JPS59157096A - 蛋白質分解酵素阻害剤 - Google Patents
蛋白質分解酵素阻害剤Info
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- JPS59157096A JPS59157096A JP3059483A JP3059483A JPS59157096A JP S59157096 A JPS59157096 A JP S59157096A JP 3059483 A JP3059483 A JP 3059483A JP 3059483 A JP3059483 A JP 3059483A JP S59157096 A JPS59157096 A JP S59157096A
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- JP
- Japan
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- protein
- molecular weight
- protease inhibitor
- ophoalpha
- protease
- Prior art date
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、は生類（ワニ、ヘヒ、ウミヘヒ、カメ、トカ
ゲなど）または鳥類にニワトリ、アヒル、ウズラ、チャ
ボ、七面鳥なとフの卵白に存在し。
ゲなど）または鳥類にニワトリ、アヒル、ウズラ、チャ
ボ、七面鳥なとフの卵白に存在し。
分子量６０万以上の巨大分子量を持ち、さらに。
ヒトα２−マクログロブリンと同様にセリンプロテアー
セ、チオールプ口テアーセ、金属プロテアーセ、酸性プ
ロテアーセのすべてのエン１゛プロナアーセの範略に属
するプロテアーゼの活性を阻害する作用を持つ多目的蛋
白質分解酵素阻害剤に関する。
セ、チオールプ口テアーセ、金属プロテアーセ、酸性プ
ロテアーセのすべてのエン１゛プロナアーセの範略に属
するプロテアーゼの活性を阻害する作用を持つ多目的蛋
白質分解酵素阻害剤に関する。
一般にプロテアーゼの種類は非常に多くあることが知ら
れているか、これらは酵素活性基あるいは作用条件によ
り以下の４クループに大きく分類される。
れているか、これらは酵素活性基あるいは作用条件によ
り以下の４クループに大きく分類される。
■）セリンプロテアーセ：トリブシン、キモトリプソン
、エクスターＵのように活性中心にヒスリーシン残基と
セリン残端を有するもの。
、エクスターＵのように活性中心にヒスリーシン残基と
セリン残端を有するもの。
２）リーオールプＩ：１ケーノ′−セ：カテプシンＢ、
パパイン、ソロメラインのように活性基としてノスう一
イン残基を白゛するもの。
パパイン、ソロメラインのように活性基としてノスう一
イン残基を白゛するもの。
３）金属ゾ１」ケアーセ：活・四発現に金属イオンを必
要とするものでザーモリノン、コラケナー−≧なとっ ４）酸性プロラ−ア−セ：ペプシ７７カブプソンなとの
よっＧこ、舌１生ノ吉としてカルボギシ基を持ら１ｉ１
１５以下に至適ｒ］１１を有するもの。
要とするものでザーモリノン、コラケナー−≧なとっ ４）酸性プロラ−ア−セ：ペプシ７７カブプソンなとの
よっＧこ、舌１生ノ吉としてカルボギシ基を持ら１ｉ１
１５以下に至適ｒ］１１を有するもの。
これらのプｉ−ｌテプーセは生物体内のあらゆる分画に
広く分布しており、生物体から抽出、精製する多くの有
用物質 例えは、医学的、−Ｅ業的、農学的に自−用な
多くの酵素、生理活性を持つペプナ１ポルモン、呈味ペ
プチド、活性蛋白質などの製造、抽出、４、ｈ製過程に
おいて、目的とする有用物質を無差別的に分解し、その
生理活性を失わせ。
広く分布しており、生物体から抽出、精製する多くの有
用物質 例えは、医学的、−Ｅ業的、農学的に自−用な
多くの酵素、生理活性を持つペプナ１ポルモン、呈味ペ
プチド、活性蛋白質などの製造、抽出、４、ｈ製過程に
おいて、目的とする有用物質を無差別的に分解し、その
生理活性を失わせ。
あるいは収率の著しい低下をもたらし、多大の経済的損
失を引き起こしている。多くの場合、このような損失を
軽減するために」二゛述のような有用物質の抽出、積装
過程で混在するプロテアーゼの活性を阻害する蛋白質分
解酵素阻害剤を人工的に添加しておくことか行われてい
る。
失を引き起こしている。多くの場合、このような損失を
軽減するために」二゛述のような有用物質の抽出、積装
過程で混在するプロテアーゼの活性を阻害する蛋白質分
解酵素阻害剤を人工的に添加しておくことか行われてい
る。
ごれらの人工的に添加する蛋白性分ＩＷ酵素阻害剤には
天然のものとして大豆、ウシの膵などから取ろトリプシ
ンインヒヒター、人１−のものとしてフェニルメタンス
ルホニルクロライＩＪ＝ｊｌとかあるかこれらは阻害す
るプロテアーゼの種類か特異的であり、限定されている
。このため、混在するプロテアーゼの種類か不明の場合
は ９Ｊノ果がないか。
天然のものとして大豆、ウシの膵などから取ろトリプシ
ンインヒヒター、人１−のものとしてフェニルメタンス
ルホニルクロライＩＪ＝ｊｌとかあるかこれらは阻害す
るプロテアーゼの種類か特異的であり、限定されている
。このため、混在するプロテアーゼの種類か不明の場合
は ９Ｊノ果がないか。
あるいは偶然の’Ｊノ果か期待されるに過ぎず、極めて
非能率的かつ経済的損失も犬である。
非能率的かつ経済的損失も犬である。
以上の理由により、これらの混在するプロテアーゼに対
し非特異的に阻害効果を持つ安定なプロテアーゼインヒ
トターの安定的供給が望まれてきた。例外的に前記４つ
の範皓に属するすべてのプロテアーゼを阻害するものに
ヒト 製口Ｊ１１ヒなα２−マクロクロゾリンとｌｆばれるプ
１コテアーセインヒヒターかある。ヒＩ・血清中のα７
−マクログロブリンは分子量７０〜８０万の巨大分子で
あり（ｌｌａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ「「１
ｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌ． ＩＩ （ｅｄ．ｂｙ Ｆａｓｍａｎ，
Ｇ．Ｄ． ） ）皿中に１５０〜４ ２ ０ ｍ＋；／
ｄｉ存在すると言われている。しかし、・２；からヒ１
ー血中に存在する蛋白質の種類は極めて多く，車１碓，
積製か困難てあり，純品として取り出すごとはＶＩＬ
シい。さらに保存中の安定性もわるく，短時間のっらに
そのプロテアーゼ阻害活性を失い安定的に利用すること
か几しく１」二業的に利用することば不可能である。
し非特異的に阻害効果を持つ安定なプロテアーゼインヒ
トターの安定的供給が望まれてきた。例外的に前記４つ
の範皓に属するすべてのプロテアーゼを阻害するものに
ヒト 製口Ｊ１１ヒなα２−マクロクロゾリンとｌｆばれるプ
１コテアーセインヒヒターかある。ヒＩ・血清中のα７
−マクログロブリンは分子量７０〜８０万の巨大分子で
あり（ｌｌａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ「「１
ｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌ． ＩＩ （ｅｄ．ｂｙ Ｆａｓｍａｎ，
Ｇ．Ｄ． ） ）皿中に１５０〜４ ２ ０ ｍ＋；／
ｄｉ存在すると言われている。しかし、・２；からヒ１
ー血中に存在する蛋白質の種類は極めて多く，車１碓，
積製か困難てあり，純品として取り出すごとはＶＩＬ
シい。さらに保存中の安定性もわるく，短時間のっらに
そのプロテアーゼ阻害活性を失い安定的に利用すること
か几しく１」二業的に利用することば不可能である。
本発明に関するは生類または鳥類の卵白中の蛋白１１分
解酵素明害剤は上記のα２−マクログロブリンに矧似し
た蛋白質であり，６０万以上の巨大分子′−量を禎ら，
さらに前記の４つの範鴫に屈するず−・・てのゾ１」１
アーセ活性を阻害する能力を１−１つだ蛋白質分解酵素
阻害剤である。さらに保存中の安定性は極めて優イ′１
，ており．１０℃以下の条件であれば、６力月以上プロ
テアーゼ阻害活性を失うことなく保存可能である。また
、は生類または鳥類の卵白中の蛋白質分画はオボアルフ
ミン、オボインヒビターおよび本発明に関する蛋白質分
解酵素阻害剤と種類が限られており、このほか一部オホ
ムコイド（鳥類のみ〉と呼はれる糖蛋白質類が存在する
に過ぎない。従って単離精製は極めて容易であり、また
収量も優れている。
解酵素明害剤は上記のα２−マクログロブリンに矧似し
た蛋白質であり，６０万以上の巨大分子′−量を禎ら，
さらに前記の４つの範鴫に屈するず−・・てのゾ１」１
アーセ活性を阻害する能力を１−１つだ蛋白質分解酵素
阻害剤である。さらに保存中の安定性は極めて優イ′１
，ており．１０℃以下の条件であれば、６力月以上プロ
テアーゼ阻害活性を失うことなく保存可能である。また
、は生類または鳥類の卵白中の蛋白質分画はオボアルフ
ミン、オボインヒビターおよび本発明に関する蛋白質分
解酵素阻害剤と種類が限られており、このほか一部オホ
ムコイド（鳥類のみ〉と呼はれる糖蛋白質類が存在する
に過ぎない。従って単離精製は極めて容易であり、また
収量も優れている。
本発明に関するは生類または鳥類の卵白中の蛋白質分解
酵素阻害剤は分子量が６０万以上と特に巨大であるため
に、プロテアーセを阻害、結合したあとの分離も容易で
あり、またこのことは工業的にも極めて有利であり、ま
たこれらの性質を利用してアフィニティークロマ１−グ
ラフィーの担体なとにも有利に応用することが可能であ
る。例えは２本発明に関する蛋白質分解酵素阻害剤オボ
アルファーＭをセファデックスなとのゲル担体に固定化
しこれにプロテアーセの混在した試料を通しプロ゛テア
ーゼを除去することにより試料の安定化をはかることが
できる。
酵素阻害剤は分子量が６０万以上と特に巨大であるため
に、プロテアーセを阻害、結合したあとの分離も容易で
あり、またこのことは工業的にも極めて有利であり、ま
たこれらの性質を利用してアフィニティークロマ１−グ
ラフィーの担体なとにも有利に応用することが可能であ
る。例えは２本発明に関する蛋白質分解酵素阻害剤オボ
アルファーＭをセファデックスなとのゲル担体に固定化
しこれにプロテアーセの混在した試料を通しプロ゛テア
ーゼを除去することにより試料の安定化をはかることが
できる。
本発明に関するは生類または鳥類の卵白中の蛋白質分解
酵素阻害剤は、独自に蛋白質分解酵素阻害作用を利用し
て医学的に治療薬となり得るものであり、さらに生物現
象ならびに病気の生化学の解析に有用な試薬としても用
いることが可能である。
酵素阻害剤は、独自に蛋白質分解酵素阻害作用を利用し
て医学的に治療薬となり得るものであり、さらに生物現
象ならびに病気の生化学の解析に有用な試薬としても用
いることが可能である。
以下１本発明になる蛋白質分解酵素阻害剤をオホアルフ
ァーＮ１とよひ、その製法をのへる。
ァーＮ１とよひ、その製法をのへる。
ば生類または鳥類の卵としては１例えばワニ、ヘヒ、ウ
ミヘヒ、カメ トカゲ ニワトリ、アヒル。
ミヘヒ、カメ トカゲ ニワトリ、アヒル。
カモ、ウズラ等の卵が挙げられ、これらの卵は受精卵、
；Ｉ！！４ Ｉ＊卵のいずれでもよい。本蛋白質分解
酵素阻也剤を精製するにあたってはまず、は生類または
鳥類の卵を９ＩＪ日と卵黄に分離したのち、卵白を音波
処理、ホモンナ・ｒザー処卯等により均一化し、ケルク
ロマ１クフノイーの方法を用いて精製Ｊる。ケルクロマ
トクラフィーとしては、セファデックスＧ−１００，Ｇ
−２００，セファロースＣＬ−６Ｂ、ＣＬ−ｊＢ、
トヨバール、ハイオゲ、ル等を用いることができる。溶
出液はｐＨ５以上９以下のトリス−塩酸緩衝液、りん酸
緩衝液等を用いる。また混在する主要蛋白質は１分子量
数万というオホムチン２同１０万以下のオハルブミン。
；Ｉ！！４ Ｉ＊卵のいずれでもよい。本蛋白質分解
酵素阻也剤を精製するにあたってはまず、は生類または
鳥類の卵を９ＩＪ日と卵黄に分離したのち、卵白を音波
処理、ホモンナ・ｒザー処卯等により均一化し、ケルク
ロマ１クフノイーの方法を用いて精製Ｊる。ケルクロマ
トクラフィーとしては、セファデックスＧ−１００，Ｇ
−２００，セファロースＣＬ−６Ｂ、ＣＬ−ｊＢ、
トヨバール、ハイオゲ、ル等を用いることができる。溶
出液はｐＨ５以上９以下のトリス−塩酸緩衝液、りん酸
緩衝液等を用いる。また混在する主要蛋白質は１分子量
数万というオホムチン２同１０万以下のオハルブミン。
オ示インヒヒター等であり１ 目的とするオホアルファ
ーＭは分子量６０万以上のため容易に分離精製される。
ーＭは分子量６０万以上のため容易に分離精製される。
収量はワニを例にとると卵１個から約２００ｍｇとれる
。使用に際しては精製したオポアルファーＮ１の十分量
を生物試料中に混入させるだけでよく、常温ないし０°
Ｃの間で十分な活性をもつ。反応時間は常温で数１０分
、ｏ’ｃで１時間で十分である。
。使用に際しては精製したオポアルファーＮ１の十分量
を生物試料中に混入させるだけでよく、常温ないし０°
Ｃの間で十分な活性をもつ。反応時間は常温で数１０分
、ｏ’ｃで１時間で十分である。
つぎに実施例により本発明になる蛋白質分解酵素阻害）
ｊの精製、物性２作用について詳細に説明するが２本発
明はこれらによって限定されるものではない。
ｊの精製、物性２作用について詳細に説明するが２本発
明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１
キューバヮニの卵白２０ｍ１をとり、これに１％ＮａＣ
１，１ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａを含むｐＨ７，５の５０ｍ
Ｍ）リス塩酸緩ｉｉ液２０ｍ１を加えた。ついで、’Ｏ
’ｃの条件下１０秒間の音波処理（トミー精工製ＵＲ２
００Ｐ超音波処理機、 ｒａｎｇｅ ｌ） を２回行
い均一化したのら遠心分離機により１５０００ ｘ ｇ
で２０分遠心し不溶分を除き上清をとった。
１，１ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａを含むｐＨ７，５の５０ｍ
Ｍ）リス塩酸緩ｉｉ液２０ｍ１を加えた。ついで、’Ｏ
’ｃの条件下１０秒間の音波処理（トミー精工製ＵＲ２
００Ｐ超音波処理機、 ｒａｎｇｅ ｌ） を２回行
い均一化したのら遠心分離機により１５０００ ｘ ｇ
で２０分遠心し不溶分を除き上清をとった。
得られた上清をセファデックスＧ２ｏＯ（５ｃｍＸ６０
ｃｍ）にかげ、これを１％ＮａＣｌ、 ｌ’ｍＭ Ｅ
Ｄ ＴＡを含む５０＋ｎＭ）リス塩酸緩衝液を溶媒とし
て溶出した。始めに溶出してきたもっとも大分子量の蛋
白分−画を集め、濃杼Ｊした。
ｃｍ）にかげ、これを１％ＮａＣｌ、 ｌ’ｍＭ Ｅ
Ｄ ＴＡを含む５０＋ｎＭ）リス塩酸緩衝液を溶媒とし
て溶出した。始めに溶出してきたもっとも大分子量の蛋
白分−画を集め、濃杼Ｊした。
吹きにこの濃縮液をセファロースＣＬ−４Ｂ （５ｃｍ
ｘ ６０ ｃｍ）にかり上記と同様の溶媒にて溶出し
た。この溶出パターンを図１に示した。図１に示した中
央のピーク（ビークｎ）を集め、・以下の要領で純度の
検定１分子量、沈降係数、アミノ酸組成、Ｐ］２色性ス
ペクトルの測定を行った。
ｘ ６０ ｃｍ）にかり上記と同様の溶媒にて溶出し
た。この溶出パターンを図１に示した。図１に示した中
央のピーク（ビークｎ）を集め、・以下の要領で純度の
検定１分子量、沈降係数、アミノ酸組成、Ｐ］２色性ス
ペクトルの測定を行った。
■）ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミ（
・電気泳動による純度の検定 ４％ないし５％のポリアク、リルアミドを用いると図２
のように２−メルカプトエタノールで還元しないものは
分子量＞３００，０００に、２−メルカプトエタノール
で還元したものは分子量＞ １７５．０００に、ともに
クマシーフルで染色すると１本のハンドを示した。この
結果より、この物質はサブユニットとして１７〜１８万
のポリペプチドを持つことがわかった。また、このポリ
ペプチドは２本づつジスルフィド結合で結ばれているこ
とかわかる。
・電気泳動による純度の検定 ４％ないし５％のポリアク、リルアミドを用いると図２
のように２−メルカプトエタノールで還元しないものは
分子量＞３００，０００に、２−メルカプトエタノール
で還元したものは分子量＞ １７５．０００に、ともに
クマシーフルで染色すると１本のハンドを示した。この
結果より、この物質はサブユニットとして１７〜１８万
のポリペプチドを持つことがわかった。また、このポリ
ペプチドは２本づつジスルフィド結合で結ばれているこ
とかわかる。
なお分子量の標準には牛血清アルフミン（Ｍｒ−６９，
０００） 、 ウサギスケルタルマスル（Ｍｒ ＝ ２
００．０００）ハタテリア脂肪酸合成酵素（Ｍｒ−２５
０，０００） 。
０００） 、 ウサギスケルタルマスル（Ｍｒ ＝ ２
００．０００）ハタテリア脂肪酸合成酵素（Ｍｒ−２５
０，０００） 。
チオグロブリン（Ｍｒ＝３３０，０００ ＞を用いた。
２）沈降平衡法による分子量測定
Ｂｅｃｋｍａｎｎ ５ｐｉｎｃｏ Ｍｏｄｅｌ Ｅを用
い、沈降平衡法により分子量を測定した結果、この物質
Ｉ、ｉ３７万の分子量を有することか分かった。温度２
０°Ｃに於げる沈降平衡図を図３に示す。−３に於ける
直線の勾配から次式により分子量を計算する。
い、沈降平衡法により分子量を測定した結果、この物質
Ｉ、ｉ３７万の分子量を有することか分かった。温度２
０°Ｃに於げる沈降平衡図を図３に示す。−３に於ける
直線の勾配から次式により分子量を計算する。
温度、−＝角速度、ｖ＝１ ／ρｐｒＯＥｅｌｎ＋ρ＝
１）ｕｆｆｅｒａＮを表す。） 前記５Ｏ５−ＰＡＧＥによる検定結果とあわせて考える
と本蛋白質は、４本のポリペプチドよりなり、うし２本
つつかジスルフィド結合していることかわかった。
１）ｕｆｆｅｒａＮを表す。） 前記５Ｏ５−ＰＡＧＥによる検定結果とあわせて考える
と本蛋白質は、４本のポリペプチドよりなり、うし２本
つつかジスルフィド結合していることかわかった。
３）沈降係数の測定
Ｂｅｃｋｍａｎｎ ５ｐｉｎｃｏ Ｍｏｄｅｌ Ｅによ
り、４．００Ｏｒｐｍ。
り、４．００Ｏｒｐｍ。
２０℃で沈降速度実験を行ったところ、蛋白濃度０に外
１して求めた沈降係数は１７〜２Ｏ３であった。
１して求めた沈降係数は１７〜２Ｏ３であった。
４）アミノ酸組成の測定
この物質は８〜１０％の糖を含有し、ポリペプナト鎖の
アミノ酸組成は第１表の通りであった。
アミノ酸組成は第１表の通りであった。
第１表
キューハワニよりの蛋白質分解酵素阻害剤（オホ“アル
ファーＭ）およびヒトよりのα２−マクログロブリンの
アミノ酸組成４）円２色性スペクトル 図４に示す通り 実施例２ 実施例１で得られたビーク■分画蛋白の所定濃度、含有
反応液０．４ｍｌ及びプロテアーゼとしてスブチリシン
、ザーモリシン、パパイン溶液（５０、ｉ７ ｇ ／ｍ
ｌ） ０．１’ｍｌを（１，０７Ｈｌ−リス塩酸ｋＮ
ｆｉｉ液（ｐＨＬ５ ） ０．５ｍｌ ％Ｉに加えさら
に基質として２％カセインｌ谷〆夜を加える。
ファーＭ）およびヒトよりのα２−マクログロブリンの
アミノ酸組成４）円２色性スペクトル 図４に示す通り 実施例２ 実施例１で得られたビーク■分画蛋白の所定濃度、含有
反応液０．４ｍｌ及びプロテアーゼとしてスブチリシン
、ザーモリシン、パパイン溶液（５０、ｉ７ ｇ ／ｍ
ｌ） ０．１’ｍｌを（１，０７Ｈｌ−リス塩酸ｋＮ
ｆｉｉ液（ｐＨＬ５ ） ０．５ｍｌ ％Ｉに加えさら
に基質として２％カセインｌ谷〆夜を加える。
、次いで上記反応液を３７℃で１０分間インキュベー１
−シブロラー゛ｊ″−セ阻害活性を測定する。同時に実
施例■で得られたピーク■蛋白分画を含まぬ上記各種プ
ロテアーゼと反応基質だけの反応を行い対照とする。
−シブロラー゛ｊ″−セ阻害活性を測定する。同時に実
施例■で得られたピーク■蛋白分画を含まぬ上記各種プ
ロテアーゼと反応基質だけの反応を行い対照とする。
測定は以下の様にして行う。即ぢ３７℃１ｏ分間の反応
後トリクロルＮｌ：酸１ 、 Ｏｍ ｌを加え反応を進
め、沈澱を成、別後上澄みの２８０ｎｍ吸光度を測定す
る。
後トリクロルＮｌ：酸１ 、 Ｏｍ ｌを加え反応を進
め、沈澱を成、別後上澄みの２８０ｎｍ吸光度を測定す
る。
この結果本発明のプロテ？−ゼインヒヒターは上記のい
ずれのプロテアーゼ活性をも阻害することか判明した。
ずれのプロテアーゼ活性をも阻害することか判明した。
図５、にトリプシンをプロテアーゼとして用いた場合の
阻害活性を示す。
阻害活性を示す。
又、トリプシン、スブチリシン、サーモリシン、パパイ
ン、ヘブシン、コラゲナーセを用いた場合表３の様にし
て求められるオホアルファーＭの最大阻害時に於けるオ
ホアルファーＭ体各プロプアーゼのモル比を表３に示す
。表３ｃこ示ず杆にオボアルファーＭは全てのプロテア
ーゼに対して強い阻害作用を示す。
ン、ヘブシン、コラゲナーセを用いた場合表３の様にし
て求められるオホアルファーＭの最大阻害時に於けるオ
ホアルファーＭ体各プロプアーゼのモル比を表３に示す
。表３ｃこ示ず杆にオボアルファーＭは全てのプロテア
ーゼに対して強い阻害作用を示す。
表３
実施例３
ラミヘビのらんば＜ ２０ｍ１をとり、実施例１と同様
な方法で、トリス塩酸緩衝液中で超音波処理した後、１
５，０００ ｘ ｇ ２０分の遠心分離を行い、その上
々みをとる。
な方法で、トリス塩酸緩衝液中で超音波処理した後、１
５，０００ ｘ ｇ ２０分の遠心分離を行い、その上
々みをとる。
実施例１と同様にセファテックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）
Ｇ−２００、次いてセファロース（Ｓｅｐｂａｌｏｓｅ
） ＣＬ−４Ｂにかりる。セファロース（Ｓｅｐｈａ
ｌｏｓｅ ） ＣＬ−４Ｂ溶出分画の２番目のｌ客用ピ
ークを集め濃縮する。
Ｇ−２００、次いてセファロース（Ｓｅｐｂａｌｏｓｅ
） ＣＬ−４Ｂにかりる。セファロース（Ｓｅｐｈａ
ｌｏｓｅ ） ＣＬ−４Ｂ溶出分画の２番目のｌ客用ピ
ークを集め濃縮する。
次にζ、ｆ農縮ｌ夜をＤＩＥＡＥセルロースカラムにか
ケｌｐ（けトリウムをＯＭ〜０．２ｈ＋タラディアント
で含む１０ｍＭ１−リス緩祉Ｊ液で溶出する。
ケｌｐ（けトリウムをＯＭ〜０．２ｈ＋タラディアント
で含む１０ｍＭ１−リス緩祉Ｊ液で溶出する。
最大ピークを示す分画を集め５Ｏ３−ＰＡ叶により純粋
（あることを確認し、分子量及びアミノ酸組成を検６ル
た。沈１；♀１ド衡図は図６の通りであり、分子量は６
５０，０００ でアリ、沈降係数は１７〜２ｏｓ、アミ
ノ酸組成は表４、円２色性は図７の通りである。
（あることを確認し、分子量及びアミノ酸組成を検６ル
た。沈１；♀１ド衡図は図６の通りであり、分子量は６
５０，０００ でアリ、沈降係数は１７〜２ｏｓ、アミ
ノ酸組成は表４、円２色性は図７の通りである。
さらに本蛋白質のトリプシン、サーモリシン、パパイン
に対する蛋白質分解阻害活性を測定した結果、いずれの
プロテアーゼに対しても阻害活性を示した。
に対する蛋白質分解阻害活性を測定した結果、いずれの
プロテアーゼに対しても阻害活性を示した。
表４
ラミヘビ蛋白質分解酵素阻害剤
（オホアルファーＭ）のアミノ酸糾成
実施例４
ニワトりの卵白４０ｍ１をとり実施例３と同様の方法に
より口開とする蛋白質分解酵素阻害活性を示−Ｊ蛋白質
分画を得る。溶出パターンを図８に示す。
より口開とする蛋白質分解酵素阻害活性を示−Ｊ蛋白質
分画を得る。溶出パターンを図８に示す。
冑られた蛋白質分画は分子量７００．０００を示し、図
９に示す沈降平衡図を示す。また、表５に示ずアくノ酸
組成をもし、沈降係数は１６〜１８Ｓを示し、さらに図
１０に示す円２色性を示した。
９に示す沈降平衡図を示す。また、表５に示ずアくノ酸
組成をもし、沈降係数は１６〜１８Ｓを示し、さらに図
１０に示す円２色性を示した。
キラに、トリプシン、す”−モリシン、パバ１′ンを用
い、蛋白質分解酵素阻害活性を測定した結果いずれのプ
ロテアーゼに刻しても強い阻害活性を示した。
い、蛋白質分解酵素阻害活性を測定した結果いずれのプ
ロテアーゼに刻しても強い阻害活性を示した。
表５
ニワトす蛋白質分解酵素阻害剤
（オホアルファーＭ）のアミノ酸組成
実施例１．３．４で得られたキューハヮニ、ラミヘビ、
ニワトりのりＩＪ白より得られたプロテアーゼインヒヒ
ターを５°Ｃに保存し、経時的にそのインヒヒター活性
をトリプソンを用いて測定した。
ニワトりのりＩＪ白より得られたプロテアーゼインヒヒ
ターを５°Ｃに保存し、経時的にそのインヒヒター活性
をトリプソンを用いて測定した。
結果を表６に示す。
表６
活性の％をン■くず。
表の様に本発明プロテアーセインヒビクーは貯蔵中の安
定性かきわめてずぐれていることが判る。
定性かきわめてずぐれていることが判る。
４、図面の説明
図１はワニの卵白から抽出されたオボアルファーＭのゲ
ルクロマトグラフィー 示し、図２はそれのＳＤＳ−ＰＡＧＥに於ける蛋白質移
動度を示すかここでａは還元前、ｂは還元後の移動度を
示し、図３はそれの沈降平衡図を示し、図４はそれの円
２色性スペクトルを示す。
ルクロマトグラフィー 示し、図２はそれのＳＤＳ−ＰＡＧＥに於ける蛋白質移
動度を示すかここでａは還元前、ｂは還元後の移動度を
示し、図３はそれの沈降平衡図を示し、図４はそれの円
２色性スペクトルを示す。
図５はワニの卵白から抽出されたオボアルファ−Ｍのプ
ロテアーゼ阻害活性を示す。
ロテアーゼ阻害活性を示す。
図６ばラミヘビの卵白から抽出されたオポアルファ−Ｍ
の沈降平衡図を示し、図７はそれの円２邑性スペクトル
を示す。
の沈降平衡図を示し、図７はそれの円２邑性スペクトル
を示す。
図８はニワトリの卵白から抽出されたオボアルファーＭ
のケルクロー７トグラフイーのン客用パターング示し、
図９はそれの沈降平衡図を示し、図１０はそれの円２色
性スペクトルを示す。
のケルクロー７トグラフイーのン客用パターング示し、
図９はそれの沈降平衡図を示し、図１０はそれの円２色
性スペクトルを示す。
特許出願人 猪 飼 篤
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澹二ｌ 涌Ｌ
α ｂ
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４０ ８０ １２０
才ｉＯ町レフ？−門 メへ８図６
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図７
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Ｚｏｏ ２’２０ ２４０４゛ｍ
図８
滞ヱｔ １ｏｏ ２００図９
４７ 砺 ４９５０
γ２
Claims (4)
- （１）下記の物理化学的性質を有することを特徴とする
蛋白質オホアルファーＩν■ １、円２色性スペクトルに於いて２１０〜２２０ｎｍの
波長域にθ−−５５００ ＝ １００１０００ｃｌｅ
／ ｄｅｃｉｍｏｌｅの楕円率を示す。 ｉｉ 、分子量 ６０〜８０万 １１１、アミノ酸組成 モル％ アスパラギン＋アスパラキン酸 ９士１スレオニン
７±ｌセリン
７．５±１グルタミン士グルタミン酸１１．５＋１
．５プロリン ５．５±１グ
リシン ６±１アラニン
７±ｌバリン
８±１ ソステイン １．２±１メチオニ
ン １．２±１イソロイシン
５±２Ｕイシン
１０±１チＵシン ４±１フ
エニルアラニン ４．７±１リジン
６．３±１ヒスチヂン
２±１．２゜アルギニン
３．５±１トリプトファン １〜 ゲルクロマトグランイーの）ｌｆ値Ｓ Ｉ） Ｓ
Ｐ Ａ Ｇ ＩΣに於いて、メルカプトエタノール
還元Ａｉ７に＞３０万、還元後１７〜Ｉ８万のスポット
をンＪｅす。 ■．沈降係数 １６〜２０Ｓ（スニドヘリ一単位） ｖｉ．蛋白質分解酵素を阻害する作用を有する。 - （２）は虫頬または鳥類の卵白を均一化し，遠心分離に
より不溶分を除去した上清をゲルクロマトグラフィーに
よって分子量６０〜８０万の蛋白質を分離・精製するこ
とを特徴とする蛋白質オホアルファーＭの製造方法。 - （３）は生類またはｆｓ ｌ’Ｔ＋かニワトリ、アヒル
またはウズラである特許請求の範囲第２項記載の蛋白質
オポアルファーＭの製造方法。 - （４）蛋白質オホアルファーＭを有効成分とすることを
特徴とする蛋白質分解酵素阻害剤
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3059483A JPS59157096A (ja) | 1983-02-25 | 1983-02-25 | 蛋白質分解酵素阻害剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3059483A JPS59157096A (ja) | 1983-02-25 | 1983-02-25 | 蛋白質分解酵素阻害剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59157096A true JPS59157096A (ja) | 1984-09-06 |
Family
ID=12308188
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3059483A Pending JPS59157096A (ja) | 1983-02-25 | 1983-02-25 | 蛋白質分解酵素阻害剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59157096A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007287997A (ja) * | 2006-04-18 | 2007-11-01 | Fujikura Ltd | 太陽電池モジュール |
| US7804021B2 (en) | 2007-02-23 | 2010-09-28 | Lintec Corporation | Light transmissible solar cell module, process for manufacturing same, and solar cell panel thereof |
-
1983
- 1983-02-25 JP JP3059483A patent/JPS59157096A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007287997A (ja) * | 2006-04-18 | 2007-11-01 | Fujikura Ltd | 太陽電池モジュール |
| US7804021B2 (en) | 2007-02-23 | 2010-09-28 | Lintec Corporation | Light transmissible solar cell module, process for manufacturing same, and solar cell panel thereof |
| US7812248B2 (en) | 2007-02-23 | 2010-10-12 | Lintec Corporation | Light transmissible solar cell module, process for manufacturing same, and solar cell panel thereof |
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