JPS59109198A - 固定化酵素カラムを用いた尿素分析方法 - Google Patents
固定化酵素カラムを用いた尿素分析方法Info
- Publication number
- JPS59109198A JPS59109198A JP21992282A JP21992282A JPS59109198A JP S59109198 A JPS59109198 A JP S59109198A JP 21992282 A JP21992282 A JP 21992282A JP 21992282 A JP21992282 A JP 21992282A JP S59109198 A JPS59109198 A JP S59109198A
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- urea
- conductivity
- immobilized
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- Pending
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、固定化酵素カラムを用いて試料中の尿素を電
導度法により定量する方法に関する。臨床検査分野にお
いて、生体液中の尿素濃度は腎機能の指標として重要視
されている。さらに、近年。
導度法により定量する方法に関する。臨床検査分野にお
いて、生体液中の尿素濃度は腎機能の指標として重要視
されている。さらに、近年。
腎疾患の治療法に人工透析が広く行なわれ、透析中の腎
機能のモニタリングに尿素が利用されてきた。この種の
尿素定量法は、一般に正確、簡便かつ迅速であることが
望まれる。
機能のモニタリングに尿素が利用されてきた。この種の
尿素定量法は、一般に正確、簡便かつ迅速であることが
望まれる。
初期の尿素定量法は、尿素を他の有機物と反応させた後
比色定量するものであったが、最近ではこの方法にかわ
りより正確な定量法きして酵素（ウレアーゼ）を用いる
方法が広く行なわれている。この方法は、尿素にウレア
ーゼを作用させてアンモニアを生成させ、このアンモニ
アヲ何うかの方法で定量する吉いうものである。アンモ
ニアの定量法としては、インドフェノール反応やネスラ
ー反応を利用するものがあるが、最も広く行なわれてい
るのは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドを組み合せた酵素比色法
である。
比色定量するものであったが、最近ではこの方法にかわ
りより正確な定量法きして酵素（ウレアーゼ）を用いる
方法が広く行なわれている。この方法は、尿素にウレア
ーゼを作用させてアンモニアを生成させ、このアンモニ
アヲ何うかの方法で定量する吉いうものである。アンモ
ニアの定量法としては、インドフェノール反応やネスラ
ー反応を利用するものがあるが、最も広く行なわれてい
るのは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドを組み合せた酵素比色法
である。
以上の比色法には、■）体液のよ・うな着色試料をその
まま使うことができない。２）操作が煩雑で時間がかか
る。３）高価な酵素を使い捨て（こするために経済的で
ないといった次点がある。
まま使うことができない。２）操作が煩雑で時間がかか
る。３）高価な酵素を使い捨て（こするために経済的で
ないといった次点がある。
また、尿素にウレアーゼを作用させ、生成したアンモニ
アと二酸化炭素を電導度法で検出する尿素定量法（特開
昭４８−３７９６号公報参照）も知られているが、この
定量法も−り述の３）の欠点を有している。更に尿素濃
度が低い場合は、酵素液の電導度を補正しなければなら
ない次点もある。
アと二酸化炭素を電導度法で検出する尿素定量法（特開
昭４８−３７９６号公報参照）も知られているが、この
定量法も−り述の３）の欠点を有している。更に尿素濃
度が低い場合は、酵素液の電導度を補正しなければなら
ない次点もある。
酵素の使い捨ての欠点を排除するため、酵素を固定化し
、 ｐＨ電極、ガラス電極などのイオン選択性電極と
組み合せて尿素を定量する方法も知られているが、ガラ
ス電極の場合は試料中のＮａ十。
、 ｐＨ電極、ガラス電極などのイオン選択性電極と
組み合せて尿素を定量する方法も知られているが、ガラ
ス電極の場合は試料中のＮａ十。
Ｋ＋イオンの影響を受けるといった欠点がある。
ｐＩ（電極の場合は、ガス状のアンモニアを測定スるた
め、被検液のｐＨを１１以上にフッる必要があり、酵素
反応の至適ｐＨと大きく異なり、反応部と検出部を分離
しなければならない。ｐｉ−Ｉ電極を用いるものは、揮
発性アミンの妨害を受けやすいという欠点もあり、実用
化されるに至っていない。
め、被検液のｐＨを１１以上にフッる必要があり、酵素
反応の至適ｐＨと大きく異なり、反応部と検出部を分離
しなければならない。ｐｉ−Ｉ電極を用いるものは、揮
発性アミンの妨害を受けやすいという欠点もあり、実用
化されるに至っていない。
この発明は、上述の欠点を除去して、より簡便。
正確、迅速かつ安価な尿素定量法を提供することを目的
とする。すなわち１本発明の第一の目的は。
とする。すなわち１本発明の第一の目的は。
尿素をアンモニア吉二酸化炭素に加水分解する酵素（ウ
レアーゼ）をガラスピーズｆ、１′どに固定化した固定
化酵素カラム（固定化酵素反応器）と２つの電導度測定
セル部から構成される尿素検出部を提供することにある
。
レアーゼ）をガラスピーズｆ、１′どに固定化した固定
化酵素カラム（固定化酵素反応器）と２つの電導度測定
セル部から構成される尿素検出部を提供することにある
。
さらに第二の目的は、この尿素検出部に尿素を含む被検
液を導き、固定化酵素カラムで処理される前後の溶液の
導電率あるいは抵抗値の違いから尿素を簡便、迅速に定
量する方法を提供することにある。
液を導き、固定化酵素カラムで処理される前後の溶液の
導電率あるいは抵抗値の違いから尿素を簡便、迅速に定
量する方法を提供することにある。
本発明者らは、上述の目的のもとに、尿素分析法につい
て検討を重ねた結果、尿素を分解しアンモニアと二酸化
炭素を生成する酵素、ウレアーゼをガラスピーズに固定
化し、この固定化酵素カラムを被検液の流路に沿って上
流側より１対の白金電極より成る第１電導度検知部１２
、固定化酵素カラム１４．１対の白金電極より成る第２
電導度検知部１５のように設置し、第１検知部と第２検
知部の出力信号（導電率あるいは抵抗値）の差を測定す
ることにより、試料中の尿素を分析する方法を発明した
。
て検討を重ねた結果、尿素を分解しアンモニアと二酸化
炭素を生成する酵素、ウレアーゼをガラスピーズに固定
化し、この固定化酵素カラムを被検液の流路に沿って上
流側より１対の白金電極より成る第１電導度検知部１２
、固定化酵素カラム１４．１対の白金電極より成る第２
電導度検知部１５のように設置し、第１検知部と第２検
知部の出力信号（導電率あるいは抵抗値）の差を測定す
ることにより、試料中の尿素を分析する方法を発明した
。
この発明は以下の原理に基づくものである。尿素はウレ
アーゼにより加水分解され、アンモニアと二酸化炭素を
与える。このアンモニアき二酸化炭素は、ｐＨ７付近で
はそれぞれ加水分解を受け（１）式を与える。
アーゼにより加水分解され、アンモニアと二酸化炭素を
与える。このアンモニアき二酸化炭素は、ｐＨ７付近で
はそれぞれ加水分解を受け（１）式を与える。
ここで用いた酵素ウレアーゼは尿素に特異的に作用する
ため、試料中の他の物質からアンモニア。
ため、試料中の他の物質からアンモニア。
二酸化炭素が生成されることはない。生成したＮＨ，’
、 ＨＣＯ，ｉ は、それぞれ試料を含む緩衝液あ
るいは溶媒の導電率を増加させる。
、 ＨＣＯ，ｉ は、それぞれ試料を含む緩衝液あ
るいは溶媒の導電率を増加させる。
第１電導度検知部１２で試料を含む緩衝溶液の導電率を
検出し、第２電導度検知部１５で固定化ウレアーゼカラ
ムの触媒作用Ｉこよる（１）の反応生成物を含む緩衝溶
液の導電率を検出する。それぞれの導電率の差は試料中
の尿素濃度に比例するため。
検出し、第２電導度検知部１５で固定化ウレアーゼカラ
ムの触媒作用Ｉこよる（１）の反応生成物を含む緩衝溶
液の導電率を検出する。それぞれの導電率の差は試料中
の尿素濃度に比例するため。
尿素濃度を定量することができる。
本発明に用いる電導度測定装置としては、コールラウツ
シュ型の４辺ブリッジでもまたリニアプ ５− 一武 リッジ型でもよく、一般に市販されているものを利用す
ることができる。また、電極間に印加する電圧は、分極
発生を紡ぐため交流電圧（好ましくは０．５ｋＨ２以上
、ｌＶ程度）が望ましい。電極は。
シュ型の４辺ブリッジでもまたリニアプ ５− 一武 リッジ型でもよく、一般に市販されているものを利用す
ることができる。また、電極間に印加する電圧は、分極
発生を紡ぐため交流電圧（好ましくは０．５ｋＨ２以上
、ｌＶ程度）が望ましい。電極は。
白金、白金黒−白金、ステンレスなどを用いることがで
きる。
きる。
電導度測定セルは、いかなる形状のものも用いることが
できるが、好ましくは第１図に示したものである。ここ
で、ｌは電導度測定用白金電極。
できるが、好ましくは第１図に示したものである。ここ
で、ｌは電導度測定用白金電極。
２はそのリード線、３はセル、４は溶液で満たされた電
導度セル室であり、セル室はシリコンダイヤフラム５な
どにより常に攪拌されている。また。
導度セル室であり、セル室はシリコンダイヤフラム５な
どにより常に攪拌されている。また。
セル室は一定の容積を有し、 ２０〜４０℃の範囲の
一定温度のリン酸緩衝溶液（０，０５〜０．５Ｍ）で満
たされている。
一定温度のリン酸緩衝溶液（０，０５〜０．５Ｍ）で満
たされている。
た状態で固定されている。
Ａ−
固定化ウレアーゼカラムは、酵素活性が十分保持され安
定である限り、この分野で周知のいかなる技術を用いて
固定化したものであってもよい。
定である限り、この分野で周知のいかなる技術を用いて
固定化したものであってもよい。
以下１本発明に基づ〈実施例を図面を参照しながら説明
する。
する。
第３図は本発明の実施例の尿素分析装置を示す系統図で
ある。一定量の試料（２００ｍ１）をシリングを用いて
試料導入部１１（容量約４ｍ１）から注入する。試料は
試料導入部１１中でリン酸緩衝液（０，０１Ｍ 、 ｐ
Ｈ７，０） Ｉ Ｏと混合された後、液送りポンプ１７
により第１電導度検知部１２（セル容量約Ｑ、２ｍ１）
に送られ、さらに固定化ウレアーゼカラム１４ （
１５Ｕ）を通り第２電導度検知部１５（セル容量約０．
２ｍＡ！ ）に運ばれる。緩衝溶の流速は２ｍｌ／１ｕ
ｘに設定しである。第１電導度検知部１２で試料と緩衝
液の混合液（被検試料液）の電導塵を測定する。次に被
検試料液は固定化ウレアーゼカラム１４内に収容されて
いる固定化ウレアーゼの触媒作用ζこより（１）式の反
応生成物を与え１分解生成物を含む被検液の電導塵は第
２電導度検知部１５で測定する。第１および第２電導度
検知部の電導塵の値は、液送り開始１．５分後のものを
用いた。第１検知部１２．第２検知部１５の電導塵はそ
れぞれ測定器１３．１６ で電導塵に対応した電圧値ｌ
こ変換、増幅され、増幅器１９で第２検知部の導電率か
ら第１検知部の導電率を目動的に差し引き、表示器２０
に表示される。
ある。一定量の試料（２００ｍ１）をシリングを用いて
試料導入部１１（容量約４ｍ１）から注入する。試料は
試料導入部１１中でリン酸緩衝液（０，０１Ｍ 、 ｐ
Ｈ７，０） Ｉ Ｏと混合された後、液送りポンプ１７
により第１電導度検知部１２（セル容量約Ｑ、２ｍ１）
に送られ、さらに固定化ウレアーゼカラム１４ （
１５Ｕ）を通り第２電導度検知部１５（セル容量約０．
２ｍＡ！ ）に運ばれる。緩衝溶の流速は２ｍｌ／１ｕ
ｘに設定しである。第１電導度検知部１２で試料と緩衝
液の混合液（被検試料液）の電導塵を測定する。次に被
検試料液は固定化ウレアーゼカラム１４内に収容されて
いる固定化ウレアーゼの触媒作用ζこより（１）式の反
応生成物を与え１分解生成物を含む被検液の電導塵は第
２電導度検知部１５で測定する。第１および第２電導度
検知部の電導塵の値は、液送り開始１．５分後のものを
用いた。第１検知部１２．第２検知部１５の電導塵はそ
れぞれ測定器１３．１６ で電導塵に対応した電圧値ｌ
こ変換、増幅され、増幅器１９で第２検知部の導電率か
ら第１検知部の導電率を目動的に差し引き、表示器２０
に表示される。
Ｍ４図は、上述した操作で血清と尿素標準溶液（２００
ｍｇ／ｄｌ ）から調製した尿素溶液（２２，１，４６
，１゜８６．２ 、１２６ｍｇ／ｄｌ） を２５℃で
測定したもノテあり、表示器２０の出力がどのように変
化するか調べた結果である。出力が尿素濃度に比例する
ことは明らかである。
ｍｇ／ｄｌ ）から調製した尿素溶液（２２，１，４６
，１゜８６．２ 、１２６ｍｇ／ｄｌ） を２５℃で
測定したもノテあり、表示器２０の出力がどのように変
化するか調べた結果である。出力が尿素濃度に比例する
ことは明らかである。
したがって、あらかじめ既知濃度の尿素標準溶液により
尿素濃度と出力との検量線を作成あるいは装置の相対感
度を校正して詔けば、未知濃度の被検液中の尿素を簡単
に決定することができる。
尿素濃度と出力との検量線を作成あるいは装置の相対感
度を校正して詔けば、未知濃度の被検液中の尿素を簡単
に決定することができる。
さらに、第１電導度検知部１２．固定化ウレアーゼカラ
ム１４．第２電導度検知部１５は、液送りポンプ１７を
用いて緩衝液１０を電磁弁２１を介して供給することに
より自動的に洗浄することができ、新たな試料を試料導
入部１１に注入することにより連続測定ができる。
ム１４．第２電導度検知部１５は、液送りポンプ１７を
用いて緩衝液１０を電磁弁２１を介して供給することに
より自動的に洗浄することができ、新たな試料を試料導
入部１１に注入することにより連続測定ができる。
第５図は、第３図の系統図の変形例を示すもので、第３
図と異なる点は、第１電導度検知部１２゜第２電導度検
知部１５の導電率測定部１３．１６ にそれぞれホール
ド回路１３’１１６１を付加した点で、この結果、第１
電導度検知部１２と第２電導度検知部１５の導電率測定
を異なる時間で行なうことが可能となり、測定時間を短
縮することができる。
図と異なる点は、第１電導度検知部１２゜第２電導度検
知部１５の導電率測定部１３．１６ にそれぞれホール
ド回路１３’１１６１を付加した点で、この結果、第１
電導度検知部１２と第２電導度検知部１５の導電率測定
を異なる時間で行なうことが可能となり、測定時間を短
縮することができる。
この発明によれば、尿素を特異的ｌこ加水分解する酵素
ウレアーゼを固定化して用いたため、他の妨害物質の影
響を受けずに、かつ安価に尿素を定量できる。また固定
化酵素と電導度法を組み合せて測定する方法を採用して
いるため、簡便に試料を注入するだけで定量が行なえる
。また有害あるいは不安定な試薬は必要とせずに定量で
きるようになった。
ウレアーゼを固定化して用いたため、他の妨害物質の影
響を受けずに、かつ安価に尿素を定量できる。また固定
化酵素と電導度法を組み合せて測定する方法を採用して
いるため、簡便に試料を注入するだけで定量が行なえる
。また有害あるいは不安定な試薬は必要とせずに定量で
きるようになった。
この発明は、いままで説明した尿素の分析の他に、
９−
Ａ−一−−−→Ｂ十尿索
のように、尿素を生成する物質Ａの分析にも応用できる
と思われる。さらには、臨床検査分野のみならず環境計
測、プロセス計測の分野にも適用できる。
と思われる。さらには、臨床検査分野のみならず環境計
測、プロセス計測の分野にも適用できる。
第１図は電導塵検知部の構造を示す上面図、第２図は電
導度測定用白金電極の構造を示す横断面図、第３図は本
発明一実施例の系統図、第４図は表示器の出力と試料中
の尿素濃度の関係を示す線図、第５図は本発明の他の実
施例の系統図である。 １・・・電導度測定用白金電極、１０・・・緩衝液供給
部、１１・・・試料導入部、１２・・・第１電導度検知
部。 １４・・・固定化ウレアーゼカラム、１５・・・第２電
導度検知部、１９・・・増幅器、２０・・表示器。 １０−
導度測定用白金電極の構造を示す横断面図、第３図は本
発明一実施例の系統図、第４図は表示器の出力と試料中
の尿素濃度の関係を示す線図、第５図は本発明の他の実
施例の系統図である。 １・・・電導度測定用白金電極、１０・・・緩衝液供給
部、１１・・・試料導入部、１２・・・第１電導度検知
部。 １４・・・固定化ウレアーゼカラム、１５・・・第２電
導度検知部、１９・・・増幅器、２０・・表示器。 １０−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）試料中に含まれる尿素の分析において、２個の電導
度検知部と固定化ウレアーゼカラムを、上流側より第１
電導度検知部、固定化ウレアーゼカラム、第２電導度検
知部と設置し、第１電導度検知部で試料さ緩衝液の混合
物の導電率を測定し。 第２電導度検知部で固定化ウレアーゼカラムの反応生成
物を含む流出液の導電率を測定し、第２電導度検知部と
第１電導度検知部で得られた出力信号の差から尿素量を
測定することを特徴とする固定化酵素カラムを用いた尿
素分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21992282A JPS59109198A (ja) | 1982-12-15 | 1982-12-15 | 固定化酵素カラムを用いた尿素分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21992282A JPS59109198A (ja) | 1982-12-15 | 1982-12-15 | 固定化酵素カラムを用いた尿素分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59109198A true JPS59109198A (ja) | 1984-06-23 |
Family
ID=16743118
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21992282A Pending JPS59109198A (ja) | 1982-12-15 | 1982-12-15 | 固定化酵素カラムを用いた尿素分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59109198A (ja) |
-
1982
- 1982-12-15 JP JP21992282A patent/JPS59109198A/ja active Pending
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