JPS59118081A - 培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法 - Google Patents
培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法Info
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- JPS59118081A JPS59118081A JP57224947A JP22494782A JPS59118081A JP S59118081 A JPS59118081 A JP S59118081A JP 57224947 A JP57224947 A JP 57224947A JP 22494782 A JP22494782 A JP 22494782A JP S59118081 A JPS59118081 A JP S59118081A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、白面病豚の牌臓から腫瘍細胞株（下妻細胞株
）を樹立し、この細胞を用いて逆転写酵素を抽出、精製
する逆転写酵素の生産法に関する。
）を樹立し、この細胞を用いて逆転写酵素を抽出、精製
する逆転写酵素の生産法に関する。
逆転写酵素は主にＲＮＡ型腫瘍ウィルスに存在し、ＲＮ
Ａから相補的なりＮＡを作る時に利用される。
Ａから相補的なりＮＡを作る時に利用される。
従来、逆転写酵素の生産は、鶏骨髄芽球症ウィルス（Ａ
ＭＶ ）を接種した雛の血液を用いて行われていた。し
かしこの方法は、ＡＭＶに感受性の高い雛の系統の選択
及び維持、雛の感染適期の採材等に特殊な施設と技術が
必要である為、培養細胞系等による簡単な操作方法を用
いての逆転写酵素の生産が要望されている。
ＭＶ ）を接種した雛の血液を用いて行われていた。し
かしこの方法は、ＡＭＶに感受性の高い雛の系統の選択
及び維持、雛の感染適期の採材等に特殊な施設と技術が
必要である為、培養細胞系等による簡単な操作方法を用
いての逆転写酵素の生産が要望されている。
そこで本発明者等は斯かる要望を満たすべく、先ず人工
的に培養、増殖、継代可能な動物の腫瘍細胞系の樹立を
試合た結果、野外発生白血病豚の牌臓から増殖時Ｃ型粒
子（レトロウィルス）を大量に放出する腫瘍細胞株（下
妻細胞株うを得た。次にこの細胞のＣ型粒子から逆転写
酵素を抽出、精製する方法を開発すべく試験研究を重ね
た結果、簡単な操作方法により活性の高い満足できる逆
転写酵素を生産できる方法を見い出した。
的に培養、増殖、継代可能な動物の腫瘍細胞系の樹立を
試合た結果、野外発生白血病豚の牌臓から増殖時Ｃ型粒
子（レトロウィルス）を大量に放出する腫瘍細胞株（下
妻細胞株うを得た。次にこの細胞のＣ型粒子から逆転写
酵素を抽出、精製する方法を開発すべく試験研究を重ね
た結果、簡単な操作方法により活性の高い満足できる逆
転写酵素を生産できる方法を見い出した。
以下不発明の培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法の
実施例について説明する。先ず腫瘍細胞株の樹立につい
て説明すると、第１図に示されるように野外発生白血病
豚の腫犬牌臓より得た細胞の浮遊液を作り、これを８．
５ Ｘ １０６細胞／ｍｌに調整した後、Ｃ０２ｔｎ卵
器にて４日間静置培養する。次にとの静置培養した細胞
浮遊液に健康子豚の胞腺細胞を植込み、２’Ｘ１ｏ７細
胞／ ｘｉとなして３２日間共生培養して増殖する。次
いでこの増殖した共生培養液の細胞を３目間隔に継代培
養を開始する。次に継代培養した細胞を軟寒天によるク
ローニングによって腫瘍細胞株（下妻’５ｏ−ｉ細胞株
）を得る。
実施例について説明する。先ず腫瘍細胞株の樹立につい
て説明すると、第１図に示されるように野外発生白血病
豚の腫犬牌臓より得た細胞の浮遊液を作り、これを８．
５ Ｘ １０６細胞／ｍｌに調整した後、Ｃ０２ｔｎ卵
器にて４日間静置培養する。次にとの静置培養した細胞
浮遊液に健康子豚の胞腺細胞を植込み、２’Ｘ１ｏ７細
胞／ ｘｉとなして３２日間共生培養して増殖する。次
いでこの増殖した共生培養液の細胞を３目間隔に継代培
養を開始する。次に継代培養した細胞を軟寒天によるク
ローニングによって腫瘍細胞株（下妻’５ｏ−ｉ細胞株
）を得る。
こうして得られる腫瘍細胞株には次のような特性を有す
る。
る。
ア）１万個／ｄの細胞を植込むと増殖し、継代培養が可
能である。
能である。
イ）１３時間で２倍に増え、最大限２０万個／−まで増
える。
える。
つ９ 第２図の写真に見られるように、０．３％軟寒天
での植込み２０日月例コロニーを形成する。
での植込み２０日月例コロニーを形成する。
工）羊赤血球によるロゼツトを形成しない。
オ）染色体数が５３から７１の範囲である。
力）自発的にＣ型粒子を大量に放出する。
上記のような特性を有する腫瘍培養細胞（下妻’８０−
１細胞９は、逆転写酵素の精製の素材として極めて好適
なものであり、以下この腫瘍培養細胞の培養で得られた
Ｃ型粒子（レトロウィルスラの精製と可溶化及び逆転写
酵素の精製について説明する。
１細胞９は、逆転写酵素の精製の素材として極めて好適
なものであり、以下この腫瘍培養細胞の培養で得られた
Ｃ型粒子（レトロウィルスラの精製と可溶化及び逆転写
酵素の精製について説明する。
腫瘍培養細胞をローラーボトルで回転培養し、６乃至１
６時間で培養液を集め、低速遠心によシ細胞を分離、除
去し、培養液をＡＧガムでｈ〜騎に濃縮踵 ２０％グリ
セリンを通して超遠心したベレットを懸濁し、蔗糖密度
勾配遠心を２回繰返すと、密度１．１５〜１．１６ｙ／
Ｉ！７！の分画にＣ型粒子（レトロウィルス）が精製さ
ｎる。
６時間で培養液を集め、低速遠心によシ細胞を分離、除
去し、培養液をＡＧガムでｈ〜騎に濃縮踵 ２０％グリ
セリンを通して超遠心したベレットを懸濁し、蔗糖密度
勾配遠心を２回繰返すと、密度１．１５〜１．１６ｙ／
Ｉ！７！の分画にＣ型粒子（レトロウィルス）が精製さ
ｎる。
こうして培養液１ハ！ｉＪ４〜５Ｎ蛋白質のＣ型粒子が
得ら扛る。このＣ型粒子はその後ＮＰ−４０及び超音波
処理によって可溶化する。
得ら扛る。このＣ型粒子はその後ＮＰ−４０及び超音波
処理によって可溶化する。
Ｃ型粒子（レトロウィルス）からの逆転写酵素のＮＨに
ＨＤＥＡＥセルロース、リン酸セルロース、ＣＭセルロ
ース、セフアデツクスＧ１００ 。
ＨＤＥＡＥセルロース、リン酸セルロース、ＣＭセルロ
ース、セフアデツクスＧ１００ 。
塩化セシウム遠心、グリセリン遠心、ポリＣアガロース
、ポＩＪ Ｕアガロース等を用いる方法があるが、Ｈｉ
ｚｉ ＆Ｊｏｋｌｉｋ及びＭａｒｃｕｓらの行った方法
が曖扛でいるので、こｎに準じて次の手順にて逆転写酵
素の精製を行った。
、ポＩＪ Ｕアガロース等を用いる方法があるが、Ｈｉ
ｚｉ ＆Ｊｏｋｌｉｋ及びＭａｒｃｕｓらの行った方法
が曖扛でいるので、こｎに準じて次の手順にて逆転写酵
素の精製を行った。
可俗化したＣ型粒子をＤＥＡＥセルロースカラムに乗せ
、食塩濃度勾配で溶出すると、０．１〜０．１５ Ｍ食
塩区分に逆転写酵素活性が溶出した。次にこの溶出した
逆転写酵素活性区分をリン酸セルロースカラムに乗せ、
食塩濃度勾配で溶出すると、０．２〜０．２８Ｍ食塩区
分に逆転写酵素活性が溶出した。次いでこの溶出した逆
転写酵素活性区分をポリＣアガロースに刀≧け、洗滌後
、食塩濃度勾配で浴出すると、０．２Ｍ食塩で酵素活性
区分が溶出し、分子量は７万と８万であった。
、食塩濃度勾配で溶出すると、０．１〜０．１５ Ｍ食
塩区分に逆転写酵素活性が溶出した。次にこの溶出した
逆転写酵素活性区分をリン酸セルロースカラムに乗せ、
食塩濃度勾配で溶出すると、０．２〜０．２８Ｍ食塩区
分に逆転写酵素活性が溶出した。次いでこの溶出した逆
転写酵素活性区分をポリＣアガロースに刀≧け、洗滌後
、食塩濃度勾配で浴出すると、０．２Ｍ食塩で酵素活性
区分が溶出し、分子量は７万と８万であった。
上記の逆転写酵素の精製過程における逆転写酵素活性を
Ｈｉｚｉ ＆、 Ｊｏｋｌｉｋの方法によりＰｏ１ｙ（
ｒＡ）ｎ（ｄＴ） １２−１８をテンプレートとして測
定した処、下記の表−１に示すような結果を得た。
Ｈｉｚｉ ＆、 Ｊｏｋｌｉｋの方法によりＰｏ１ｙ（
ｒＡ）ｎ（ｄＴ） １２−１８をテンプレートとして測
定した処、下記の表−１に示すような結果を得た。
表−１精製過程における逆転写酵素活性＊１分間当４１
７）１＜’ノモルの・Ｈ，−ｄＴＴＰの酸不溶物へのと
りこみを１単位とする。
７）１＜’ノモルの・Ｈ，−ｄＴＴＰの酸不溶物へのと
りこみを１単位とする。
上記の表−１で明らかなように逆転写酵素の比活性は、
精製が進むにつれて高くなり、全般的にみて活性の高い
逆転写酵素が得らｎることが判る。
精製が進むにつれて高くなり、全般的にみて活性の高い
逆転写酵素が得らｎることが判る。
以上の説明で判るように本発明によれば、野外発生出血
病豚の牌臓から増殖時大量のＣ型粒子（レトロウィルス
）を放出する腫瘍細胞株を容易に得ることができて、こ
の細胞のＣ型粒子（レトロウィルス）から活性の高い逆
転写酵素を簡単な操作により大量に生産できるという優
扛た効果がある。
病豚の牌臓から増殖時大量のＣ型粒子（レトロウィルス
）を放出する腫瘍細胞株を容易に得ることができて、こ
の細胞のＣ型粒子（レトロウィルス）から活性の高い逆
転写酵素を簡単な操作により大量に生産できるという優
扛た効果がある。
第１図は豚腫瘍細胞（下妻’８Ｏ−１）の樹立の工程を
示す図、第２図は豚腫瘍絹胞株の０．３％軟寒天での植
込み２０日目処形成されたコロニーを示す写真である。 第１図 月参ハ免龜イ田ＰＩ己 （下専’８０−１’）の４責１
°立１・１セ鳥菓 第２図 手続補正書（自発） 特許庁長官若杉和夫 殿 １ 事件の表示 昭和５７年 特 許 願第２２４９４７号２発明の名称 培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法３ 補正をする
者 事件との関係 特許出願人 ４、 代 理 人 〒１０３ 住 所 東京都中火区日本橋本町２丁目１番地６
補正により増加する発明の数 訂 正 明 細 書 １、発明の名称 培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法２、特許請求の
範囲 野外発生白道病豚の牌臓よシ得た細胞の浮遊液を調整し
た後所要期間装置培養し、次に健康子豚の胸腺細胞と所
要期間共生培養して増殖し、次いで所要期間毎に継代培
養し、次に軟寒天によるクローニングによシ腫瘍細胞株
を得、次いでこの細胞を所要時間回転培養して培養液を
集めた後細胞を除去して培養液を濃縮し、次に２０チグ
リセリンを通して超遠心したペレットを懸濁し、蔗糖密
度勾配遠心を繰返して密度１．１５〜１．１６ ｔ／ｄ
の分画にＣ型粒子を精製し、次いでこのＣ型粒子をＮＰ
−４０及び超音波処理により可溶化し、次にＣの可溶化
しｆｃＣ型粒子粒子ＲＡＥセルロースカラムにのせ食塩
濃度勾配で溶出して０．１〜０１５Ｍ食塩区分に逆転写
酵素活性を浴出し、次いでこの逆転写酵素活性区分をリ
ン酸セルロースにのせ食塩濃度勾配で溶出してＯ１２〜
０．２８Ｍ食塩区分に酵素活性を溶出し、然る後この酵
素活性区分をポリＣアガロースにかけ洗浄後食塩濃度勾
配で溶出して０．２Ｍ食塩で酵素活性区分を溶出するこ
とを特徴とする培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法
。 ３、発明の詳細な説明 本発明は、白道病豚の牌臓から腫瘍細胞株（下妻細胞株
）（ｉ−樹立し、この細胞を用いて逆転写酵素を抽出、
精製する逆転写酵素の生産法に関する。 逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡ（ＲＮＡ−Ｄ
ＮＡ ＩＤ’ｂｒｉｄ）を合成する酵素で、１９７０
年Ｂａｌｔｉｍｏｒｅによｐ Ｒａｕｓｈｅｒ マウス
白面病ウィルｙ、 （Ｒ−ＭＬ Ｖ ）から、またＴｅ
ｍ１ｎと水呑によってラウス肉腫ウィルス（Ｒ８Ｖ）か
ら発見された。Ｃの酵素は、もともとＲＮＡ型腫瘍ウィ
ルスに存在し、ゲノムＲＮＡ１もとにしてそれに相補的
なりＮＡを作る過程において働き、その時生成したＤＮ
Ａはプロウィルスとして宿主細胞のクロモソームに入り
、ウィルスの増殖やｔｒａｎｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｋおこす０今日遺伝子組換え技術の普及とともに、ＲＮ
Ａから相補的なりＮＡ ｆｃＤＮＡ） を合成する際
にこの酵素が用いられ、この酵素の需要が高まっている
。 現在この逆転写酵素の生産は、鶏骨髄芽球症ウィルス（
ＡＭＶ）を接種したひなの血液（プラズマ）を用いて行
われている。しかしこの方法は、ＡＭＶに感受性の高い
ひなの系統の選択及び維持、感染適期の採材等の特殊な
施設と技術が必要な為、培養細胞系等による簡単な操作
方法を用いての逆転写酵素の生産が要望されている０ これすでにトリレトロウィルスやマウスやサル等の哺乳
類のレトロウィルスにおいて、培養細胞を用いてこの酵
素の精製が試みられているが、大量のウィルスを集める
ためには手間と材料を必要とされ、また哺乳類レトロウ
ィルスでは高い比活性の酵素は得られていない。 そこで本発明者等は上記諸事情に鑑み、人工的に培養、
増殖、継代可能な動物の腫瘍細胞系の樹立を試みた結果
、野外発生白血病豚の牌臓から増殖時にＣ型粒子（レト
ロウィルス）を大量に放出し、且つ維持の簡単な腫瘍細
胞株（下妻細胞系）を得た。そしてこの細胞系を用いて
Ｃ型粒子を集め、逆転写゛酵素の抽出精製を試みた処、
簡単な操作によって活性の高い満足のできる逆転写酵素
を生産できる方法を見出した。 以下本発明の培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法の
実施例について説明する。 先ず腫瘍細胞株の樹立について説明すると、第１図に示
す如く野外発生白血病豚の種火した牌ＭＡを細切し、メ
ツシュを通過させ、遠心洗滌し、ｌＯチ牛脂児血清を含
むＲＰＭＩ−１６４０培養液に８．５ Ｘ １０’細胞
／ｄに調整浮遊させ、ＣＯ。 排卵器で４日間静置培養し、次にこの静置培養した細胞
浮遊液全健康子豚の胸腺細胞に加え、２ Ｘ １０７細
胞／−となして３２日間共生培養した。その後共生培養
液の細胞を３目間隔で継代培養し、６０日目処軟寒天に
よるクローニングを行ない、腫瘍細胞株（下妻’８０−
１細胞株）を得た。 こうして得られた腫瘍細胞株は、次のような特性を有す
る。 ア）１万個／ｄの細胞を植込むと増殖し、継代培養が可
能である。 イ）１３時間で２倍に増え、２〜４万細胞／ｄまで増え
る。 つ）第２図の写真に見られるように、０．３％軟寒天で
の植込み２０日１にコロニー分形成する。 工）羊赤崩球によるロゼツトを形成しない。 オ）染色体数が５３から７１の範囲である。 力）自発的にＣ型粒子を大量に放出する。 上記のような特性を有する腫瘍培養細胞（下妻’８０−
１細胞）は、逆転写酵素の精製の素材として極めて好適
なものでるり、以下この腫瘍培養細胞で得られたＣ型粒
子（レトロウィルス）の精製と可溶化及び逆転写酵素の
精製について説明する。 Ｃ型粒子の精製；腫瘍培養細胞をローラーボトルで回転
培養し、６乃至１６時間で培養液を集め、低速遠心で細
胞禾除去踵培養液をＡＧガムで１７３〜１／４に濃縮し
、濃縮液を２０チグリセリンを通して２５，０００ｒ、
ｐｏｍ、 ９０分遠心したべＬ／ノットｆ１ＴＮＥ緩
衝液（０，０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｌ 。 ｐＨ７，４、１ｍＭＥＤＴＡ 、 ０．Ｉ Ｎ ＮａＣ
ｎ）に懸濁し、１５−６０％Ｗ／Ｖ蔗糖密度勾配遠心し
く １８．００Ｏｒ、ｐ、ｒｂ１６時間）、密度１．１
５〜１．１６ｆ／−の分画を４０．００ Ｏｒ−ｐ−ｍ
・６０分遠心によって濃縮後、再び蔗糖密度勾配遠心に
よってＣ型粒子（レトロウィルス）が精製される。こう
して培養液１２当９４〜５呼蛋白質のＣ型粒子が得られ
る。 逆転写酵素の精製；こうして得られたＣ型粒子は０．２
％ ＮＦ４０ 、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣλｐＨ
８，０゜０．１５Ｍ ＮａＣλ、 １ｍＭ ｄｉｔｈｉ
ｏ ｔｈｒｅｉｔｏｌ中で超音波処理し、４Ｃで１時間
おいて可溶化する。 Ｃ型粒子（レトロウィルス）からの逆転写酵素の精製に
はＤＥＡＥセルロース、リン酸セルロース、ＣＭナセル
ール、セファデックスＱ１００゜塩化セシウム遠心、グ
リセリン遠心、ポリＣアガロース、ポリＣアガロース等
を用いる方法があるが、Ｈｉｚｉ ＆ Ｊｏｋｌｉｋ及
びＭａｒｃｕｓ らの行った方法に準じて、次の手順
で逆転写酵素の精製を行った。 可溶化したＣ型粒子をＤＥＡＥセルロース緩衝液（０，
０２Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ１． ｐＨ７，５、０，１
％ ＮＦ４０ 。 ２０チグリセロール、 １ｍＭ ｄｉｔｈｉｏ ｔｈｒ
ｅｉｔｏｌ）に透析後、Ｄ Ｅ Ａ Ｅ セルｏ −ス
にのせ、０．０２Ｍ０１７Ｍ食塩濃度で浴出する。第３
図に示す如く、０．１〜０．１５Ｍ５Ｍ食塩濃逆転写酵
素活性（黒丸実線）が溶出した。次にこの浴出した逆転
写酵素活性分画を集め、リン酸セルロース緩衝液（０，
０５Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣＪＩ ｐＨ８，０、０，２％
ＮＦ４．０ 、２０％グリセリン＋ １ｍＭ ｄｉｔ
ｈｉｏ ｔｈｒｅｉｔｏｌ ）に透析し、リン酸セルロ
ースカラムにのせ、０．０５Ｍ−０，８Ｍ食塩濃度勾配
で溶出すると、第４図に示す如（０，２〜０．２８ Ｍ
食塩濃度で逆転写酵素活性Ｃ黒丸実線）の山がみられた
。この活性分画を集め、リン酸セルロース緩衝液で６倍
に稀釈し、ポリＣアガロースにかけ、同緩衝液で洗滌後
、０．０５〜０．６Ｍ食塩濃度勾配で溶出した処、第５
図に示す如＜０．２Ｍ食塩で酵素活性が溶出した。この
酵素活性分画について、ＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動で分析した結果は、第６図に示す如く、分子量７万
と８万の成分から成立っていた。 またこの活性分画について、混入リボヌクレアーゼの有
無を調べるため、８Ｈ−ラベルした細胞のリポソームＲ
ＮＡの２８８分画と３７Ｃ１時間インキュベートし、５
−３０％ｍ糖密度勾配にのせ、４０．００Ｏｒ、ｐｏｍ
５時間遠心を行なった結果、第７図に示す如くその遠
心像（黒丸実線）は、酵素の無い緩衝液のみの対照（白
色点線）と殆んど同じ遠心像を示し、リボヌクレアーゼ
の混入が殆んど無いことが示された。 逆転写酵素活性の測定は、反応液０．１ｄ、トリス緩衝
液０．０５Ｍ ｐＨ８，０、０，０６Ｍ ＮａＣｎ 、
０．０１ ＭＭｎＣｎｚ 、 ５ ｒｎＭ ｄｉ ｔ
ｈｉｏ ｔｈｒｅｉ ｔｏｌ 、 ５０ ｐＭ ”Ｈｄ
ＴＴＰ（チミジン３リン酸） 、 （１２３ｃｐｍ／
Ｐｍｏｌｅ ）０．２ Ａｚａｏ／ｓｇ ｐｏｌｙ（ｒ
Ａ） （ｄＴ）ｕ−ｔｓ 、 ３７ Ｃ１時間保温後、
ＤＥ８１ Ｆ紙に反応液をっけ、５％Ｎａ２ＨＰＯ４で
１０分間６回、水で２回洗い、アルコールテ乾燥シ、ト
ルエンシンチレータテ測定した。１分間当９１ナノモル
８Ｈ−ｄＴＴＰの酸不溶物へのとシこみを１単位とする
。 上記の精製過程における逆転写酵素活性を下記の表−１
に示した。 表−１精製過程における逆転写酵素活性上記の表−１で
明らかなように逆転写酵素の比活性は、精製が進むにつ
れて高くなシ、全般的にみて活性の高いリボヌクレアー
ゼの混入の殆んど無い逆転写酵素が得られることが判る
。 以上の説明で判るとおり本発明によれば、野外発生白面
病豚の牌臓から得られた増殖時に大量のＣ型粒子（レト
ロウィルス）を放出する腫瘍細胞株を用いることによっ
て、この細胞のＣ型粒子（レトロウィルス）から活性の
高い逆転写酵素を簡単な操作によシ大量に生産できると
いう優れた効果がある。 ４、図面の簡単な説明 第１図は豚腫瘍細胞（下妻’８Ｏ−１）の樹立の工程を
示す図、第２図は豚腫瘍細胞株の０．３チ軟寒天での植
込み２０日目処形成されたコロニーを示す写真、第３図
は逆転写酵素のＤＢＡＥセルロースでのクロマトグラフ
ィを示す図、第４図は逆転写酵素のリン酸セルロースで
のクロマトグラフィを示す図、第５図は逆転写酵素のポ
リＣアガロースでのクロマトグラフィを示す図、第６図
はポリＣアガロース精製逆転写酵素のＳＤＳポリアクリ
ルヌミドゲル電気泳動上から分子量８万と７万のバンド
を示す写真、第７図はポリＣアガロース精製逆転写酵素
の残存リボヌクレース活性の検定結果を示すグラフであ
る０ 出 願 人 家畜衛生試験場長 佐 澤 弘 士代理
人 弁理士 高 雄次部゛゛）第１図 第３図 朽ｌ大写峙索のＤＥＡＥゼルロースて°／）７０マド７
パラフイＦｒａｃｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ −；＠素なケ１生（１０ｍｌ）、−ｏ；ｉ白’ｆｌ＠ｊ
ｊ 、”−”：ＮａＣ１ｔｆＸ第４図 嵌車ス写許１紫ｎリン酸ゼルロースてｒクロマトグラフ
イー：Ｎ奪Ｅ舌−１１（１０ｐｉ ）、 ’＝’蛋白
！濃度 、Ａ−−−Ａ：ＮａＣノ」軟槌第５図 道車ム写４４のボッＣアガ′叶スてｎフロマドグラフィ
ー：ｄ素；舎１生＜２０ｐｌ）、”−＝：ＮａＣｊＪ度
第６図 第７図 Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ 手続補正書（自発） 昭和５８年９月 ５日 昭和 ５７年 特 許 顕第 ２２４９４７号３、 補
正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 茨城県筑波郡谷田部町観音ｆｉ３−１−
１４、 代 理 人 〒 １０３６、 補正に
より増加する発明の数 ８、補正の内容 （１） 昭和５８年８月２３日差出の手続補正書に添
付の訂正明細書３頁１行のｒ ｔｒａｎｓ ｆｏｒｍ−
ａｔｉｏｎ Ｊ ｋ ［ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
Ｊと訂正する０（２）同６頁１５行の「ｄｉｔｈｉｏ
ｔｈｒｅｉｔｏｌ Ｊ ｋｌ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅ
ｉｔｏｌ Ｊと訂正する。 （３）同７頁８行乃至９行のｌ Ｏ，０２Ｍ ０．７
Ｍｌを「０．０２Ｍ〜０．７ＭＪと訂正する。 （４）同７頁１４行の［ｄｉｌｈｉｏ ｔｈｒｅｉｔｏ
ｌ Ｊ ｋ「ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ Ｊ と訂
正する。 （５） 同１０頁１７行の［ポリアクリルアミドゲル
電気泳動」ヲ「ポリアクリルアミドゲル電気泳動、」と
訂正する。 （６）昭和５８年８月２３日差出の手続補正書に添付し
た図面第３図及び第７図を添付の通り訂正する。 第３図 ’４に’ｆ−ｇ衆のＤＥＡＥセルロースで刀りロマトグ
ラフィー；耐素３古・）１（１０）ｌｌ）、 ：
’に白質漏度、 ・−−−−ａ：ＮａＣ１１第７図 Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ
示す図、第２図は豚腫瘍絹胞株の０．３％軟寒天での植
込み２０日目処形成されたコロニーを示す写真である。 第１図 月参ハ免龜イ田ＰＩ己 （下専’８０−１’）の４責１
°立１・１セ鳥菓 第２図 手続補正書（自発） 特許庁長官若杉和夫 殿 １ 事件の表示 昭和５７年 特 許 願第２２４９４７号２発明の名称 培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法３ 補正をする
者 事件との関係 特許出願人 ４、 代 理 人 〒１０３ 住 所 東京都中火区日本橋本町２丁目１番地６
補正により増加する発明の数 訂 正 明 細 書 １、発明の名称 培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法２、特許請求の
範囲 野外発生白道病豚の牌臓よシ得た細胞の浮遊液を調整し
た後所要期間装置培養し、次に健康子豚の胸腺細胞と所
要期間共生培養して増殖し、次いで所要期間毎に継代培
養し、次に軟寒天によるクローニングによシ腫瘍細胞株
を得、次いでこの細胞を所要時間回転培養して培養液を
集めた後細胞を除去して培養液を濃縮し、次に２０チグ
リセリンを通して超遠心したペレットを懸濁し、蔗糖密
度勾配遠心を繰返して密度１．１５〜１．１６ ｔ／ｄ
の分画にＣ型粒子を精製し、次いでこのＣ型粒子をＮＰ
−４０及び超音波処理により可溶化し、次にＣの可溶化
しｆｃＣ型粒子粒子ＲＡＥセルロースカラムにのせ食塩
濃度勾配で溶出して０．１〜０１５Ｍ食塩区分に逆転写
酵素活性を浴出し、次いでこの逆転写酵素活性区分をリ
ン酸セルロースにのせ食塩濃度勾配で溶出してＯ１２〜
０．２８Ｍ食塩区分に酵素活性を溶出し、然る後この酵
素活性区分をポリＣアガロースにかけ洗浄後食塩濃度勾
配で溶出して０．２Ｍ食塩で酵素活性区分を溶出するこ
とを特徴とする培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法
。 ３、発明の詳細な説明 本発明は、白道病豚の牌臓から腫瘍細胞株（下妻細胞株
）（ｉ−樹立し、この細胞を用いて逆転写酵素を抽出、
精製する逆転写酵素の生産法に関する。 逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡ（ＲＮＡ−Ｄ
ＮＡ ＩＤ’ｂｒｉｄ）を合成する酵素で、１９７０
年Ｂａｌｔｉｍｏｒｅによｐ Ｒａｕｓｈｅｒ マウス
白面病ウィルｙ、 （Ｒ−ＭＬ Ｖ ）から、またＴｅ
ｍ１ｎと水呑によってラウス肉腫ウィルス（Ｒ８Ｖ）か
ら発見された。Ｃの酵素は、もともとＲＮＡ型腫瘍ウィ
ルスに存在し、ゲノムＲＮＡ１もとにしてそれに相補的
なりＮＡを作る過程において働き、その時生成したＤＮ
Ａはプロウィルスとして宿主細胞のクロモソームに入り
、ウィルスの増殖やｔｒａｎｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｋおこす０今日遺伝子組換え技術の普及とともに、ＲＮ
Ａから相補的なりＮＡ ｆｃＤＮＡ） を合成する際
にこの酵素が用いられ、この酵素の需要が高まっている
。 現在この逆転写酵素の生産は、鶏骨髄芽球症ウィルス（
ＡＭＶ）を接種したひなの血液（プラズマ）を用いて行
われている。しかしこの方法は、ＡＭＶに感受性の高い
ひなの系統の選択及び維持、感染適期の採材等の特殊な
施設と技術が必要な為、培養細胞系等による簡単な操作
方法を用いての逆転写酵素の生産が要望されている０ これすでにトリレトロウィルスやマウスやサル等の哺乳
類のレトロウィルスにおいて、培養細胞を用いてこの酵
素の精製が試みられているが、大量のウィルスを集める
ためには手間と材料を必要とされ、また哺乳類レトロウ
ィルスでは高い比活性の酵素は得られていない。 そこで本発明者等は上記諸事情に鑑み、人工的に培養、
増殖、継代可能な動物の腫瘍細胞系の樹立を試みた結果
、野外発生白血病豚の牌臓から増殖時にＣ型粒子（レト
ロウィルス）を大量に放出し、且つ維持の簡単な腫瘍細
胞株（下妻細胞系）を得た。そしてこの細胞系を用いて
Ｃ型粒子を集め、逆転写゛酵素の抽出精製を試みた処、
簡単な操作によって活性の高い満足のできる逆転写酵素
を生産できる方法を見出した。 以下本発明の培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法の
実施例について説明する。 先ず腫瘍細胞株の樹立について説明すると、第１図に示
す如く野外発生白血病豚の種火した牌ＭＡを細切し、メ
ツシュを通過させ、遠心洗滌し、ｌＯチ牛脂児血清を含
むＲＰＭＩ−１６４０培養液に８．５ Ｘ １０’細胞
／ｄに調整浮遊させ、ＣＯ。 排卵器で４日間静置培養し、次にこの静置培養した細胞
浮遊液全健康子豚の胸腺細胞に加え、２ Ｘ １０７細
胞／−となして３２日間共生培養した。その後共生培養
液の細胞を３目間隔で継代培養し、６０日目処軟寒天に
よるクローニングを行ない、腫瘍細胞株（下妻’８０−
１細胞株）を得た。 こうして得られた腫瘍細胞株は、次のような特性を有す
る。 ア）１万個／ｄの細胞を植込むと増殖し、継代培養が可
能である。 イ）１３時間で２倍に増え、２〜４万細胞／ｄまで増え
る。 つ）第２図の写真に見られるように、０．３％軟寒天で
の植込み２０日１にコロニー分形成する。 工）羊赤崩球によるロゼツトを形成しない。 オ）染色体数が５３から７１の範囲である。 力）自発的にＣ型粒子を大量に放出する。 上記のような特性を有する腫瘍培養細胞（下妻’８０−
１細胞）は、逆転写酵素の精製の素材として極めて好適
なものでるり、以下この腫瘍培養細胞で得られたＣ型粒
子（レトロウィルス）の精製と可溶化及び逆転写酵素の
精製について説明する。 Ｃ型粒子の精製；腫瘍培養細胞をローラーボトルで回転
培養し、６乃至１６時間で培養液を集め、低速遠心で細
胞禾除去踵培養液をＡＧガムで１７３〜１／４に濃縮し
、濃縮液を２０チグリセリンを通して２５，０００ｒ、
ｐｏｍ、 ９０分遠心したべＬ／ノットｆ１ＴＮＥ緩
衝液（０，０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｌ 。 ｐＨ７，４、１ｍＭＥＤＴＡ 、 ０．Ｉ Ｎ ＮａＣ
ｎ）に懸濁し、１５−６０％Ｗ／Ｖ蔗糖密度勾配遠心し
く １８．００Ｏｒ、ｐ、ｒｂ１６時間）、密度１．１
５〜１．１６ｆ／−の分画を４０．００ Ｏｒ−ｐ−ｍ
・６０分遠心によって濃縮後、再び蔗糖密度勾配遠心に
よってＣ型粒子（レトロウィルス）が精製される。こう
して培養液１２当９４〜５呼蛋白質のＣ型粒子が得られ
る。 逆転写酵素の精製；こうして得られたＣ型粒子は０．２
％ ＮＦ４０ 、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣλｐＨ
８，０゜０．１５Ｍ ＮａＣλ、 １ｍＭ ｄｉｔｈｉ
ｏ ｔｈｒｅｉｔｏｌ中で超音波処理し、４Ｃで１時間
おいて可溶化する。 Ｃ型粒子（レトロウィルス）からの逆転写酵素の精製に
はＤＥＡＥセルロース、リン酸セルロース、ＣＭナセル
ール、セファデックスＱ１００゜塩化セシウム遠心、グ
リセリン遠心、ポリＣアガロース、ポリＣアガロース等
を用いる方法があるが、Ｈｉｚｉ ＆ Ｊｏｋｌｉｋ及
びＭａｒｃｕｓ らの行った方法に準じて、次の手順
で逆転写酵素の精製を行った。 可溶化したＣ型粒子をＤＥＡＥセルロース緩衝液（０，
０２Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ１． ｐＨ７，５、０，１
％ ＮＦ４０ 。 ２０チグリセロール、 １ｍＭ ｄｉｔｈｉｏ ｔｈｒ
ｅｉｔｏｌ）に透析後、Ｄ Ｅ Ａ Ｅ セルｏ −ス
にのせ、０．０２Ｍ０１７Ｍ食塩濃度で浴出する。第３
図に示す如く、０．１〜０．１５Ｍ５Ｍ食塩濃逆転写酵
素活性（黒丸実線）が溶出した。次にこの浴出した逆転
写酵素活性分画を集め、リン酸セルロース緩衝液（０，
０５Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣＪＩ ｐＨ８，０、０，２％
ＮＦ４．０ 、２０％グリセリン＋ １ｍＭ ｄｉｔ
ｈｉｏ ｔｈｒｅｉｔｏｌ ）に透析し、リン酸セルロ
ースカラムにのせ、０．０５Ｍ−０，８Ｍ食塩濃度勾配
で溶出すると、第４図に示す如（０，２〜０．２８ Ｍ
食塩濃度で逆転写酵素活性Ｃ黒丸実線）の山がみられた
。この活性分画を集め、リン酸セルロース緩衝液で６倍
に稀釈し、ポリＣアガロースにかけ、同緩衝液で洗滌後
、０．０５〜０．６Ｍ食塩濃度勾配で溶出した処、第５
図に示す如＜０．２Ｍ食塩で酵素活性が溶出した。この
酵素活性分画について、ＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動で分析した結果は、第６図に示す如く、分子量７万
と８万の成分から成立っていた。 またこの活性分画について、混入リボヌクレアーゼの有
無を調べるため、８Ｈ−ラベルした細胞のリポソームＲ
ＮＡの２８８分画と３７Ｃ１時間インキュベートし、５
−３０％ｍ糖密度勾配にのせ、４０．００Ｏｒ、ｐｏｍ
５時間遠心を行なった結果、第７図に示す如くその遠
心像（黒丸実線）は、酵素の無い緩衝液のみの対照（白
色点線）と殆んど同じ遠心像を示し、リボヌクレアーゼ
の混入が殆んど無いことが示された。 逆転写酵素活性の測定は、反応液０．１ｄ、トリス緩衝
液０．０５Ｍ ｐＨ８，０、０，０６Ｍ ＮａＣｎ 、
０．０１ ＭＭｎＣｎｚ 、 ５ ｒｎＭ ｄｉ ｔ
ｈｉｏ ｔｈｒｅｉ ｔｏｌ 、 ５０ ｐＭ ”Ｈｄ
ＴＴＰ（チミジン３リン酸） 、 （１２３ｃｐｍ／
Ｐｍｏｌｅ ）０．２ Ａｚａｏ／ｓｇ ｐｏｌｙ（ｒ
Ａ） （ｄＴ）ｕ−ｔｓ 、 ３７ Ｃ１時間保温後、
ＤＥ８１ Ｆ紙に反応液をっけ、５％Ｎａ２ＨＰＯ４で
１０分間６回、水で２回洗い、アルコールテ乾燥シ、ト
ルエンシンチレータテ測定した。１分間当９１ナノモル
８Ｈ−ｄＴＴＰの酸不溶物へのとシこみを１単位とする
。 上記の精製過程における逆転写酵素活性を下記の表−１
に示した。 表−１精製過程における逆転写酵素活性上記の表−１で
明らかなように逆転写酵素の比活性は、精製が進むにつ
れて高くなシ、全般的にみて活性の高いリボヌクレアー
ゼの混入の殆んど無い逆転写酵素が得られることが判る
。 以上の説明で判るとおり本発明によれば、野外発生白面
病豚の牌臓から得られた増殖時に大量のＣ型粒子（レト
ロウィルス）を放出する腫瘍細胞株を用いることによっ
て、この細胞のＣ型粒子（レトロウィルス）から活性の
高い逆転写酵素を簡単な操作によシ大量に生産できると
いう優れた効果がある。 ４、図面の簡単な説明 第１図は豚腫瘍細胞（下妻’８Ｏ−１）の樹立の工程を
示す図、第２図は豚腫瘍細胞株の０．３チ軟寒天での植
込み２０日目処形成されたコロニーを示す写真、第３図
は逆転写酵素のＤＢＡＥセルロースでのクロマトグラフ
ィを示す図、第４図は逆転写酵素のリン酸セルロースで
のクロマトグラフィを示す図、第５図は逆転写酵素のポ
リＣアガロースでのクロマトグラフィを示す図、第６図
はポリＣアガロース精製逆転写酵素のＳＤＳポリアクリ
ルヌミドゲル電気泳動上から分子量８万と７万のバンド
を示す写真、第７図はポリＣアガロース精製逆転写酵素
の残存リボヌクレース活性の検定結果を示すグラフであ
る０ 出 願 人 家畜衛生試験場長 佐 澤 弘 士代理
人 弁理士 高 雄次部゛゛）第１図 第３図 朽ｌ大写峙索のＤＥＡＥゼルロースて°／）７０マド７
パラフイＦｒａｃｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ −；＠素なケ１生（１０ｍｌ）、−ｏ；ｉ白’ｆｌ＠ｊ
ｊ 、”−”：ＮａＣ１ｔｆＸ第４図 嵌車ス写許１紫ｎリン酸ゼルロースてｒクロマトグラフ
イー：Ｎ奪Ｅ舌−１１（１０ｐｉ ）、 ’＝’蛋白
！濃度 、Ａ−−−Ａ：ＮａＣノ」軟槌第５図 道車ム写４４のボッＣアガ′叶スてｎフロマドグラフィ
ー：ｄ素；舎１生＜２０ｐｌ）、”−＝：ＮａＣｊＪ度
第６図 第７図 Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ 手続補正書（自発） 昭和５８年９月 ５日 昭和 ５７年 特 許 顕第 ２２４９４７号３、 補
正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 茨城県筑波郡谷田部町観音ｆｉ３−１−
１４、 代 理 人 〒 １０３６、 補正に
より増加する発明の数 ８、補正の内容 （１） 昭和５８年８月２３日差出の手続補正書に添
付の訂正明細書３頁１行のｒ ｔｒａｎｓ ｆｏｒｍ−
ａｔｉｏｎ Ｊ ｋ ［ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
Ｊと訂正する０（２）同６頁１５行の「ｄｉｔｈｉｏ
ｔｈｒｅｉｔｏｌ Ｊ ｋｌ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅ
ｉｔｏｌ Ｊと訂正する。 （３）同７頁８行乃至９行のｌ Ｏ，０２Ｍ ０．７
Ｍｌを「０．０２Ｍ〜０．７ＭＪと訂正する。 （４）同７頁１４行の［ｄｉｌｈｉｏ ｔｈｒｅｉｔｏ
ｌ Ｊ ｋ「ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ Ｊ と訂
正する。 （５） 同１０頁１７行の［ポリアクリルアミドゲル
電気泳動」ヲ「ポリアクリルアミドゲル電気泳動、」と
訂正する。 （６）昭和５８年８月２３日差出の手続補正書に添付し
た図面第３図及び第７図を添付の通り訂正する。 第３図 ’４に’ｆ−ｇ衆のＤＥＡＥセルロースで刀りロマトグ
ラフィー；耐素３古・）１（１０）ｌｌ）、 ：
’に白質漏度、 ・−−−−ａ：ＮａＣ１１第７図 Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 野外発生白面病豚の牌臓より得た細胞の浮遊所要期間毎
に継代培養し、次に軟寒天によるクローニングにより腫
瘍細胞株を得、次いでこの細胞を所要時間回転培養して
培養液を集めた後細胞を除去して培養液を濃縮し、次に
２０係グリセリンを通して超遠心したベレットを懸濁し
。 蔗糖密度勾配遠心を繰返して密度１．１５〜１．１６１
／−の分画にＣ型粒子を精製し１次いでこのＣ型粒子を
Ｎｐ−４０及び超音波処理により可溶化し、次にこの可
溶化したＣ型粒子をＤＥＡＥセルロースカラムにのせ食
塩濃度勾配で溶出して０．１〜ｏ、１ｓＭ食塩区分に逆
転写酵素活性を溶出し、次いでこの逆転写酵素活性区分
をリン酸セルロースにのせ食塩濃度勾配で溶出して０．
２〜０．２８Ｍ食塩区分に酵素活性を溶出し、然る後こ
の酵素活性区分をポリＣアガロースにかけ洗浄後食塩濃
度勾配で溶出して０．２ Ｍ食塩で酵素活性区分を溶出
することを特徴とする培養腫瘍細胞による逆転写酵素の
生産法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57224947A JPS6028278B2 (ja) | 1982-12-23 | 1982-12-23 | 培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法 |
| US06/559,383 US4729955A (en) | 1982-12-23 | 1983-12-08 | Method of producing reverse transcriptase |
| EP83112813A EP0114342B1 (en) | 1982-12-23 | 1983-12-20 | A method of producing reverse transcriptase |
| DE8383112813T DE3380217D1 (en) | 1982-12-23 | 1983-12-20 | A method of producing reverse transcriptase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57224947A JPS6028278B2 (ja) | 1982-12-23 | 1982-12-23 | 培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59118081A true JPS59118081A (ja) | 1984-07-07 |
| JPS6028278B2 JPS6028278B2 (ja) | 1985-07-03 |
Family
ID=16821682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57224947A Expired JPS6028278B2 (ja) | 1982-12-23 | 1982-12-23 | 培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4729955A (ja) |
| EP (1) | EP0114342B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6028278B2 (ja) |
| DE (1) | DE3380217D1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5112756A (en) * | 1986-06-02 | 1992-05-12 | Canadian Patents And Development Limited | Continuous production of bovine Maedi-Visna-like viral antigens in Cf2Th cells |
| JP2852431B2 (ja) * | 1988-12-07 | 1999-02-03 | 財団法人阪大微生物病研究会 | レトロウイルスのプロテアーゼ、逆転写酵素及びエンドヌクレアーゼ、並びにこれ等の酵素の製法 |
| US8124410B2 (en) * | 2006-06-08 | 2012-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods of finding, selecting and studying cells in heterogeneous co-cultures |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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- 1982-12-23 JP JP57224947A patent/JPS6028278B2/ja not_active Expired
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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