JPS5921400A - Ｌ−アミノ酸の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は四重極型實り’ｉ分析計を用いるし一アミノ酸
の定量法に関し、詳しくは、定を−一ぜんとするＬ−ア
ミノ酸脱炭酸酵素活性を有する微生物菌体叉は該菌体？
こ由来する酵素を、四重極實１ｉ分析計りこ連なり先端
がガス透過性膜で険われたガス導入用プローブの隔膜−
１−、ｔこ取イｊけた測定プローブを用いるＬ″−アミ
ノ１俊の定Ｉ、１法１こ関する３、Ｌ−アミノ酸の定置
法としては、従来がらがぽチャ、エンエリヒア拳フリ、
またはクロストリレラム・ウェル／ユ由来のし一グルタ
ミ／酸脱炭酸酵素（Ｌ’　−ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｄｅ
ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　）あるいは、エシェリヒア−
コリまたはバクテリ１ンム・キャダベリス由来のＬ−リ
ジン脱炭酸酵素（Ｉ、−１，ｙｓｉｎｅｄｅｃａｒｂｏ
ｘｙｌａｓｅ　）を用いて、次の弐（１）の反応：によ
って発生する炭酸ガスの畦を、マノメトリーで測定する
・ノールフルグ検圧法、あるいは発生する炭酸ガスな比
色定逼するオートアナライザ法が知られている。

これらは、正確ですぐれた方法であるが、酵素の連続的
使用が困難なため、高価な酵素を測定のたびｔこ新たｔ
こ使用しなければならず、経済的でないｌ−１測定の手
間と時間を多く安する１、又オートアナライザー法の場
合には装置が複雑で高価な酵索なたれＥｌｋ　Ｌで便用
する為、必然的ｔこ測定コストが、かかり過ぎる。また
酵素を固定１にしで連続的に使用する力θ、もηえられ
るが、末だ実用化されるｌこは１５つでいないＬ／）が
現状である。１またいｒれの力ｌｉ、も、脱炭酸酵素反
Ｌ１−口ご−よって尾ノ１する炭酸／Ｊ’スＪ）測定器
の応答１／１・や測定可能濃度範囲ｔこ制約があり、そ
れに（ｒ＋−って１−−アミノ酸の測定速度や測＞ｉｉ
　Ｉ’ｉ　ｍｐｊ則範囲も限られたものであ−〕だ、Ｊ 本発明とは１−記した実情に艦み１１ｉ１便、正σ６か
つ迅速で測定”’Ｊ’　ｆｉｌ―濃度範囲の広い１７−
１４　、を酸の定）−〇、Ｔ、：′つい−ｃ　１ｌＩｌ
究したー結果、例えばエノｊ−リヒャ（・４．７トロバ
クター４する、りＬ）、：Ｘ　＋・リジウム属、バチル
ス属、スルソト」ノカス属、ンクードモナスＡ’１ｍ、
バーｆ゛ル、ノ、ｋｉ；　、ミグノコ２ノカス属、ラク
トバチルス属”、ｑ、　１こ属（−るΔ１１１菌類、ア
スペルギルス属寺に属すイ）ｆ−′ノＤ　１’＋’４類
ある（・はＬ’　ｌ’　ｌ□ルラ属等の属する耐１ｉＪ
唄？、−属し、かつ定＋１１せＡ２とするＩ、−アミノ
１俊の脱炭酸酵素をｉｊする粘）ｌ（１％１１＋を・四
ｊｌＶ陽員１１１分ｔ’ｉ　＝目、一連なり光１’：ｌ
ａが、ガス、ｄｊ過１’Ｌ　ＩＩ！ｊ！で覆わｉｔたガ
ス導入用プローブの隔膜Ｌｔｃ取り一′）目だ測定ゾ１
１−−７’を磁気的条件Ｉ・−で該当する１−記のし一
アミノ酸を・含有する被験液に浸ｉ？ｔ　、　または接
触すて）と、工１、′より生ずる炭酸ガスと対し１′、
、する四重極Ｉ％ｌＪ″ｅｉ　ｉｊ＋−分析旧の出力電
流を測定することｔごまって、迅速−（１Ｆ確、低コス
トで測定がｉｉ’ｆ能で、１−かも測定可能ｃｊ０−範
囲な飛躍的ｔこ向−１し得ることな発ｉｔｊ　ｉ、本発
明を完成する１・ご１′つだ３、 本発明の特徴は水肥（１）式の反応を微生物菌体内の竹
Ｔの酵素系を利用して行い、生成されて）炭酸ガスを四
重枠型τム（↓（分析計′Ｃ測定すζ）ことｔごあイ・
１、四市極へ９質！ＩＩ分析計は、近年簡便かつ安価な
ＴｌｌＸ１分析Ｊ１として実験用のはかりこ現場用のガ
ス導／すと１．でもｉ［１され、製鉄−■、業（炉のガ
ス壬ニーター）、医療（呼吸モニター）など種々の分野
で利用されている。四重吻型宣ｈｉり）４’１ｉｊｌけ
、分子１１（３００程度（理論的ｒこは６００’）ｆで
のｈ゛スの同時迅速測定ｔこ用いられる。

本発明では四重極型質品分析ｉ１の持つカスの迅速測定
性と、測定可能濃度範囲が険めて広いこと１こイｆＩＪ
　ｌ−＋、−アミノ酸の迅速、高感度測定を実現した。

本発明ｔこよイ〕効果としては （１）　　選択１’ｌが良く、１・、も精度で、か′〕
安価ｔこ測定が−〔！きる。

（２１従来υ、の測定所安時間ｊＩＶｔ分〜数を一分で
あるのｔこス・ｊして本）′？４明１こよるそれは数Ｆ
抄以干と極め−〔迅速な測定ができるので、Ｑ大な試料
数なｉｉ１時間の間１ζ−１，ｌＬ理することが用１ｊ
ヒ１こなり、微生物ノスクｌ）　−：＝　７グ作朶など
の大幅な効率化が進められイ〕、。

（、（）　　測定１１丁能（７ス度範囲が非″／：’ｌ
　ｌこ広いので、被測定液の箱状（）５率な震えること
なく、測定出来るので装置内に鴎めＣｆ）ｉ）　Ｉ史に
なり、実用性が飛躍的ｒコ向Ｌ　Ｌ、　／、：　、、Ｉ
ｌｌち、ｂＹ−＊法のダイブミックレンジはｌ：１Ｏｉ
ｕ十であるの１こえｊ　１．、−Ｃ本発明のダイブミッ
クし７′７′はｌ：ｌＯ，ｏｆｌｏ　　以ｌ−である。

本発明で便用−する微生、物ｉよ、（伺えば■、−グル
タミンＶを′定１．（する「こ−は、■、−グルタミン
酸脱ＩＲＮ＆ｒｈ素＜、　ｇｌｕｔａ＋ｏａｔｃ　＋Ｉ
ｃｃａｒｈｏｘｙｌａｓｅ　’＞活性の強い菌株として
、例えば、Ｊ−ンＪ−リヒｆ−コリＡＴＣ（ｌｏ７ｓ７
　　　、　　り　ト］　ス　ト　　リ　　ジ　ウ　ノ、
　・　　鳴ン　　寡−ル　。

ＩＦＯＯ４１３等が用いら１１、Ｉ２−リジ／な′メ↓
Ｈ１１ｉ、するｔこは［、−リジノ脱炭酸酔素（’　ｌ
　−＋−ｙらｉｎｃ＋１ｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　）
活）生の強い菌株としで、例々ば工・／エリヒｆ、コリ
（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈ＋ａｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ２３２２
６、・くクテリウム・キャダベリス（Ｂ＋ｉｃ＋ｅｒｉ
ｕｍ　ｃａｄａｖｅｒｉｓ　）　Ａ　ＴＣＣ９７６Ｉ１
、ストレブｌ−−＋７カスーノアエカリス（巨【４（ｌ
）　ｔ　（ｌ仁０（１口］５ｆａｅｃａｌｉｓ　　’）
ＡＴＣＣ１２９８４、ツユ−ド２ｔ　ノ　ス・す７カｐ
フイア（Ｐｓｅｕｄｏ＋ｎｏｒ＋ａｓ　５ＩＩｃｃｈａ
ｒｏｐｈｉａ　）ＡＴＣＣ１５９４６，バチルス−ズブ
’Ｊ−ＩＪ　７゜（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｕｈ目１ｉｓ
　）　ＡＴＣＣＩ　５０　：づ７、ミクノコノ力ス曽ヴ
イレスセンス（−Ｍｙｘ、ｏ智ｔｃｃｕｑｖｉｒｅｓｃ
ｅｎｓ　　　）　ＡＴＣＣ２５２０３、り　ロ　ス　ト
　　リ　　Ｊ二　−シ＋３１２４　　、ラクトバチルス
・カゼイＡＴＣＣ６２７８等が用いられ、また、Ｌ−フ
ェニルｙ　ラ＝　７　ヲ定ｈｉ：　するｔこはＩ、−フ
ェニルアラニン脱炭酸酵素（Ｌ　−Ｐｈｅｎｙｌａｌａ
旧ｎｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）活性の強い菌株
として、例えばストンブトコツカス・フ７エカリス（５
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　）へ１
’ＣＧ３０４３等が用いられる。

また、Ｌ−フルギニンを定積するために１ｊＬ−フルギ
ニ／脱炭酸酵素（Ｌ−Ａｙｇｉｎｉｎｅｄｅｃａｒｂｏ
ｘｙｌａｓｅ　）活性の強い菌株として、例えばエノエ
リヒ７−コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）
八ＴＣＣＩ　０７　Ｂ　７等がそれぞれ月１いられ、さ
らｔこ、ここｒこ記載していないアミノ酸ｔこつぃても
該当する脱炭酸ｌＳ素の存ｒＥする微生物を用いてそれ
ぞれ定ｉ１することが川ｆｉｂである。

本発明で使用する菌体の調製はそれぞれの菌株ｔこＬ１
゛５、じた通常の栄ｌＩ４培地で培養し、０．１　ＭＫ
ＣＩテ２〜３回洸滌した後、低ｔｒｌ！ｔこて乾燥粉末
とする。

感興ｔこ応じてアセト／、トルエンなどの４１機浴媒テ 又は／およびアセナルピリジュウムブロマイドなどの界
面活性剤で処理した菌体な用いても良い。

（特公開漸５４−６３５７）この粉末状の菌Ｃ本はこれ
を冷凍庫内で保存すれば長期間（２年以ト）活性が維持
される。

本発明のｆｌＩＱ定用プローブは第１図ｔこ示すようｔ
こステ／レスチューブの先端に細孔を有する膜の支持体
（５）（焼結金属、パンチフグ・メタルなど）を取付け
、テフロン、ノリコーンなどのガス透過性を有する隔膜
０）でおおったもので１−記微生拘の菌体粉末を水ｒこ
溶解してペースト状？こしたものイ２）を、ミリボア・
フィルター濾紙片、ナイロ／俸メシンユ等の担体（３）
ｒこ塗布し、これを例えｋｆ、セａファ／膜等のような
微生物を透過しない微細孔を自する膜（４）で覆って第
１図の如く隔膜ｎｉｌ、ｊこ収りイ・１けることｔこよ
って容易ｔこ作成することができる。また上記のように
粉末化した菌体な例えばコラーゲンまたはアクリルアミ
ド・ゲル等で固定化した固定化微生物を用いても同様ｔ
こ作成することができる。

ここに微生物の菌体層（２ンを掩うための微細孔な１１
する薄膜（４１としては、本発明で用いる微生物の菌体
を通過せず、炭酸ガス等を自由ｔこ通過させる薄膜（４
１であれば（＝Ｉでも良く、例えば４１Ｊボアフイルタ
ー等の多孔１／１膜、セロファン、動物性半透膜等の透
析膜等の１−記の条件を満足するものであれはすべて使
用することができる。尚固定化微生物膜を用いた場合は
７１−記の＃膜（４）は小使である。

第１図ｔこ於て、（１）は′６１す定プローブの隔膜（
シリコーン膜）、（２）ヲよ微生物又は酵素層、（３）
は担体、（４１は透析膜（セロファン膜）　、（６１は
細孔？：４４する支持体、（６）は測定プ「コープ本体
（ステンレスチューブ）、（７）は四重極型實殖分析計
へガスを移送する導管（例えば、ステンレスチューブ）
を示ス。

第２図に７１＜す定１．ｉ／ステ゛ムのセクトは本（６
［の実施態様の１つである、第２図の（７）は測定プロ
ーブ、（９）はフローセル、＋８１　、　ｆ８’＋はゴ
ムバノキ／グ、（ＩｌｌはＮ２ガス吹込１１．０υはパ
ンファー液注入口、０３はサンプル注入１１．０３は四
重極型質址分析計、０４はレコーダ、０８は導管（ステ
ンレスチューブ）を夫々示す。この第２図のシステムＩ
こ従って本発明の測定法を１：Ｊ、　−Ｆ　ｒこ説明す
る１、まず最初ｒこバッファー注入ＦＴＩ　Ｑｌｌから
一定の流昂で、吹込１目ｕｌからＮ２ガスを吹込みなが
ら７０−セル＋９１内？こ流ｌ１、四屯極型實ムト分析
、ｆｌの電流ｌｆｔ力をし：］　−ター　Ｑ◆に記録す
る。す／プルを０３かう注入時間５〜３０秒間でｌＯ〜
３０秒間隔を置いて順次注入する。このサンプル液はバ
ッファー液で適当ｔこ希釈す矛しフ１１−セル＋９１　
内ｔこ達１−る。フＩＪ−セル（９）内ではす／プル中
の該当し一アミノ酸が微生物の酵素ｔこより（１）式の
反応ｔこより分解されｃｏ２ガスが発生する。このＣＯ
，ガスは隔膜０）を通って四ダー０４に記録される。

該゛ＩＥ流出力餡と基質ｌ、−アミノ酸の濃度Ｃの間ｔ
こけ良好な直線性が認められるのでこの関係を用いて被
験液の基質濃度を求めることができる。

測定時の条件については、測定のｐＨけ３．５〜６．５
、／ｌ、Ａ度は２０〜４０ｒの範囲が良く、サンブルと
６（す定プローブとの接触時間は５〜３０秒間で充分で
あり、通常２０秒でほぼ飽和値ｔこ達する。

入（Ｔ１の１ｌｌｌｌｌｌｌｌ聞良ｌＯ〜１０　　Ｍで
あり、非常ｔこ広い範囲の測定が可能で、該電流出力と
濃＋ａ　Ｃの直線性は非常ｔこ良１１ｊである。

使用するバノソアー液としては、クエン酸、フマル酸、
コハク酸等の４１機酸バッファー、又はビリンノー塩酸
バノ７アーが用いられる。特ｔこＮａＣ１とＫＨ，ＰＯ
，（それぞれｏ、ｓｖ／１ｔｅ）及びピリドキＩノール
−５゛−りん酸（ｏ、１ｒ／ｚ）を含有したビリジ７−
塩酸バッファーは望ましいものである。

−５２図では鎌気的条ｆ４＋こするためＮ、ガスを用い
一〇いるが、別にＮＪガＸｉこ限定されず、委は溶（ｆ
酸素が共存しなければ良いのであって、他の不活性ガス
で１１°【換しても良く、又溶存酸素を含まないキーＳ
−’Ｊアーを用いても良い。以−■−の条件で使用した
場合、連続使用で１力月以上活Ｖ１が持続される。

例えばＬ−アミノ酸としてｌ、−グルタミン酸を定置す
る場合、使用菌株としてエシェリヒア・コリＡＴＣＣ８
７３９のｌ束結乾燥菌体を用いてｐ　Ｈ４，４０で３Ｏ
ｒの温度で測定して見たところ、次の第１表ｔこ示すよ
うｔこ、Ｌ−グルタミン酸を１００％とした場合、５条
以りの起電勾な示すものは見当らない。

第１表　微生物電極の選択性 第１表ｔこ示されていない、定ｊｌぜんとする■、−グ
ルタミン酸以外の他の■、−アミノ酸、すなわちＬ−メ
チＡニノ、Ｌ−ヒスチジ／、■、−リジン、Ｌ−プロリ
ン、Ｌ−セリフ、Ｌ−インロイノン、Ｌ−）Ｊニルアラ
ニン、Ｌ−ロイ７ン、Ｌ−アスパラギン、Ｉ、−バリ／
、！、−スレオニン、Ｌ−オル＝　チア　、ｌ、−７ト
ルリン及びりんご酸、ピルビン酸、グルコース、尿素等
は全く影響が見られなかｆ）た。

又、同じエシェリヒア・コリを用いるソールブルグ検ｔ
＋−法では１．−グルタミン酸１００％ｔこ対してＬ−
チｇ／７４５％、Ｌ−フルギニン８０％、■、−トリプ
トファ７２５　％　、りんご酸４０チと、かなり彫りを
受ける。又かぼちや由来の酸素を用いた場合、尿素の影
響が著しいため窒素諒として尿素を用いるＬ−グルタミ
／Ｑ文発階その他のし一アミノ酸発階ゾ１１スのｌｌｌ
ｌＩ足が不Ｊ　６ｔ：であり、これｔこメ４して本発明
の四屯極型′員ｈｉ分析計を用いる本法は１ｌＩ（択１
〆ｌ＋こおいても本・）６明のノＪ法が非常に優れてい
ると見ることができる。

１−２述の如く、本発明の方法は従来法に比較して（１
）顆択１／１が良く、（２１非常に迅速な測定ができ、
（８）広い良度レンジの試験液を希釈の手間なしに測定
Ｉｊｆ能である等の点で優れた方法であり、従来法より
簡便でかつ正確ｒこ、目的とするし一アミノ酸を定駿す
る方法を提供するものである。

ｔＯ 実施鋼中組成を・ｉりすチは特記なき１ＩＪ４す２／ｄ
／をへ 示す。

実施例１ エシェリヒア−コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ　）ＡＴＣＣ８７３９を第２表の培地を用いて３０　
ｔ：でフラスコ振盪培養した。２０時間Ｊ’；４養後、
培養液５（ｌｓｗ／を遠心分離して、湿菌体を得た。こ
れを０．１　Ｍ、　ＫＣＩ溶液溶液５０モｅ回ａ滌し、
凍結乾燥して、０．６２の菌体な得た。

第２表　培地組成（ｐ　＋ｉ　７．ｏ　）：Ｌ記の１〜
２りの凍結乾燥菌体を少腋の水に溶かしペースト状とし
、４’ｒ　Ｉ　Ｏ＊ａ＋のナイロン・メツンユｔこ塗す
つけ、これをセロファンｌｌｉ　（４１を用いて、第１
図のように四＋１極型貞１ｔ！分析旧に連らなり、先端
がガス透過性膜（／リコーン膜）でおおわれたガス？！
）入用プローブ４１）（Ｅ６０３６型、　ラジオメータ
ー？Ｌ　、デフマーク）のシリコーンＩＩＱ　ｆｉ＋−
）−に取りつけた。

この測定プ１スープを用いて、第２図１こ示すフローセ
ル（９）（容１ｉ１０．５　ｍｌ　）にゴム・パツキ／
グ（８゜８°）を介して挿入Ｉ１、第２図のような測定
システムを組）γてた０、１ バッファー液としては、ｐＨ４，４０，０，１Ｍピリジ
ン−塩酸バッファー（０，５ｙ　／ｄｉのＮａＣ１及び
Ｋｔｌ、ＰＯ４を８む）を、第２図の００から５　ｍｅ
　／　ｍｉｎの流ｌｉｔで流入させ、ＩｌｌからＮ、ガ
スを０．２　Ｌ　／　ｍｉｎの流品で吹込んでフローセ
ル＋９１内を通し、測定プローブ（７）は、そこでの発
生Ｃｏｇ　、ｊｉｔを測定するためステンレスチューブ
０９を介して四重極型質娼分析ｊ１０３、さら１こは記
録Ｍｔ　０４　ｔこ接続した。測定中、７０−セル（９
）内の温度は３０ｒｔこ保′〕た。ナノプルは、６００
０ｐｐｍのし一グルタミ／酸水溶液及びその吊釈液をＩ
ＩＩ次１ｍｌ／ｍｉｎの速度で、注入時間３分で０３か
ら注入した。このリーフプルは、バッファーにより希釈
され、フト−セルｔｉｌｌ　ｌこ流入すると同時ｔこ、
四１１Ｌ極型質ｈ４゜分析５１０３は指示をしはじめ、
３０秒後には指示が飽和レベルに達し、第３図のような
ピークが記録された。第３図中、畿軸は、四重極型’Ｌ
’１鼠分析計の出力電流（ｍＡ）、横軸は時間を示す。

第３図中の６ピークの高さと７１２−セル中のグルタミ
ン酸濃度の間には第４図の関係が見られ、ｔ＋’：ｌ！
　Ｉ（ｔ’　！　−１０ｐｐｍの間で非常に良好な直線
性を「Ｖた３、 一方、ルビバクテリウム・ラクトフェルノアタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９を第３表の培地を用いて３０Ｃで通気纜？
ト培養を行なった。

第３表　培地組成（ｐＨ７，０） 得られた培＆　１１ｋを２０倍希釈しサンプル八とし、
これに試薬のＩ、−グルタミン酸を既知量だけ添加し、
す／プルＢ、Ｃ，Ｉ）を調製した。

これらのす／プルを第２図のシステムｔこ従い、ピーク
値を読み取り標準濃度液で作った校正直線からし一グル
タミン酸のへ度を求めｔこ。その結果は、第４表１こ示
す如くであり、各サンプルについて従来のオートアブラ
イザー法（カポチャ醇素を使用）で測定ｌまたｉｌ（＋
と良く一致していた。

第４表　１．−グルタミン酸プロスの分析結果ｌ実施例
２ クロストリジウム・ウェル７ユ（（ｌｏｓｔ口ｄｉｕｎ
ｔｗｅｌｃｈｉｉ　）　ＡＴＣＣＩ　３１２４を３％カ
ゼイ／のトリプシン分解物、２チグルコースに肉片を加
えた培養液で、水素ガスを通して３０Ｃ，２０時間フラ
スコ振盪培養した。培養＃＆５０　ｙｔｌを実施例１と
同様の操作で、０．３ｔの菌体を得た後、６１！Ｉ定プ
ローブを構成し、実施例１と同様ｔこして得た■５−グ
ルタミン酸発酵液の経時的なサンプルＡ１８％Ｃ１Ｄｔ
こりいてグルタミン酸の濃度を求めた。その結里ｌｊ１
第５人に示す如くで、各→ノンプルｔこついて、ｔμＴ
Ｖのカポチャ酵素夕用いた４−トアブライザー法で４１
１１定しｊ、Ｈ（１ｔｙと良く一致１−ていた。

冑′区５表　Ｌ−グルタミノ酸プｐスの分析結果２実施
例３ ／ＩＩＪバクタド・７０イ／ナイ（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔ
ｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ　）　ＡｒＣ（１０７８７を、実
施例１と同条件で第２人ｔこ小すＩ？；　Ｉｌ！組成を
用いて培養し、ｔ、：。

Ｊ７Ｘ３’ｊ液５０ａ＋／！を遠心・分離して６］ｌＩ
菌体を′得、（１，１Ｍ、ＫＣ１ｆｆＩ液で２回６．滌
俊、５　ｍｌの水に懸濁、トルエ／を室Ｒ＋Ａで５　Ｖ
／渦ト、１０〜２０分攪拌し、冷却遠沈した。これを真
空デシケータ−中で乾燥して０．５　ｔのトルエフ処理
菌体を得、測定プローブな構成した。実施例２と同じサ
ンプルのＩ、−グルタミン酸発酵液についてＩ７−グル
タ５）酸濃度を求め、第６　ｋなイ４７　ｔこ。

第６　Ｊ　　１．−グルタミノ酸ブロスの勺ＩＪｉ結宋
；う実施例４ ０ドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏ＋ｏｒｕｌａ　ｇ
ｌｕｔｉｎｉｓ）ＩＦＯＯ４１３を第７表１こ示す培地
を用いて３０Ｃ１４８時間フラスコ振盪培養ｌまた。

第７表　培地組成（ｐＨ６，３） 」；い・↓液５０＋ｎｌ＋を遠心分離しＣ化た湿菌体を
（）、１Ｍ、ＫＣＩ　　１Ｂ＞ｔ＜−ｃ２回洗滌後、凍
結乾燥シテ０６ｙの菌体を得た。これな用いて測定プロ
ーブ゛を構成し、実施例２と同じサンプルσ）Ｌ−グ、
！レタミ／＋ｔ々発階１＋に＋こりいてグ／トタミンｒ
杖濃ＩＷを求めたところ、従来のカボザヤ酔素シ用いｔ
こ）ｒ−）アークライザー法で測定したｆｌＩ′Ｉと良
く一致し、て（・た。

実施例５ ラクトバチルス・カゼイ（１，ａｃｌｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓｃａｓｅ＋　’）　ＡＴＣＣ７４６９（試験ＡＩ）を
脱指粉１Ｌ１０％、１．−リジン塩０．５≠、ピリドキ
サ−／し１００１ｔＶ／′ｔからなる培養液で、ストレ
プトコンカス・ノ二カリス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ｆａｃｃａｌｉｓ　）ＡＴＣＣ＋２９８４　（Ａ２
　”）、ンー＋　−ド七Ｊ−ス・＠）’ノカロフイ７　
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ａｃｃ旧１ｒｏｐｈ　ｉ
　ａ　）Ａ′ｒＣＣ１５９４６（４３）、バ’）　ルス
−ズ−）”Ｊリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉ
５）　ＡＴＣＣ＋５０３７　（Ａ４）、ミクソコツカス
・ヴイレスセンス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｉｒｅｓ
ｃｅｎｓ　）　　Ａ　ＴＣＣ２５２０３（廂５）を肉エ
キス１％、ポリくプｌ−７１％、ＮａＣｌ　　Ｏ，５％
、し−リジン塩酸塩０．５％、ビリ１゛キサ−＋ｐ　ｌ
　００　ｐｙ／ｌからなる”ｉＸ　４１８に−Ｃｋ、さ
ら１こアスペルギルス−ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｎｉｇｅｒ　）ＡＴＣＣ６２７Ｂ（扁６）？グルー
ノース２％、Ｋ）Ｉ、　Ｐｏ、　　０．１％、炭酸イ４
灰添加こうじ１１の１１１地でそれぞれ振盪培養し、２
４時間後、各培ｊ蓬液５０　ｎｌを遠心分離１−テ＋ｉ
ｕ！菌体ｆ　１１＋１　そ＃１ぞ扛０．１Ｍ％ＫＣＩ　
　溶液で２回洗滌後それぞれ０．５へ−Ｃ）、６Ｖの凍
結乾燥菌体を得た。この菌体な用いて実施例１の方法で
測定プローブを構成１１、実％、ｉ例２と同様のす／プ
ルの■、−リジン発酵液Ａ％　８％　Ｃ１こついてＬ−
、、−ＩＪレジン度を定置１−たところ、第８表のごと
〈従来法の酸性ニノヒドリ７法の値とよく一致した。

第８　表１、−リン／・プロスの分Ｕｒ結果実施例６ ストレゾ１コツカス・ソアエ力リス （５ｒｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　）
ΔＴＣＣ＋２９８４をｌｒピイノのトリ１フフ分解物３
≠、グルコース１襲、酊１り自己分解物０．１％の培食
液で３７Ｃ１１５時間」１１養１−１ｌ中結乾燥して０
．５２の菌体を得、これを用いて測′ｊｖブ１１−ブな
溝成し、実施例２と同様の試料の１、−グルタミン酸発
酵液ｔこｖ４なる欧のＬ−フェニルアラニ／を添Ｄ１１
　Ｌ　、それソ）Ｌ　試料Ａ、Ｂ、Ｃとし液体りｐマド
グラフィー法の測定値と比較し、次の第９表を得た。た
だしバッファー液は実施例１と同様としｐＨを５．０Ｉ
こ設定したものを用いた。その結果両者はよく一致して
いた。

第９表　ブロス酸中のし一フェニルアラニ／の分析結束
実施例７ エンエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ　）ＡＴＣＣ１０７８７を実施例６と同様ｔこ培養し
、実施例１の方法で０．３２の菌体を得、これを用いて
微生物電極を構成し、実施例２と同様のＬ−グルタミン
酸発酵液ｔこ異なる量のし一フルギニノを添加１７て、
それぞれ試料Ａ１１３、Ｃと１７、本発明の方法で′７
ｊｌ　Ｉｎｌし、−・力液体クロマｌグラフィーで疋１
、Ｘシて七の結果なス・ｊ比して第１０表に７１りずが
、表ｔこ小すようｔこ両名は」、く一致した。尚、使用
した・二ノソアー液は実施例６と同様であ−９だ。

第１０ノ〈　ゾルＡ液中の１．−アルギニンの分析結果

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法に用いる四屯極型簀ｈ１分析６し
こ連らなり、先端がカス透過性膜でおおわｌ＋たガス導
入用プローブの隔膜」二に菌体又は酵素を１１′ｙ、す
（＝Ｉけた測定プ１」−ブの構造説明図、図中（１）７
リコー７膜、（２）微生物又は酵素層、（３）担体、（
４）透析）模、（５）細孔なイｊする膜の支持体、１６
１１１１す’＋Ｉ’ゾ１Ｊ　−プ本体（ステンレス）、
（７）四屯極型４（：５　ｐ、ｌ、分４）ｉｉｉｌにガ
スを移送するｚＸ４管を７」＜す。。 第２図は本発明の方法１こ使用する定ｌｉｔ、　、７ス
テｊ、セットの　−態様を示す。図中、ｍ　１ｌｌｌｌ
定用ソ１」−ゾ、＋８１　、　（偵ゴムパソギ７グ、（
９）フｌコーセル、（１１１Ｎ、！ガノ、吹込１−１、
ａｔ＋バッファー液汁人１］、（１３す７プル？１人目
、（１、憬四屯極型゛員ｈ１１分析１：１．０・９レ−
３−グー。 第３図は実施例１の１７−グルタミンｊシ゛水ｍ液及び
その属釈液の法人時間１０８、洗滌時間２０　Ｊ：！；
とした１１．５の四ｊｌｊ極型′Ｃ↓ＩＪ：　’ｔ）析
。１０′屯ｌＡＬ出力を小（−フッソ、縦１ｌＩＩＩＩ
はＩ（Ｉｉ流出力（Ａ）、横軸は時間を小才、。 第４図は第３図中のピークの高さくＡ）と、ノーーーセ
ル中のＬ−グルタミン酸液濃度との閃１糸を示すグラフ
。 特許出願人　味の素株式会社 １粉補ｉ＋’、　ｉ！：　（７’Ｊｊ’ｌ：　）Ｌ　Ｉ
ｌ’ｌの入車 １１ｉ（（Ｉｔ　ｈ　７１４：＋　１１片Ｃｌ０ｉ　１
　　、’３　（１（１２２！３？、イ亡ＩＩ月ｑＢ’１
ｆ＋・ ）　−ノ′　ミ　７ｖ型の測定？人 ３、　１１１ｉ＋ｌ　　ｋＣｌ　る石 ・ｌｉ　ｆｌどの関（糸　　１’＋　ｎ’ｌ　１ｌｌｆ
イ１人１１所　　　中３ｉｊ　？ｉｔ！中央ト巾オ庇　
Ｊｌｌ！１ｌｌ用！＋１＋１ｉ１１　を二Ｊ、　ｌ　ｌ
　ｌ！’＋＋１ト１　り）什１１月の数　　　　イ、：
（２［定Ｍ７人、ｌ　’Ｅ：　ｆｉｌｌす定ン人１にＫ
１１−ＩＪ：　！Ｊ’。 ５９９−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 四屯極型τム４；分析謹しこ連なり、先端がガス透過性
   膜で覆われたガス導入用プローブの隔膜」−しこ、定＆
   、１せんとするし一アミノ酸の脱炭酸酵素活性を有する
   微生物菌体又は該菌体に由来する酵素な取りつけた測定
   プローブを鎌気的条件下で当該■、−アミノ酸を含有す
   る被験液と接触せしめ、基′貞ａ度と該６１１１定プロ
   ーブ近傍で生じる炭酸ガスと幻応する四重極型’Ｉ’１
   　ｆｉｔ：　Ｍｌの出力゛ｉヒ流との間の比例関係を利
   用して、！ＩＳ、質濃度を求めることからなるし一アミ
   ノ酸の定駄法。