JPS5894385A - 細胞融合方法および細胞融合用試薬 - Google Patents
細胞融合方法および細胞融合用試薬Info
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- JPS5894385A JPS5894385A JP19066181A JP19066181A JPS5894385A JP S5894385 A JPS5894385 A JP S5894385A JP 19066181 A JP19066181 A JP 19066181A JP 19066181 A JP19066181 A JP 19066181A JP S5894385 A JPS5894385 A JP S5894385A
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- fusion
- cells
- polyethylene glycol
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、咄乳動物の体内に存在する有核正常細胞と咄
乳動物由来の癌細胞味との細胞融合に際して、細胞融合
を促進する方法ならびに融合用試薬に関する。
乳動物由来の癌細胞味との細胞融合に際して、細胞融合
を促進する方法ならびに融合用試薬に関する。
近年、細胞融合の研究は飛躍的に進展しており、免疫学
の分野にも応用され多大の成果を上げている。代表的な
研究成果としては、マウスの抗体産生細胞とマウスの骨
髄腫細胞とを融合させることにより、抗原特異性の明ら
かなモノクロナール抗体を分泌する融合細胞を作製する
ことが可能となった。この方法を用いることにより、今
までの動物免疫では得ることの難しかった抗体も得るこ
とができるようになった。また融合細胞は無限の増殖能
力を有し、凍結保存も可能であるために、常に求める抗
体を得ることができるという利点を有している。
の分野にも応用され多大の成果を上げている。代表的な
研究成果としては、マウスの抗体産生細胞とマウスの骨
髄腫細胞とを融合させることにより、抗原特異性の明ら
かなモノクロナール抗体を分泌する融合細胞を作製する
ことが可能となった。この方法を用いることにより、今
までの動物免疫では得ることの難しかった抗体も得るこ
とができるようになった。また融合細胞は無限の増殖能
力を有し、凍結保存も可能であるために、常に求める抗
体を得ることができるという利点を有している。
細胞融合において、細胞を融合させる方法には大別して
、次の二つの方法がある。
、次の二つの方法がある。
ｔｌ＋センダイウィルス等の細胞融合能を有するウィル
スを用いる方法。
スを用いる方法。
（２１ポリエチレングリコール等の水溶性ポリマーを融
合剤として用いる方法。
合剤として用いる方法。
この二つの方法のうち、後者の方法がより一般で簡便な
方法として広く用いられている。
方法として広く用いられている。
本発明者らは、細胞融合を支配する要因を種々解析し、
高い効率細胞融合を行ｔなうことを目的として極々の検
討を行なった結果、意外にもポリエチレングリコールを
含む溶液の１１度およびｐＨを選択することにより、非
常に効率よく細胞融合を行なえる条件が存在することを
見い出し、本発明を完成するに至った。
高い効率細胞融合を行ｔなうことを目的として極々の検
討を行なった結果、意外にもポリエチレングリコールを
含む溶液の１１度およびｐＨを選択することにより、非
常に効率よく細胞融合を行なえる条件が存在することを
見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、哺乳動物の体内に存在する有核細
胞と癌細胞様との細胞融合に際し、３０〜５０％のポリ
エチレングリコールを含みｐＨ８，０〜８．５に調整し
た細胞融合試薬を用いることによる細胞融合方法および
該融合用試薬である。
胞と癌細胞様との細胞融合に際し、３０〜５０％のポリ
エチレングリコールを含みｐＨ８，０〜８．５に調整し
た細胞融合試薬を用いることによる細胞融合方法および
該融合用試薬である。
鴫乳動物の体内に存在する有核細胞とは、血液細胞、リ
ンパ系細胞、内臓を禍成する細胞などが含まれ、癌細胞
様とは、培養系で無限増殖能を有する細胞であり、細胞
融合に用いるに際しては、８−アザグアニン耐性、５−
ブロモデオキシウリジン耐性等の酵素欠損変異株の使用
が望ましい。
ンパ系細胞、内臓を禍成する細胞などが含まれ、癌細胞
様とは、培養系で無限増殖能を有する細胞であり、細胞
融合に用いるに際しては、８−アザグアニン耐性、５−
ブロモデオキシウリジン耐性等の酵素欠損変異株の使用
が望ましい。
たとえば、このような酵素欠損変異株には、マウス骨髄
肺細胞、マウスリンパ肺細胞、ヒト骨髄腫細胞、ヒ）
リンパ肺細胞などがある。細胞間の組合せとしては、異
種動物、同軸動物を問わないが、通常は同極動物の細胞
間の融合が正常細胞の形質を癌細胞に移入する目的には
好ましい。
肺細胞、マウスリンパ肺細胞、ヒト骨髄腫細胞、ヒ）
リンパ肺細胞などがある。細胞間の組合せとしては、異
種動物、同軸動物を問わないが、通常は同極動物の細胞
間の融合が正常細胞の形質を癌細胞に移入する目的には
好ましい。
特異抗体の産生を目的とする場合には、マウス、ラット
、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、七ニド、ウマ、
ウシ等の抗体産生細胞と、！Ａ８１もしくは同種動物、
より好ましくは同系動物の骨髄腫、リンパ肺等の癌細胞
との融合に、本発明の融合試薬は適している。ポリエチ
レングリコールを溶解せしめる液は、りン戯緩衝化生理
食塩水、ハンクス処方平衡塩液、その他種々の平衡塩液
のいずれも用いられる。ポリエチレングリコールの平均
分子蓋は、１０００〜６ｏｏｕ程度までいずれも用いら
れるが、低分子量のものは細胞毒性が強く、高分子量の
ものは溶解性が低く、いずれも融合試薬としては不適で
ある。平均分子蓋２ＵＯＬ１〜４０口０がより好ましい
範囲である。
、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、七ニド、ウマ、
ウシ等の抗体産生細胞と、！Ａ８１もしくは同種動物、
より好ましくは同系動物の骨髄腫、リンパ肺等の癌細胞
との融合に、本発明の融合試薬は適している。ポリエチ
レングリコールを溶解せしめる液は、りン戯緩衝化生理
食塩水、ハンクス処方平衡塩液、その他種々の平衡塩液
のいずれも用いられる。ポリエチレングリコールの平均
分子蓋は、１０００〜６ｏｏｕ程度までいずれも用いら
れるが、低分子量のものは細胞毒性が強く、高分子量の
ものは溶解性が低く、いずれも融合試薬としては不適で
ある。平均分子蓋２ＵＯＬ１〜４０口０がより好ましい
範囲である。
ポリエチレングリコールの１１２は、３０〜５５チの範
囲のものが用いられる。３０％未満のものは効果的な融
合効果が得られず、５５％を超えるｌｌ１１度のものは
、細胞毒性が高く用いられない。
囲のものが用いられる。３０％未満のものは効果的な融
合効果が得られず、５５％を超えるｌｌ１１度のものは
、細胞毒性が高く用いられない。
ポリエチレングリコール溶液のｐＨは、炭酸水素ナトリ
ウム飽和水溶液を適宜加えることにより調整し、ｐＨ８
，０を超えてｐ Ｈ８，５以下の範囲が用いられる。ｐ
Ｈ８，０以下で実施する方法はよく用いられるが、細
胞に対する毒性は低いものの融合は効果的に進行せず、
８．５を超えるｐＨでは細胞は急速に死滅してしまう。
ウム飽和水溶液を適宜加えることにより調整し、ｐＨ８
，０を超えてｐ Ｈ８，５以下の範囲が用いられる。ｐ
Ｈ８，０以下で実施する方法はよく用いられるが、細
胞に対する毒性は低いものの融合は効果的に進行せず、
８．５を超えるｐＨでは細胞は急速に死滅してしまう。
本発明における融合試薬の用い方は、以下の方法による
。
。
培地中に分散混合状態にある有核正常細胞と癌細胞様を
遠心処理および平衡塩液による洗浄操作を施し、培地の
蛋白成分を十分に取除き、細胞総数１０７個あたり０．
１〜０．２−量の融合試薬を徐々に滴下混和し、２０〜
３９Ｃの条件下で１〜５０分間放置する。その後、遠心
処理および平衡塩液もしくは蛋白質を含まない培地によ
る洗浄操作により１、ポリエチレングリコール−を十分
に除去する。
遠心処理および平衡塩液による洗浄操作を施し、培地の
蛋白成分を十分に取除き、細胞総数１０７個あたり０．
１〜０．２−量の融合試薬を徐々に滴下混和し、２０〜
３９Ｃの条件下で１〜５０分間放置する。その後、遠心
処理および平衡塩液もしくは蛋白質を含まない培地によ
る洗浄操作により１、ポリエチレングリコール−を十分
に除去する。
さらに、この細胞をアミノプテリン４ Ｘ １０−’〜
４Ｘ１０−’Ｍ、チミジン１．’６ Ｘ １０’″″Ｓ
Ｍ１ ヒポキサンチンｌＸ１０′−４Ｍを含むＨＡＴ培
地中で７〜１５日間培養することにより、融合細胞を選
別することができる。
４Ｘ１０−’Ｍ、チミジン１．’６ Ｘ １０’″″Ｓ
Ｍ１ ヒポキサンチンｌＸ１０′−４Ｍを含むＨＡＴ培
地中で７〜１５日間培養することにより、融合細胞を選
別することができる。
以上の方法により、効果的に融合細胞を獲得することが
できる。
できる。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１
マウス肺臓細胞とマウス骨髄肺細胞との細胞融合を行っ
た。以下に細胞融合の条件と手順を記載する。
た。以下に細胞融合の条件と手順を記載する。
融合試薬の調製
ハンクス処方平衡塩液２．８艷に、平均分子量２０００
のポリエチレングリコール２ｆを溶解せしめ、４５チポ
リエチレングリコール液となした。
のポリエチレングリコール２ｆを溶解せしめ、４５チポ
リエチレングリコール液となした。
さらに、この溶液に炭酸水素ナトリウム飽和水溶液を適
宜加え、ｐＨを８．１に調整し、３７Ｃで保温した。
宜加え、ｐＨを８．１に調整し、３７Ｃで保温した。
マウス肺臓細胞の調製
マウスの肺臓を無菌的に取り出し、１００メツシユの金
網を用いて肺臓細胞を採取した。さらに、この時混入し
てくる赤血球をトリス−塩化アンモニウム溶血液を用い
て溶血せしめた後、肺臓細胞をハンクス処方平衡塩液で
十分に遠心処理により洗浄した。
網を用いて肺臓細胞を採取した。さらに、この時混入し
てくる赤血球をトリス−塩化アンモニウム溶血液を用い
て溶血せしめた後、肺臓細胞をハンクス処方平衡塩液で
十分に遠心処理により洗浄した。
マウス骨髄腫の調製
マウス骨髄腫細胞はマウスＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃ由来で、
８−アザグアニン耐性株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−
ＵＩを用いた。この骨髄肺細胞も、ノ・ンクス処方平衡
塩液で十分に洗浄し、蛋白質成分を取り除いた。
８−アザグアニン耐性株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−
ＵＩを用いた。この骨髄肺細胞も、ノ・ンクス処方平衡
塩液で十分に洗浄し、蛋白質成分を取り除いた。
ＨＡＴ培地の調製
ＲＰＭ１１６４０培地に１５％の牛胎児血清を含み、さ
らに、アミノプテリン４×１０Ｍ１チミジン１．６ Ｘ
Ｉ Ｕ−’Ｍ 、ヒボキサンチンｌＸ１０”’Ｍ宝含
む培地を調製した。
らに、アミノプテリン４×１０Ｍ１チミジン１．６ Ｘ
Ｉ Ｕ−’Ｍ 、ヒボキサンチンｌＸ１０”’Ｍ宝含
む培地を調製した。
以主によって調製したマウス肺臓細胞ｌＸ１０”個とマ
ウス骨髄肺細胞３Ｘ１０’個を混、合し、遠心後、上清
を取り除きペレット状にした。ここに先に調製したホリ
エチレングリコール液１．５−を徐々に滴下混和９，３
．７７：の条件下で１分間放置後、ハンクス処方平衡塩
液を２０ゴ徐々に加え混和した後、遠心処理しポリエチ
レングリコールを除去し九。次に残った細胞にＨＡＴ培
地を８０−加え混和した後、９６大の細胞培養用グレー
ト４枚に、この細胞を含むＨＡＴ培地をまき、１０日間
炭酸ガス培養器にて培養した。
ウス骨髄肺細胞３Ｘ１０’個を混、合し、遠心後、上清
を取り除きペレット状にした。ここに先に調製したホリ
エチレングリコール液１．５−を徐々に滴下混和９，３
．７７：の条件下で１分間放置後、ハンクス処方平衡塩
液を２０ゴ徐々に加え混和した後、遠心処理しポリエチ
レングリコールを除去し九。次に残った細胞にＨＡＴ培
地を８０−加え混和した後、９６大の細胞培養用グレー
ト４枚に、この細胞を含むＨＡＴ培地をまき、１０日間
炭酸ガス培養器にて培養した。
１０日後に増殖してきた融合細胞のコ−二一の数と、融
合に用いたマウス骨髄腫細胞の数から、下に示す＋ｌｉ
式にしたがい細胞融合の効率を判定した。その結果を表
１に示す。
合に用いたマウス骨髄腫細胞の数から、下に示す＋ｌｉ
式にしたがい細胞融合の効率を判定した。その結果を表
１に示す。
・・・・・・・・・１１１
実施例２
マウス肺臓細胞とマウス骨髄腫細胞との細胞融合を行っ
た。融合試薬の組成は実施例１と同じで、ｐＨを８．２
に調整した。その他、細胞株、細胞数、融合条件、手順
は実施例１に同じである。融合効率を表１に示す。
た。融合試薬の組成は実施例１と同じで、ｐＨを８．２
に調整した。その他、細胞株、細胞数、融合条件、手順
は実施例１に同じである。融合効率を表１に示す。
実施例３
マウス肺臓細胞とマウス骨髄肺細胞との細胞融合を行っ
た。融合試薬の組成は実施例１と同じであるが、ｐＨを
８．５に調整した。その他、細胞種、細胞数、融合条件
、手順は実施例１に同じである。
た。融合試薬の組成は実施例１と同じであるが、ｐＨを
８．５に調整した。その他、細胞種、細胞数、融合条件
、手順は実施例１に同じである。
融合効率を表１に示す。
比較例１
マウス肺臓細胞とマウス骨髄腫細胞との細胞融合を行っ
た。融合試薬の組成は実施例１と同じであるが、ｐＨを
７．４にｆＡ整した。その他、細胞種、細胞数、融合条
件、手順は実施例１に同じである。
た。融合試薬の組成は実施例１と同じであるが、ｐＨを
７．４にｆＡ整した。その他、細胞種、細胞数、融合条
件、手順は実施例１に同じである。
融合効率を表１に示す。
比較例２
マウス肺臓細胞とマウス骨髄腫細胞との細胞融合を行っ
た。融合試薬の組成は実施例１と同じであるが、ｐＨ１
９，０に調整した。その他、細胞株、細胞数、融合条件
、手順は実施例１に同じである。
た。融合試薬の組成は実施例１と同じであるが、ｐＨ１
９，０に調整した。その他、細胞株、細胞数、融合条件
、手順は実施例１に同じである。
融合効率を表１に示す。
実施例４
ヒト末梢血リンパ球とヒト骨髄腫細胞との細胞−６を行
った。
った。
ヒト末梢血リンパ球の調製
ヒト末梢血より、フィコールコンレイ法によシリンパ球
を分離し、ハンクス処方平衡塩液で十分に洗浄する。
を分離し、ハンクス処方平衡塩液で十分に洗浄する。
ヒト骨髄腫細胞の調製
ヒト骨髄腫細胞は、ヒト由来で８−アザグアニン耐性骨
髄腫細胞株であるＵ−２６６を用いた。
髄腫細胞株であるＵ−２６６を用いた。
ハンクス処方平衡塩液で十分に洗浄し、蛋白成分を取り
除いて用いた。
除いて用いた。
ＨＡＴ培地の調製
アマノプテリン濃度をｌＸ１１’Ｍとし、その他の組成
は実施例１と同じである。
は実施例１と同じである。
融合試薬の調製
ハンクス平衡塩液中、３５チポリエチレングリコール液
となし、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液でｐＨ８，２に
調整する。
となし、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液でｐＨ８，２に
調整する。
以上によって調製されたヒト末梢血リンパ球、２ Ｘ
１０’個とヒト骨髄細胞腫２ Ｘ １０’個を混合し、
融合条件、手順は実施例１にしたがって融合した。
１０’個とヒト骨髄細胞腫２ Ｘ １０’個を混合し、
融合条件、手順は実施例１にしたがって融合した。
融合後、細胞はＨＡＴ培地４０ｍに混和し、９６穴グレ
一ト２枚にまき、１５日間炭酸ガス培養器で培養した。
一ト２枚にまき、１５日間炭酸ガス培養器で培養した。
融合効率を表１に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ｉｌｌ Ｍ乳動物の体内に存在する有核正常細胞と哺
乳動物由来の癌細胞味との細胞融合に際して、３０〜５
５％のポリエチレングリコールを含みｐＨ８，０〜８．
５ Ｋ調整した融合試薬を用いることを特徴とする細胞
融合方法。 （２）咄乳動物の体内に存在する有核正常細胞と哺乳動
物由来の癌細胞味との細胞融合の友めの試薬であって、
３０〜５５％のポリエチレングリコールを含みｐＨ８，
０〜８．５に調整せしめた細胞融合用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19066181A JPS5894385A (ja) | 1981-11-30 | 1981-11-30 | 細胞融合方法および細胞融合用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19066181A JPS5894385A (ja) | 1981-11-30 | 1981-11-30 | 細胞融合方法および細胞融合用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5894385A true JPS5894385A (ja) | 1983-06-04 |
Family
ID=16261795
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19066181A Pending JPS5894385A (ja) | 1981-11-30 | 1981-11-30 | 細胞融合方法および細胞融合用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5894385A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985002411A1 (en) * | 1983-11-25 | 1985-06-06 | The University Of Melbourne | Cell line and monoclonal antibody |
| JPS60172934A (ja) * | 1984-02-17 | 1985-09-06 | Kachiku Eisei Shikenjo | 免疫グロブリンの製造法 |
| JP2006296364A (ja) * | 2005-04-25 | 2006-11-02 | Kanazawa Univ | がん幹細胞の作成方法 |
-
1981
- 1981-11-30 JP JP19066181A patent/JPS5894385A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985002411A1 (en) * | 1983-11-25 | 1985-06-06 | The University Of Melbourne | Cell line and monoclonal antibody |
| JPS60172934A (ja) * | 1984-02-17 | 1985-09-06 | Kachiku Eisei Shikenjo | 免疫グロブリンの製造法 |
| JP2006296364A (ja) * | 2005-04-25 | 2006-11-02 | Kanazawa Univ | がん幹細胞の作成方法 |
| WO2006115243A1 (ja) * | 2005-04-25 | 2006-11-02 | National University Corporation Kanazawa University | がん幹細胞の作成方法 |
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