞ｒう１ど（１（メ１１〕る１俟７
′ルキル基をイ（するアミン、犠・、４体の効１’１１
．げついで述べる。

方逮す、＋各”：’ｒ　、ｌｌｌ＋、　Ｉｃウシ胎児Ｊ
（ｎ清を０．４％Ｗ／νＶ加えるこＪ−を除＋−ｊ　（
ζＩ実施例１と同様である１、結果を＄２に示した。表
中の数値Ｃ，種々置換了ルギル１１＋１１釦を、イｉす
る一紛、二級および三級の各１中アミン請］、り体添加
培地で増殖させた細胞級のアミン誘導体復ｒ添加で増争
さぜた細胞数に対する自分率・を示す１、゛ヰ／；Ｔ、
かっこ内の数字け、アミン誘２す（，４−σ）培ｊ１も
・＼ｑ）添加θＨ’Ｂ度を示す。表２に示【７た各（Φ
下ミン誘樽イ４ン含む培地で、対照にくらべ約１．１〜
１２倍の増殖＋１’４を示し、正常二倍体肺細胞Ｍ、ｌ
値−５＃ｌｌｌ胞の増殖が著ｌ〈向」−することが閉め
られ７）ｌ７、 表　　　　２ かっこ内は培地・＼の添加−尾を示１’＋　　−１ｔ−
Ｊ試験してないにと金示す、 ４、　　し１面でハ簡１１へ一寿蒲明 １・１し陳１マウスミエローマ細ハｒ：１．　（１１３
ｘ６３Ａｇ８　ｔＪｌ）の増殖Ｗ−ｆｉｌ　１−るｎ−
プロピルアミンおよびイソプロピル）ミンの効果な示−
ｌグラフ、３・２図ｅ」了フリツノＳｌ’　ＩＩす′ル
腎１１１．細胞の増殖に対−４゛るシクロ−＼１１１１
月アミン」、ひジ：ｒタノール了ミンのり１果′ｆｄ：
π゛４４グテフ３図にｊヒト胎児肺細胞（ＩＷｌｉｌ、
コー５）の増殖を列するジ１１−プロヒル−７’　ミン
お」、びジイソゾ「ｌパノールアミンの効果を示すグラ
フ、Ａ・４図はｌ　）・胎児腎細胞に対する【１−メク
ザ／ｌ−丁ミニ／、ジ１１−ン（クプノ１下ミンおよ０
」・Ｉｆ　ｎ　−＝Ａクチル丁アミの効叶・を示ずグラ
フてあ２．。

＝４５２ 第１図 １ｔｐｏｃｌ＆　（ＰｍｏＦ／Ｉ） 第２図 ；靜ＪｏＪ／Ｌ　（ｕｍｏｌ’／ｆ　）第３図 め加誠康（ｕｍｏｆ／ｊ　） 第４図 潅〃０濃＆　（ｕ　ｍａ１／β） ４５３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （］）培養培地中に一般式 ％式％） （式中、１（、、１，、）（、ｌ　は同一またけ異なっ
   て直鎖状、分岐状、環状アルキル基またはそれらの置換
   アルキル基であるか、または水素原子を表わし、Ｎ９．
   　Ｉｔ、　、　ＩＩ、　は同時に水素原子ではない。）
   で示されるアミン誘導体（たソし、エタノールアミンお
   よびホ、スホエタノールアミンを除く）を添加する仁と
   を特徴とする動物に由来する細胞の培養法。 （２）　　アルキル基または置換アルキル基の炭素数が
   １〜８である特許請求の範囲第１．１Ｊ記載の培養法。 （３）置換アルキル基の置換基が水酸基、リン酸基、了
   ミノ基のいずれかである特許請求の範囲第２項記載の培
   養法。 （４）１１．、Ｒ，、ｌ−が同一である特許請求の範囲
   第１項記載の培養法。 （５）　　直鎖状アルキル基がメチル基、エチル基、ｎ
   −フロビル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１１−
   ヘキシル基、＋１−ヘプチル基、”−オクチル基である
   特許請求の範囲第２項記載の培養方法。 （６）分岐状アルギル基がイソプロピル基、イソブチル
   基、イソペンチル基、イソヘキシル基、インヘプチル基
   、イソオクチル基である特許請求の範囲第２項記載の培
   養法。 （７’ｌ　　９状アルキル基がシクロヘキシル基である
   特許請求の範囲第２項記載の培養法、 （８）　　ｆ＆置換アルキル基ヒドロキンメチル基、ヒ
   ドロキシエチル基、ヒドロキシｎ−プロピル基、ヒドロ
   キシイソブチル基、ヒドロキシｎ−ブチル基、ヒドロキ
   シイソブチル基、ホスホヒドロキシメチル基、ホスホヒ
   ドロキシエチル基、ホスポヒドロギシｎ−プロピル基、
   ホスホヒドロキシエチル基、ホスポヒドロキシｎ−ブヂ
   ル基、ホスホヒドロキシイソブチル基の中から選ばれた
   いずれかである特許請求の範囲第３項記載の培養法。 （９）動物に由来する細胞がマウスミエローマ細胞であ
   る特許請求の範囲第１項記載の培養法。 （１０）動物に由来する細胞が正常二倍体細胞である特
   ＃’ｆ　１ｔｐｌ求の範囲第１項記載の培養法。 ０１）動物に由来する正常二倍体細胞が腎臓に由来する
   正常二倍体細胞である特許請求の範囲第１０項ｔ１シ載
   の培養法、 （］２）腎臓がヒト胎児の腎臓である特ｉｔ′ｆ請求の
   範囲第１１項記載の培養法。 （１３）　＄ｈ物に由来する正常二倍体細胞がヒト胎児
   の肺に由来−ずイ・正常二倍体細胞で４）る特許請求の
   範囲第１０項ｈ１シ載の培養法。 ０４）動物に由来する正常二倍体細胞がヒト胎児包皮に
   由来する正常二倍体ｆ４１１胞である％ｇ’トＭ求の範
   囲第１Ｏシ自記載の培養法 Ｑｓ）　培養培地がエビダーマルグロースファクターと
   トランスフェリンを含む培養培地である特許請求の範囲
   第１項記載の培養法。