JPS59205394A - ２’，５’―リボアデニレート―モルホリノアデニレートヌクレオチド、これを有効成分とする抗腫瘍剤，これを有効成分とする自己免疫性の病気の治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、２，５−インターヌクレオチド結合、少なく
とも１個のリボースアデニンユニットおよび末端モルホ
リンユニットを有するヌクレオチド化合物に関し、詳し
くは前記のヌクレオチド化合物の抗Ｉ！１ｉＩｓ剤また
はインターフェロンによる自己免疫性の病気を避けるた
めまたはインターフェロンの指抗耐としての用途に関す
る。

〔技術の背景および従来技術〕

２−５Ａは、一般式：　ｐｐｐ５’Ａ　２’　（ｐ５’
Ａ　）　ｎ（ｎ≧２）で示される２′、５′−結合リボ
ヌクレオチドである。２−５Ａは、インターフェロンに
よって誘起される２−５Ａ合成酵累と呼ばれる醇紫によ
って、 ＊　ＡＴＰ−＋ｐｐｐ５’Ａ　２’　（ｐ５’Ａ）ｎ　
＋（ｎ　−１）ｐｐ　（ｎ≧２）という具合にＡＴＰか
らつくられる。２−５Ａ合成酵素は２−５Ａポリメラー
ゼ、２’、　５’−ヌクレオチジルトランスフェラーゼ
と呼ばれていることもある。２−５Ａはエンドリボヌク
レアーゼ（ＲＮｍ５ｅ　Ｌ　、　ＲＮａ５ｅ　Ｆ　）を
活性化し、活性化されたエンドリボヌクレアーゼはＲＮ
ＡをＵｐＡ　、　ＵＴＩＵまたはＵ匹の系列のものに裂
開する。このために、２−５Ａは、真核細胞の細胞を含
まない抽出物における蛋白質合成の温存的な阻ＪＦ剤（
ＩＣ８ｏ：〜１０”’Ｍ）とされている。

２−５Ａによる蛋白質合成の阻止のメカニズムはインタ
ーフェロンの抗ウィルス作用のメカニズムに結び付けら
れている。すなわち、インターフェロンは２−５Ａ合成
酵素を有力な宿主細胞に誘発し、またウィルスの模写に
よって生成した二本鎖ＲＮＡは酵素を誘発して、２−５
Ａがつくられるが、２−５ＡはＲＮａ５ｅ　Ｌを活性化
してウィルスのｍ　ＲＮＡを分解して蛋白質合成の阻止
をもたらす。

２−５Ａに関する多くの研究およびこのような２−５Ａ
による蛋白質合成の抑制は、２−５Ａのウィルス病また
はガンの治療剤としての用途を暗釈する。

しかしながら、２−５Ａ自身はイオン的性質を有してい
るために、細胞内に入り込むことが難かしく、また２−
５Ａは２　／　、　５　／−ホスホジェステラーゼによ
って分解されるので、生体内または細胞抽出物内の寿命
が短かく、その生物学的活性は意外に弱い。

単一のヌクレオシドのリボース環をモルホリン環に変換
することがＪ、　Ｃ，キムによって報告され、（Ｂｉｏ
ｃｈｅ＋ｍ１ｓｔｒｙ第２巻第３４４−３５０　！　（
１９６３年）〕この化合物の正確な構造はブラウン等に
よって公衷された（　Ｊ、　Ｃｈｅ＋ａ、　Ｓｏｃ、第
５０７２−５０７４ｇ（１９６５年）〕。キムの化合物
は、本発明の化合物と容易に区別することができる。と
いうのは（１）キムの化合物は単一のモルホリン環に変
換された単一のリボースを葡するだけのものであること
、（２）キムの化合物はモルホリンのＮにメチル置換が
あるだけであること、（３）キムの化合物にはホスフェ
ート部分がないこと、および（４）キムの化合物には生
物学的活性の増強がないことにおいて本発明の化合物と
は異なるからである。

米国特許第３５３２６９５号明細書および米国特許第３
５４２７７６号明細書には、過ヨウ紫峻塩による変換が
プリンリボシドをモルホリノイソニコチンアミドに酸化
したことを開示する。

また米国特許第３６８７８０８号明細書はポリヌクレオ
チド鋼上のホスフェートのチオ同族体による置換または
存在するホスフェートにこのような同族体を結合するこ
とを開示する。

また米国特許第３５７９８９０号明細書は多糖類および
ポリペプチドのイミダゾリル誘導体を開示する。

さらに米国特許第３８５０７４９号明細書は２’、　　
（３’）−〇−イソバレリルＡｐＡｐＡｐＡを含むオリ
ゴリボヌクレオチドを開示する。これには末端のモルホ
リンの開示はなく、また総べての化合物は、　？、　！
５／−インターヌクレオチド結合を有するものである。

さらに米国特許第３９９８８２２号明細書は、モルホリ
ノを含むピリダジンを開示する。

さらになお米国特許第４０００１３７号明細書および米
国特許第４０４１０３７号明細書は担腫努剤として有用
なイノシン、アデニンおよびシチジンを含む種々の合成
ヌクレオチドを開示する。

さらにまた米国特許第４２１０７４６号明細書はｐｐｐ
ＡｐＡｐＡを開示する。

もう１つ米国特許第４３０２５３３号明細瞥は（２′。

−５）　　ｐｐｐＡｐＡｐＡを開示する。

これらの化合物のほとんどのものは末端に置換モルホリ
ンがなく、また２’、５’−結合のないものもあり、こ
れらの点のいずれかによって本発明の化合物と明らかに
相違し、明確に区別することができる。

〔発明の目的および発明の要約〕

本発明の目的は、細胞内における蛋白質合成の阻止に有
効である２’、　５’−結合リボアデニレートの新規誘
導体を提供することにある。

本発明は、一般式： （１５） （１）式において、Ｊ　ｎ、Ｙおよび２、特許請求の範
囲の一般式に同じである。

によって示される化合物であって、２，５−インターヌ
クレオチド結合、少なくとも１個のリボース−アデニン
ユニットおよび末端モルホリンユニットを有する新規な
ヌクレオチド化合物である。

本発明は、上記の新規なヌクレオチド化合物を有効成分
とする蛋白質合成を阻止する薬剤である。

〔発明の詳細な説明〕

本発明の上記のヌクレオチド化合物は次のように記述す
ることもできる。

さらに本発明の）記のヌクレオチド化合物は次のように
記述することもできる。

（１６） （１）式、（Ｉ）式および（１）式のいずれにおいても
、重は０、！、２．３または４であり、力はｌか５１５
までの整数であり、Ｙは、ＹがＨでありうる末端ホスフ
ェート上を除いて、常にＨ１アデノシンまたはＣｚ−ｓ
ｏの第一級または第二級アルコールである。また２は、
ＨまたはＣｘ　−ｇｏの炭化水素或いは置換炭化水素で
あって、その炭票原子の１つを通してモルホリン環の窒
素原子に結合する基であるが、詳細には次のとおりであ
る。

本発明のヌクレオチド化合物のより好ましい形は、ホス
フェートのない化合物（Ｉｌｌ−０）、モノホスフェ−
）−（ｍ＝１）およびトリホスフェート（ｍ＝３）であ
る。しかしながら本発明の化合物のジホスフェート（ｗ
ａ　＝　２　）およびテトラホスフェ−）−（ｍ＝４）
の形のものもまた有用である。

ｌが３を超えると、その化合物はモノ−およびトリー型
に裂開することが多くなるだろうということが信じられ
る。

Ｙ！７１■であるのが好ましい。Ｙが■でない場合、置
換基部分は、化合物の性質を改変しうるように作用しう
る。たとえば、本発明の化合物を使用することにおいて
、Ｙが■であると、最も効果的な抗ウイルス性の化合物
はトリホスフェートであるが、モノホスフェートは、イ
ンターフェロンに対する悪い雪性の反応を阻止するため
または自己免疫欠乏疾患を処理するために、細かく調整
する治療薬中においてより効果的である。一般的に、ジ
ホスフェートおよびテトラホスフェートは、（ｙがＨで
ある場合）トリホスフェートと同様に行動するであろう
。ホスフェートのない化合物は、恐らくトリホスフェー
トと同様に行動するだろう。

ＹがＨ以外の置換基部分である場合、テトラホスフェー
トはＹが■であるときのトリホスフェートと同様に行動
するだろう。トリホスフェートは、Ｙｔｆｉ■である時
のモノホスフェートまたはトリホスフェートのいずれと
も同様に行動するだろう。

そしてジホスフェートとモノホスフェートは、ＶがＨで
あるときのモノホスフェートと同じに行動するだろう。

（Ｉ）式、（！［）式または（１１）式のいずれにおい
ても、ｎは１から１５までの整数でありうる。

合成法において可能性のある変化のゆえに、ｎの値は絶
対数よりもむしろ平均でありうる。リボースモノマー（
ｎ＝１）が本発明で有用であるが、リボースの低重合物
（ｎ＝２ないし６）が好ましく、またリボースオリゴマ
ー（ｎ＝２．３または４）が最も好ましい。化合物はこ
れらのモノマーおよびポリマーの混合物であってよい。

（１）式、（Ｉ）式または（１）式のいずれにおいても
、２は■或いは複素環のモルホリノ環の窒素に結合した
Ｃｚ−ｇｏの炭化水素または牧換炭化水累であってもよ
い。結合は置換基部分の炭素原子の１つを通じるべきで
あり、またそれゆえにかかる結合のための遊離の炭素原
子ををしないいかなる部分もこの発明から排除される。

またこの発明の化合物の所望の生物学的活性または安定
性を妨げるいかなる置換基部分も排除される。

好ましくけ、Ｚは次の式を有する。

■ −Ｃ−Ｒ１ Ｒり 式において、Ｒ１およびＲ＊　　（またはＺ自体）は同
一または異なったものであることができ、また水素また
はＣ凰ｍの、好ましくはＣｔ−４ｏ。

より好ましくはＣｔ−ｓｏ、最も好ましくはＣｔ−ｓｏ
を有する次の部分のいかなるものであってもよい。

ａ）アルコールおよびそれらに相当するエステル、エー
テルおよび酸であって、これらは飽和または不飽和、分
枝または直鎖であって、好ましくは直鎖および不飽和ま
たはステロールであって次のものを含むが、これらに限
定されない。

○！−テトラデカノールおよび！−オクタコサノールの
ような直鎖の一価アルコール、 ○シスー９−へキサデセノールおよびシス−９−アイコ
セノールのような直鎖の一価不飽和アルコール、 ○キミルアルコールおよびセラチルアルコールのような
二価アルコール、 ○グリセロールおよびプロピレングリコールのような多
価アルコール、 ○アミノイソプロパツールおよびアミノシクロへキセノ
ールを包含するアミノアルコールのような置換アルコー
ル、 ｂ）ラノステロール、ルペオール、アルファーアミリン
、フプロステロール、アグノステロール、コレステロー
ル、シトステロール、スチグマステロール、ブラシカス
テロール、エルゴステロール、ルミステロール、タキス
テロール、および７−シヒドロコレステロールのような
ステロール（脂環族アルコール）、特にコレステロール
およびエルゴステロール、 Ｃ）エタン、イソペンタン、デカン、ノナデカン、およ
びテトラセンタンのようなアルカン、ｄ）プロピレン、
ブタジェン、テトラメチルエチレン、およびイソプレン
のようなアルケン、ｅ）グリシン、アラニン、バリン、
ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、セリン、
スレオニン、メチオニン、システィン、シスチン、チロ
シン、ショートチロシン、チロキシン、トリプトファン
、アスバルチン、グルタミン、アルギニン、およびヒス
チジンのようなアミノ酸、 ｆ）ブチルアミン、オクチルアミン、およびウンデシル
アミンのような第１級アミン（第２級、第４級または第
４級アミンではないが）、ｇ）ベンゼン、キシレン、ナ
フタレン、コロネン、およびスチルベンのような芳香族
炭化水素、ｂ）シクロプロパン、シクロペンタン、スピ
ロペンタン、およびデカリンのようなシクロアルカンお
よびシクロアルケン、 １）アセトン、ジエチルケトン、およびシクロヘキサノ
ンのようなモノケトンおよびアセトン、ｊ）　トリプロ
ピオニトリル、アクリロニトリル、およびマロノニトリ
ルのようなニトリル、ｋ）フェノール、クレゾール、ナ
フトール、およびアルキルフェノールのようなモノヒド
ロキシであるフェノール、 り１次のものを含む有機酸（上記のアルコールに相当す
るものに加えて） ○ペンタノイック、トリデカノイック、およびテトラコ
サノイックのようなｎ−飽和酸およびそれらのメチルエ
ステル（メタノイックを除く）、Ｑ２１−トリアコテノ
イック、９．１２−オクタデカジェノイック、９＋　１
２＋　１５−オクタデカトリエノイック、および１２−
ヒドロキシ−９−オクタデカノイックのようなモノおよ
びポリ不飽和脂肪酸（エポキシを除く）、 ０３−メチルブタノイック、１０−メチルステアリツク
、および１３−（２−シクロペンチル）トリデカノイッ
クのような分枝鎖脂肪酸、○マロニック、サクシニック
、アジピック、アゼライツク、およびフタリックのよう
なＣｓよりも大きい二垣基酸、 限定することを腫図しない上記の広範囲の適例となる外
糸か５２におけるいかなる置換基部分も本発明の目的の
ために有用であることは、それが次の臨界的な限定に常
に遼遇するならば、明白とするべきである。

りモルホリノ部分の窒素に結合するために遊離の炭素を
常に存すること、 ２）この発明の化合物の残りの部分の増強された生物学
的活性と常に調和しないものでないこと、３）この発明
の化合物の残りの部分の分解に対する増強された抵抗性
と調和しないものでないこと、４）それが生体内に服用
されるためである揚台に、この発明の化合物を薬剤的に
調和しないものにしないこと、および ５）ｌ−５０、好ましくは１−４０　、より好ましくは
１−３Ｇ　、最も好ましくは１−２０の炭素原子の総数
を有する、 特に興味のあるのは、既に合成された本発明による化合
物であって、さらにその詳細は以下に与えられるであろ
う。このような化合物は、２が複合Ｍ類であるもの、ま
た２が−ＣＨＲｚＲｔｓであって、Ｒ１およびＲ１１の
一方が水素であるが、他方がペンチル、ε−アミノペン
チルまたは−ＣＫ　２６０１’ＡＩ＋　（パラ）である
か或いはＲ１およびＲｔａの双方がメチルであるものを
包含する。

過ヨウ素酸塩酸化／シッフ塩基の生成／水素化ホウ素還
元のサイクルによるｐ５’Ａ２’　（ｐ５’Ａ２’）　
ｎｐ５Ａの化学的修飾は、メー末端ヌクレオチドのリボ
ースがＮ−１ｆｉ換モルホリン（アザヘキサピラノース
）に変えられた一連の２−５Ａ類似化合物を与えた。こ
の修飾を育する２、５−オリゴリボアデニレート、５／
−モノホスフェートは、２−５Ａまたはポリ（１）ポリ
（Ｃ）の作用の招抗剤としてＶ、未修飾の９５’Ａ２’
　Ｐ５’ＡＺ’　Ｔ１５’Ａよりも５−１０倍強力であ
った。四散体トリホスフェートｐｐｐ５’ｘ２’ｐ５’
Ａ２’ｐ５’Ａ２／ｐ５’Ａに対するこの修飾の適用は
、鰻白質合成の阻止剤または２−５Ａ依存エンドリボヌ
クレアーゼの活性化剤としてｐｐｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ
２’ｐ５’Ａ　（２−５Ａ三量体トリホスフェート）の
活性の１０倍の活性を有する類似化合物をもたらした。

今日までに報告された最も有力な２−５Ａ誘導体のこの
新規な２−５Ａ類似化合物は１０＝’Ｍ　（半極大阻止
のためのｆｉｆｆ）の濃度において、脳心筋ウィルスＲ
ＮＡによりプログラムされたマウスのＬ細胞の抽出物中
の翻訳を阻止した。かかるＮ−置換モルホリンで＃＆飾
されたメツ５−オリゴリボアデニレートの総べては、２
−５Ａまたはその誘導体が急速に破壊された条件の下で
Ｌ＊Ｉｌａ抽出物による分解に対して極度に抵抗性のあ
ることが見出された。これらのデータは、２−５Ａホス
ホジエステラーゼの作用のために完全な２−末端リボー
ス環を必要とすることを示す。

かくして２−５Ａの２２−末端の大規模な化学的修飾は
、その生物学的活性に対して逆に影響しないが、分解に
対するｍ損性のような他の都合のよい性質をいっしょに
付与することを可能にする。

以下の検討において省略形が用いられる。

ＰＥＩ　：ポリエチレンイミン、ＥＭＣＶ　：胴ｒｒｐ
筋炎ウィルス、ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
、ＤＭＳＯニジメチルスルホキシド、ｄｓ　ＲＮＡ　：
二重ラセン（構造）のＲＮＡ　、およびｒ）ＭＦ　ニジ
メチルホルムアミド。

２′、５／−ホスフォジエステル結合を有するオリｆ　
　／ ゴヌクレオチドは、かかる２、５−結合オリゴマーを恐
らくは優先的に分解することのできる少なくとも１の酵
素がインターフェロンで処理されるかまたは処理されて
いない細胞の抽出物中に証明されているにもかかわらず
、その３’＊　５’−ｘ合の片割れよりも酵素分解に対
してかなり抵抗性がある。この酵素は２−５　Ａ　　（
ｐｐｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ　）をその２′
−末端から分解して５’−ＡＭＰおよび５′−ＡＴＰ（
５−末端におけるＮ−１から）を得る。精油出物におい
ては、５−末端（Ｎ−１）は、ホスファターゼの作用の
ゆえに、ＡＴＰとして明白ではない。２−５Ａを分解す
る酵素は、末端の２’　（３）−リボースの水酸基の化
を的修飾がオリゴヌクレオチド鎖の切断の速度を著るし
く遅らせるさいう点で、他に記載されたホスホジェステ
ラーゼ（たとえば、Ｃｒｏｔａｌｕｓ　ａｔｒｕｘから
の蛇形ホスホジェステラーゼ）と基質特異性において類
似でありうることが明白である。２−５Ａの分解に応答
しうるホスホジェステラーゼ活性は、酵素作用を認睦す
る位置としてその２′−および／または３′−水酸基を
存する完全な末端リボースを必要とするだろう、この仮
説は、２−末端のリボース全体が遊離の水酸基の存在し
ないモルホリン部分で置換された２１−末端を修飾した
オリゴリボヌクレオチドの代謝的安定性についてここで
記録された観察により支持される。他の研究において、
２−５Ａの推定上コルディセビン（Ｃｏｒｒｌｙｃｅｐ
ｌｎ　）類似化合物のｐｐｐ５’　（３’ｄＡ　）　２
’ｐＰｉ’　（３’Ａ　）　２’ｐ５’　（３’ｄＡ　
）はＨｅＬａ　ＩＲ胞の抽出物中で増仲された安定性を
有することが報告され、そしてこの発明において用いら
れたのと同じ柔性の下で、コルディセビン類似化合物の
ｌ−モノホスフェートとのｐ５’　（３’ｄＡ　）−２
’ｐ５’　（３’ｄＡ　）　　２’ｐ５’　（３’ｄＡ
　）は２時間のインキュベーシミンの豪に１７％が分解
されただけであった。末端の３−０−メチル化類似体の
Ｔｌｐｐ５’　Ａ２′−ｐ５’Ａ２’　ｐ５’　Ａｍは
、２−５Ａ自身と比較されると、細胞抽出物中において
実質的に増加した寿命（ｍｌ用期間）を有していたこと
が見出された。最移に、２−５Ａの３−末端をホスフォ
リル化した誘導体がウサギの網赤血球またはエールリッ
ヒ腹水ガン細胞の抽出物による分解に対してより安定で
あることが報告された。

本発明の結果は、２−５Ａ依存リボヌクレアーゼ（ＲＮ
ａｓｂＬ）への結合とその活性化のためのオリゴヌクレ
オチドの構造上の必要性に対する情報を提供する。結合
と活性化の分離は、別個の現象として前置て確豆されて
いた。２／−末端を修飾した１７＋！屑体トリホスフェ
ート！３はＲＮａ５ｅ　Ｌの有力な活性化剤であるので
、末端のリボース（Ｎ　−４）の大規模な修飾はｐｐｐ
５’Ａｚ’　ｐ５’ｈ２′ｐ５’Ａ２’ｌ）５’Ａにお
ける相当するＮ−４宋端のリボース位置がエンドヌクレ
アーゼの活性化と結合に有力な貢獣とならないに違いな
いことをほのめかす、これは、２−５Ａの四量体トリホ
スフェートのｐｐｐ５’Ａ２′ｐ−−５’Ａ２’ｐ５’
Ａ２’ｐ５’Ａおよび２−５Ａ三量体トリホスフェート
の１）ＴＩＴ１５’　Ａ２’ｌ）５’Ａ２’　Ｔ＋５’
ＡがＲＮａ５ｅ　Ｌの活性化剤として全く同等であると
いうことおよび他の場所で報告された観察と一数する。

同様に、網赤血球システムにおいてｐｐｐ５’Ａ２’　
ｐ５’　Ａ２’　ｐ５’　Ａ−２’ｐ　５　’Ａおよび
ｐｐｐ５’Ａ２’　ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ２”ｐＡ２’
ｐ５’ＣｐがＲＮａ５ｅ　Ｌの活性化剤として等しく効
果的であるが、Ｌ細胞システムでは、かかる３′−末端
モノホスフォリル化類似体が修飾されていない２−５Ａ
よりもずっと少ない活性（５３０倍）でめったことが報
告された。３／−０−メチル化類似体の１１１１ｐ５’
Ａ２’ｌ）５’　Ａ２’ｐ５’Ａｍは、ＲＮＡ切断（４
２）を増強するためのその能力によって検定されるよう
に、２−５Ａ三景体よりも約４倍も活性的であることが
確められているので、２−５Ａ′：Ｅ、′＠、体トジト
リホスフェート端（Ｎ−３）ヌクレオチドの３７−水酸
基は、恐らくはエンドヌクレアーゼへの結合またはエン
ドヌクレアーゼの活性化のいずれのためにも重要でない
。２−５へ三景体の末端リボシド（Ｎ−３）の３７−水
酸基に対する水六の置換の効果は、網赤血球溶解物にお
ける三量体トリホスフェートの生物学的活性が四量体ト
リホスフヱートに比べて変則的に低いことが知られてい
るので、定量的に評価することが難かしい。２−末端を
修飾した＝１体モノホスフェー１−１１が２−５Ａ作用
の発抗剤としてＴＩ５’Ａ２’ｐ５’　Ａ２’＋１５’
Ａよりも効果的であるという事実は、もし全部でなけれ
ば、２−５Ａ三量体の末端＜Ｎ−３）ヌクレオチドのリ
ボース部分のほとんどのものがエンドヌクレアーゼに対
する結合に含まれないことを暗示する。この結論の支持
において、研突者は、最近ｐｐｐ５’Ａ２′−ｐ５’Ａ
２’ｐ５’　（２’ｄＡ　）がＲＮａ５ｅ　Ｌの効果的
な活性化剤であることを見出した。しかしながら、かか
る結論の総べては、直接のヌクレアーゼ結合の研究がホ
スホジェステラーゼを含まないように精製したエンドヌ
クレアーゼにより成し遂げられるまで、仮のままで残さ
れる。

要約すると、２−５ＡのＮ−３−またはＮ−４−末端リ
ボース環のＮ−Ｎ換モルホリンシステム（アザヘキサピ
ラノース）への変換はＲＮａ５ｅ　Ｌへの結合を明らか
に妨害しないが、２−５Ａを正常に分解する２’１５′
−ホスホジェステラーゼの作用を妨害する。この著るし
く増強された分解への抵抗性は、蛋白質合成の阻止剤お
よびＲＮａ５ｅ　Ｌ作用の活性化剤として２−末端のリ
ボースを修飾した四散体トリホスフェート１３の増強さ
れた潜在能力と相互に関連した。増大した代謝安定性は
、また２′−末端を修飾した２’、５’−オリゴリボア
デニレート５−モノホスフェート１１および１２の、２
−５Ａの作用およびポリ　（１）　　・ポリ　（Ｃ）の
拮抗剤としての増大した活性に関連しうる。翻訳の阻止
と増強したＲＮＡ分解の活性化が関連する限り、修飾し
た四量体トリホスフェート１３は今日まで報告された最
も活性的な２−５Ａ誘導体である。１３のような修飾さ
れた誘導体は２−５Ａから容易に入手でき、そして恐ら
く最も重要なことに、修飾の性質は２−５Ａ分子のメー
末端のさらに大巾な変更を許容する。

（実験の手順について） 細胞抽出物の調製およびインターフェロンで処理するか
または処理していないマウスのし細胞の抽出物における
細胞を含まない蛋白質合成の技術と条件は他に記述され
ていた。

薄層クロマトグラフィーはシステムＡ（ｎＢｕｏ；（／
ＥｔＯＨ／ＨｘＯ／ＮｌＴａＯＨ，６０：　２０　：　
２０　：　１）またはシステムＢ　（クロロフォルム／
メタノール、１０：１）によるシリカゲルＧＦプレート
上、またはシステムＣ（Ｏ６Ｉ　Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯｍ　
）またはシステムＩｌ　（０−２５Ｍ　Ｍｌ（ａＴ（Ｃ
Ｑｓ　）によるＰＥＩセルロース上のいずれでもよかっ
た。高速液体クロマトグラフィー（ｕｐｔ、ｃ）は超球
駄０ｒ）Ｓ　−Ｃ−１８カラム（４，６１１１１Ｘ　ｘ
５ｍ）　ヲ使用する型式１１０Ａ、ｊ？ンプを有するベ
ックマン装置により、１．０ｍＬ／分の流速によって行
なわれた。溶離は５０　ｍ　ＭのＮＨａ−Ｈ嘗ＰＯｓ　
（ｐＨ：　７−２）　　（３０％）およびメタノール−
水（１：１）（７０％）のイソクラチック混合液によっ
た。検出は２６０　ｉｎにおいてであった。

（マウスのＬ細胞抽出物における２　／　、　５／−オ
リゴアデニレートの安定性　免疫化学的研究）４００　
ｎＭの最終濃度におけるオリゴアデニレートが３０℃に
おける０〜６時間の間、蛋白質合成条件（マイナス（３
Ｈ）　−１ｅｕおよびＥＭＣＶ　ＲＮＡ　）の下でイン
キュベートされた。試料が除去され、等量のリン酸塩で
Ｓ衝された塩水（ＰＢＳ、　０．０１Ｍリン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７，４，０゜１４　Ｍ　ＮａＣ１）で希釈され
、また加えられた０、０５％ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレー）（ＰＳＭ）で希釈され、そしてその
後に９５”Ｃにおいて１０〜１５分間加熱された。冷却
後、試料はＥｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロ遠ろ機中で室温
において１分間遠ノら分離された。

上澄液の試料は競合的な酵素と結合した抗体の検定にお
ける分析に先立って、０゜０５　Ｍ　ＰＳＭ中に連続的
に希釈された。（３倍） （化合ｆｍ１１または！２の存在における２−５Ａ合成
の反応機構） Ｗ準的な反応混合物は次のものから構成された。

１８０　蓋Ｍ　　ＫＣＩ　　ｓ　　２０　　ｍＷ　　Ｍ
ｇ　　（ＯＡＣ）　　麿　、　　１０　　調Ｍ　　ＡＴ
Ｐ　。

４０　ｍ１４１（ｅｐｅｓ　　（ｐｆｌ　７．５　）　
、１４　ｆｉＭｆｌ−メルカプトエタノール、２０％グ
リセロールのＷ９液の１００μ！；０゜０１　Ｎ　ＫＣ
Ｉ中のポリ（１）ポリ（Ｃ）（２゜ＩＯ−３Ｍｐ　）　
、０．０１　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ　　（ｐＨ７，５）または
０．０１　Ｍ　ＭＣＩのいずれかの１０　ｐ　Ｉ　、０
．０１　Ｎ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７，５）　　（−ｄｓ　
ＲＮＡ　、対照）５水５μｍの潜在的阻止剤の５１１１
　ｉ水中の〔α−””Ｐ　〕−ＡＴＰ（３０゜８　Ｃ１
／　ｍモル、０．６４５　ｖ＋　Ｃ１／　ｍｌアマーシ
ャムサーレ）；インターフェロンで処理された（　１０
　ａ位置　！ＩＩ　）マウスのＬＦＩ胞のミクロコツカ
スのヌクレアーゼで処理されたＳｓｏ抽出物の２０１Ｊ
　Ｉ　。インキュベーションは３０”（：において表示
された時間であったが、そこにおいてアリコツト（３５
μｌ）が除去され、そして冷水で１０倍に希釈された。

これらの希釈された反応混合やは分析まで一９０℃にお
いて凍結された。

反応混合物は、希釈された反応混合物の２μｌをプラス
チックのＰＥＩセルロースプレート（Ｅ。

Ｍｅｒｅｋ　）上に置くことによる薄糖クロマトグラフ
ィーによって分析された。そのプレートは先ず溶媒シス
テムＤにより、そしてその後溶媒システムＣにより３回
展開された。よく通風されたフード（風洞）において完
全に乾燥した後、そのプレートはデュポン社のＣｒｏｎ
ｅｘ　強化スクリーンを使って１８時間Ｘ−線フイルム
（コダックＳＢ　−５）に総光された。展開されたフィ
ルムの鋳型（注ＤＮＡ合成の時の相補的なりＮＡを示す
）がトレーシングペーパーを使って製作され、そしてこ
れがｔｉｅプレート上に相応するｉ射性のスポットを移
すために使用された。そのプレートは鋳型によって指示
された位置によって切り取られ、そして得られた小片は
標準シンチレーション瓶において！Ｏｍｌの細かい粉末
により数えられた。大きな放射能による各々の放射能の
パーセンテージはｔｌｅ上で見えるようになった成分の
総べてと関連した。ＡＴＰ　。

ｐｐ５’Ａ２’ｐ５′Ａ、ｐｐｐＡ２’ｐ５’Ａ２’ｐ
５’Ａなどの位置は信頼すべき標識から決定された。

尻尾のついた（　ｐＡ　）　ｓまたは尻尾のついた（　
ｐＡ　）　４のどちらも２−５Ａ二量体トリホスフェー
ト、三量体トリホスフェートまたは四量体トリホスフェ
ートの合成の比率に意義のある効果を有しなかったこと
は明白である。２−５Ａに関連した生産物はポリ　＜１
＞ポリ　（Ｃ）の不存在においてはつくられなかった。

過ヨウ紫酸塩酸化／シッフ塩基生成／水素化ホウ素還元
の一連の操作にょる２−５Ａおよび関連するオリゴヌク
レオチドの誘導体化に対する試験的研究のために、アデ
ノシンおよびＡＴＰが基質のモデルとして選択され、そ
してヘキシルアミンがシッフ塩基生成のアミンとして用
いられた。ホスフェート残基のβ−除去または得られる
３−アザヘキソピラノース環の分解のような可能性のあ
る複雑な反応は媒ｑｑ　（ｍｅｄｉｕｍ　）のｐＨがヘ
キシルアミン結合の後に注意深く８゜６に調整され、モ
してシアノ水素化ホウ素ナトリウム還元の後に６．５に
調整されたときに、アデノシンまたはＡＴＰから（７）
および（８）のすぐれた収量が得られたので実際にはな
かった。

（以下余白） 第１表（続き） 〔修飾された（２′→５′）オリゴリボアデニレートの
生物学的活性の評価〕 これまでの研究は、５／−モノホスフェート化されたオ
リゴリボアデニレートのｐ５’Ａ２’　ｐ５’Ａ２’　
ｐ５’Ａが２−５Ａで活性化されたりボヌクレアーゼと
結合することができ、そしてポリ（Ｉ）　　・ポリ（Ｃ
）と同様に２−５Ａ＠身の蛋白質合成阻害効果を妨げる
ことを示した。この観察は、与えられたヌクレオチドま
たはオリゴリボヌクレオチドが２−５Ａで活性化された
りボヌクレアーゼに意義のある結合をすることができる
かどうかを決定するため比較的簡単なアプローチを提供
した。このために（２′→５′）オリゴアデニレート５
′−モノホスフェート（１１）および（１２）が、ｊ！
に初に脳心筋炎ウィルスのＲＮＡによりプログラムされ
たマウスの１４細胞抽出物中の１１ｐｐ５’Ａ２’　ｐ
５’Ａ２’　ｐ５’Ａの翻訳阻止効果を妨げるためのそ
れらのために評価された。

実験において、２−５Ａの三量体のｐｐｐ５’Ａｆ−１
１５’　Ａ２’　１）５’Ａが、文献における他の数値
と一致する〜２　Ｘ　ＩＣｒ’モルの半極穴応答のため
の濃度によって翻訳を阻止したテトラヌクレオチドピー
モノホスフェートとともにまたはそうでなく、種々の濃
度において加えられた。しかしながら化合物（１２）　
カ８Ｘ１ｆｆ−’　Ｍ（７）ｆｆｉＩ度でｇ在すると、
ｉ白質合成の半極穴阻止をもたらすのに必要とされた２
−５へ三量体トリホスフェートの濃度において少なくと
も１０００倍の増加があった。四量体（１２）自体は翻
訳に対して意義のある効果はなかった。

２／−末端を修飾したオリゴリボヌクレオチドが２−５
Ａ作用の箱抗剤としていかに効果的であるかの発想を得
るために、これらのものは、実験において修飾されてい
ない三層体モノポスフェートｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ２’
ｐ５’Ａと比較された。この実験において２−５Ａ三量
体トリホスフェートの濃度が２０　ｎＭにおいて一定に
保持され、モしてｐ５−’Ａ２／−ｐ５’Ａ２’　ｐ５
’Ａ　ｓ修飾された三層体モノポスフェート（１１）ま
たは［ｆｆｉされた四量体モノホスフェート（＋２）が
変λられた。これらの条件の下では、２−５Ａの作用を
妨げるために必要とされた（２→５）オリゴリボヌクレ
オチドのａＸはオリゴヌクレオチドの性質に依存した。

２−５Ａに基因する翻訳の阻止において５０％の減少を
もたらすのに必要な濃度の比較は、オリゴモノヌクレオ
チドモノホスフェートを２−５Ａ作用の招担剤としての
効果の次の（減少）の順序に格付けすることになった。

修飾された四量体モノホスフェート（１２）ニアＸＩＯ
”’Ｍ、修飾されたもの（１１）　　：（４１） ２Ｘ１０−’　　Ｍ、　　ｐ５Ａ２ｐ５Ａ２ｐ５Ａ　：
　　１．４ＸＩＯ−’Ｍ０ｐ５’Ａ２’ｐ５　’Ａ２’
　ｐ５’　Ａに対する最扱の数値は先に報告されたもの
と一致している。

２′−末端を修飾した（２′→５′）オリゴヌクレオチ
ドが１１５’Ａ２’　］）５’Ａ２／１１５’Ａがする
のと同じメカニズム（すなわち２−５Ａ依存性エンドリ
ボヌクレアーゼの作用を妨げることによる）によって２
−５Ａの蛋白質合成阻止作用を妨げたかどうかを確Ｈ めるために、（３１，）　Ｐｌｂ筋炎ウィルスのＲＮＡ
の２−５Ａで増強された分解が修飾された四量体モノホ
スフェ−）（１２）の存在または不存在において、マウ
スのし細胞抽出物中で追試された。脳心筋炎ウィルスの
ＲＮＡの２−５Ａで活性化された分解は、（１２）によ
って妨げられた。さらに両方の例において（１２）の８
　Ｘ　１０−’　Ｍの濃度は最大の阻止の５０％をもた
らすのに必要とされるｐｐｐｓ’　Ａ２’　ｐ５’　Ａ
ｉ　ｐ５’Ａの濃度において約１０００倍の増加をもた
らしたので、その結果の間に良好な一致があった。

オリゴマーの＋１！ｌ’　Ａ２’　ｐ５’　Ａ２’　Ｔ
）５１’　Ａは、インター（４２） フエロンで処理されたマウスのＬ細胞においてポリ　（
１）　　・ポリ　（Ｃ）によって生ずる蛋白質合成の阻
止のほとんどを妨げることができる。この観察はポリ（
Ｔ）　　・ポリ（Ｃ）の阻止効果が２−５Ａ合成醇素−
エンドヌクレアーゼによって主として仲介されることを
暗示する。修飾されたオリゴヌクレオチド（１１）およ
び口２）は＄１５’　Ａ２’−ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ自
身よりも２−５Ａ作用のより効果的な札抗剤であること
が見出されたので、かかるオリゴマーがポリ　（１）　
　・ポリ　（Ｃ）の兄抗剤としていかに効果的であるか
を決定することが興味のあることであった。一つの実験
においてポリ（１）　　・ポリ（Ｃ）の濃度は２　Ｘ　
１０−’　Ｍｐにおいて一定に保持されたが、一方にお
いて、Ｉ）５’Ａ２’−ｐプＡ２’ｐ５’Ａ　、　ｅｓ
ｔｍされた三層体モノホスフェ−）（１１）または修飾
された四量体モノホスフェ−）（１２）の濃度が２　Ｘ
　１０−’モルから１０−”モルの範囲を超えて変えら
れた。ｐ５’Ａ２’Ｔ１５’Ａ２’−Ｔ１５／Ａの行動
様式は先に報告されたものと同様であった；すなわちポ
リ　（Ｉ）　　・ポリ　（Ｃ）によって生ずる最大の阻
止を５０％にまで減少させる濃度は大Ｒ１１Ｏ−’Ｍで
あった。しかしながら２′−末端を修飾したオリゴヌク
レオチドは、１０−’の範囲内の濃度における（１１）
および（１２）が最高のポリ（Ｉ）　　・ポリ（Ｃ）の
阻害において５０％の減少をもたらすことができたので
、この点において朗らかに秀れていた。四量体（１２）
が２−５Ａ作用を妨げることにおいて三層体（１１）よ
りも幾分か効果的であった実験に対して、この場合に、
（１１）および（１２）の双方がポリ　（Ｉ）　　・ポ
リ（Ｃ）の阻止作用を妨げることにおいて大略等しい能
力を有していた。前置ってＩ）５’Ａ２’　Ｔ１５’Ａ
２’−−ｐ５’Ａによって観察されたように、ポリ　（
Ｉ）　　・ポリ　（Ｃ）の阻止作用の逆転は完全ではな
かった。

別の実験が（１１）または（１２）のどちらも標準の合
成酵素の検定条件の下で２−５Ａの生成の速度に影響を
与えていなかったことを離型したので、ポリ（１）　　
・ポリ（Ｃ）の作用の阻止は２−５Ａ合成の阻止による
ものでなかった。

修飾された（２′→５′）オリゴリボアデニレート５′
−モノホスフェート（１１）および（１２）は、２−５
Ａおよびポリ（１）　　・ポリ（Ｃ）の双方の作用の轄
抗剤として、修飾されていないｐ５’Ａ２’−ｐ５’Ａ
２’ｐ５’Ａに対して明らかに秀れていたので、相当す
る末端を修飾した（２′→５）オリゴリボアデニレート
四量体５′−トリホスフェ−）（１３）が合成され、そ
して脳心筋炎ウィルスのＲＮＡによりプログラムされた
マウスのし細胞抽出管における蛋白質合成の阻止剤とし
て評価された。実験において四量体トリホスフェート（
１３）が２−５Ａ王量体トリホスフェー）　ｐｐｐ５’
Ａ２’ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａおよび２−５ＡＶＴＡ置体
トリホスフェートｐｐｐ５’Ａ２′−ｐ５’Ａ、ｙ’　
ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａと比較された。比較の目的のため
に、最大阻止の５０％を達成したオリゴヌクレオチドの
ｍ度が各々の化合物に対して決定された。

ｐｐｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ　：　Ｉ　Ｘ　
Ｉｆｆ’　モル、ｐｐｐ５／ａ２’ｐｓ’Ａ２’ｐ５’
Ａ２’ｐ５’ａ　：　５　Ｘ　１０−”　モア１／、修
飾された四量体トリホスフェート（１３）　　：Ｉ　Ｘ
　１０−３０モル。

２−５へ四鷺体トリホスフェートが２−５Ａ王量体トリ
ホスフェートよりも２倍も活性的であることは以前に報
告されていなかったが、この結果は、種々のし細胞抽出
物によるおよび２−５Ａ四量体トリホスフェートの種々
の製剤による多数の興なった場合に観察された。末端を
ｆＩｔＩＮシた四量体トリホスフェート（！３）は、細
胞の存在しない蛋白質合成の阻止剤として、２−５Ａ三
景体トリホスフェートよりも１０倍も活性的であり、ま
た２−５Ａ四量体トリホスフェートよりも５倍も活性的
であることが見られる。この結果は種々の異なったし細
胞抽出物中の（１３）の２つの異なった製剤によって観
察された。

２′−末端を修飾した四量体トリホスフェート（１３）
の増強された活性は、細胞抽出物中の〔３Ｈ）脳ノ外筋
炎ウィルスのＲＮＡの分解が試験された時に、観察され
た。修飾した四量体トリホスフェート（１３）は、半極
大応答を引き出すために９　Ｘ　１０−”モルの濃度を
必要とするｐｐｐ５’　Ａピー１１５’Ａ２／ｐ５’Ａ
に比較して半極大応答を引き出すために必要とする９　
Ｘ　１０−”モルの濃度を６するラベルされたＲＮＡの
分解を増強した。これに加えて、これらの数値と蛋白質
合成の阻止に対する相当する濃度の応答の間に良好な相
関関係があった。

２′−末端を修飾した（２′→５′）オリゴリボアデニ
レートの２−５Ａ作用のｔｅＩｔＦｉ剤としてのまたは
２−５Ａ依存エンドリボヌクレアーゼの活性化剤として
の増強された活性が細胞抽出物における種々の酵素活性
による分解に対する増大した抵抗性からもたらされたと
いう可能性を探査するために、修飾されまたは修飾され
ていないオリゴリボヌクレオチドの分解に対する増大し
た抵抗性が試験された。最初に２−５Ａ王量体トリホス
フェートｐｐｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａおよび
四量体トリホスフェート（！３）の不活性化が第２のマ
ウスのし細胞の存在しないシステムにおけるそれらの生
物学的活性の減少した量をモニターすることによって追
試された。マウスのし細胞抽出物における蛋白質合成の
粂件の下では、修飾した四量体トリホスフェート（１３
）の翻訳阻止の能力は少なくとも５時間は完全に安定し
ていたが、修飾されていないオリゴマーのｐｐｐ５’Ａ
２’　ｐ５’Ａ２’　ｐ５’　Ａは約１５分の半減期で
急速に破壊された。

（以下余白） たオリゴマーの５７−モノホスフエートと５７−ドリホ
スフエートの双方の分解が相当する４／Ｓ＃されていな
いモノ−およびトリーホスフェートの分解と比較された
。しかしながらこの場合に、反応のコースが２−５Ａお
よびその誘導体に対して免疫酵紫測定の検定法を用いて
追試された。この研究に使用された抗ｆｆ１！清は、修
飾されていないものおよびｌ−末端を修飾した２、５−
オリゴリボアデニレートの双方により、ナノモルの範囲
において５０％阻止され、同量体オリゴリボアデニレー
トは相当する三量体のもの（第３衷の実験）よりも２〜
５倍反応性であった。これに対して、二量体は、これと
同じレベルの阻止を達成するのに約３０ＯｎＨの濃度を
必要とし、その反応性はずっと少なかった。モノヌクレ
オチドおよびアデノシンはミリモルにおいてのみ阻止的
であった。三量体と四量体オリゴリボアデニレートによ
る知力な抗体の反応性および二量体とより小さい種属に
よるより弱い反応性は、三量体と′Ｖｑｆｆｉ体２’＋
５’−オリゴリボアデニレートの低濃度の安定性の研究
を許容した。修飾していない２′、５′−オリゴリボア
デニレートが４×１０−″′モルのオリゴマーの最終濃
度において、実験の部に記述された改変された蛋白質合
成条件の下でインキュベートされたときに、抗体反応性
物質の存在に急速な減少があった。

ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ２’ｐ５’ＡＳｐ５”Ａ２’ｐ５
’Ａ２”ｐ５’Ａ２’ｐ５”Ａまたはｐｐｐ５’Ａ２’
ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ　（７）半減期は２
０〜３０分であると評価された。これに対して、相当す
る修飾された化合物（ＩＩ）　、（＋２）および（１３
）による抗体の反応性は６時間のインキュベーションの
後でも減少しなかった。事実、（１２）および（１３）
を含む反応混合物の反応性は時間とともに僅かに増加し
た。この増加は５′−末端ホスフェートの部分的な離脱
によるようであった。抗体の反応性は、５′−末端ホス
フェートがｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａおよびｐ
５’Ａ２’ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ２’−ｐ５Ａからそれ
ぞれ離脱したときに、３倍および８倍増大し、そしてｐ
ｐｐ５’Ａ２’　ｐｓ／　Ａ２’ｐ５　’Ａ２’ｐ５’
ＡがＡ２’ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａに分解さ
れたときに、１０倍増加する。（１３）の生物学的活性
が上記の条件の下で顕著に減少しないという観点におい
て、ホスファターゼの役割は最少であるに違いない。

しかしながら２−５Ａに対する蛋白質合成の検定は２−
５Ａの濃度における小さな変化（〜５０％）を確実に見
付けなかったようである。かくして２−末端を修飾した
オリゴリボアデニレートのゆっくりした分解が遮へいさ
れ、そして相当する修飾されていないポリマーのための
２０〜３０分の半減期の評価は最高として注目されるだ
ろう。５′−末端ホスファターゼは、２′−末端を修飾
したオリゴリボアデニレート上では、修飾されていない
ポリマー上よりも活性的でないと仮定すると、これらの
結果は、生物学的活性を測定することによって観察され
たそれらのものを確証する。すなわちメー末端を修飾し
た２／、　ｒ、／−オリゴリボアゾニレ−）−（１１）
　Ｎ　　（１２）　％　　（１３）は、細胞の存在しな
い抽出物中で修飾され１いない２／、　ｓ／−オリゴリ
ボアデニレートよりもずっと安定である。

この明細書において引用された番号付きの化合物は次の
ように示されるが、参照は分子式（Ｉ）、（Ｉ）および
（１）式になされる。

参考例１（２’−５７−オリゴリボアデニレート　モノ
ホスフェート（ｐＡ）ｎ　　（ｎ＝２〜４）の調製〕２
′−５／−オリゴリボアデニレート　モノホスフェート
（ｐＡ　）　ｎが、アデノシン　５仁ホスフオル゛イミ
ダゾリド（ＩｍｐＡ　）の鉛イオンで触媒された重合、
または適当に保護されたＡ２’ｐ５’ＡまたはＡ２’ｐ
５’　Ａ２’　ｐ５’Ａのホスフォリレーションによっ
て１１１１１された。鉛イオンで触媒された重合の場合
に、重合反応混合物は、好ましくない３’、　５’ホス
フ工−ト結合異性体を除去するために、先ずヌクレアー
ゼＰ１で処理され、そしてその後に、ＤＥＡＥセファデ
ックス（ＨＣＯｓ）　Ａ　　２５カラム上で公休された
が、このカラムはトリエチルアンモニウム重炭酸塩（Ｔ
ＥＡＢ）　Ｈａ液（ｐＴ４　：　７．６）　　（０，１
Ｍ〜０．７５　ＭのＴＭ腺的傾斜）によってＷ９離され
た。

各オリゴマーの純度が、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム緩
衝液（＋）Ｆｌニア・５）および１Ｍ塩化リチウム中で
展開されるＰＥＩ　ｋルロースｔｌｅプレート上でチェ
ックされた。

実施例！〔化合物１２の調製によって示された脂肪族第
１アミンによる（　ｐＡ　）　ｎの誘導体化のための方
法〕 水（３００ｐ　１　）中の２’　　５’（ｐＡ）４　　
（４１５０ＤＳ＊ｓｓ　、１０１モル）の水冷溶液に０
．１Ｍメタ過ヨウ紫酸ナトリウム（１２０ｐモル）が加
えられた０反応源合物が水上で２０分撹拌された後、ヘ
キシルアミン（ｓｐｉ、ａｏμモル）が加えられ、そし
て溶液のｐＨが１０％酢酸によって、８．５に直ちに調
整された。反応混合物は、水上でさらに２０分撹拌され
、そして０．５Ｍシアノ水票化ホウ素ナトリウム（１０
０ｐりが加えられた。溶液は、１０％酢酸によってｐＨ
６・５に滴定され、そして水上で４０分間撹拌し続けら
れた。反応混合物は、そコテＤＥＡＥ　セフ　７デツ’
）　ス（ＨＣＯ−ｓ　）　Ａ　−２５カラム（１，０Ｘ
　２０　ｅｍ）に適用され、そのカラムは０．３５　Ｍ
〜Ｑ、４０　Ｍ　ＴＥＡＢ　　（ｐ■ニア、６）の直線
的傾斜（２５０ｍｌ　７２５０　ｍｌ　）によって溶解
された。適当なフラクシミンが集められ、真空において
濃縮され、そしてＴＥＡＢ緩衝液を除去するために、数
回水とともに蒸発された。ヘキシルアミンの尻尾のつい
た（　ｐＡ　）　４　　（１２）が、残液をメタノール
（３００μＩ）に溶解し、そしてそれを乾燥アセトン中
のヨウ化ナトリウム溶液（５ｏ　ｍｌ　／　５　ｒｒＬ
ｔ　）中に注入することによって、ナトリウム塩として
単離された。得られた沈デン物が遠、ｂ分離され、乾燥
アセトン（各３　ｍｌ　）で２度洗浄され、そして真空
の下のＰ２０＠上で乾燥された。収率は、２５８　ａｍ
における読み（３５４０Ｔ）ａｓ＠、８．５１１モル）
によると、８５％であった。同様な手履が、総べての尻
尾のついたオリゴヌクレオチドモノホスフェートを調製
するために採用された。

実施例２〔２−末端を修飾した（Ｔ）Ａ）４のトリホス
フヱートの調製〕 ヘキシルアミンの尻尾のついた四量体モノホスフェート
の化合物１２　（３５４０Ｄ＊＠ｓ　、８−５μモル）
が乾燥ＤＭＳＯ（２５０μり中に溶解され、そしてカル
ボニルジイミダゾール（９−５ｆｒＬｉｌ　、５８゜６
μモル）がそれに加えられた。室温において４０分間撹
拌された径、反応混合物全体が乾燥アセトン中のヨウ化
ナトリウム（５０縛／６ｍ／）に注加された。

得られた沈デンが遠心分離され、乾燥アセトン（２Ｘ３
ｔｔｔ／）で洗浄され、そして真空下の室温において３
時間Ｐ３０６上で乾燥された。ＤＭＦ（２００１１１）
中の０．５　Ｍ　ｌ−リブチルアンモニウムピロホスフ
ェート溶液がこの乾燥した沈デンに加えられた。反応混
合物は室温で２４時間放置された後に、冷水（１ｍｌ　
）が加えられた。希釈された溶液はその後にｒ）ＥＡＥ
セファデックス（ＨＣＯ；　）Ａ−２５カラム（１，０
Ｘ　２０　ｃｌｎ）に適用され、このカラムは０゜３　
Ｍ　ＴＥＡＢから０．６　Ｍ　ＴＥＡＢ　（ｐＨ：　７
．６）の１ｍＦ！ｌ的な傾斜度（２５０ｍｌ　／　２５
０崎）によって溶離された。適当なフラクションを集め
て蒸発した後、トリホスフェートｉ３が上記と同じ方法
においてナトリウム塩として単離された。（１３３００
＊ｓａ　）　、（３゜２哩モル、収率３７．６％）”Ｐ
ＮＭＲ（Ｄａ　Ｏ）　　：　−０，６５、−〇。７７、
−０．８７、−〇。５６３　　（ｄｌＪ＝＝１９Ｈ２）
　、−１０，７０（ｄ、Ｊ：１８８１）　、−２０，８
９（ｔ９Ｊ＝　１８　Ｈｚ）化合物！３は上記のＨＰＬ
Ｃ条件の下で７゜１９分の保持時間を有し、そして９９
％以上の純度であった。

実施例３９−（３’−アザ−４′−へキシル−１／。

２’、　３’、　４’−テトラデオキシヘキソプラノス
ー１７−イル）−アデニン（２−（９−アデニル）−６
−ヒドロキシメチル−４−ヘキシルモルホリン〕（７） アデノシン（２６７１，１ｍモル）がＤＭＦ（１０畦）
中に溶解され、そして水浴中でＯ６１誠メタヨウ素酸ナ
トリウム溶液（１２ｍり）により処理された。２０分後
にヘキシルアミンが反応混合物に加えられ、そして溶液
のｐＨが０゜５　Ｎ　ＴＩＣ＋により８．６に調整され
た。反応混合物は氷上で１０分間撹拌され、そして０゜
５Ｍシアノ水水化化ホウ素ナトリウム溶液　１０　ｍＬ
　）が加えられた。溶液は再び０．５　Ｎ　ＭＣＩによ
り！Ｉ■６゜５に滴定され、そして氷上４０分間撹拌さ
れた。水（２０ｆｆｉＬ）が反応混合物に加えられ、そ
して溶液は酢酸エチル（４Ｘ４０ｍＬ）により抽出され
た。集められた有機層が重炭酸ナトリウムの飽和溶液お
よび食塩の飽和溶液により洗うされ、そしてその後に、
硫酸ナトリウム無水物上で乾燥された。真空における６
１１１の蒸発後に、得られた固体残渣がアセトンから再
結晶されて、融点１３６〜１３８”Ｃｓ分析値、Ｃ：　
５７−０９．　Ｈ：　７−８５　、Ｎ　：　２４．９１
　、　Ｃ５ｅＨ＊ｓＯ＊Ｎａのための計算値、Ｃ：５７
−４６、Ｆｌニア。８４、Ｎ：２５．１３の無角の結晶
（３０２ｆｎｌ　、０．９０５　ｍモル、収率９０・５
％）を得た。

実施例４　（（ｐＡ）４−ａｍｉｎｅ！合体の１哩製の
ための一般的方法〕 水（３００μり中の２−５　（ｐＡ）４（４１５０Ｄ＊
ｓ＠、１０ｍモル）の水冷ＷＱ液に、０．１Ｍのメ逼。

り膳ヨウ業酸ナトリウム（１２０μりが加えられた。反
応混合物が水上で２０分間撹拌された後、ＤＭＦ　　（
１２０ｐｌ）中に溶解されたチラミン（８，２哩、６０
ｍモル）が加えられた。アミンの添加の直径に、溶液の
ｐＨが１０％酢酸によって８゜５に調整された。反応混
合物は、さらに２０分間、氷上で撹拌された。このよう
にしてつくられたシッフ塩基が０゜５Ｍシアノ水水化化
ホウ素ナトリウム１００μｌ）によって還元され；溶液
は再び１０％酢酸によってｐＨ６，５に滴定され、そし
て水上で４０分間撹拌された。反応混合物は、その後に
ｒｌＥＡＥセファデックス（ＨＣＯ−ａ　）　　Ａ　　
２５カラム（１，ＯＸ　２０　ｃｌｎ）に適用され、そ
のカラムは０．３５　Ｍ〜０．４５ＭＴＥＡＲ（ｐＨ：
　７．６）のＺ線的傾斜（２５０、’　２５０幌）によ
り溶離された。適当なフラクションが集められ、真空中
で濃縮され、そしてＴＥＡＲＬｉｌｆｉ液を除去するた
めに、数回水といっしょに蒸発された。（ｐＡ　）　４
−チラミン接合体はト’ｒエチルアンモニウム塩として
単離された。その収部は、２５８　！ｌ璽（３６３００
ａｍｓ単位、８゜８哩モル）におけるＯＤの読みによる
と８８％であった。同様な手順が、２’ｙ５’　　（Ｔ
ＩＡ）４と他のアミンの接合物をｍｅするために採用さ
れた。反応条件の詳細は第３表に列挙される。ＨＰＬＣ
（高速液体クロマトグラフィー）による最終的な純度の
チェックの結果も第３表に示された。

第３表　（続き） ＨＰＬＣ分析　ｄ） 実施例５（（ＰＡ）４−アミン接合物のトリホスフェー
トの調製〕 （ｐＡ　）　４のチラミン接合＠　（３６３００＊＊＊
、８゜８μモル）が乾燥ＤＭＦ　　（５００ｐ　ｌ　）
に溶解され、そしてトリフェニルホスフィン（ＩＬｓ　
ｒｒｄｉ　、　４４μモル）、イミダゾール（５，６叫
、８８１モル）およびジビリジニルジスルフィド（９，
７縛、４４９モル）がその溶液に順々に加えられた。室
温において６０分間撹拌された後、反応混合物全体が乾
燥アセトン中のヨウ化ナトリウムｌ？９液（５０ｍｆｉ
／６ｍ１）中に注入された。生成した沈デンが遠、ｂ分
離され、乾燥アセトンで３回洗浄され、（各５　ｍｌ　
）そして真空中の室温において３時間Ｐａ　Ｏｆｌ上で
乾燥された。このようにしてＩＩＪ＃されたチラミン接
合物の５′−ホスフオロイミダゾリデートがＤＭＦ　（
２００μｍ）中の０．５Ｍ１−リブチルアンモニウムピ
ロホスフェートの溶液で処理された。反応混合物は、イ
ミダゾリデートが溶液中に完全に溶解するまで撹拌され
た。反応混合物は室温において２４時間放置され、引続
いて冷水（１ｍｌ　）が加えられた。希釈された溶液は
、その径でＤＥＡＥセファデックス（ＨＣＱ’−＊　）
　　Ａ　　２５カラム（１，０×２０ｃ１ｎ）に適用さ
れ、そのカラムは０．３０　Ｍ〜０．６０　Ｍ　ＴＥＡ
ＴＩ緩衝液（ｐｔｌ　：　７．６）の直線的傾斜（２５
０ｍｌ　７２５０　ｍｌ　）によって溶離された。適当
なフラクションを集めて蒸発した後、（ＴＩＡ）４−チ
ラミン接合物のトリホスフェートが、５”）ｙｈスフｘ
−ト（２５０Ｄ＊ｓｓ　、０−６ｐ　％ル、収率７．０
％）および回収された５′−モノホスフェート（６２Ｑ
Ｄ＊ｓｓ　、１゜５ｐモル、収率１７％）といっしょに
トリエチルアンモニウム塩（１５２０Ｄｍｓｓ　、３−
７μモル、収率４２％）として単離された。

参考例２〔アデノシン　Ｓ′−トリメタホスフェ−）−
（ＡＴＭＰ）の調製〕 ＡＴＭＰがＫｆｌＯｒｒｅ等（１９７６”）によって最
初に記述された方法を僅かに改変した方法によって合成
された。手短かに言うと、乾燥ｒ）ＭＳＯ（６００μり
中に溶解されたＡＴＰ　（乾燥したトリブチルアンモニ
ウム塩、６０ｔＩモル）が室温において１時間、乾燥し
たアルゴン気流中でＤＣＣ（７９，５ｍ　、３９０μモ
ル）によって処理された。溶液から析出したジシクロヘ
キシル尿素を濾過した径に、反応混合物は、乾燥したＤ
ＭＳＯを除去するために、乾燥したエーテルによって３
回（各７　ｍｌ　）抽出された。

得られたガム状の残渣は、その後で次の反応のために使
用された。

実施例６　（Ａ５’ｐｐｐｐＡ２’ｐ５’Ａ２’ｐ５’
Ａ２’ｐ５’Ａ　ｖｖｖ（化合物２０）の調製〕 化合物１２（トリエチルアンモニウム塩、６２１Ａｍａ
ｏユニット、１５μモル）がトリブチルアミン（１０μ
ｍ、４０９モル）および乾ｔ！ｈＤＭＦ中（５００μり
中に溶解され、そしてその溶液に、上記でＮ製されたＡ
ＴＭＰ　　（６０μモル）が加えられた。Ｖｏｌｔｅｘ
ミキサーで混合した径、反応混合管は室温で７日間放置
された。溶液は水（１，５７Ｗりで希釈され、そしてＤ
ＥＡＥセファデックス（ＨＣＯｓ）Ａ−２５カラム（ｌ
。０×２０σ）に適用され、そのカラムは０．３０　Ｍ
〜０．６４　Ｍ　ＴＥＡＢ　（ｐＨ：　７゜６、全量５
００　ｗｔｌ　、　１３６のフラクション）の直線的傾
斜により溶離された。９５から１０７のフラクションが
合体され、そして濃縮された。化合物２０はトリエチル
アンモニウム塩（３４２Ａｆｆｉ・０、全量５００＋ａ
／、収率４４％）としてｍｓされた。生産物は、０．２
５Ｍ！炭酸アンモニウム中で展開された（Ｒｆ：０．２
２）　ＰＥＩセルロース上で均質であった。最終的な純
度の点検は、Ｂｏｎｄａｐａｋ　ＯＤＳカラム（４゜５
Ｘ２５０ｍ）を取り付けたＨＰＬＣによって行なわれた
。溶媒Ａは５０　ｍＷリン酸アンモニウム（ｐＨニア。

０）であり、そしてｆｎ媒Ｂはメタノール−Ｈｌｌ。

（１：　１）であった。溶離は、２５分における溶［Ｂ
のゼロから１００％までの直線的傾斜で行なわれた。検
出は２５８　ｔｖ＋において行なわれた。化合物２０は
１８．２分の保持による単一のピークを与えた。

出願人　森永乳業株式会社 代理人　弁理士　津１）昭

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）式： 式中、−Ｙは、ＹがＨでありうる末端ホスフェート上を
   除いて、常にＨ１アデノシン、または０１〜２ｏの第１
   級または第２級アルコールである。 −鳳は、Ｏｌｌ、２．３または４である。 −ｎは、ｌから１５までの整数である。 −２は、■または０１〜＠Ｑの炭化水素或いは置換炭化
   水素であって、その［１）子の１つを通してモルホリン
   環のＮ原子に結合する基である。 を有し、２，５−インターヌクレオチド結合、少なくと
   も１個のリボースアデニンユニットおよび末端モルホリ
   ンユニットを有することを４１ｔｖｍとするヌクレオチ
   ド化合物。 （２）ｚが１〜４０のＣ４ｌ子を有する・−とを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載のヌクレオチド化合物
   。 （３）ｚがｌ〜２０のＣ原子を存することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載のヌクレオチド化合物。 ■ （４）ｚが、式ニーＣ−Ｐｔ　　（Ｒ＋　）　モしテＲ
   ｔ■ およびＲ２は、同一かまたは異なったものであり、また
   その各々は、水翼；飽和または不飽和および分枝または
   直鎖であるアルコールとそれらの相応するエステル、エ
   ーテルおよび酸；ステロール；アミノ酸；第１級アミン
   ；芳香族炭化水素；シクロアルカンとシクロアルケンｉ
   モノケトン；ニトリル；フェノール；脂肪酸；二塩基性
   カルボン酸；および置換されたときは上記の化合物から
   なる群より選択されたものでありうるが、ただし２は、
   ａ）モルホリノ部分のチッ素に結合するために遊離の炭
   紫を常に有する、 ｂ）化合物の残りの部分のｍ強された生物活性と調和し
   ないものでない、 Ｃ）化合物の残りの部分の分解に対する増大した抵抗性
   と調和しないものでない、 ｄ）生体内に服用されたときに、薬剤的に調和しない化
   合物をつくらない、 ことを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載のヌクレ
   オチド化合物。 （５）ｚが複合糖類であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項に記載のヌクレオチド化合物。 ■ （６）ｚが、式ニーＣ−Ｒｘであり、またＲｘお１１ よびＲＩＩの双方がメチルであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項に記載のヌクレオチド化合物。 （７）ＲｚおよびＲｓの一方が■であり、他方が（３） （メタまたはバラ）であることを特徴とする特許請求の
   範囲第４項に記載のヌクレオチド化合物。 （８）ｍが、０、ｌまたは３であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項に記載のヌクレオチド化合物。 （９）ＹがＨであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項に記載のヌクレオチド化合物。 （１０）ＹがＨであることを特徴とする特許請求の範囲
   第８項に記載のヌクレオチド化合物。 （１１）ｎが２から６までであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項に記載のヌクレオチド化合物。 （１２）ｎが２．３または４であることを特徴とする特
   許請求の範囲ｇ１１項に記載のヌクレオチド化合物。 （１３）ｍが０、！または３であり、ＹがＨであり、モ
   してｎが２．３または４であることを特徴とする特許請
   求の範囲第４項に記載のヌクレオチド化合物。 （４） （１４）ｍが１または３であり、ＹがＨであり、モして
   ｎが２．３または４であることを特徴とする特許請求の
   範囲第６項に記載のヌクレオチド化合物。 （１５）ｍが１または３であり、Ｙが■であり、そして
   ｎが２．３または４であることを特徴とする特許請求の
   範囲第７項に記載のヌクレオチド化合物。 （１６）生体内の服用のために薬剤的に受入れうる担体
   中にあることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
   のヌクレオチド化合物。 （１７）Ｉｌｉｆｆ物細胞によってつくられたインター
   フェロンの作用を遮へいするための拮抗剤としての用途
   を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
   のヌクレオチド化合物。 （１８）２−５Ａシステムにおいて、それを模倣するか
   または置き換えることによってインターフェロンを妨げ
   るための用途を有することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項に記載のヌクレオチド化合俯。 （１９）２−５Ａシステムによる抗腫瘍剤を細かく調整
   するための用途を有することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載のヌクレオチド化合物。 （２０）インターフェロンで誘発された自己免疫性の病
   気を避けるための用途を有することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項に記載のヌクレオチド化合物。 （２１）拮抗剤として、２，５−インターヌクレオチド
   結合、少なくとも１つのリボース−アデニンユニットお
   よび末端モルホリンユニットを有するヌクレオチド化合
   物であって、式： 式中、−Ｙは、Ｙが■でありうる末端ホスフェート上に
   あることを除いて、常に■、アデノシンまたはＣｔ〜２
   ０の第１駁または第２台アルコールである、 一謹は、Ｏｌｌ、２．３または４である、−・ｎは、ｌ
   から１５までの整数である、そして−２は、ＨまたはＣ
   １〜ｌＩＯの炭化水素またはモルホリノ環のＮにそのＣ
   原子の１つを通じて結合された置換炭化水素である、 を有する化合物の有効量を使用することを特徴とする動
   物細胞によってつくり出されたインターフェロンの作用
   を阻止する方法。 （２２）　　２９５−インターヌクレオチド結合、少な
   くとも１つのリボース−アデニンユニットおよび末端モ
   ルホリンユニットを有するヌクレオチド化合物であって
   、式： （７） 式中、−Ｙは、ＹがＨでありうる末端ホスフェート上を
   除いて、常にＨ，アデノシンまたはＣ１〜ＳＯの第１Ｗ
   ｋまたは第２Ｗｋアルコールである、 一篇は、０．１．２．３または４である、−ｍは１かう
   １５までの整数である、そして−２は、ＨまたはＣ１〜
   ＩＩＯの炭化水素またはモルホリノ環のＮにそのＣＷ子
   の１つを通じて結合された置換炭化水素である、 を有する化合物の有効量を使用することにより、２．５
   −Ａシステムにおけるそれの模倣をするかまたは置き換
   えることを特徴とする動物細胞によりつくり出されたイ
   ンターフェロンの作用を回避する方法。 （２３）　　２．５−インターヌクレオチド結合、少な
   くとも１つのリボース−アデニンユニットおよび末端モ
   ルホリンユニットを有するヌクレオチド化合物であって
   、式： （８） 式中、−Ｙは、Ｙが■でありうる末端ホスフェート上を
   除いて、常にＨ，アデノシンまたはＣ１〜ｓｏの第１級
   または第２級アルコールである、 一璽は、０．１，２．３または４である、−ｎは、ｌか
   う１５までの整数である、−２は、■またはＣ１〜ｓＯ
   の炭化水素またはモルホリノ環のＨにそのＣ原子の１つ
   を通じて結合された置換炭化水素である、 を有する化合物の医薬的に有効であり、また受容できる
   量を投与することを特徴とする２、５−　Ａによる抗腫
   瘍療法を細かく調整する方法。 （２４）　２．５−インターヌクレオチド結合、少なく
   とも璽つのリボース−アデニンユニットおよび末端モル
   ホリンユニットを有するヌクレオチド化合物であって、
   式： 式中、−Ｙは、Ｙが■でありうる末端ホスフェート上を
   除いて、常にＨ１アデノシンまたはＣｔ−ｓｏの第り級
   または第２級アルコールである、 一膳は、０、！、２．３または４である、−ｎは、ｌか
   ら１５までの整数である、そして−２は、ＨまたはＣＬ
   〜８ｏの炭化水素またはモルホリノ環のＮに、そのＣ原
   子の１つを通じて結合された置換炭化水素である、 を有する化合物の医薬的に有効であり、また受容できる
   量を投与することを特徴とするインターフェロンに誘発
   される自己免疫性の病気を避ける方