JPS5925698A - エリスロポエチンの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 きるエリスロポエチンの測定法に関する。

エリスロポエチン’（　Ｅ　Ｐ　Ｏ　）は、赤血球生成
１足進因子とも呼ばれ、骨ずいに存在する赤血球系幹細
胞に働いて赤血球系細胞への分化を促進させる一種のホ
ルモンであり、主として腎で産生されると考えられてい
る。ＥＰＯ産生を調節するのは、酸素需要供給のバラン
スであり、酸素欠乏状態に陥ると産生が九進し、逆に酸
素過剰状態になると産生が減少する。例えば貧血や二次
性赤血球増７′ｊ（ｊ症では産生が増力口し、真性赤血
球増肌症では産生が減゛少する。ＥＰＯは市販されてお
り、分子量４イヒノ 〜５万の酸性糖蛋白質であるが、綺学構造は完全には解
明されていない。ＥＰＯは、将来医薬として貧血患者、
手術後患者、腎摘出（Ｃよる人工透析患者に対し広くｌ
史用されることになろう。

従来、ＥＰＯの測定法には免疫学的方法と生物学的方法
がある。免疫学的方法ではＥＰＯを抗原として使用する
が、抗原ＥＰＯの単離精製が極めて困難であるため現在
は粗製のＥＰＯを用いて抗体を作成してＥＰＯを定量す
ることが試みられており、この方法は当然のことながら
信頼性が低い。

生物学的方法は信頼性がより高いので現在多く利用され
ており、これは生体内法と生体外法に分けられる。

生体内法は飢餓ラットや多血寺マウスを用い、赤血球へ
の５９Ｆｅ（アイソトープ）の取り込み率でＥＰＯ活性
を測定する。この生体、内法は、動物を用いる関係上Ｅ
ＰＯの本来の生物活性が測定できる長所を有するが、し
かし感度が低く操作が煩雑であり、動物を使用するため
費用も高くつく。

生体外法にＶ″ｒ、２種あり、一つは骨すい細胞や胎児
肝細胞を用い、ヘムへのＳ　Ｑ　Ｆｅの取り込み率でＥ
ＰＯ活性を測定する方法（５９Ｆｅ法）やＤＮＡへの３
Ｈ−チミン／（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　）の取り込み率で
ＥＰＯ活性を測定する方法（３Ｈ−チミジン法）であり
、他の一つは後に説明するコロニーアッセイ法である。

これらの生体外法は、いずれも高感度で操作も簡単であ
シ費用も安いが、しかし多数の検体を処理するにはなお
煩雑であり技法上難点がある。

本発明は、コロニーアッセイ法の改良にかかるもので、
生物学的測定法に属する生体外法としての長所を生かし
ながら、しかも多数の検体を簡易に処理できるようにし
たものである。

コロニーアッセイ（Ｃｏ１ｏｎｙ　　Ａｓ５ａｙ　）法
は、メチルセルロース法とも呼ばれ、赤血球系前駆細胞
を含む細胞懸濁液とメチルセルロース液との混合液をプ
ラスチック製ぺ）　ＩＪ皿に入れて培養した後、形成さ
れた赤血球系コロニーの数を顕微鏡観察により測定する
ものである。コロニー数が加えたＥＰＯＩに依存するこ
とを利用して検体中のＥ　Ｐ　Ｏ破を測定する。

メチルセルロースは細胞の不動化のため加えるのである
が、非常に粘稠なため、前記混合液をペトリ皿に正確か
つ迅速に加える操作には大変な注意を必要とし、さらに
あまり少量の混合液を加えることは操作上不可能である
。

通常は混合液をペトリ皿１枚当ｐｌｒｎｌと多量加えて
いるっこのようなコロニーアッセイ法によると、多数の
検体を迅速に処理することは困難であり、また多量の検
体が必要となり不経済である。

本発明者ら（−ｉ、これらの難点を克服すべく検討した
結果、平底マイクロタイタープレートを使用する新しい
技法を開発し、目的を達することに成功した。

すなわち、本発明は、単細胞化したマウス胎児肝７洲胞
を培養液に懸濁し、これにエリスロポエチン険体を混合
し、混合液を平底マイクロタイタープレートにまき、次
いで培養を行った後、発生した赤芽球コロニーの数を計
、則し、この数からエリスロポエチンを定置することを
特徴とするエリスロポエＬンの測定法である。

本発明の測定法によると、メチルセルロースを加えなく
ても平底マイクロタイタープレート中のウェル（ｗｅｌ
ｌ、穴）の中で細胞が物理的衝撃によって移動すること
がない。また、１ウエル当りにまく細胞懸濁液は０．２
ｍｌであるので、検体の量を節約できる。本発明では粘
稠なメチルセルロースを使用しないから、細胞懸濁液を
迅速かつ正確にまくことかり能となり、多数の検体を能
率的に処理することができる。

次に、本発明をより詳細に説明する。

妊娠したマウスより無菌的に胎児を取出し、用され、胎
児は胎生１３〜１５日のものがよい。摘出された肝組織
は洗浄され、洗浄液としては適当な合成培養液例えば汗
牛血清１０〜２０チ含有１夜が用いられる。ピペッティ
ング（ｐｉｐｅｔｉｎｇ）によシ肝細胞の単細胞化を行
う。単細胞化した肝細胞を培養液に懸濁させる。培養液
としては牛胎児血清２０〜２５係含有液が好適に使用さ
れる。懸濁に先立って、単細胞化した肝細胞を０．８５
％塩化アンモニウム溶液（ｐ　Ｈ７，０）で処理すると
、成熟赤血球が除去され赤芽球コロニーの数を正確に計
測できるので、測定精度を一層高めることができる。

このようにして調製された細胞懸濁液とエリスロポエチ
ン検体とを混合し、混合液を平底マイクロタイタープレ
ート（１プレートに１２×８ウエル、全体で９６ウエル
となっている。）に、１ウェル当シ細胞懸濁ｌ夜０．２
　ｍｌ（５Ｘ１０’個細胞）をまく。次いで培養を行う
。培養は通常炭酸ガスを混入した培養器（空気中５係Ｃ
ｏ２，３７℃、湿度飽和）中で４８時間行い、培養後ベ
ンチジン溶液を１ウェル当り１５μｔをしずかに添加し
ヘモグロビンを含む細胞を特異的に染色する。赤芽球コ
ロニーを顕微鏡観察し、８個以上の赤芽球細胞を含むコ
ロニーを単位としてコロニー数を計測する。

なお、染色に用いたベンチジン溶液は、水（ａ）、９０
％酢酸に溶解した３％ベンチジン溶液（ｂ）、３０％過
酸化水素水（ｃ）を（ａ）　：　（ｂ）　：　（ｃ）　
−２００：３０　：１の組成比率で混合したものであり
、使用時に調製した。

標準エリスロポエチンについて上記と同じ方法でコロニ
ー数を計測し検量線を作成し、検量線から検体エリスロ
ボエチンを定量する。

本発明は、平底マイクロタイタープレートの技法を採用
することにより１１、多数の検体に′ついてエリスロボ
エチン量（単位／ｍ１．）が簡易に測定でき、また０、
　００５〜０．６４単位／ｍｌの広い範囲で測定が可能
であり、さらに検体も血清、尿など生体試料に限られず
食品などにも拡大できるので、実用効果の大きいエリス
ロボエチ／測定法ということができる。

次に本発明に実施例１′だより説明する。

実施例１ （再生不良性貧血患者の尿中のエリスロポエチンレベル
の測定） 妊娠１３日口のマウス（スイス系ＮＦＳ）より無菌的に
胎児１０匹を取り出し、それぞれから胎児肝臓を摘出し
、これを仔牛血清１０条を含むＮＣＴＣ１０９液（細胞
洗浄液）で洗浄して血球や小腸断片環を除去した後、細
胞洗浄液に胎児肝細胞を分散させるためピペッティング
（ｐｉｐｅｔｉｎｇ）により単細胞化を行った。得られ
た単細胞を０．８５％塩化アンモニウム溶液で５分間室
温において処理して成熟赤血球を除去した後、遠心分離
により胎児肝細胞を収集し、得られた細胞を細胞洗浄液
で２回洗浄した。次いでこれを牛胎児血清２５％を含む
ＮＣＴＣ１０９液に懸濁させて胆児肝細胞懸濁液を調製
した。細胞の数は全体で１０．’Ｍ固であった。

別に、検体法サンプルと標準エリスロポエチン（コンノ
ート社５ｔｅｐＨｌと２５係牛賠児而清をＮＣＴＣ１０
９ｉに加えたもの）を用意した。検体法サンプルの調製
は次のようにして行ったっ再生不良性貧血患者の尿をセ
ファデクスＧ２５でゲル濾過して高分子画分を集め、凍
結乾燥して乾燥粉末を培地に加えた後０．２２μのフィ
ルターを通し滅菌（除菌）した、。

この検体法サンプルと標準エリスロポエチンをそれぞれ
、前記のとおり調製した胎児肝細胞に０〜１単位／ｒｎ
ｌになるよう混合し、９６ウエル平底マイクロタイター
プレートに１ウェル当り胎児細＠５　Ｘ　１０’個とな
るようにまいた後、炭酸ガス培養装置中５％炭酸ガス含
有空気の存在下３７℃で４８時間培養した。培養後、１
ウェル当り染色用ベンチジン溶液（組成と比率は前記の
とおり）１５μｔを添加し、赤芽球細胞を特異的に染色
し、染色された細胞８個以上よりなる塊を赤芽球コロニ
ーとして定め、１ウエル中に存在するコロニー数を顕微
鏡丁で計測した。

標準エリスロポエチンを用いた結果から検重線を作成し
、これから唄者尿中に含−まれだエリスロボエヂンのレ
ベルを測定した。結果８ｒｉ　４．６単位／　ｍｌであ
った。

同じ検体尿ザングルを他の方法で測定したところ、５９
Ｆｅ法では６０単位／ｍｌ、　”　Ｈ−デミジン法では
６３単ｍ　／　ｍｌ　、　　メチルセルロース法では５
５正位／−であった。正常人の尿を同様に処理して前記
４種類の方法でＥＰＯ活性を測定したが、活性法はとん
ど検出されなかった。

実施例２ （ヒト血清中のエリスロポエチンレベルの測定） ヘパリン採血により正常人より採血した新鮮なヒト血液
を遠心分離し一ヒ清の血清を得た。

このものを５７℃、３０分間加熱することにより非動化
した後０．４５μフイルターに通し除菌し検体血清サン
プルとした。

このサンプルについて実施例１と同様に操作し測定した
ところ０．１３単位／ｒｎ１．の結果を得た。

同じ検体血清サンプルを他の方法で測定（〜だところ、
３Ｈ−デミジン法では０２１単位／４　メチルセルロー
ス法でｋｉ　０．３５　単位／−であった。

また、実施例１の再生不良性貧血患者の血清、中のＥＰ
Ｏ量を測定したところ、本発明法では４単位／４３Ｈ−
デミジン法では３４単位／　ｍｌ　’、メチルセルロー
ス法では２１単位／ｍｌであった。

特許出願人　　雪印乳業昧式会社 代理人　弁理士　　　ヒ　　居　　三　部５１４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）単細胞化したマウス胎児肝細胞を培養液に懸濁し
   、これにエリスロボエチン検体を混合し、混合液を平底
   マイクロタイタープレー［・にまき、次いで培養を行っ
   た後、発生した赤芽球コロニーの数を計測し１．、この
   数からエリスロボエチンを定宿することを特徴とするエ
   リスロボエチンの測定法。 （２）　　単細胞化したマウス胎児肝細胞を０．８５係
   塩化アンモニウム溶液で処理することにより成熟赤血球
   を除去する特許請求の範囲（１）の測定法。 （３ン　　培養液に仔牛血清を添加する特許請求の範囲
   （１）の測定法。 （４）　　培養後ベンチジン液により赤芽球を染色する
   特許請求の範囲（１）の測定法。