JPS5928478A - 酵母の形質転換法 - Google Patents
酵母の形質転換法Info
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- JPS5928478A JPS5928478A JP57138253A JP13825382A JPS5928478A JP S5928478 A JPS5928478 A JP S5928478A JP 57138253 A JP57138253 A JP 57138253A JP 13825382 A JP13825382 A JP 13825382A JP S5928478 A JPS5928478 A JP S5928478A
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- Japan
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- yeast
- cells
- dna
- cesium
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵母の形質転換法に関する。
遺伝子操作によって形質転換体を取得するためには、デ
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）を目的とする菌体内に取り込
ませる技術が重要である。
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）を目的とする菌体内に取り込
ませる技術が重要である。
大腸菌を代表とする原核細胞においては、細胞をカルシ
ウム処理してコンピテント（ＤＮＡ取シ込み能のある）
な細胞とした後、低温でＤＮＡと接触させてＤＮＡを細
胞表面に吸着させ、しかる後３７〜９．２１；の熱パル
スを与えてＤＮＡを菌体内に取り込ませる技法が広く採
用されている。しかしながら、酵母を始めとする真核細
胞では堅固な細胞壁を有しているために、原核細胞に頻
用されるカルシウム処理は効果がなく、細胞壁を除去す
る酵素（ザイモリエースやカタツムリ消化液など）で処
理してプロトプラストにした後ＤＮＡと接触させ、これ
を固形培地中に再生させることによって形質転換体の取
得を行なっている。しかしながら、酵母菌体をプロトプ
ラストにすること、ｉ ｆｒそれらを再生する操作は非
常に煩雑であると共に多大な時間を要する。そこで、よ
り簡単な形質転換法の開発が要望されている。
ウム処理してコンピテント（ＤＮＡ取シ込み能のある）
な細胞とした後、低温でＤＮＡと接触させてＤＮＡを細
胞表面に吸着させ、しかる後３７〜９．２１；の熱パル
スを与えてＤＮＡを菌体内に取り込ませる技法が広く採
用されている。しかしながら、酵母を始めとする真核細
胞では堅固な細胞壁を有しているために、原核細胞に頻
用されるカルシウム処理は効果がなく、細胞壁を除去す
る酵素（ザイモリエースやカタツムリ消化液など）で処
理してプロトプラストにした後ＤＮＡと接触させ、これ
を固形培地中に再生させることによって形質転換体の取
得を行なっている。しかしながら、酵母菌体をプロトプ
ラストにすること、ｉ ｆｒそれらを再生する操作は非
常に煩雑であると共に多大な時間を要する。そこで、よ
り簡単な形質転換法の開発が要望されている。
この様な観１点に鑑み、本発明者らは鋭意研究の結果、
さきに、アルキルアリールポリエーテルアルコール系非
イオン界面活性剤で処理した酵母菌体がＤＮＡを取り込
み、酵母をプロトプラスト化することなく形質転換を行
いうろことを見出した（特願昭！Ａ−／、ｊ、２グｇ
、１号）。本発明者等は上記知見にもとづいて更に研究
の結果、ある種の金属イオンで処理した酵母菌体もまた
容易にＤＮＡを取り込み、簡単に形質転換可能なことを
見出し、本発明を達成した。すなわち、本発明の要旨は
、酵母菌体をルビジウム、セシウム寸たはリチウムイオ
ンで処理し、この処理菌体にデオキシリボ核酸を接触さ
せることを特徴とする酵母の形質転換法に存する。
さきに、アルキルアリールポリエーテルアルコール系非
イオン界面活性剤で処理した酵母菌体がＤＮＡを取り込
み、酵母をプロトプラスト化することなく形質転換を行
いうろことを見出した（特願昭！Ａ−／、ｊ、２グｇ
、１号）。本発明者等は上記知見にもとづいて更に研究
の結果、ある種の金属イオンで処理した酵母菌体もまた
容易にＤＮＡを取り込み、簡単に形質転換可能なことを
見出し、本発明を達成した。すなわち、本発明の要旨は
、酵母菌体をルビジウム、セシウム寸たはリチウムイオ
ンで処理し、この処理菌体にデオキシリボ核酸を接触さ
せることを特徴とする酵母の形質転換法に存する。
本発明をさらに詳細に駅、明するに、本発明の形質転換
法が適用される酵母としては、サツカロミセス（Ｓａｏ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｅ ） ｐ、クリベロマイセス（Ｋ
ｌｕｙｖｅｒｏｍｙａｅｓ ）属のもの、例えばサッカ
１ａｃｔｉｓ ）等が挙げられる。
法が適用される酵母としては、サツカロミセス（Ｓａｏ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｅ ） ｐ、クリベロマイセス（Ｋ
ｌｕｙｖｅｒｏｍｙａｅｓ ）属のもの、例えばサッカ
１ａｃｔｉｓ ）等が挙げられる。
これらの酵母菌体は、ルビジウム、セシウムまたはリチ
ウムイオンで処理される。このためこれら金属の水溶性
化合物たとえば鉱酸塩、有機酸塩等が使用され、とくに
リチウムの水溶性化合物が好ましい。具体例としては例
えば、塩化ルビジウム、酢酸ルビジウム、塩化セシウム
、酢酸セシウム、塩化リチウム、酢酸リチウム等が挙げ
られる。
ウムイオンで処理される。このためこれら金属の水溶性
化合物たとえば鉱酸塩、有機酸塩等が使用され、とくに
リチウムの水溶性化合物が好ましい。具体例としては例
えば、塩化ルビジウム、酢酸ルビジウム、塩化セシウム
、酢酸セシウム、塩化リチウム、酢酸リチウム等が挙げ
られる。
上記金属イオンによる酵母菌体の処理条件は、と＜ｒ（
限られるものではないが、通常上記金属イオン（ｉ７
／ ＯｍＭ以上、好ましくは！；０〜１０００ｍＭとぐ
にｌθθ〜Ｊ ００ ｍ、Ｍ程度の濃度で含有する緩衝
液により室温以下の低温、好オしくはＯＣ付近で１時間
程度行なわれる。
限られるものではないが、通常上記金属イオン（ｉ７
／ ＯｍＭ以上、好ましくは！；０〜１０００ｍＭとぐ
にｌθθ〜Ｊ ００ ｍ、Ｍ程度の濃度で含有する緩衝
液により室温以下の低温、好オしくはＯＣ付近で１時間
程度行なわれる。
上記処理後、処理液にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を加
え、低温で、菌体とＤＮＡとの接触をおこなう。接触時
間は特に制限はないが、通常２０分〜ａ時間程度で十分
である。接触後ポリエチレングリコールにて処理する。
え、低温で、菌体とＤＮＡとの接触をおこなう。接触時
間は特に制限はないが、通常２０分〜ａ時間程度で十分
である。接触後ポリエチレングリコールにて処理する。
その後、約ｑｏＣ前後に昇温し、約３分間程度熱処理す
るのが好ましい。
るのが好ましい。
接触させるＤＮＡとしては、種々のプラスミドＤＮＡ、
１７合プラスミドＤＮＡが使用され、例えば、公知のＹ
Ｒｐ ７、ｐＤＢハリ、ＹＥｉｐ＆あるいはｐＧＫｔ
−／、ｐＧＫｔ−一等が挙げられる。ＹＲｐ７は、ｐＢ
ＲＪ ２２に、酵母の第り染色体上の’ｒｒｐ ／遺伝
子を含むＤＮＡ断片（染色体ＤＮＡの複製開始点を含む
）を挿入した複合プラスミドである。
１７合プラスミドＤＮＡが使用され、例えば、公知のＹ
Ｒｐ ７、ｐＤＢハリ、ＹＥｉｐ＆あるいはｐＧＫｔ
−／、ｐＧＫｔ−一等が挙げられる。ＹＲｐ７は、ｐＢ
ＲＪ ２２に、酵母の第り染色体上の’ｒｒｐ ／遺伝
子を含むＤＮＡ断片（染色体ＤＮＡの複製開始点を含む
）を挿入した複合プラスミドである。
またｐＤＢ 、）、 ’ｉ’ ｇは、ｐＢＲＪ ２２に
酵母遺伝子’Ｌｅｕ 、２および、２／Ｌプラスミド断
片（複製開始点を含む）を挿入した複合プラスミドであ
る。また、ＹＥｐ Ａは、ｐＢＲ，？、２．２ に、酵
母遺伝子Ｈ１ｓＪおよび」μプラスミド断片（複製開始
点を含む）を挿入した複合プラスミドである。さらに、
ｐＧＫｌ、−／、ｐＧＫ７−コは、％開開５ルー、３９
０９９号公報に記載されている線状プラスミドである。
酵母遺伝子’Ｌｅｕ 、２および、２／Ｌプラスミド断
片（複製開始点を含む）を挿入した複合プラスミドであ
る。また、ＹＥｐ Ａは、ｐＢＲ，？、２．２ に、酵
母遺伝子Ｈ１ｓＪおよび」μプラスミド断片（複製開始
点を含む）を挿入した複合プラスミドである。さらに、
ｐＧＫｌ、−／、ｐＧＫ７−コは、％開開５ルー、３９
０９９号公報に記載されている線状プラスミドである。
以上のように、本発明に従って、酵母菌体に上述のＤＮ
Ａを接触させて導入す込際に、予め酵母菌体をルビジウ
ム、セシウム又はリチウムイオンで処理しておけば、煩
雑なプロトプラスト化処理を要せず、容易に酵母菌体の
形質転換を行うことができる。
Ａを接触させて導入す込際に、予め酵母菌体をルビジウ
ム、セシウム又はリチウムイオンで処理しておけば、煩
雑なプロトプラスト化処理を要せず、容易に酵母菌体の
形質転換を行うことができる。
以下、本発明を実施例について具体的に説明する。
実施例／
酵母サツカロミセス セレビシェ Ｄ／３−／Ａ（ａ、
ｔｒｐ／ ｈｉｓ ３−！ｒＪ２、ｇａｌ／）をＹＰ
Ｄ培地（／９！＋酵母エキス、λチポリベブトン、−係
グルコース ｐＨｓ、３）にて、３０Ｃで／Ａ待時間振
盪培養後菌し、ＴＥＩ緩衝液〔１０ｒＩＬＭトリス命塩
酸（ｐＨ７，１）、／ ｍＭエチレンジアミン四酢酸二
ナトリウム〕で７回洗浄する。次にこの洗浄菌体を／
００ ｍＭ濃度の種々の金属イオンを含むＴＫ緩衝液ハ
０ｒｆＬｌに懸濁し菌体濃度を１０／ｍｌとする。ｏＣ
で７時間ゆるく振盪した後、そのθ、／ｍｌに／３μｌ
のプラスミドＹＲｐり溶液（／θμ？）を加えＯＣで３
０分間放置する。
ｔｒｐ／ ｈｉｓ ３−！ｒＪ２、ｇａｌ／）をＹＰ
Ｄ培地（／９！＋酵母エキス、λチポリベブトン、−係
グルコース ｐＨｓ、３）にて、３０Ｃで／Ａ待時間振
盪培養後菌し、ＴＥＩ緩衝液〔１０ｒＩＬＭトリス命塩
酸（ｐＨ７，１）、／ ｍＭエチレンジアミン四酢酸二
ナトリウム〕で７回洗浄する。次にこの洗浄菌体を／
００ ｍＭ濃度の種々の金属イオンを含むＴＫ緩衝液ハ
０ｒｆＬｌに懸濁し菌体濃度を１０／ｍｌとする。ｏＣ
で７時間ゆるく振盪した後、そのθ、／ｍｌに／３μｌ
のプラスミドＹＲｐり溶液（／θμ？）を加えＯＣで３
０分間放置する。
次に７０チボリエテレングリコールグＯＯθ溶液をｏ、
ｔｒｎｌ加え、ＯＣで６０分間放置した後滅菌水でユ回
洗浄後ｏ、ｓｍＡの水に懸濁し、ヒスチジンを含む最少
培地（０，６７チ イースト ナイトロジエンベース、
＋２９６グルコース、５０μ２／ｍｌ Ｌ−ヒスチジ
ン、２ｑ６寒天）に塗布し、３０Ｃで、２〜３日間培養
後生じるコロニーを形質転喚体とした。
ｔｒｎｌ加え、ＯＣで６０分間放置した後滅菌水でユ回
洗浄後ｏ、ｓｍＡの水に懸濁し、ヒスチジンを含む最少
培地（０，６７チ イースト ナイトロジエンベース、
＋２９６グルコース、５０μ２／ｍｌ Ｌ−ヒスチジ
ン、２ｑ６寒天）に塗布し、３０Ｃで、２〜３日間培養
後生じるコロニーを形質転喚体とした。
結果は表／に示すように、ルビジウムおよびセシウムイ
オンで処理した場合の形質転換体数は、他の金属イオン
処理によるものに比し格段に大きい。
オンで処理した場合の形質転換体数は、他の金属イオン
処理によるものに比し格段に大きい。
表 ／
実施例コ
実施例／における洗浄菌体を、種々の濃度のルビジウム
、セシウムおよびカルシウムイオンを含むＴＥ緩筒液ハ
Ｏａｌに懸濁し、以下例／と全く同一の方法でプンスミ
ドＹＲｐ？溶液を添加し、培養して生ずるコロニーを形
質転換体としてその数を測定した結果を表ユに示す。
、セシウムおよびカルシウムイオンを含むＴＥ緩筒液ハ
Ｏａｌに懸濁し、以下例／と全く同一の方法でプンスミ
ドＹＲｐ？溶液を添加し、培養して生ずるコロニーを形
質転換体としてその数を測定した結果を表ユに示す。
表コに示すように、ルビジウムおよびセシウムイオンで
処理した場合には、濃度の増大に伴い形質転換体の著し
い増加がみもれる。
処理した場合には、濃度の増大に伴い形質転換体の著し
い増加がみもれる。
表 一
実施例３
酵州−リ゛ツカロミセス セレビシェＡＨ−ｓｓ株（ａ
、 ｈｉｓ７．１ｅｕ−） （ＡＴＯＯ３ｇ １２６
）をＹＤＤ培地（／ｑ６酵母エキス、２係ポリペプト
ン、コ係グルコース、ｐＨ３゜３）にて、３０Ｃで１６
時間振盪培養後集菌し、ＴＥｉ緩衝液［： ／ ｏ ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，３）、／ ＺｎＭエチレンジア
ミン四酢酸二ナトリウム〕で７回洗浄する。この洗浄菌
体を／θＯｍＭ濃度の酢酸リチウノ、を含むＴＥ緩衝液
／、０ｍ１ＫＮ濁し、菌体６１（度を１０８／ｍｅとす
る。０Ｃで７時間ゆるく振盪した後、そのｏ、ｔｒｎｅ
にｌ古μｔのプラスミドｐＤＢΩ９ｇ溶液（１０μｙ）
を加えＯＣで３０分間放置した後７０係ポリエチレング
リコールｙｏｏｏ溶液ｏ、７ｍ、ｅを加え、０υで６０
分間放置、する。ついで４１．２１ＪＣＪＡ温し、この
温度で５分間保持した後、滅菌水で一回洗浄し、０．！
；ｍ１４の水に懸濁し、ヒスチジンを含む最小培地（０
，６クチイーストナイトロジエンベース、２チグルコー
ス、ＳＯμｙ／ｍ１Ｌ−ヒスチジン１．２ヴ寒天）に塗
布し、３０Ｃでλ〜３日間培養後生じるコロニーを形質
転換体としてその数を測定した。その結果を表３に示す
。々お参考までに実施例／における（３ａ、 Ａｔ、
Ｏｏ、 Ｍｎ、 Ｚｎ、 Ｂａ、 Ｏｕイオン等の添加
結果を併記する。
、 ｈｉｓ７．１ｅｕ−） （ＡＴＯＯ３ｇ １２６
）をＹＤＤ培地（／ｑ６酵母エキス、２係ポリペプト
ン、コ係グルコース、ｐＨ３゜３）にて、３０Ｃで１６
時間振盪培養後集菌し、ＴＥｉ緩衝液［： ／ ｏ ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，３）、／ ＺｎＭエチレンジア
ミン四酢酸二ナトリウム〕で７回洗浄する。この洗浄菌
体を／θＯｍＭ濃度の酢酸リチウノ、を含むＴＥ緩衝液
／、０ｍ１ＫＮ濁し、菌体６１（度を１０８／ｍｅとす
る。０Ｃで７時間ゆるく振盪した後、そのｏ、ｔｒｎｅ
にｌ古μｔのプラスミドｐＤＢΩ９ｇ溶液（１０μｙ）
を加えＯＣで３０分間放置した後７０係ポリエチレング
リコールｙｏｏｏ溶液ｏ、７ｍ、ｅを加え、０υで６０
分間放置、する。ついで４１．２１ＪＣＪＡ温し、この
温度で５分間保持した後、滅菌水で一回洗浄し、０．！
；ｍ１４の水に懸濁し、ヒスチジンを含む最小培地（０
，６クチイーストナイトロジエンベース、２チグルコー
ス、ＳＯμｙ／ｍ１Ｌ−ヒスチジン１．２ヴ寒天）に塗
布し、３０Ｃでλ〜３日間培養後生じるコロニーを形質
転換体としてその数を測定した。その結果を表３に示す
。々お参考までに実施例／における（３ａ、 Ａｔ、
Ｏｏ、 Ｍｎ、 Ｚｎ、 Ｂａ、 Ｏｕイオン等の添加
結果を併記する。
表 ３
手続ネ甫正書（自発）
特許庁長官 若 杉 和 夫 殿
１ 事件の表示 昭和５７年特許願第１３８２５３
号２ 発明の名称 酵母の形質転換法３ 補正をす
る者 事件との関係 出願人 （５９６） 三菱化成工業株式会社 ４代理人 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三菱化成工業株式会社内 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６ 補正の内容
号２ 発明の名称 酵母の形質転換法３ 補正をす
る者 事件との関係 出願人 （５９６） 三菱化成工業株式会社 ４代理人 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三菱化成工業株式会社内 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６ 補正の内容
Claims (1)
- （１）酵母菌体をルビジウム、セシウムまたはリチウム
イオンで処理し、この処理菌体にデオキシリボ核酸を接
触させることを特徴とする酵母の形質転換法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57138253A JPS5928478A (ja) | 1982-08-09 | 1982-08-09 | 酵母の形質転換法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57138253A JPS5928478A (ja) | 1982-08-09 | 1982-08-09 | 酵母の形質転換法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5928478A true JPS5928478A (ja) | 1984-02-15 |
| JPH0526464B2 JPH0526464B2 (ja) | 1993-04-16 |
Family
ID=15217629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57138253A Granted JPS5928478A (ja) | 1982-08-09 | 1982-08-09 | 酵母の形質転換法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5928478A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6190341A (ja) * | 1984-10-09 | 1986-05-08 | Toshiba Corp | 光デイスク |
-
1982
- 1982-08-09 JP JP57138253A patent/JPS5928478A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6190341A (ja) * | 1984-10-09 | 1986-05-08 | Toshiba Corp | 光デイスク |
| JPH0375940B2 (ja) * | 1984-10-09 | 1991-12-03 | Toshiba Kk |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0526464B2 (ja) | 1993-04-16 |
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