JPS58501008A - ビタミンｂ↓１↓２又は葉酸化合物測定用試料の調製用組成物及び調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 の調製、並びに測定 発明の背景 発明の分野 るための方法及び材料に関し、さらに測定に関する。

さらに詳しくはビタミンＢ、２（コバラミン）及び／又は葉酸化合物（葉酸）を 測定するためのヒト血清を調製するための方法及び材料に関する。

先行技術 以前から、ヒトのビタミンＢ１□の測定は、ビタミンＢ１゜の欠乏を引き起こす ある種の病気、例えば悪性貧血、胃切除術後の症状、栄養失調、腸障害、及び／ 又はビタミンＢ１２の血中レベルがしばしば低下する他の症状を診断し、それに 続いて治療するための有用な技法であると認められている。ヒトにおけるビタミ ンＢ１□の測定はさらに、ある種の骨髄増殖疾患、例えばビタミンＢ１゜の血中 レベルがしばしば上昇する慢性骨髄性白血病の診断にも有用である。

れかを用いて、微生物学的測定法により測定されていた。さらに最近では、ビタ ミンＢ、２の放射性同位元素希釈（ＲＩＤ）測定法が使用されている。このビタ ミンＢ、２の放射性同位元素希釈測定法は文献によく記載されている〔例えばラ オ（Ｌ４ｕ　）等（１９６５’）ｒＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｓｅｒｕｍ 　Ｂ１２　Ｌｅｖｅｌｓ　ＵｓｉｎｇＲａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ　Ｄｉｌｕｔｉ ｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏａｔｅｄ　ＣｈａｒｃｏａｌＪＢＬＯＯＤ、２６，２０２； ラペン（、Ｒａｖｅｎ）等（１９６８）　ｒＴｈｅＥｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｙａ ｎｉｄｅ　Ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　０ｔｈｅｒ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｎｔｈｅ　Ａ ｓ５ａｙ　ｏｆ　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｂ１２　ｂｙ　Ｒａｄｉｏ−Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｍｅｔｈｏｄ　Ｕｓｌｎｇ　Ｃｏ−Ｂ１２．　Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　Ｆａｃｔｏ ｒ　ＡｎｄＣｏａｔｅｄ　Ｃｈａｒｃｏａｌ　Ｊ　ＧＵＹＳ　ＨＯ８ＰＩＴＡＬ 　ＲＥＰＯＲＴＳ、１１７．８９に記載された上記の変法；及び（１９６９）ｒ 　ＩｍｐｒｏｖｅｄＭｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｖｉｔａｍｉ ｎ　Ｂ１２　ｉｎ　ＳｅｒｕｍＵｓｉｎｇ　Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ ＋　Ｃｏ−Ｂ１２ａｎｄ　Ｃｏａｔ＠ｄＣｈａｒｃｏａｌ　Ｊ　ＪＯＵＮＡＬ　 ＯＦ　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ、　２２．２０５：を参照のこと ）。さらに最近においては測定に使用される結合蛋白質（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒ ｏｔｅｉｎ）がビタミンＢ１□に特異的でない場合に、例えば純粋な固有因子（ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）　、又はビタミンＢ、２に非特異的な結合 蛋白質を除去し又は不活性化するために処理された結合蛋白質でない場合に、放 射性同位元素希釈測定法により測定される見かけ上のビタミンＢ１２レベルに、 間違りて寄与するビタミンＢ１２類似体の存在が見出されている（アレン（Ａｌ ｌｅｎ）の米国特許第４，１８８，１８９号：１９７９年８月２４日にアレンに より出願された米国特許出願第０６９，２５７号；及びコールハウス（Ｋｏ　１ 　ｈ　ｏ　ｕ　ｓ　ｅ　）等（１９７８）　ｒｃｏｂａｌａｍｉｎａｎａｌｏｇ ｕｅｓ　ａｒｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　ｃ ａｎ７８４；を参照のこと）。

このような先行技術の発展を考慮して、最近における放射性同位元素希釈法によ るビタミンＢ１２の測定においては、例えばコールハウス等が教唆する方法に従 って、試験すべき血清試料を加熱又は煮沸することによシ内因性（ｅｎｄｏｇｅ ｎｏｕｓ）天然結合蛋白質から内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　）ビタミンＢ１ ２を遊離する段階、並びに、非特異的結合蛋白質を除去又は不活性化した一定量 の固有因子結合蛋白質、及びそれのみで固有因子のすべてと結合するのに適当な 既知量の放射性ビタミンＢ１２、例えば５７Ｃｏ−Ｂ１２を加える段階を含める 。こうして、加えた固有因子結合蛋白質のすべてが測定すべき試料中に存在する ビタミンＢ１２及び反応組成に加えた放射性ビタミンＢ、２のいずれかと結合す る。反応において、天然ビタミンＢ１２と放射性ビタミン”１２の両者が動的に 競争しながら限定された量の固有因子結合蛋白質と結合するので、固有因子蛋白 質に結合したビタミンＢ１□の放射性カウントが阻害され又は減少した程度によ り被験試料中に存在する天然ビタミンＢ１２の量が示される。例えば未結合放射 性ビタミンＢ、２を吸着する蛋白質を被覆した木炭を使用して、例えば固有因子 蛋白質に結合したビタミンＢ１□から未結合ビタミンＢ１□のすべてを分離する ことによシ、放射性ビタミンＢ、２と固有因子との結合の阻害を測定する。そし て１、固有因子に結合した放射性ビタミンＢ１２及び固有因子に結合した非放射 性ビタミンＢ１２を含有する上澄液の放射能を測定する。そして、被験試料中の ビタミンＢ１２の濃度を、当業界において良く知られている技法を使用して、カ ウントを標準チャートと比較することによ請求める。

葉酸（ｆｏｌａｔｅ）の測定は、放射性葉酸及び前記°と同じ目的の葉酸結合剤 を使用する点を除き、前記の方法と非常に類似している。

すでに記載したごとく、前記のビタミンＢ、２測定の結果は、しばしば、他の測 定技法、例えば微生物学的測定法によって得られる結果と一致しないことがコー ルハウス等によシ認められている。放射性同位元素希釈測定法にょシ得られるビ タミンＢ１２の測定値が高く出ることが非常に多いい。多くの先行技術に係るビ タミンＢ、２の測定値が試料中に実際に存在するビタミンＢ、２の量よシ高いの は、コールハウス等によシ確立されたごとく、哺乳動物の血液及び組織中に、先 行技術に係るＲＩＤ測定法において使用される非特異的蛋白質結合剤と反応する ビタミンＢ１２類似化合物が存在するためである。コールハウス等により、先行 技術の結合蛋白質のほとんどの部分に、ビタミンＢ、２に特異的でなくビタミン Ｂ、２類似体と結合し得る結合蛋白質が実質的な責合まれていることが確認され た後、アレンにより正確化する技・法が開発された。アレンの研究の結果、今日 性われている正確なＲＩＤ測定法に・おいては、非特異的な結合蛋白質を除去又 は不活性化し、その結果結合反応においてビタミンＢ１２に対してのみ特異的で あってビタミンＢ１□□類似体と結合し得ない純粋な又は純化した固有因子結合 蛋白質・のみが使用される。

葉酸のＲＩＤ測定においては、葉酸類似体牟に関する同様な問題及び非特異□的 葉酸結合剤に関する同様な問題は非常に少ないが、結合蛋白質として固有因子の みを使用する改良された特異的ビタ゛ミンＢ１２ＲＩＤ測定法、及び葉酸測定法 においてもなお、被験試料中のビタミンＢ、２及び／又は葉酸を内生結合蛋白質 から遊離せしめるために加熱（又□は煮沸）を必要とする。この加熱段階は制御 が困難であり、めんどうであり、そして試験管を取扱い、キャップを付け、そし てキャップを取り外すのに時間を要し、この加熱段階のために試料の加熱が避け られない。

最近、試料を化学的に変性せしめる方法によって、煮沸することなく内因性結合 蛋白質からビタミンＢ１□を遊離せしめることが報告されている。イタキシオス （Ｉｔｈａｋｉｓｓｉｏａ）等（１９８０）は、「ＲｏｏｍＴｅｍｐｅｒａｔｕ ｒｅ　Ｒａｄｉｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｂ１２ｗ１ｔｈ　０ｙｓｔｅｒＴｏａｄ ｆｉｓｈ　（Ｏｐａａｎｕｓ　ｔａｕ）　ｓｅｒｕｍ　ａｓ　ｂｉｎｄｅｒＪｃ ＬＩＮＩｃＡＬＣＨＥＭＩ　５ＴＲＹ　、　２６　、３２３において、ＫＣＮの 存在下でＮａＯＨを使用して−を１３．６にすればビタミンＢ１□の遊離は９８ チよシ多くなシ、ヒト血清アルブミンに替えてフィコール（Ｆｉｃｏｌ）を使用 すれば遊離が１００チに達すると報告している。ここでは２〜１２の範囲におけ る一環境での蛋白質からビタミンＢ１２の遊離について検討されている。イタキ シオス等は、被験試料中の内因性結合蛋白質の遊離の影響については検討してお らず、又若干の試料においては轟然に存在するであろう内因性結合蛋白質又は固 有因子遮断抗体が異状に多量に存在する場合に生ずるであろう潜在的問題を認識 していない。ＲＩＡプロダクツ社、ワルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マス（Ｍａ　 ｓ　ａ　）からの１９８０年１０月付市販キットのラベルｒＮｏ−Ｂｏｉｌ　Ｃ ｏｍｂｏｓｔａｔ　Ｔ＊ＭＫｉｔ　ｆｏｒ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｒａｄ ｉｏａｓｓａｙ　ｏｆ　ＦｏＬＡＴＥ　ａｎｄＶＩＴＡＭＩＮ　Ｂ１２Ｊが最近 、葉酸及びビタミン”１２の両者を分析するための非煮沸技法において、０．０ １％ＫＣＮ及びジチオスレイトールの存在下における変性剤としてのＮａＯＨの 使用を開示するもＱとして注目されている。ここでは未破壊内因性結合蛋白質の ビタミンＢ１２測定に対する影響については検討されておらず、又若干の試料中 に存在する内因子結合蛋白質又は固有因子遮断抗体が多量に存在する場合に生ず るなんらかの潜−狂的問題は認識されていない。

同様に、カリフォルニア・ロスアンゼルスのジアグノスチックプロダクツ（Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）社製市販キットの日付の無いラベルｒＮ ｏ−Ｂｏ　ｉ　Ｉ　ＤｕａｌｃｏｕｎｔビタミンＢ１□及び葉酸用ラジオアッセ イ」も又、葉酸及びビタミンＢ１２の両者を分析するだめの他の非煮沸技法にお けるＮａＯＨ、ＫＣＮ及びジチオスレイトールの使用を開示するものとして注目 された。この場合にも、未破壊結合蛋白質、又は固有因子遮断抗体もしくは多量 の内因性結合蛋白質の存在について、検討されておらず、又認識されていない。

それぞれの先行技術において、ＫＣＮは通常第一に試料中のビタミンＢ１２をそ の最も安定な形であるジアノコバラミンに変換するために加えられる。同様に、 葉酸測定中の葉酸を安定化する手段として、葉酸測定及び従って又ビタミンＢ１ ２−葉酸測定において通常ジチオスレイトールが使用される。

最近になって、最良に保証されたＲＩＤビタミンｎ、２−葉酸測定技法がマサチ ニーセッッ、メジフィールド、コーニング社から、１９８０年１２月から提供さ れるようになった。（血清、血漿及び赤血球細胞中のビタミンＢ１２及び葉酸を 同時測定するための）［Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｂ１２〔Ｃｏ）　／Ｆｏｌａｔｅ　［ １２５Ｉ：］　ＲａｄｉｏａｓｓａｙＪＩｍｍｏｐｈａｓｅ　（登録商標）０こ のキットと試験の資料及び正確さはいずれの公知の先行技術にも優る。

発明の詳細な説明 すでに述べたごとく、ビタミンＢ１２及び／又は葉酸の最も標準的な先行技術の 放射性同位元素希釈測定法において、内因性結合蛋白質からビタミンＢ１□及び ／又は葉酸を分離するために被験試料の加熱又は煮沸が行われる。最新の技法に おいては、前記の分離は、煮沸を行うことなく、強塩基を用いて、且つその他の 薬品を用いて又は用いないで行われる。

そして、既知量の放射性ビタミンＢ、２及び／又は放射性葉酸が調製された被験 試料と混合され、そして、天然のビタミンＢ１２及び放射性ビタミンＢ１□と結 合し得る（但しビタミンＢ１□類似体とは反応することができない）特異的結合 蛋白質及び／又は葉酸結合剤が混合物に加えられる。次に、公知の方法を用いて 、結合した試料の放射能を、例えば標準曲線と比較することにより、被験試料中 に存在する天然ビタミンＢ１□又は葉酸の量を決定する。

今や、この発明の教唆に従って、ＲＩＤ測定法を単純化し、改良し、そして多く の場合測定に出立って被験試料を加熱又は煮沸する段階を省略することによりさ らに正確にすることができることが見出された。この測定は次の組成物及び手法 を用いることからなる。

（１）加熱又は煮沸をすることなくすべてのビタミンＢ１゜及び／又は葉酸を内 因性結合蛋白質から実質上完全に遊離せしめる。

（２）被験試料中に存在し、天然ビタミンＢ１２及び放射性ビタミンＢ１２又は 葉酸に結合するであろう内因性結合蛋白質を原試料中のビタミンＢ１２又は葉酸 から遊離せしめ、又は原試料中に結合しないで存在せしめて、これを実質上完全 に破壊する。

（３）　若干の未破壊結合蛋白質を実質上完全に阻害し又は遮断する。そして、 （４）被験試料中に存在する可能性のある若干の固有因子遮断抗体を実質上完全 に阻害し又は破壊する。

非煮沸試験において前記の方法を考慮しそして実行することを怠れば、以下にの べるごとくビタミンＢ１２及び／又は葉酸のＲＩＤ測定において誤差が生ずるで あろう。

この方法は、加熱又は煮沸することなく試験すべきビタミンＢ１□及び／又は葉 酸試料を、加熱又は煮沸することなく、ビタミンＢ、２及び／又は葉酸を内因性 結合蛋白質から実質上完全に遊離せしめる組成物及び方法によシ処理し、試料中 にビタミンＢ１２及び／又は葉酸から遊離して存在し又はその他の状態で存在す る内因性結合蛋白質の実質上すべてを実質上完全に破壊し、破壊されなかった内 因性結合蛋白質を実質的に阻害又は遮断し、そして被験試料中に存在する実質上 すべての固有因子遮断抗体を阻害し又は破壊することによシ達成される。さらに 詳しくは、次の結果を供する成分と方法との組合わせが教唆される。

すでに述べたごとく、加熱又は煮沸しないで被験試料からビタミンＢ１□及び葉 酸を遊離させる多くの技法が公に知られ使用されている。しかしながらこの発明 は、明らかに知られておらずもしくは理解されておらず、又は他のＲＩＤ非加熱 法により無視されていた事実の認識に基礎を置いている。すなわち、（１）　ビ タミンＢ、２を正確に測定するためには、被験試料からのビタミンＢ１□及び／ 又は葉酸の最適な遊離が達成されなければならない。

（２）煮沸によれば、被験試料中でビタミンＢ１□がら遊離して存在しても又は 他の形態で存在していても、内因性結合蛋白質を見かけ上実質的に破壊すること ができるが、最近公表された非加熱法においては、若干の血液試料における実質 的量の内因性蛋白質の生存を許す結果となシ、このために後で詳述するごとくビ タミンＢ１□の測定が不正確になる。

（３）　コールハウス等の及びアレンの教唆に従えば、若干の試料中には最近の ビタミンＢ１２のＲＩＤ測定に使用される固有因子蛋白質と反応し、又はこれを 遮断する抗体がはじめから存在し、この抗体も又、後はど詳述するようにビタミ ンＢ１゜の測定を不正確にする。

これらの問題点を認識することなくそしてこの発明の方法及び組成物を使用する ことなく、最近の非煮沸技法、並びにコールハウス等及びアレンの方法を使用す ればビタミンＢ、２異状患者に対する臨床上容認できない程ビタミンＢ、２の測 定が不正確になるであろう。もっともコールハウス等及びアレンの方法は煮沸法 においては非常に正確である。例えば、非煮沸遊離処理後に試料中に存在する未 破壊の又はまだ阻害されていない内因性結合蛋白質は、測定インキュベーション 中に試料由来ビタミンＢ１□及び放結合したビタミンＢ１２と未結合ビタミンＢ 、２の分離に使用した技法に応じてビタミンＢ１２の高い又は低い読み値が得ら れる。

試料中に固有因子と結合することができる抗体が存在するが煮沸によって破壊さ れていないその他の場合、結合蛋白質として固有因子を使用するコールハウス等 及びアレンのＲＩＤ測定法においては、添加され、試料のビタミンＢ、２及び放 射性ビタミンＢ１゜とのみ反応しそして結合することが期待される固有因子が固 有因子遮断抗体と反応し、この結果いくらかの固有因子は放射性ビタミンＢ、２ 及び試料のビタミンＢ１２と反°応できなくなるであろう。固有因子のこの反応 の結果、固有因子に対する抗体の競争が加わるために、固有因子と結合する両タ イプのビタミンＢ１２の量が少なくなり、この結果、結合放射性ビタミンＢ１□ −固有因子の濃度が低く観察され、このために、この発明の技術を使用しない場 合には被験試料中のビタミンＢ、２の量が高く観察される。

又、被験試料中の内因性結合蛋白質から実質上すべてのビタミンＢ１２又は葉酸 が遊離しなければ、ビタミンＢ、２又は葉酸の測定値が誤差にょシ低く出ること は詳細に説明しなくても明らかである。

最後に、血清中に異状に多くのビタミンＢ、２及び内因性結合蛋白質を有する患 者、例えば慢性骨髄性白血病患者において、非煮沸遊離法の後に試料中に存在す るまだ阻害されていない内因性結合蛋白質についての検討において述べ冬ごとく 、放射性ビタミンＢ、２についての過剰の内因性結合蛋白質の競争のためにビタ ミンＢ１２の測定レベルが実際に存在するレベルよりも低く出ることが、最近注 目されている。

これらの発見に基づき、ビタミンＢ、２及び／又は葉酸の測定のために、試料を 、内因性蛋白質からビタ゛ミンＢ１□を遊離せしめ、内因性結合蛋白質及び固゛ 有因子（ＩＦ）遮断抗体を実質上破壊し、そして未だ破壊されてい力い若干の内 因性結合蛋白質と反応し又はそれを阻害する組成物で処理することを提案する。

好ましい態様においては、使用する蛋白質破壊組成物には゛強塩基及び強力なジ スルフィド蛋白質破壊剤であるスルヒドラル化合物を含め、一方未破壊内因性結 合蛋白質と結合する物質としてビタミンＢ、２類似体を選択する。こ−れらの発 見に基いてさらに、ＩＦ−遮断抗体を有する及び有しない低ビタミンＢ１２患者 、並びに高ビタミンＢ１２ＣＭＬ患者からの多数の試料を用いて、上記の目的が 達成されることを証明したことを明らかにする。

上記のような教唆に基づき、他のタイプの組成物及び関連技術を容易に決定する ことができ、そしてこの発達の実施に適用することができる。

次に記載するさらに詳細なこの発明の態様から、この発明の前記の目的及び他の 目的、特徴及び利点が明らかになろう。

発明の詳細な説明 最近公表された非煮沸ビタミンＢ１２及び／又は葉酸測定において適切に認識さ れておらず又は扱かわれていない問題点及び多数の試験試料を使用したこれらの 問題点の注意深い解析に基いて、この発明の方法及び組成物を開発した。この方 法及び組成物は最近公表された非煮沸ビタミンＢ１□ＲＩＤ分析において認識さ えされておらず扱かわれてもいない問題点を回避するものである。

この発明の好ましい組成物には、一般に、非煮沸ビタミンＢ１２又はＲＩＤ測定 を行う場合に加えられるビタミンＢ１２類似体を含有せしめる。ビタミンＢ１□ 類似体は、被験試料中に試料ビタミンＢ１２から遊離して又は他の状態で存在す る内因性結合蛋白質と結合する。この内因性結合蛋白質と添加したビタミンＢ１ ゜類似体との結合によシ、そして添加したビタミンＢ１２類似体により内因性結 合蛋白質を阻害することにより、内因性結合蛋白質は放射性ビタミンＢ１２及び ／又は試料ビタミンＢ１２と結合できなくなる。

従って、このような結合又は再結合によって生ずべき誤差が回避される。添加す るビタミンＢ１□類似体は、実質上固有因子と結合せず、そしてそれによって固 有因子が放射性ビタミンＢ１２及びビタミンＢ１゜と結合する能力を害しないも のであるべきである。

この発明の実施に有用なビタミンＢ１２類似体には、コビンアミド（ｃｏｂｉｎ ａｍｉｄｅ）　（Ｃｂｉ）　ＣＮ−Ｃｂｌ（ｂｄｅ−ＯＨ）及び（３、５、６Ｍ ｅ　３ＢＺＡ）（ＣＮ、０Ｈ）Ｃｂａ　、又は他のビタミンＢ１□類似体が含ま れるがこれに限定されない。ビタミンＢ、２！似体は、少なくとも測定のために 調製すべき試料中に存在することが予想される内因性蛋白質の実質上すべてと結 合するのに十分な量でなければならない。ビタミンＢ１２類似体を血清試料２０ ０μｌ当シ約Ｉ　Ｊ〜約１０，０００ｎｇとするのが有用である。

ビタミンＢ、２類似体の好ましい量は血清試料２００μｌ当り約２０ｎ＆〜約１ ０００　ｎ、！ｉ＋の範囲である。ビタミンＢ１□類似体の被験非煮沸試料への 添加は、ビタミンＢ１□の遊離に先立って、ビタミンＢ、２の遊離中に又はビタ ミンＢ１□の遊離の直後に行うべきであり、常に放射性ビタミンＢ１□の添加に 先立って又はそれと同時に行う必要がある。これらのいずれかの時点に添加する ことによシ、ビタミンＢ、２類似体は、それが実、質的量の遊離ビタミンＢ１□ 又は添加された放射性ビタミンＢ、２と結合することができる前に直接内因性結 合蛋白質と結合することができる。驚くべきことに、ビタミンＢ１□類似体は内 因性結合蛋白質と結合するのみならず、後程第１表に示すごとく、内因性結合蛋 白質からのビタミンＢ、２の遊離をも促進する。

この発明の非煮沸測定の組成物には強塩基を使用するのが好ましい。強塩基は、 この発明の他の成分と一緒になって、内因性結合蛋白質からのビタミンＢ１２の 遊離を助けると共に、内因性結合蛋白質及び試料中に存在するであろう固有因子 遮断抗体を実質上破壊し及び／又は不活性化するのを助けると信じられる。塩基 は、他の成分と一緒になって、実態上すべてのビタミンＢ１□及び／又は葉酸を 内因性結合蛋白質から遊離せしめ、実質上すべての内因性結合蛋白質を破壊し及 び／又は不活性化し、そして実質上すべての固有因子遮断抗体を阻害又は破壊す るのに十分な量使用しなければならない。好ましい強塩基にはＮａＯＨ、ＫＯＨ 、ＬｉＯＨ及び他の強塩基が含まれるがこれに限定されない。有用な塩基濃度は 、部分的中和、及びビタミンＢ１□及び／又は葉酸との結合に実質上特異的な固 有因子すなわち結合蛋白質の添加を含む段階に先だつ、測定用試料の調製中に約 ０．０　’２　Ｎ〜約４．ＯＮの範囲である。塩の濃度は測定用試料の調製巾約 ０．３Ｎ〜１．ＯＮとするのが好ましい。塩基は測定用試料の調製作業を開始す ると同時に添加するのが好ましい。この非煮沸測定試料のだめの組成物には、内 因性結合蛋白質からのビタミンＢ１２の遊離を助け、そして内因性結合蛋白質及 びＩＦ−遮断抗体の実質的な破壊を助ける追加の化合物を１種以上含めるのが好 ましい。この追加の化合物は、その蛋白質破壊性に基いて選択するのが好ましい 。ジスルフィド蛋白質破壊剤の１種にスルヒドラル化合物がある。有用なスルヒ ドラル化合物に属するものとしてベータメカブトエタノール（ＢＭＢ）　、チオ グリコレート、チオグリセロール及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）がある０但 し、他のスルヒドラル化合物又は他の蛋白質破壊剤も−１この発明の実質に使用 することができる。

蛋白質破壊物質は、他の成分と一緒になって、実質上すべてのビタミンＢ１□を 内因性結合蛋白質から遊離せしめ、実質上すべての内因性蛋白質を破壊及び／又 は不活性化し、そして実質上すべての固有因子遮断抗体を阻害し又は破壊するの に十分な量使用する必要がある。スルヒドラール化合物の有用な濃度は、測定用 試料の調製の間、約０．００４Ｎ〜約０．４Ｎの範囲である。スルヒドラル化合 物の濃度は測定用試料の調製の間約０．０４Ｎ〜約０．ＩＮでおるのが好ましい 。蛋白質破壊物質は、試料を測定のために調製する際、そして好ましくは放射性 ビタミンＢ、２を試料に添加する際又はそれに先立って試料に加えることにより 内因性結合蛋白質と添加した放射性ビタミンＢ、２との結合を回避し又は最少限 にする。

次に、この発明の非煮沸試料調製及び方法を使用する好ましいビタミンＢ１゜測 定方法の１つを記載する。一般的に、測定方法は米国特許第４，１８８，１８９ 号に記載されている方法と実質上同じであるが次の点で異る。すなわち（１）試 料と加えた試薬を煮沸又は加熱しない。そして、（２）この発明の教唆に従って 追加の又は代シの化合物を使用する。測定中、試薬及び試料はすべて約り５℃〜 約３５℃の範囲の周囲室温におく。凍結又は冷蔵されている任意の試薬又は試料 は室温になるまで放置する。これは、この明細書において使用する加熱ではない 。試験を開始するために２００μｌの被験血清又は標準をピペットで取り各試料 管に入れ、各試料管には見分けるためのラベルを付ける。そして次の成分、 ６０ｐｇ５７Ｃｏ−Ｂ１２ １００　ｎｇ　コビンアミド １０．０μ９　ＫＣＮ ２０００．０Ｍｇ　ＤＴＴ を含有する５０μｌの水溶液を加える。そして、それぞれの管に５０μｌの２． ０ＮａＯＨをピペットで入れ、そして十分に混合した後、加熱することなく約２ ０分間管を周囲温度にインキ−ベートする。続いて、次の組成すなわち、 ０−０１　Ｍ　ＮａＰＯａ　、ｐＨ７ ０，１２７Ｍ　ＮａＣ１ ０，１６２Ｍ　硼酸 約５０９９のビタミンＢ１□と結合する量の固有因子を含有するＰＨ６，ｓの水 溶液１０００μノを加えて寿痕を実質上中和し、そして試料ビタミンＢ１□及び 放射性ビタミンＢ、２の両者を固有因子と結合せしめることによシ測定を完了す る。そして、この混合物を加熱しないで約１時間インキエペートする。同時に又 は引続いて木炭を添加し、溶液中に存在する結合していない試料ビタミンＢ　及 び放射性ビタミンＢ１□を２ 木炭・と結合せしめ、次にこの木炭を上澄液から除去する。ＩＦ結合剤に結合し た試料ビタミンＢ１□及びトレーサー放射性ビタミンＢ１２を含有する上澄液、 又は残りの未結合試料ビタミンＢ１□及び未結合放射性ビタミンＢ１□を含む木 炭のいずれかの放射能カウントを用いて、１種類以上のよく知られそして証明さ れた技法を用いて被験試料中のビタミンＢ１２の量を示すことができる。最近最 もよく検討された、そして正確なＲＩＤ煮沸測定法として前記したコーニングの 放射測定法と比較して証明されるごとく、この発明の好ましい試料調製と測定は 、ビタミンＢ１□の非常に正確な測定結果を与える。

前述の好ましい方法には種々の変更を加えることができるが、なお、方法のいか なる段階においても加熱又は煮沸を行わないビタミンＢ、２測定のための試料調 製法及び組成物を提供するこの発明の範囲にとどまる。例えば、試料調製のだめ の他の成分の・量を変更することなく、血清試料の量を増加、例えば２倍に増加 し、又は実質上減少することができる。

効率化のために、トレーサー、内因性蛋白質破壊剤、抗体破壊剤、ビタミンＢ１ □類似体、及び強塩基又はこれらの任意の組合わせを１つの一定量の液体アリコ ートの中に加え、これを同時に試料に加える場合もこの発明の教唆内である。同 様に、そして多数のビタミンＢ１□測定を行なう研究室で特に有利に使用するた めに、トレーサー、内因性結合蛋白質及び抗体破壊剤、ビタミンＢ１□類似体、 並びに強塩基の種種の組合わせを液の形及び／又は固体の形に調製し、必要なと きに液を用いて再調製して使用するのもこの発明の教唆内である。これらの物質 は又、例えばキットとして一緒に包装することができ、実験室は試験用物質を外 部の供給者から入手することができ、個々の素剤及び組成物を貯蔵しておく必要 がなく、又は広範囲の試験準備をすべて行う必要がない。ここに示唆した任意の 組合わせにおいて、放射性トレーサーを除くすべての物質は、この発明の好まし い態様の教唆に従って非煮沸ビタミンＢ、２測定用試料試製に必要である。

葉酸はビタミンＢ１２と同時に測定する場合が多いので、前記の例は葉酸の同時 測定のために容易に使用することができる。例えば、放射性ビタミンＢ１□を加 えるのと同時に１２５ニ一ラベル葉酸のごとき放射性葉酸を加え、工Ｆ結合剤の 添加と同時に試料葉酸及び放射性葉酸と結合する葉酸結合剤を加える。このよう な変更によシ、公知の二重測定法を用いて、測定方法をビタミンＢ１２と葉酸の 同時測定を行うのに適するものとすることができる。

同様に、この発明の方法を、非煮沸法と組成物を用いて葉酸のみを測定するよう に変えることができる。

前記のごとく、この発明の組成物及び方法はまだ知られておらず、そして最近公 表された非煮沸ビタミンＢ１゜ＲＩＤ測定において明確に知られておらず、又は 考慮されていない情報を使用し、そして問題点を認識して考えられ、開発され、 そして発展したものである。すでに詳述したごとくこれらの問題点には次のこと が含まれる。

（１）　ビタミンＢ１□の測定を正確に行うために、被験試料中の内因性結合蛋 白質から実質上すべてのビタミンＢ、２を遊離せしめる必要がある。

（２）被験試料中でビタミンＢ１゜から遊離している内因性結合蛋白質及び他の 形で存在する内因性結合蛋白質を実質上すべて破壊又は不活性化する必要がある 。（すでに公表された非煮沸法においては、実質的な量の内因性結合蛋白質が若 干の血液試料中で残存しており、この結果その試料中のビタミンＢ１□の測定が 不正確になる。）そして、 （３）　ＲＩＤ測定中に固有因子蛋白質と反応し、又はそれを遮断する性質を有 する試料由来の抗体を破壊し又は不活性化する必要がある。（このようなＩＦ− 遮断抗体のために、すでに公表されている非煮沸法におけるビタミンＢ１□の測 定が不正確になる。）加熱しないで内因性結合蛋白質からビタミンＢ、２を分離 するためには、ビタ声ンＢ１２と内因性結合蛋白質との結合を破壊する組成物が 必要であることが明らかである。蛋白質破壊物質として知られている塩基を使用 することは自明のことである。し易・シながら強塩基は、それのみでは、内因性 結合蛋白質から実質上すべてのビタミンＢ、２を遊離せしめない。

その上、強塩基は、それのみでは、実質上すべての内因性結合蛋白質を破壊し、 又は不活性化しない。

さらに、強塩基は、非煮沸試料に存在する場合がある実質上すべてのＩＦ−遮断 抗体を破壊しない。

問題点のこのような認識と共に、内因性結合蛋白質からのビタミンＢ１゜の遊離 及び内因性結合蛋白質の破壊又は不活性化能力について種々の物質を単独で及び 組合わせて試験した。これらの物質は、これを単独で又は種々の組合わせにおい て、プレインキュペーションにより種々の形の内因性結合蛋白質と結合した既知 量の放射性５７Ｃｏ−Ｂ１２に適用した。さらに詳しくは、”Ｃｏ−Ｂ、２を、 Ｒ蛋白質（Ｒ）及びトランスコバラミンＩＩ　（ＴＣＩＩ）として知られている 結合蛋白質を含有するヒト血漿中の内因性結合蛋白質と結合せしめ、そして又、 Ｒのみ及びＴＣＩ［のみと結合せしめた。対象試料としそ使用するために　５７ 　ＣＯ−Ｂ　１□をいかなる結合蛋白質も実質上台まない緩衝液にプレインキュ ペ１トしたＯ 第１表に示すように、放射性ビタミンＢ、２とプレインキュベートし、そして次 に個々の、又は組合わせた物質で処理した後、それぞれの試料を実質上中和し、 ＩＦ又は他の結合剤を伴々わないで６０分間インキユベートシ、そして内因性蛋 白質から遊離した１及び遊離していた結合した放射性ビタミンＢ１□の実質上す べてを吸収する木炭で処理する。従って、この方法を使用する場合、上澄液中に 見出される５７Ｃｏ−Ｂ１゜の量が少なくなるに従って、例の第１表に示した通 り、物質（１種又は複数種）により遊離した　Ｃｏ−Ｂ１２の量が多くなり、そ して、測定調製用組７ 酸物においてその物質はより良好である。第１表により明らかなように、種々の 単独の又は結合させた物質は、”７Ｃｏ−Ｂ１□の遊離に対して種々の効果を有 する。

第　１　表　Ａ 血漿及び種々の結合剤からの〔５７ＣＯ〕Ｂ１□の遊離Ｒ−−−１００，Ｏ ＴＣＩＩ　７４．３ 緩衝液　０．４ 血漿　＋　−−９５，９ Ｒ＋　−−９９，８ ＴＣＩＩ　＋−−７６，１ 緩衝液　十　−−０，１ 血漿　４４．９ 一十− Ｒ−＋　−１００，０ ＴＣ１１８３，７ −＋− 緩衝液　０．３ −＋− 血漿　−−＋４０．８ Ｒ−−＋　３１．３ ＴＣｎ　−一＋　６．０ 緩衝液　−−＋　０．３ 血漿　十　＋　−７１，１ Ｒ＋　＋−１００，０ ＴＣｎ　＋　＋　−８４，８ 緩衝液　十　＋　−０，２ 血漿　＋　＋　２６．９ Ｒ十　−＋　４．４ ＴＣＩＩ　＋　＋５．０ 緩衝液　＋　十０．０ 血漿　−十＋　２．５ Ｒ＋　＋　１０．８ ’ｒｃｎ　−＋　＋　１．５ 緩衝液　−＋　十Ｏ，Ｓ 血　漿　十　十＋１．４ Ｒ＋　十　＋　Ｑ、９ ＴＣ■　十　＋　＋　ｌ、Ｑ 緩衝液　＋　＋　＋　０．１ さらに第１表Ａに関し、コビンアミド（Ｃｂｌ）、ベタメカノドエタノール（Ｂ ＭＥ）及びＮａＯＨ（強塩基）を使用した場合に、試料２９〜３２のすべてにつ いて、他のすべての組合わせと比較して、上澄液中に残存する５７ＣＯ−Ｂ、２ のノや一七ントが最低となる。従って、タミンＢ、２は結合蛋白質から最も多く 遊離する。

さらに、遊離分析中強塩基であるＮａＯＨが０．５Ｎの濃度で使用されている第 １表の試料１３〜１６に特に注意しなければならない。試料１３〜１５において は、実質的な量の５７ｃｏ−Ｂ１□が上澄液に残存しておシ、従って他の物質を 存在せしめないで強塩基で変性させることによっては実質上完全な遊離が起らな いことに注目されよう。このことは変性剤としての強塩基それ自体の効果につい ての疑問を喚起する。

なお、すべての溶液はＫＣＮを含有している。

結局、第１表のデータから、既知量の放射性ビタミンＢ１□を使用し過剰量の内 因性結合蛋白質又はＩＦ−遮断抗体を使用しない実験において、Ｃｂｉ　（ビタ ミンＢ１゜類似体）、ＢＭＥ（ジスルフィド蛋白質破壊剤組成物）、及びＮａＯ Ｈ（強塩基）の組合わせが最も実質上完全なビタミンＢ１２遊離組成物を供する ことが十分に明らかである。同様に、第１表Ｂのデータは、この同じ組成物が、 内因性葉酸結合蛋白質からの葉酸の実質上完全な遊離をもたらすことを示してい る。

血清からの葉酸の遊離 Ａ　２．６　８２．９ Ｂ　１．７　４５．ｊ Ｃ３，２９７，０ Ｄ　１，８　５７．６ Ｅ　２．２　７４．９ Ｆ　１．９　７４．６ Ｇ　１．５　５２．４ ＊　これらの血清は高い内因性葉酸結合蛋白質レベルを有する。

＊＊第１Ａ表と同じ一完全条件 ＊＊＊　Ｃｂｉ　、　ＢＭＥ及びＮａＯＨの前に中和溶液すなわちＴｒｉｓ　− ＨＣｌを加えた。

第１表の測定条件 Ａ、これらの測定における試料の容積は２００μノであシ、５μｌのＨ２０中４ ５．４ｐｇぴＢ１２と共に２０分間室温においてインキュベートした。試料は、 ａ）　４０　μｌｌの緩衝液Ａ　（０，０５Ｍ　ＫＰＯ４ｐＨ７，５，０，５Ｍ 　ＮａＣｔ。

漿：ｃ）４０μ７唾液Ｒ蛋白質（１，２ｎｇＢ１゜結合能）＋４０μノ緩衝液Ａ ＋１２０μノ塩水；ｄ）１６０μｌＴｃｍ（ｏ、ｓ　９　ｎｇＢ１２結合能）　 ＋　４　’ＯＩｌｌ緩衝液Ａ０このインキュベーションに続いて、５μノの水中 ２５　”＋９のＫＣＮを各試験管に加え、そして８種類の異なる条件を導入した 。【第１表参照）これらは、次のものからなる可能なすべての組合わせである。

すなわち、ａ）５μノの水中１μｓのコビンアミド；ｂ）４０μｌのＩＭＢ廊； 及びｃ）１００μＡのＮａＯＨ。

成分の不足分は水を加えた。容量３５５μノにおいて、反応を室温にて２０分間 行い、その後ＮａＯＨを含むこれらの管を２７５μｌのＩ　Ｍ　Ｔｒ　ｉ　５− ＨＣｔｐＨ７，５によシ中和した。すべての試験は０．１　Ｍ　ＮａＣｔによシ 容量を１．５−としその最後の６０分間測定を続けた。反応は、０．５ｍｌ！の ＢＳＡ塗布木炭によシ停止した。試験管を１０．０００Ｘ、ｌｉ’で２０分間遠 心分離し、そしテ１．０ｍＡ’ノ上澄液をカウントのため取り出した。

ｎ、１２５ニ一葉酸の遊離を試験するためにも完全な測定を行った。

第２表Ａは、コールハウス等及びアレンの標準的煮沸法と、ジスルフィド蛋白質 破壊組成物としてＢＭＥをも使用したこの発明の原型的な非煮沸法とを使用した 、多数の正常者についてビタミンＢ１□測定を行なった比較データである。第２ 表Ｂは、若干の正常試料及び患者からの試料についての葉酸分析の比較データを 含む。第２表Ｃは若干の正常試料と２つのビタミンＢ１２欠乏患者からの試料に ついてビタミンＢ、２及び葉酸の同時測定の比較データを含む。

煮沸法及び非煮沸法の両者を使用したピタミ：／′、Ａ１葉酸、並びにビタミン Ａ及び葉酸の測定結果が全体として一致しておシ、科学的にも、臨床的に°も耐 えうる範囲において良好外結果である。この結果は、正常者及びなんらかのビタ ミンＢ１□欠乏患者におけるビタミンＢ１２及び／又は葉酸を測定するのにこの 発明の組成物が正確且つ有用であることを支持している。

第２表Ａ 煮沸法及び非煮沸法を使用した正常試料の血清Ｂ、２値煮沸法　非煮沸法 正常： １、　３９０　３５０ ２、　２６０　３１９ ３、　２３０　２５８ ４、　３２５　４１９ ５、　４７５　５１０ ６、　３６５　４６５ ７、　２０５　２４２ Ｂ、　５４０　５９０ ９、　４１０　５２７ １０、　３９０　４９６ １１、　１５０　２１１ １２、　６３６　４９０ １３、　３００　３５７ １４、　４６０　５８９ １５、　３９０　４９０ １６、　３０５　３１６ １７、　２６５　３２６ １８、　３７０　４２０ １９、　２００　２９２ ２０、　３２５　２３５ ２１、　２３０　２９０ ２２、　２９５　３８２ ２３、　４２５　５４６ ２４、　７００　７８５ ２５、　２８０　３１０ ２６、　１６５　１７１ ２７、　２００　２５４ ２８、　１８５　２２０ ２９、　１５０　２２３ 第２表Ａ（続き） 煮沸法　非煮沸法 正常： 第２表Ｂ コロラドゼネラル病院における葉酸値が必要とされる患者についての、煮沸法及 び非煮沸法による血清葉酸値 １　６．１　６．８ ２　３．３　２．６ ３　２２．０　１６．３ ４　７、６　７．２ ５　２．８　２．５ ６　２０．０　３５．７ ７　２．５　１．６ ８　１２．０　１０．８ ９　４．５　４．７ １０　１１．８　１０．３ １１　３．４　４．０ １２　３．４　４．０ １３　５．９　９．３ １４　３．０　３．５ １０．０　６．９ １６　２３．０　２０．５ １７　１１．５　８．８ １Ｂ　２．１　２．５ １９　３．４　３．０ ２０　３．１　３．２ ２１　８．６　８．２ ２２　４．５　４．６ ２３　３．３　４．０ ２４　１３．５　１５．６ ２５　６．１　６．２ 第２表Ｂ（続き） ２６　８．５　８．０ ２７　３．２　３．０ ２８　＞２５．０　２８．０ ２９　２３．０　１８．８ ３０　１１．５　８．４ 発明者等の病院実験室のベクトンーデイツキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉ ｎｓｏｎ）Ａｖｆ−（正常値範囲３〜５　ｎｇ／ｍＱ第２表Ｃ 第２沸Ｃを用いたビタミンＢ１□及び葉酸の個別的測定と同時測定 １　１２．８　２４５　１１．５　１９０２　８．５　３６０　９．２　３０５ ３　Ｌ７．２　３００　１４．１２６０４　１５．２　２００　１６．４　１８ ５５　１６．２　４００　１６．０　３７０６　５．８　３２０　５．２　３６ ０ ７　１５．５　３４０　１１．５　２７０３　７．６　（１０７，４（１０ ９２３，０８０２３，０４０ 第３表は、よシ多くのビタミンＢ、２欠乏患者の試料への煮沸法及びこの発明の 原形的な非煮沸法の適用を示すものとして興味ある。血清試料÷１７以外につい ては、両法による一致は統計的に卓越しておシ、やはシとの発明の科学的正確さ と有用性を示している。しかしながら、血清試料４Ｐ１７における大きな差は統 計的に容認し得ない。この発明のこの原形的な非煮沸測定法から得られるデータ を使用すれば、試料す１７を供した患者は正常として分類されることになる。従 って、この原形的組成物及び方法において、試料＋１７の原形的非煮沸測定は臨 床的に容認できない欠点を示している。この１人の患者についての診断の失敗は 、この患者をビタミンＢ１２で治療することについての失敗をまねいたかもしれ ない。ビタミンＢ、２欠乏を治療しなければ、潜在的に致命的血液及び／又は神 経的異状を引き起こす可能性がちシ、後者の場合には、後でビタミンＢ１□で治 療しても回復せず、患者は一生精神病施設に収容されるという特に深刻な結果が しばしば生ずるので前記のような失敗は、この患者にとって悲惨な結果をまねい たかもしれない。

引続く解析によシ、第３表に示す試料≠１７を含む「欠乏」試料の多くがＩＦ− 遮断抗体（第３表において「抗ｌＦ遮断抗体」と表示されている）を有していた 。第３表において、「＋」はこのような抗体の存在を、「−」はその不存在を示 している。さらに解析した結果、試料４Ｐ１７は適度に高い値でＩＦ遮断抗体を 有しておシ、さらに重要なことに゛、この試料の抗体は使用した原形的な測定用 組成物による破壊に対して特に耐性を有することが示された。（ＩＦ−遮断抗体 は多くの異なった構造を有しておシ、そしてこのために破壊に対する耐性が異な る。）さらに、これらのＩＦ−遮断抗体は試験中にＩＦについてビタミンＢ、２ と競争することも確認された。このため、破壊され又は阻害されない場合には、 抗体がＩＦをして試料ビタミ＜Ｂ、２及び放射性ビタミンＢ１２と結合できなく シ、これによ、！：ｌ、ＩＦと結合するビタミンＢ１□及び放射性Ｂ１□の量が 不正確に少なくなシ、この結果、ＩＦ含有上澄液の放射能カウントが小さくなる 。このカウントが低いことが、実際に存在するのはＩＦ遮断抗体であるのに、あ たかも追加のビタミンＢ１が存在するかのでとく解される。従って、若干の試料 にこのような抗体が存在するときは、実質上すべての抗体を破壊することができ る他の組成物を考案しなければならない。

ＢＭＥに替えてさらに強力なジスルフィド蛋白質破壊物質、ＤＴＴを含めてこの 発明の原形的組成物を再構成することによシ、さらに効果的にＩＦ遮断抗体を破 壊する組成物が得られる。ＤＴＴを使用した組成物を使用し、そして第３表の試 料の幾つかを再試験した結果、試料す１７については５５　ｐｇ／ｍＪという低 いビタミンＢ１２含量が示された他は、それぞれの試料について同じビタミンＢ 、２測定値が得られた。ふシ向って見れば、内因性結合蛋白質及びＩＦ遮断抗体 が試料中に存在する場合には、古い煮沸法によってはこれらが明らかに破壊され るが、非煮沸化学的方法においては、ビタミンＢ１２は内因性結合蛋白質から遊 離するが、実質上すべてあ内因性結合蛋白質又は実質上すべてのＩＦＲ断抗体が 破壊され又は不活性化されることはない。これらの問題点は、実質上すべてのビ タミンＢ１２を遊離せしめ、実質上すべての内因性蛋白質を破壊し、実質上すべ ての破壊されなかった結合蛋白質と結合し、又はこれを不活性化し、そして実質 上すべてのＩＦ−遮断抗体を破壊し又は不活性化するこの発明の好ましい組成物 及び非煮沸法によシ克服された。

第３表 臨床的に証明され九Ｂ１□欠乏を有する患者についての、煮沸法及び非煮沸法を 用いた血清Ｂ１２値６、　５４　３９　− １０、　７５　３３　＋ １３、　５１　６０　− １４、　３９　５９　− １５、　２４　３８　− １６、　（１０１３＊ ＊＊１７．　５２２９０　＋ １８、　１８　６１　− １９、　２２　５９　− ２０、　＜１０　＜１０　− ２１、　７０３５　＋ ２２、　１０　３０　− ２３、　９５　１１３　− ２６、　８５　１０４　− 第３表（続き） ２９、　３２　４５　− ３０、　３９　６８　− ３１、　４４　１５　− ３２、　３８　４９　− ３６、　２８　（１０− ３７、＜１０　（ｉｏ　＋ ３８、　７０　５５　− ３９、　４２　６８　− ４０、　５８　５６　− ４１、　３８　（１０十 ＊＊　非煮沸法による高い値は、抗、ＩＦ抗体の不完全な破壊のためである。

支持データ ビタミンＢ１２の非煮沸分析の問題点についての最近の認識、すなわち、ビタミ ンＢ１□実質上すべてを十分に遊離せしめる必要があること、及び最初に実質上 すべての内因性結合蛋白質を破壊又は不活性化する必要があることを含む認識を もって、原形的な解決の概念を構成し、その実用化への還元を行い、そして、新 たな問題、その問題が若干の試料におけるＩＰ−ｆｉ断断体体存在と関係がある こと、そして従って若干の試料に存在するであろう実質上すべてのＩＦ遮断抗体 の破壊又は不活性化が必要であることを認識し、そして、この発明の好ましい態 様の組成物及び方法を再構成し、これを再び実施に還元し、明らかに精度の高い ビタミンＢ、２及び／又は葉酸の非煮沸ＲＩＤ測定法を確立した。

この発明の正確さと有効性を点検するための段階と方法を行った。

第５表に関し、第１表と同様に、高い精度を有する参考のためのコーニングの煮 沸法とこの発明の非煮沸法との間で「非特異的結合の」比較を行った。

「非特異的結合」は、コーニングの参照測定法の遊離工程に従う又はこの発明の 遊離工程に従う　５７Ｃ８−Ｂ１゜と結合する試料の能力の試験である。コーニ ングの参照法又はこの発明の非煮沸法を効果的に行う。但し、それぞれの場合に 、ＩＦ結合剤の代シにブランク試薬を使用する。次に木炭を用いて内因性結合蛋 白質に結合しているビタミンＢ１２及び放射性ビタミンＢ１２から未結合ビタミ ンＢ４２及び未結合放射性ビタミンＢ１□を分離し、次の定義すなわち、として 「非特異的結合」をめる。第４図に関し、この発明の非煮沸測定法はビタミンＢ 　正常者及び２ ビタミンＢ、２欠乏（低）者のみならず、患者のビタミンＢ１２レベルが極度に 高くなシそして内因性結合蛋白質のレベルが極度に高くなる病気であ゛る慢性骨 髄性山崩病に罹患していることが明らかな患者についても、コーニング参照測定 法とよく一致する。さらに詳しくは、各群の平均の比較にょシ示されるように、 この発明の非特異的結合はコーニング参照測定法に勝る。

第４表の［不飽和Ｂ１２−結合能」は内因性ビタミンＢ１２に結合しないもとの 試料中の内因性結合蛋白質の量を示す。このような結合していない内因性結合蛋 白質は、実質上すべての内因性結合蛋白質を破壊し又は阻害しない測定法におい て精度を妨害するであろう。

第４表 参照煮沸測定法及びこの発明の非煮沸測定法を使用した非特異的結合の比較 １　４７０　２．３　１．３ ４　３６０　２．４　１．２ ６　１７０　２．６　１．４ １２　１００　２．４　１．０ ２０　７１０　３．０　１．１ ２１　５２０　２．２　１．１ ３０　３４０　１．７　１．０ ３６　２３０　１．８　１．０ ３９　５８０　１．３　１．２ ４０　９２０　２．５　１．４ ４１　２．４００　３．２　１．３ ４３　５６０　２．８　１．２ 低Ｂ、２、抗体陰性 １　８７０　２．２ｏ、６ ２　２．６００　２．１　１．４ ３　１．３００　２．２　１．２ ４　２．３００　１．９　０．８ ５　１．４００　１．７　０．８ ６　８５０　２．６　１．２ 平均　１，４０２　２．０　１．０ 第４表（続き） 慢性骨髄性白血病 １　２．４００　３．９　１．７ ２　３．２００　４．５　１．７ ３　４．５００　６．３　２．１ ４　１．２００　３．９　１．５ ５　３．９００　６．０　２．３ ６　１７．０００　１２．４　７．４ ７　２．０００　９．１　６．５ ８　１．８００　５．３　２．１ ９　１４．０００　３．１　２．７ １２　８６０　２．２　１．２ １３　１５．０００　４．２　２．４ １４　７．９００　−０．３　０．４ １５　１５．０００　４．４　３．４ １６　７．１００　０．０　０．８ １７　７．３００　０．６　２．２ １８　７．４００　−２．１　０．４ 平均　７．１７０　４．１　２．４ 第５表は、平常なビタミンＢ１２レベルを有すると考えられる正多数の正常者（ ５０名）についての、コーニング参照測定法及びこの発明の非煮沸測定法の間の 比較的直線的な対比を示す。これは第２表に類似しているが、第２表において使 用した試料と第５表におけるそれとは異なる。それぞれの試料及びすべての試料 について、そして全試料の平均について、両測定法は科学的及び臨床的に非常に よく一致している。第５表は又、この発明の好ましい方法及び組成物を使用した 場合の正常なビタミンＢ１２の範囲を明らかにしていることにも注目すべきであ る。

この正常値は、参照測定法の「１４８〜６９６ｐｇ／ｍｌ　Ｊに比べてｒ　１４ ０〜７０４　ｐｇ／ｍＡ！　Ｊであシ、この差は数学的及び科学的に有意でない 。

第６表は、抗体を伴なわないビタミンＢ１□欠乏試料について、参照測定法とこ の発明の非煮沸測定法との間の比較を示す。この場合にも、両測定法の結果は、 科学的及び臨床的に完全に一致する。両測定法においてすべての試料は正常値の 範囲よシ下にあり、そして、両方法の平均は完全に一致する。これによ、９　、 ＩＦ遮断抗体が存在しないビタミンＢ１２欠乏者のビタミンＢ１２の測定におけ るこの発明の方法の正確さが強く確認される。

第７表は（血液中にＩＦ遮断抗体を有するビタミンＢ１゜欠乏者を認定するため に使用する場合におけるこの発明の方法の正確さを支持するものとして非常に興 味深い。この表において、「工Ｆに結合するビタミンＢ１□遮断容量」は、血清 中にはじめから存在するＩＦ遮断抗体によ多結合されることができ、そして結合 されるであろうＩＦの量を示すものである。試料７６についての低い値６００　 ｐｇ／ｍｌから試料９６についての高い値３６０，０００　ｐｇ／ｍｅの範囲が ちシ、平均値は２９．　ＯＯＯｐｇ／ｍｌである。これらの試料において、ＩＦ 遮断抗体のレベルが雑多でしか゛もしばしば非常に高いにもかかわらず、各試料 のそしてすべての試料の同定において、ビタミンＢ１２欠乏の場合には１００チ の試料において、参照測定法とこの発明の測定法の間に完全な一致が認められる 。さらに詳しくは、この発明によ請求められるビタミンＢ１２の値は、各群の平 均の比較によシ示されるように、参照測定法のそれよシも正確なようである′。

従って、この発明の好ましい態様を使用すれば、この発明の非煮沸測定法は、い かなる試料についても、工Ｆ遮断抗体の存在によシ効果的でなくなったシ、実質 不能になったシすることがない。

第５表 ５０名の正常者における参照煮沸測定法とこの発明の非煮沸測定法との血清ビタ ミンＢ１２の値の比較１　２４３　１８０ ２　３２２　３６５ ３　３４３　２６７ ４　２７３　２６５ ５　３５０　４５０ ６　４３０　４１０ ７　２２５　１７２ ８　２７０　２２５ ９　４２９　３２０ １０　３０３　２０３ １１　７３０　６９０ １２　３９７　３７５ １３　１８２　１９２ １４　２３４　２５０ １５　３３０　’３３０ １６　３９７　４２０ １７　４５５　４３５ １８　１８１　１８６ １９　３６３　３４０ ２０　３６０　３２０ ２１　１７５　１３０ ２２　２２０　２０３ ２３　５４０　５１０ ２４　３４５　３４３ ２５　３３８　３７３ 第５表（続き） 血清ビタミンＢ１２の値 ２６　３０３　２９７ ２７　３８５　３４５ ２８　〜４００　４４５ ２９　３６０　３４０ １　３０　５８０　５５０ ３１　１９７　１８０ ３２　７９５　７９０ ３３　３８０　３８０ ３４　４４２　４２７ ３５　４６５　４５０ ３６　２３２　２５０ ３７　３０８　３５０ ３８　２５０　２５０ ３９　１９３　２４５ ４０　３２２　２８５ ４１　３８５　３６５ ４２　１６２　２００ ４３　２１５　１８０ ４４　３５２　５００ ４５　７００　７４０ ４６　２１８　１６３ ４７　３７７　３２３ ４８　２３３　２５０ ４９　４５０　５２０ ５０　１５０　１６１ 平均　３４６　３３９ 平均範囲ａ　１４８−６９６　１４０−７０４第６表 抗ＩＦｆｉ断抗体を有しない１２名の患者における、参照煮沸測定法及びこの発 明の非煮沸測定法による血清ビタミンＢ、２の値の比較 ２　１２８　１２０ ３　１０８　２５ ４　１２０　１００ ５　５　３８ ６　９２　９９ ７　７７　８９ ８　７８　１０３ ９　１０７　１０３ １０　１　１　７　１　１　７ １１　８　０　１　０　４ １２　８　８　９８ 平均　８５　８５ 第７表 抗ＩＦ遮断抗体を有する１１１人の患者についての、参照煮沸測定法及びこの発 明の非煮沸測定法による血清ビタミンＢ１２の値の比較 １　２００．０００　０　０ ２　１７．０００　０　２４ ３　２１．０００　１１０　１２０ ４　１８、ＯＯ００２０ ５２４，０００００ ６１，３０００５ ７２，３００７０１２０ ８２１，００００１６ ９１，０００３９７５ １０４，９０００１９ １１６，４０００２６ １２６，４０００６０ １３１５，０００３０６０ １４２３，０００００ １５２５，０００１５２５ １６３，６００８３９０ １７４，２００４７４０ １８１５，００００１９ １９１，２００１００２８ ２０２，４００１３０ ２１１，２００８６２４ ２２１，２００１５０ ２３２２，０００１０６８４ ２４１，４００８０２４ ２５１，５００１１７３１ 第７表（続き） ２６　１．１００　５　５ ２７　８．７００　９９　７８ ２８　７００　６９　５ ２９　６．４００　５　０ ３０　２５．０００　３３　０ ３１　５．１００　２５　３４ ３２　２６．０００　９１　６２ ３３　２５．０００　３８　１８ ３４　５．８００　７２　６０ ３５　２．５００　２９　１９ ３６　６．４００　５　０ ３７　４．７００　７６　５６ ３８　３．６００　４４　４２ ３９　２．３００　２８　１８ ４０　７．７００　０　０ ４１　２３．０００　５　５ ４２　９．０００　４１　１Ｂ ４３　１８．０００　２４　１９ ４４　２７．０００　２９　０ ４５　３．９００　１２２　６８ ４６　１．８００　１４２　１３５ ４７　４．３００　５　０ ４８　２．４００　１２５　１１０ ４９　１８．０００　３５　２２ ５０　４．２００　３８　０ ５１　４２．０００　２２　１０ ５２　４．０００　１８　０ ５３　５０．０００　３６　０ ５４　２５．０００　３３　０ 第７表（続き） 低Ｂ、２、抗体　ＩＦへのＢ１□結　血清中ビタミンＢ１２の値陽性患者　合遮 断の容量　コーニング参　この発明の非５５　４．４００　２９　２０ ５６　２１．０００　２８　１１ ５７　５．５００　１００　１１８ ５８　３３．００−０　２３　０ ５９　４．２００　３１　６１ ６０　３．７００　５４　３９ ６１　１４０．０００　２５　７ ６２　４．１００　３１　２６ ６３　２１０．０００　７０　８６ ６４　５．５００　９０　３３ ６５　２０．０００　２６　５ ６６　３．６００　４７　４８ ６７　６７．０００　３３　１８ ６Ｂ　４，４００　５１　３７ ６９　４．１００　７４　４７ ７０　１７０．０００　３３　４０ ７１　１０．０００　０　５ ７２　１２．０００　２５　２０ ７３　１２．０００　４０　２８ ７４　２００．０００　５５　３６ ７５　１．４００　１０　１３ ７６　６００　３０　２０ ７７　１０．０００　７９　４０ ７８　１９．０００　１２３　９４ ７９　１．５００　１０　５ ８０　２．３００　２７　２７ ８１　８．７００　４１　４４ ８２　２．９００　４６　４０ ８３　２６０．０００　３９　１０ ８４　８００　７８　４８ 第７表（続き） ８≦　７．７００　１１０　１５ Ｂ６２．９００　９６　３２ ８７　８００　４５　２９ ３Ｂ　１８０，０００　１２５　１０２１３９　２．７００　１０　１５ ｇ０　６，４００　１６　１４ ９１　２１．０００　０　５ ９２　４．４００　１１５　５７ ９３　２．２００　９４　５１ ９４　８．７００　９２　４８ ９５　３２０．０００　５　０ ９６　３６０．０００　２３　１３ ９７　１．０００　６８　０ ９８　１７、ｅｌ　ＯＯ２４５ ９９１，４００１０６３１ １００３，０００３６０ １０１２２，０００５０ １０２２，９００３６４２ １０３２，９００３９２１ １０４２，４００３５０ １０５９００１３０９３ １０６２０，０００３３１９ １０７９００２５１３ １０８２，７００４６０ １０９２，９００５７１９ １１０５４，０００７０４０ １１１１４０，０００４１３７ 平均　２９．０００　４５　３１ 正常範囲よシ低い患者数　（１１１）　（１１１）正常範囲よシ低い！ｅ、省の ％　（１００％）　（１００％）第８表に関して、実質的な数のＣＭＬ患者につ いて参照測定法及びこの発明の方法の両者を用いて試験を行った。後で詳述する ように、若干の非煮沸測定法は試料濃度に影響されるかもしれないという・示唆 があったので、「標準」試料濃度と「希釈」した試料濃度について、測測定方法 を行った。第８表に示す結果から、この場合も、この発明の測定は参照測定と完 全に一致した。１つの場合、すなわち参照測定において正常なビタミンＢ１２の 範囲にあると確認されたＣＭＬ患者において、この発明の非煮沸測定もまたそれ を、そしてそれのみを正常であるとする結果を示した。

先行技術の検討において示したように、最近２種類の公知の「非煮沸」測定が市 販されておシ、それぞれＲＩＡ及びジアグノスチνり・ゾロダクツのそれである 。第９表には、多数のビタミンＢ１□正常者、多数のビタミンＢ１２欠乏者及び 多数のＣＭＬ患者についての、前記の市販非煮沸測定と「コーニングの参照煮沸 測定」との非特異的結合性の比較を示す。第７表に示した結果は、正常者゛及び ＩＦ遮断抗体を有しない欠乏患者からの試料における非特異的結合によシ測定し た場合、非煮沸ＲＩＡ試験及びジアグノスチック・プロダクツ試験は内因性結合 蛋白質の破壊に関し完全に正確であることを示している。しかじながら、非特異 的結合によシ測定した場合に、そして同じ患者について第４表に示したような参 照測定法及びこの発明の方法両者と比較した場合に、市販のキットは両者ともＣ ＭＬ患者からの試料中の内因性結合蛋白質の破壊又は不活性化もしくは遮断を行 わない。従って、すべてを参照としてのコーニング煮沸測定法と比較した場合、 この発明の非煮沸法は、少なくともＣＭＬ患者については現存する市販非煮沸キ ットよシ正確である。

第９表はさらに、キットの測定用物質を、第９表に示すように、市販のキットが この発明の結成物及び方法に非常に一致するように変えた場合、これら変更を加 えたキットの結果は参照測定に徘常に一致する。しかしながら、この発明におけ る問題点の認識及びその解決なくして、変形の必要性も変形それ自体も期待され ず又貸われないであろう。

第８表 慢性骨髄性白血病患者２９人についての、参照煮沸測定法及びこの発明の非煮沸 測定法による血清ビタミンＢ１２の値の比較 １　＞２．０００　４，１００　＞２．０００　４，２００２　＞２．０００　 ３，５００　）２，０００　２，７００３　＞２．０００　２，３００　１，９ ００　１．７００４　＞２．０００　３，３００　＞２．０００　２，６００５ 　＞２．０００　４，４００　＞２．０００　４，６００６　）２，０００　７ ，５００　＞２．０００　８，６００７　＞２．０００　１４，０００　＞２． ０００　１７，０００８　＞２．０００　４，７００．＞２．０００　４，８０ ０９　＞２．０００　６，３００　＞２．０００　７，０００１０　＞２．００ ０　５，０００　＞２．０００　６，１００１１　＞２．０００　６，３００　 ＞２．０００　６，６００１２　４６０　５００　４１０　４５０１３　＞２． ０００　６，８００　＞２．０００　７，６００１４　＞２，０００　６，３０ ０　＞２．０００　７，４ＱＱ１５　＞２．０００　５，８００　＞２．０００ 　５，７００１６　）２，０００　６，６００　＞２．０００　７，５００１７ 　）２，０００　８，５００　＞２．０００　１０，０００１８　＞２．０００ 　４，９００　＞２．０００　５，９００第８表（続き） １９　＞２．０００　１３，０００　＞２．０００　１５，０００２０　＞２． ０００　４，７００　＞２．０００　４，９００２１　＞２．０００　１６，０ ００　＞２．０００　１８，０００２２　＞２．０００　７，０００　＞２．０ ００　８，０００２Ｂ　＞２．０００　１５，０００　＞２．０００　１７，０ ００２’ｌ−＞２．０００　１３，０００　）２．０００　１６，０００２！ｉ 　＞２．０００　７，０００　＞２．０００　８，４００２Ｇ１，７００　１， ３００　１，８００　１，６００２７　１．９００　１，６００　１，９００　 １．６００２１？　＞２．０００　４，２００　＞２．０００　４，７００２’ ｔ　＞２．０００　３７００　＞２．０００　４，４００第９表 参照煮沸測定、並びに、標準型及びこの発明の非煮沸測定法に近ずけて変形した ＲＩＡ−ゾロダクッ社及びジアグノスチック・ゾロダクッ社の非煮沸測定法の比 較 測定法　タット・キット　ドウアルカウント・正常 １　４７０　２．３　１．５　−０．８４　３６０　２．４　０．８　−０．８ ６　１７０　２．６　１．０　−１．１１２　１００　２．４　１．６　−１． ２２０　７１０　３．０　１．９　−０．５２１　５２０　２．２　０．８　− １．１３０　３４０　１．７　０．８　−１．４３６　２３０　１．８　０．５ 　−０．９３９　５８０　１３　０．５　−１．０４０　９２０　２．５　１． ６　−０．８４１　２．４００　３．２　４．２　０．８４３　５６０　２．８ 　１．２　−０．２４５　９２０　３．１　２．２　−０．５４９　１６０　１ ．７　０．３　−１．６平均　６０３　２．４　１．３　−０．８７ ２　２．６００　２．１　０．７　０．１３　１．３００　２．２　０．６　０ ．９４　２．３００　１．９　０．５　−０．７５　１．４００　１．７　０． ４　−０．５６　８５０　２．６　１．０　０．７ １０　１．２００　１．５　０．０　０．４１２　１、Ｚｏｏ　３．３　１．５ 　０．１平均　１，４０２　２．０　０．６　０．０８ 第五υスＶ（小ｊ１）１１．−％ＩＸ五ハノーク７／すτツｒと考えられる。こ のような妨害は、標準曲線を作るために使用される既知量のビタミンＢ１２を含 有する調製された非血清試料に比べて、調製された血清試料において大きい。

る試料をＲＩＡプロダクツのキット及びジアグノスチック・プロダクツのキット を使用して測定し、そしてコーニングの参照測定と比較した。第１２表は、この 発明の測定法による同様の試験を記載した第７表と比較すべきである。第１，１ 表においては第７表における場合よシ少数の試料が使用されているが、これは、 第７表において使用した多数の試料が使いつくされ、従ってさらに試験すること ができなかったからである。しかしながら、ＩＦ遮断抗体を有する１２人のビタ ミンＢ１□欠乏者によるこの省略された比較においてさえ、ＲＩＡ７°ロダクツ のキットによっては５０％よシ少ない欠乏者が欠乏者として認定されたに過ぎず 、ジアグノスチック・プロダクツのキットにおいては単に１２人中１０人（８３ ％）がビタミンＢ１２欠乏として認定されただけである。ＲＩＡプロダクツのキ ットが、ＩＦ遮断抗体を有するビタミンＢ、２欠乏者について特に不正確である という事実は、第１２表の患者≠１６の４７０　ｐｇ／ｍｌＯ値によりて支持さ れる。なぜなら、第１０表に示すようにＲＩＡプロダクツのキットを使用して５ ０人の正常者について得られた平均値４１５　ｐｇ／ｍＡ！よシ高いからである 。これら市販のキットはいずれも、単に不正確であるのみならず、患者の診断及 び治療のために全体的に臨床的に容認できない結果をもたらす。第７表を参照に した比較によれば、この発明の非煮沸測定法は、患者の診断及び治療について臨 床的に容認できるものでアシ、この測定においては、１００％のビタミンＢ、２ 欠乏者がそのように認定される。第７表は、ＩＦ遮断抗体陽性者の単なる１２′ 人ではなく１１１人の試験結果であるという事実は、この発明の非煮沸測定が正 確であシ精密であることを一層明らかにする。

第１０表 ５０人の正常者についての、参照煮沸測定及びＲＩＡゾロダクツ社及びシアグツ スティック・プロダクツ社の非煮沸測定による血清ビタミンＢ１２の値の比較 コーニング　ＲＩＡグロダクツ　シアグツスティック・１　２４３　２０３　３ ４７ ２　３２２　３５７　４０６ ３　３４３　６０３　７５０ ４　２７３　２４３　２７５ ５　３５０　４４５　４１２ ６　４３０　４２０　４９３ ７　２２５　１８１　１７５ ８　２７０　３４０　２８３ ９　４２９　４６３　４２０ １０　３０３　２３５　２８３ １１　７３０　７５０　７２５ １２　３９７　３３３　３１５ １３　１８２　２４７　２’２０ １４　２３４　３１０　３１０ １５　３３０　４００　４２６ １６　３９７　４５０　４７０ １７　４５５　４５５　５２０ １８　１８１　２０４　１７７ １９　３６３　４１０　４２６ ２０　３６０　４００　４６７ ２１　１７５　２２０　２３４ 第１０表（続き） コーニング　ＲＩＡプロダクツ　シアグツスティック・２２　２２０　３０３　 ２８５ ２３　５４０　６４５　５８７ ２４　３４５　３７７　４４６ ２５　３３８　４８０　４６０ ２６　３０３　４１７　３４０ ２７　３８５　２４０　４６０ ２８　４００　５２５　４８０ ２９　３６０　５４５　４５０ ３０　５８０　６６０　６９０ ３１　１９７　２９０　２８７ ３２　７９５　８６０　８６０ ３３　３８０　５２７　５５５ ３４　４４２　３９５　５７５ ３５　４６５　４８０　５７０ ３６　２３２　３５０　２８３ ３７　３０８　４１０　４５０ ３８　２５０　３９７　４２０ ３９　１９３　３５０　３５７ ４０　３２２　３６６　５５３ ４１　’３８５　５６５　５６５ ４２　１６２　１９４　３４７ ４３　２１５　３６０　３６５ ４４　３５２　６４５　５８５ ４５　７００　８００　１．０６０ ４６　２１８　２４０　３７５ ４７　３７７　３４５　５４５ ４８　２３３　３１２　３１０ 第１０表（続き） ４９　４５０　７８０　５３５ ５０　１５０　２００　１７７ 平均　３４６　４１５　４４２ ＆）データの高い値への歪を補正するため対数正規化した後の平均値±２・標準 偏差 抗ＩＦ遮断抗体を有しない１２人の患者についての、参照煮沸法並びにＲＩＡ　 ｆログ２２社及びジアグノスチックプロダクツ社の非煮沸測定法による血清ビタ ミンＢ１２の値の比較 １　１８　１１０　３６ ２　１２８　２２４　１４５ ３　１０８　１７５　５４ ４　１２０　２３５　１４０ ５　５　１１７　２９ ６　９２　２２４　１０７ ７　７７　１７７　６１ ８　７８　１７０　１１９ ９　１０７　１８３　１２８ １０　１１７　２４０　１７５ １１　８０　１５５　１３８ １２　８８　１８５　１４６ 平均　８５　１８３　１０６ 第１２表 抗ＩＦ５１断抗体を有する１２人の患者についての、参照煮沸法、並びにＲＩＡ プロダクツ社及びジアグノスチック・プロダクツ社の非煮沸測定法による血清ビ タミンＢ１２の値の比較 陽性患者　コーニング　ＲＩＡプロダクツ　ゾアグノスチック・（ｐ　ｇ／ｍｌ ）　（ｐ　ｇ／罰）　（ｐｇ／Ｉｎ７り３　１１０　２４５　１９５ １３　３０　１４０　９６ １５　１５　１８０　３８ １６　８３　４７０　１６８ １８　０　１５０　３１ ３２　９１　２５０　１３６ ３４　７２　１２５　１１３ ４５　１２２　１８５　１５５ ４６　１４２　２０５　１９１ ５２　１８　１０７　４３ ５９　３１　１１０　５８ ６４　９０　２９５　５７ ８３　３９　２００　１７ 平均　６７　２２２　１０７ 正常値よシ 低い患者の　（１００％）（４２％）（８３％）チ この発明を使用した第８表の場合と同様に、ＣＭＩＬ患者について、ＲＩＡゾロ ダクツのキット及びジアグノスチック・プロダクツのキットを使用した結果を第 １３表及び第１４表に報告する。この場合も、若干の試料を使いつくして使用す ることができないため、第１３表及び第１４表についても若干の省略がなされて いる。第１３表及び第１４表中の上下に＊印を付した中央欄に、使用することを 意図して購入した市販のキットを使用して得た結果を示す。ＲＩＡプロダクツの キットを使用した場合１７試料中６試料のみが高ビタミンＢ、２として認定され 、そしてジアグノスチック・プロダクツのキットにおいては、１７試料中１０試 料のみが高ビタミンＢ１□として認定されたことが注目される。従って、これら の市販キットは、ＣＭＬを診断する手段として高ビタミンＢ１２を伴う患者をそ のように認定するには不適当であろう。第８表に示した場合と比較すればこの発 明の非煮沸測定法は、高ビタミンＢ、２レベルを伴う１００チのＣＭＬ患者を高 レベルであると認定している。

第１３表及び第１４表においても、ＲＩＡグロダクッのキット及びジアグノスチ ック・プロダクツのキットを第１５表に示すように、まず希釈して、そして変更 を加えて使用した場合、この変形又は希釈に６７ よシ両キットは、高ビタミンＢ、２を伴うＣＭＬ患者の認定において、完全に正 確な結果をもたらす。しかしながら、この発明の教唆なくしては、ＲＩＡプロダ クツのキット及びシアグツステック・プロダクツのキットをこのように変更する ことは知・シ得ないｆ６ろう。

第１３表 慢性骨髄性白血病患者１８人についての、参照煮沸測定法、並びにＲＩＡ　７’ ロダクツの非煮沸アッセイ法を、標準型で、及びこの発明の非煮沸測定法に近ず けるように変形した方法で使用した場合の血清ビタミンＢ１２の値の比較 煮沸法　標準測定　変形測定 測定容量　測定容量　測定容量 １　）２，０００　４，１００　１．０００　４３００　）２ρ００　４，５０ ０２　”）２ｐ００　３，５００　１，０００　２，７００　：）２ρ００　３ ２００５　″）２．ＱＯＯ４，４００８９０４２００）２ρ００　５，３００６ 〉２ρ００　７，５００　３００　７ρ００　１，７００　８．６００７〉２ρ ００１４ρ００　５８０　１５，０００　）２ρ００　１８，０００８〉２ρ０ ０　４，７００　１，４００　４．３００　＞２ρ００　４，４００９〉２ρ０ ０　６，３００　２９０　６．０００　＞２ρ００　７，０００１０〉２ρ００ 　５ρ００　９９０　５Ｊ３００−＞２ρ００　６７００１１〉２ρ００　６， ３００　３１０　６．６００　）２ρ００　７３００１２　４６０　５００　５ ５０　５８０　５００　５７０１３〉２ρ００　６８００　３２０　６．０００ 　２ρ００７，３００１４〉２ρ００　６，３００　４６０　６．６００　）２ ρ００　７，５００１５　）２，０００　５，８００　３１０　５．０００　） ２ρ００　６．２００１６　＞２．０００　６，６００　５００　７２００　＞ ２ρ００　７，５００１７〉２ρ００　８．５００　５１０　８．６００　＞２ ρ００　９，８００１８〉２ρ００　４９００　５４０　５，１００　）２ρ０ ０　５，８００第１４表 沸法、並びに、シアグツステック・プロダクツの非煮沸測定法を、標準型で、及 びこの発明の非煮沸測定法に近ずけるように変形した方法で使用した場合の血清 ビタミンＢ１□の値の比較 煮　沸　法　ルカウントキット （ｐｖｆｎ＠　（ｐＶｆｎ＠　（ｐｇＪ／）　（ｐｇ４　（ｐｇ４）　（ｐｇ４ ）１〉２ρ００　４ＪＯ０１，７００４，７００）２ρ００　４，４００２〉２ ρ００　３５００　１，４００　３ρ００　〉２ρ００　２４００３〉２ρ００ 　２３００　８９０　１，９００　１，８００　１．７００４〉２ρ００　３３ ００　１，７００　２．８００　）２ρ００　２，１００５〉２ρｏｏ　４，４ ０ｏ　１２００　４，４００　＞２．０００　４，７００６　）２．０００　７ ５００　５００　６５００　）２ρ００　８，２００７〉２ρ００　１４．００ ０　１，４００　１７ρ００　〉２ρ００　２１，０００８〉２ρ００　４，７ ００　１．８００　５２００　＞２ρ００　４，１００９〉２ρ００　６，３０ ０　６８０　６．６００　＞２ρ００　７，３００１０　〉２ρ００　５，００ ０　１，７００　５．９００　＞２．０００　６，７００第１４表（続き） 煮　沸　法　ルカウントキット 測定容量　測定容量　測定容量 （ｐｖｆｎ◇　（ｐ一つ　（ｐｕｐ　（ｐ一つ　（ｐし呻　（ｐ−０１１〉２ρ ００　６，３００　６４０　５．９００　）２ρ００　７，５００１２　４６０ 　５００　４８０　５１０　５２０　４００１３〉２ρ００　６，８００　６０ ０　６．６００　）２ρ００　７，４００１４〉２ρ００　６３００　９９０　 ６，９００’＞２ρ００　８，６００１５〉２ρ００　５，８００　６４０　５ ．５００　）２ρ００　６，１００１６〉２ρ００　６，６００　９００　７ρ ＯＯ〉２ρ００　８，４００１７　）２，０００　８，５００　９９０　９．９ ００　）２，０００　１１，０００１８〉２ρ００４ρ００　１，１００　５． ４００　＞２．０００　５，４００第１５表に言及する。この表は、この発明の 好ましい態様のだめの測定調製条件、並びにＲＩＡゾロダクツの非煮沸キット及 びジアグノスチック・プロダクツの非煮沸キットの標準的測定調製条件を示す。

この表はさらに、第９表、第１３表及び゛第１４表において検討したように、こ れらのキットのそれぞれにおいて行われた変形を示すデートをふくむ。第１５表 においてはさらに、この発明の好ましい態様、並びにＲＩＡ　プロダクツのキッ ト及びジアグノスチック・プロダクツのキットの比較が容易である。各非煮沸試 験法において、同じ出発容量の血清試料が使用されることが明らかである。試料 の出発容量は臨界的ではなく、選択事項であるが、いうまでもなく、他のすべて の方法及び成分を使用する試料の容量に合わせて調整しなければならない。次に 、標準的ＲＩＡプロダクツ法及びジアグノスチック・プロダクト法においてはビ タミンＢ１２類似体が使用されないのに対してこの発明の好ましい態様において はコビンアミド類似体が使用されることが注目される。次に、各方法において強 塩基ＮａＯＨが使用されるが、この発明の好ましい態様における塩基濃度がそれ ぞれ、ＲＩＡプロダクツのキット及びジアグノスチック・プロダクツのキットに おける塩基濃度に比べて約２２チ〜約６５チ高い。他の成分とその濃度との組合 わせにおいて、内因性結合蛋白質から内因性ビタミンＢ、２を最も完全に遊離せ しめる点において、そして内因性結合蛋白質とＩＦ遮断抗体の最初の不活性化又 は破壊において、塩の濃度が重要な因子であることが理論付けられる。この発明 の幾つかの理論の１つは非煮沸測定調製によっては、内因性ビタミンＢ１２から 遊離する内因性結合蛋白質又は他の形で存在する内因性結合蛋白質が実質上完全 に破壊又は阻害されず、そして、破壊又は阻害されなかった結合蛋白質がサンプ ル中の内因性ビタミンＢ１□及び／又は添加した放射性ビタミンＢ１２と結合し 、このいずれかの反応によシ誤まったビタミンＢ１２の読み値が得られるという ことである。したがって、ビタミンＢ１２から遊離した又は試料中にその他の形 で存在する実質上すべての内因性結合蛋白質と結合することができる類似体を添 加することは理論的であシ、そして、これにより、さらに正確な測定値をもたら すであろう血清測定調製法及び組成物が供される。コパンアミドは、入手が簡単 であシ、コストが安いために選択される。しかしながら、内因性結合蛋白質と結 合することができ、そして測定において結合剤として使用される固有因子を阻害 又は妨害しない他のビタミンＢ、２類似体も、この発明の方法及び組成物にとっ て実質上重要である。

それぞれの方法にシアン化カリウムを使用するが第１５表には示してない。測定 用調製にシアン化物を存在せしめることは、長い間、試験すべきビタミンＢ１２ をその最も安定な型であるジアノコバラミンに変えるための標準的方法とされて いた。すでに述べたように、イキキション等は、強塩基とシアン化物との結合わ せによシ、卓越したビタミンＢ１２の遊　離が得られることを示している。この 発明は、第１表に示すごとく、そして、いずれも強塩基及びシアン化物を使用し ているＲＩＡプロダクツのキット及びジアグノスチック・プロダクツのキットに ついての第９表、第１３表及び第１４表に示すごとく、シアン化物と強塩基との 組合わせは、それのみでは最適なビタミンＢｉ２の遊離を供さないことを明らか にしてる。

各方法においては、抽出過程でＤＴＴを使用する。

ＲＩＡプロダクツのキット及びジアグノスチック・プロダクツのキットはいずれ も、ビタミンＢ１２と葉酸の同時測定を意図していること、及びＤＴＴのごとき スルヒドリル化合物を葉酸の安定化のために使用することはこの技術分野におい てよく知られていることにまず注目する必要がある。しかしながら、この発明に おいては、スルヒドリル化合物は第１にその公知の性質のためにジスルフィド蛋 白質破壊化合物として使用され、この用途は前から期待されておらず又は認識さ れていなかった。そして、このものは、内因性結合蛋白質から内因性ビタミンＢ １２を遊離せしめ、そして被験試料中に存在する又は存在するかもしれない内因 性結合蛋白質及びＩＦ遮断抗体を実質上破壊するという用途を有する。第３表に 示したように、そしてそれに関連して検討したように、蛋白質破壊化合物のタイ プと量の選択は、破壊に対して耐性を有するＩＰ遮断抗体を含有する試料におい ては臨界的である。この発明の好ましい態様において使用するＤＴＴの濃度は、 ＲＩＡプロダクツのキットで使用されるＤＴＴの濃度とジアグノスチック・プロ ダクツのキットで使用されるＤＴＴの濃度の中間にあることに注意する必要があ る。しかしながら、さらに、表に示したごと（、ＲＩＡプロダクツのキット及び ジアグノスチック・プロダクツのキットにおいては、実質的な数のＩＦ遮断抗体 を含む低ビタミンＢ１２試料、及び実質的な数の高ビタミンＢ、２ＣＭＬ試料を 、そのように認定することができないことに注意する必要がある。さらに、最大 量のＤＴＴを含むＲＩＡプロダクツのキットは、ＣＭＬ患者のビタミンＢ１２分 析において最悪の結果を供することが注目される。高濃度のＤＴＴによシ、ＣＭ Ｌの分析において及び／又はＩＦ遮断抗体を伴なわない低ビタミンＢ１２の分析 において、新たな鴫差が生ずると考えられる。従って、この時間で、科学的な確 実性をもってビタミンＢ１２測定用試料の調製において使用できるスルヒドラル 化合物の特定の濃度を示すことはできない。最適の非煮沸試験法のためにスルヒ ドラル化合物と、他の成分の量及びタイプとの関係が重要であることは明らかで ある。もちろんスルヒドリル化合物の−ＳＨ部分がジスルフィド蛋白質破壊能力 を有する部分であシ、そしてＤＴＴのごとき化合物はＢＭＥのごとき化合物の２ 倍の一田部分を有する。従って、この発明の他の成分と組合わせて使用するスル ヒドラル化合物の選択には、−８Ｈの濃度と構造を考慮すべきである。

又、コビンアミドはう因性結合化合物からの内因性ビタミンＢ１２の遊離を助け ることが知られる。このことは、測定調製組成物にコピンアミドを含む試料にお いて最も多量のビタミンＢ１２の遊離が起こることを示す第１表のデータにょシ 支持される。従って、コビンアミドは、試料中の内因性結合蛋白質と結合する用 途のみならず、試料中でビタミンＢ１２の遊離を助けるという用途を有する。さ らに、類似体は内因性結合蛋白質からビタミンＢ、２を取シ代える作用をし、こ のため溶液中の内因性結合蛋白質−ビタミンＢ１２複合体の濃度を希釈し、そし てさらに遊離を進める方向にビタミンＢ１２　からの内因性結合蛋白質を遊離す る反応を促進する。

ＲＩＡプロダクツのキット及びシアゲスチック・プロダクツのキットでは、調製 中の血清に強塩基を加える前に、室温において実質的なインキュベーション時間 が認められるのに対し、この発明の好ましい態様においては、他の測定調製成分 と同時に又はそれと共に強塩基を加える。試料中の実質上すべての内因性結合蛋 白質を破壊し又は阻害し、そしてこれがビタミンＢ、２と再結合すること又は放 射性ビタミンＢ１２と結合することを防止する必要があること、そして強塩基は 強力な蛋白質破壊物質であるので、強塩基の同時的又は早期的添加によシビタミ ンＢ１２と内因性結合蛋白質との再結合及び放射性ビタミンＢ１２と内因性結合 蛋白質の結合が阻害され、両種類の遊離されたビタミンＢ１２の量が最適レベル に維持されることが認められる。

この発明の好ましい態様によシ達成された実験結果及びこの発明のはじめの原形 的方法並びにＲＩＡプロダクツのキット及びジアグノスチック・プロダクツのキ ットによシ達成された比較の結果から、抽出時における溶液の濃度（又は容量） 、成分の性質及び量、並びに種々のインキュベーション時間は、ＩＦ遮断抗体を 含有する試料又はＣＭＬ患者の試料を測定する場合には、相当重要である。ＩＦ 遮断抗体を伴わないビタミンＢ、２欠乏患者の試料についてＲＩＡプロダクツの キットによシ得られたデータの解析か゛ら、このことは実際の測定時においても 真実であることが示される。これらのことがら、ビタミンＢ１２の測定に使用す る調製及び測定方法のそれぞれの成分及びその組合わせ、量、濃度及び種々のイ ンキュベーション時間の選択において、工Ｆ遮断抗体を伴う及び伴わないビタミ ）’　Ｂ１２欠乏患者からの試料、並びにＣＭＬ患者からの試料を使用するのが 重要であることが明らかである。追加のそして他の患者を使用すればこの発明の 原形的方法並びにＲＩＡプロダクツのキット及びジアグノスチック・プロダクツ のキットは科学的にも臨床的にも容認できないのに、第２．９．１１．１２．１ ３及び１４表に示されているように少数の患者試料のみを用いれば、前記の方法 が科学的にも臨床的にも容認しう′ると認められるがもしれないから、測定方法 を確認するために１人よシ多くの、そして各群からの少人数よシ多くの患者から の試料を使用する必要があることが示されている。最後に、第１５表は、標準Ｒ ＩＡ　７’ロダクツのキット及び標準ジアグノスチック・プロダクツのキットに 、ビタミンＢ、２類似体、コビンアミドの添加、強塩基、ＮａｏＨ及びスルヒド ラル化合物（ＤＴＴ　）の濃度の調節、及び容量従って又試験溶液の濃度及び試 験方法の観点がら変更が加えられたこ、とを示す。第９．１３及び１４表は、こ のような変更を行うことによシ、市販のキットをこの発明の好ましい態様によシ 達成されたように条件の改良を行うことができる。最初の成分に若干の制限があ シ、そしてさらに、実際の成分が完全に知られていないから、キラ６トを、この 発明の好ましい態様と同等な正確さと確実さを有するように変えることはできな い。それにもかかわらず、変更によシキットを改良し、臨床的に容認できるレベ ルにすることができる。

この明細書において、「臨床的に容認できる」なる用語は、実質上１００チ正確 であることを意味することを意図する。例えば、ＩＦ遮断抗体を破壊することが 困難なために試料≠１１において誤りが生じている第３表に関し、この′不正確 さが患者のビタミンＢ１２欠乏に関する診断の誤シを導びいたかもしれない。こ のビタミンＢ１２欠乏の診断と治療の誤シによシ、潜在的な致命的な血液及び又 は神経異常が進行したかもしれない。神経の異常が一度進行すれば、その後ビタ ミンＢ１２で治療しても回復しないという深刻な結果となる。

第１６表に関し、コーニング参照煮沸法、ＲＩＡプロダクツ非煮沸法、ジアグノ スチック・プロダクツ非煮沸法、とこの発明の非煮沸法の標準曲線間の比較を行 った。これらの標準曲線は、固有因子に結合した多数の放射能カウントを示して おシ、これが既知試料中の非放射性ビタミンＢ１２　（ｐｇＡＩＬ！りの量に相 当する。まず、コーニング参照測定法の曲線とこの発明の非煮沸測定法の曲線は 実質上相互に区別できない。ＲＩＡプロダクツのキットの標準曲線とジアグノス チック・プロダクツのキットの標準曲線はコーニング測定のそれと異るが、これ らの曲線に再現性がある限シ、このような相異は問題とならない。しかしながら 、第６表に示した４つの測定のいずれかにおいて、偽変動すなわち被験試料中の ビタミンＢ１２の量に関係ない変動があれば、１０％であっても、測定すべき被 験試料中の非放射性ビタミンＢ１２の量が”大きく変動する。この発明の教唆と 分析に基き、ＲＩＡプロダクツのキット及びジアグノスチックプロダクツのキッ トを使用すれば、結合した放射性ビタミンＢ１゜の４６チという大きな偽変動が 生ずることが認められる。これは、これらのキットにおいては、結合したビタミ ンＢ１２のすべてが完全には遊離せずそして／又はすべての結合蛋白質が実質上 完全に阻害又は破壊されず、そして／又はすべてのＩＦ遮断抗体が完全に阻害又 は破壊されず、そして／又は破壊されなかった又は阻害されなかった内因性結合 蛋白質が結合されないためである。

この発明の好ましい態様において、測定のために試料を調製した後、これを中和 し、可溶性ＩＦと共にインキ、ペートシ、次にアルブミンをコードンタ木炭を加 えて未結合の試料ビタミ２　Ｂ１２及び放射性ビタミンＢ１□を吸着せしめる。

この発明の変法においては、試料を測定のために調製した後、中和し、可溶性成 分としてＩＦ結合剤を溶液に加えるかわシに系にＩＦを加えるための他の方法を 使用することができ、さらに良好な測定結果を供するものとして実際に好ましい 。使用されるＩＦの型はＩＦが共有結合的に結合した小さなガラスピーズからな るものである。このヨウナＩＦ−ガラスピーズは、コーニングの実験を基礎にし て作ることができる。このようなガラスピーズを使用する場合、測定の最終段階 は今まで述べたものと異る。前も゛って、アルブミンをコードンタ木炭を液に加 えて試料からの及び放射性の未結合ビタミンＢ１２を吸着せしめ、そしてＩＦに 結合した試料からの又は放射性のビタミンＢ１２を含有する上澄液を放射能カウ ントの測定に供する。ＩＦ−ガラスピーズを使用して、試料からの及び放射性の Ｂ１２をガラスピーズ上のＩＦに結合せしめる。ガラスピーズは、それを加えた 液体組成物に比べて比重が犬であるから、遠心分離によシ容易に管の底に沈降す る。そして、次に上澄液を除去することによシ、ガラスピーズ上のＩＦに結合し た自然の及び放射性のビタミンＢ１２を伴なったガラスピーズをのこす。そして 、試料中の自然ビタミンＢ１２の量を測定するために、容易に分離され、そして 取扱われたガラスピーズを放射能カウント測定にかける。第４〜１６表に示され たこの発明のすべてのデータは、可溶性ＩＦを溶液に加え、次に木炭を使用して 未結合ビタミンＢ１２を除去するのではなく、工Ｆ−がラスビーズを使用して集 収された。この発明に該当する少なくとも２つの理由のために、測定の終シにＩ Ｆ−ガラスピーズを使用することによシ、遊離ＩＦ及び木炭法に比べて正確な測 定値が得られると信じられている。

第１の理由は、工Ｆ−遮断抗体が、可溶性ＩＰと結合するのと比べて、工Ｆ−ガ ラスピーズの方にょシ良く結合するととである。第２の理由は、内因性結合蛋白 質への非特異的結合が、工Ｆ−ガラス測定法において未結合ビタミンＢ１２を伴 う上澄液中に存在し、そして、このために、内因性結合蛋白質への非特異的結合 がＩＰに結合したビタミンＢ１２と共に上澄区分に存在する可溶性ＩＦと木炭と を用いる測定法において生ずることがあるように試料ビタミンＢ１２の読が低く なることがない。もちろん、ガラス以外の妨害をしない固体材料に結合したＩＰ も、測定の際、同様に改良された性質を有する。

好ましい態様の変形に関連して、そして第１表及び第２表の検討において示した ように、この発明の最初の多くの研究は、ビタミンＢ１２の分析と共に葉酸の同 時分析ができる方法で行われた。さらに詳しくは、この発明の非煮沸方法及び組 成物は又、血清中での葉酸の非煮沸遊離にも有用である。第１７表に示すごとく 、ビタミンＢ１２と葉酸の同時的ＲＩＣ測定にはこの発明の教唆を使用すること ができる。葉酸のみを測定する場合には、方法及び組成物中にビタミンＢ１２類 似体を加える必要がないのは言うまでもない。もつとも、ビタミンＢ１２測定及 び葉酸測定に共通な試薬の調製において便利であれば存在してもさしつかえない 。

（騙 この発明を解析し、そして完成するのに使用したデータは、測定精度を決定する のに適当な科学的及び臨床的方法が必要であることを示すのに価値がある。もし 正常者のみを使用してビタミンＢ、２の試験をしたのであれば、又もしＩＦ遮断 抗体を有しない低ビタミンＢ１□の試料のみを試験したのであれば、あるいは又 、低ビタミンＢ、２であｐ、ＩＦ遮断抗体を含む少数の試料を試験したのであれ ば、あるいは又ＣＭＬ患者を試験しなかったのであれば、あるいは又、これらの 群のいずれかにおいて患者数が充分でなかったなら、■Ｆ遮断抗体の破壊が困難 な及び／又は困難でない低ビタミンＢ、２試料を検知するのに有効でなく、そし て／又は多くの内因性結合蛋白質を含む異状にビタミンＢ、２が多い試料を検知 するのに有効でない方′法又は組成物が得られたであろう。

これによ’）　、ＲＩＡ　７’ロダクツのキット及びジアグノスチック・ゾロダ クツのキットにおいて生ずるような誤まった測定が行われたであろう。最初は、 この発明は各試料のＩＰ遮断抗体は特別であシ、そして、ある場合にはＩＦ遮断 抗体は破壊することが非常に困難であシ、このためある試料の測定が不正確にな るという事実を認識した。第５表に示すごとく、この発明において非常に多数の 試料を試験することにより、ＩＦ遮断抗体の存在又は不存在に関係なく、そして ＩＦ遮断抗体を破壊することの困難さに関係なく正確な測定方法を完成すること ができた。

結論として、この発明の目的は達成された。この発明は、哺乳動物の血液、組織 及び血清のビタミンＢ１□、葉酸及びビタミンＢ１２と葉酸の両者を測定するた めの調製の段階において試料の加熱又は煮沸を行うことなく調製する方法を開示 し、そして教唆する。これらの目的を達成するため、被験試料からビタミンＢ１ □及び葉酸を遊離せしめる最適の方法及び組成物が決定された。さらに、ビタミ ンＢ、２のＲＩＤ非加熱測定法において内因性結合蛋白質によシ引き起こされる 問題を認識し、このような内因性結合蛋白質を実質上破壊し又は不活性化する方 法及び組成物を開発した。又、内因性結合蛋白質を結合するビタミンＢ１２類似 体を使用する未破壊の又はまだ阻害されていない結合蛋白質を結合する方法及び 組成物を開発した。最後に、固有因子蛋白質と反応し又はそれを遮断する試料中 に自然に存在する抗体の存在の問題を認識し、そしてこのようなＩＦ遮断抗体を 実質上阻害し又は破壊する方法及び組成物を作った。これらの方法及び組成物は 使用に便利であシ、煮沸測定法よ多段階が少なくてすみ、そして時間が節約でき る。さらに、この出願を通して詳述したように、この発明の好ましい態様は非常 に正確であシ、そしてある場合には実際に参照煮沸測定法に勝る。若干の好まし い組成物が、この出願において詳述されておシ、他の組合わせ及び濃度も教唆さ れている。内因性蛋白質を結合するビタミンＴＡ１□を伴う又は゛伴わない、少 なくとも２種類の蛋白質破壊組゛酸物の組合わせであるこの発明の種々の方法に 使用される成分の基本的な組合わせは、望ましい結果を得るのに有用である。好 ましい態様において、内因性結合蛋白質を結合するビタミンＢ１２類似体の量は 、例え、ば第４及び９表の試料＃６のような任意の試料に存在する内因性結合蛋 白質の最大量を完全に結合するのに十分なものとすべきである。もちろん、誤差 が容認される範囲内で、１０倍〜１００倍又はこれよシ多くのビタミンＢ１２類 似体を使用することができよう。

同様に、最も大量の、そして最も耐性の強いＩＦ遮断抗体が、この発明の組成物 及び方法において予想されるべきである。

この明細書において使用する「加熱」なる語は、温度を上昇せし′めるために物 質に積極的にエネルギーを加えることを言い、周囲環境との接触によ多温度が変 化する場合を含まない。この明細書において、ルギーを加えることによって生ず る通常の意味に用゛いる。「加熱することなく」とは物に積極、的にエネルギー を与えないことをいう。「非煮沸」及び「煮とを言う。この発明の組成物及び方 法は、ビタミンＢ、２及び／又は葉酸測定のための試料の調製にお！で加熱又は 煮沸を必要としない点において特（新規である空、この発明の教唆内でタロ熱又 は需沸を行うこともできる。

若干の好ましい態様を記載したが、１．Ｆ遮断抗体と実質的量の内因性結合蛋白 質とが遍在し、ない場合さらに、この発明の組成物は、この発明の方法に従°１ 使用するだめの便利な６″・トの彎にし・使用者手続補正書（方式） ％式％ １　事件の表示 ＰＣＴ／１３１１８２１００４２６ ２　発明の名称 ビタミン１．及び／又は葉酸化合物 測定用試料の調製並びに測定 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ユニパーシティ　パテンツ。

インコーがレイティド ４代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号（外３名） □ ６　補正の対象　− （１）　４Ｉ許法第１８４条の５第１項の規定による書面 （２）願書の翻訳文 （３）　明細書の一訳文第１頁 ７　補正の内容 別紙のＭＩシ ８　添付書類の目録 （１）　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　Ｌ通 （２）願書の翻訳文　１通 （３）明細書の翻訳文第１頁　１通 明　細　書 ｏ＊ｓｉ−並びＫ１１ｌ定 発明Ｏ分野 とＯ発羽は測定用Ｏ哺乳動物血及び組織を詞躾する九めｔｊ２Ｆ渋及び材料に関 し、さらＥｌｌ定に関する・さらに詳しくはビタミン”１１１　（コパツ（ｙ） 及び／叉は索酸化舎物（Ｉｌ酸）を霧室する丸めのヒト皇曹を真勇するため０２ 昧及び材料に関する。

先行技術 以前から、ヒトＯビタ電ン１．．ａｌｌ定は、ビタ建ｙ　ｌ、、　０欠乏を引龜 起ζすある種Ｏ病気、例えと暴性貧血、胃ＩＢ除Ｉｌ後Ｏ症状、栄養失調、腸障 書、λび／又紘ビｌ１ｙｌ、、０皇中レペ＃がしｄしば低下する倫ＯＩｉ状を診 断し、それに絖いて１＆僚するえめＯ有用な技法であると認められている。とト におけるビタ電ンＩＩ、、０測定はさらに、ある種Ｏ骨髄増殖狭１、例えばビタ ｔ　）’　１１！　０血中し４ｋがしとしと上昇する慢性骨髄性白血病０鯵断に も有用である。

最初、ビタ建ン慕１．絋、例えと為−ダレナ・ダラシれかを用いて、微生物学的 測定法によ）霧室されて国際調香−［有］ １１１１６１１１・１１・−＾１１ＦＩＩ（＾鴎＾Ｎ・ｐｃｒｎｒｓ　Ｆｌ　ｌ ｔ　ｎ　ｎ７．　）　ｔ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物の血液、組織又は血清のビタミンＢ１２（コバラミン）測定用試料 の調製に使用するための内因性ビタミンＢ１２結合蛋白質と結合する物質を含ん で成る組成物及び測定。 ２、内因性結合蛋白質と結合する物質が、固有因子（ＩＦ）と実質上結合せず、 ＩＦのビタミンＢ１゜との結合能を妨害しないビタミンＢ１２類似体を含む請求 。 の範囲第１項記載の組成物。 ３、　ビタミンＢ１２類似体がコビンアミド、ＣＮ−Ｃｂｔ−（ｂｄｅ−ＯＨ） 及び（３，５，６ＭｅＪＢＺＡ）　（ＣＮ　−０Ｈ）Ｃｂａから成る群から選ば れる請求の範囲第２項記載の組成物。 ４、結合物質が、試料調製中の任意の時点において存在する実質上すべての未破 壊の又はまだ阻害されていない内因性結合蛋白質と結合するのに十分な量存在す る請求の範囲第１項記載の組成物。 ５、試料調製中に、ビタミンＢ１２類似体を試料２００　ｔＬｔに対して約１ｎ ｇ〜約１　（ＬＯ００ｎｇの濃度範囲で存在せしめる請求の範囲第２項記載の組 成物。 ６、試料調製中に、ビタミンＢ１□類似体を試料２００ｇに対して約２０ｎｇ〜 約１＊ＯＯＯｎｇの濃度範囲で存在せしめる請求の範囲第２項記載の組成物。 ７、　内因性結合蛋白質及び固有因子（ＩＦ）　ｍ断抗体物質を含む請求の範囲 第１項記載の組成物。 ８、　内因性結合蛋白質を結合する物質、並びに、内因性結合蛋白質及びＩＦｆ ｉ断抗体全抗体しそして／又は阻害する物質が内因□性結合蛋白質から実質上す べての試料ビタミン”１２を遊離せしめるのに十分な総合量存在し、そして前記 の内因性結合蛋白質及びＩＦ遮断抗体破壊物質が、試料調製中の任意の時点にお いて存在する実質上すべての内因性結合蛋白質及びＩ’Ｆ遮断抗体を破壊しヤし て／又は阻害するのに十分な総合量存在する請求の範囲第７項記載の組成物。 ９、内因性結合蛋白質及び／各はＩＦ遮断抗体を破壊しそして／又は阻害する物 質の１つが強塩基である請求の範囲第７項記載の組成物。 ２２３強塩基、ｆＮａＯＨ，、ＫＱ）！及びＬｉＯＨから成る群からの濃度範囲 で存在せしめる請求の範囲第９項記載の組成物。 １２、強塩基を試料調製中に約０．１Ｎ〜約１．ＯＮの濃度範囲で存在せしめる 請求の範囲第１０項記載の組成物・ ・１３．　内因性結合蛋白質及びＩＦ遮断抗体を破壊しそして／又は阻害する物 質の１つがジスルフィド蛋白質破壊物質である請、不の範囲第７項記載の組成物 。 １４、ジスルフィド蛋白質破壊物質がスルヒ゛ドラル化合物である請求の範囲第 １３項記載の組成物。 １５、スルヒドラル化合物がベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、チオグリ コレート、チオグリセロール又はジチオスレイトール（ＤＴＴ　）がら選ばれる 請求の範囲第１４項記載の組成物−０ １６、スルヒドラル化合物を、試料調製中に約０．００４Ｎ〜約０．４Ｎの濃度 範囲で存在せしめる請求の範囲第１４項記載の組成物。 １７、スルヒドラル化合物を試料調製中に約０．０４Ｎ〜約０．１ＯＮ存在せし める請求の範囲第１５項記載の組成物。 １８、スルヒドラル化合物及び強塩基が内因性結合蛋白質及びＩＦ遮断抗体を破 壊する少なくとも２種類の物質を含む請求の範囲第７項記載の組成物。 １９、内因性結合蛋白質と結合する物質がコビンアミドを含み、スルヒドラル化 合物がＤＴＴを含み、そして強塩基がＮａＯＨを含む請求の範囲第１８項記載の 組成物。 ２０　試料調製中にコビンアミド、ＤＴＴ及びＮａＯＨが内因性結合蛋白質から 実質上すべての試料ビタミンＢｉ２　’Ｚ遊離せしめるのに十分な総合量存在し ；試料調製中ＮａＯＨ及びＤＴＴが実質上すべての内因性結合蛋白質及びＩＦ遮 断抗体を破壊しそして／又は阻害する１のに十分な総合量存在し；そして試料調 製中にコビンア、ミドが実質上すべての未破壊の又はまだ阻害されていない内因 性結合蛋白質と結合するのに十分な量以上に存在する請求の範囲第１９項記載の 組成物。 ２１、試料調製中にコビンアミドが任意の時点において試料中に存在する実質上 すべての内因性結合蛋白質と結合するのに十分な量以上に存在し、ＤＴＴが約０ ．０４Ｎ〜約０．１０　Ｎの濃度範囲で存在し、そし請求の範囲第１９項記載の 組成物。 ２２、哺乳動物の血柩、組織又は血清のビタミンＢ１２及び／又は葉酸測定用試 料の調製に使用するための強塩基及びジスルフィド蛋白質破壊化合物を含む組成 物。 ２３、強塩基がＮａＯＨ、ＫＯＨ及びＬｉＯＨからなる群から選ばれ、そしてジ スルフィド蛋白質破壊物質がベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、チオグリ コレート、チオグリセロール及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）カら成る群から 選ばれたスルヒドラル化合物であ゛る請求の範囲第２２項記載の組成物。 ２４、強塩基がＮａＯＨを含み、スルヒドラル化合物がＤＴＴを含む請求の範囲 第２３項記載の組成物。 ２５、試料調製中にＮａＯＨが約０．１Ｎ〜約１．　ＯＮの濃度範囲で存在し、 そしてＤＴＴが約０．０４Ｎ〜約０．１ＯＮの濃度範囲で存在する請求の範囲第 ２４項記載の組成物。 ２６、組成物中にビタミンＢ、２類似体が含まれる請求の範囲第２２項記載の組 成物。 ２７、組成物中に放射性ビタミンＢ１゜が含まれる請求の範囲第１項、第８項、 第２０項、又は第２１項記載の組成物。 四、請求の範囲第８項、第２０項、第２１項、第又は第２１項の組成物で処理す ゛る段階を含む哺乳動物の血液、組織又は血清のビタ奢ンＢ１２測定用試料の非 煮沸、非加熱的調製方法。 ３０、試料を請求の範囲第３２項又は第２４項の組成物で処理する段階を含む哺 乳動物の血液、組織又は血清のビタミンＢ１２及び／又は葉酸°を測定するため の試料の非煮沸、非加熱的調製′方法。 ３１、測定調製中の試料を前記の試料調製用組成物で実質上同時に処理する請求 の範囲第２９項記載の方法。 ３２、試料を、周囲条件下で、内因性結合蛋白質及びＩＦ遮断抗体を破壊しそし て／又は阻害する少なくとも２種類の物質で処理する段階を含む哺乳動物の血液 、組織又は血清のビタミンＢ、２及び／又は葉酸を測定するための試料の調製方 法６ ３３、試料が内因性結合蛋白質に結合する物質によってさらに処理される請求の 範囲第３２項記載の方法。 あ、調製中の試料が、内因性結合蛋白質及びＩＦ遮断抗体を破壊しそして／又は 阻害する２種類の物質によシ、実質上同時に処理される請求の範囲第３２項記載 の方法。 ３５、調製中の試料が内因性結合蛋白質と結合する物質によってさらに処理され る請求の範囲第３５項記載の方法。 ３６、試料と処理物質の混合物が周囲条件においてインキュベートされる請求の 範囲第３２項又は第３３項記載の方法。 ３７、インキュベーションの後、ＩＦが混合物に加えられる請求の範囲第３６項 記載の方法。 ３８、ＩＦが固体非妨害担体に溶けないように結合している請求の範囲第３７項 記載の方法。 ３９、固体担体がＩＦｉ共有結合によ多結合した多数のガラスピーズである請求 の範囲第３８項記載の方法。 ４０、試料を、ビタミンＢ１２類似体、約０．０４Ｎ〜約０．ＩＮの濃度範囲の ＤＴＴ　％及び約０．３Ｎ〜約１．ＯＮの濃度範囲のＮａ　ＯＨで実質上同時に 処理し、そしてこの混合物を周囲条件においてインキュベートする段階を含んで なるヒト血清のビタミンＢ１２ＲＩＤ測定用試料の室温調製法。 ４１、インキュベーション後、混合物を約４〜約１０の一範囲に中和し、そして 固体非妨害担体に結合したＩＦを加える請求の範囲第４０項記載の調製法。 ４２、ＩＰ遮断抗体を伴う又は伴わない実質的な数の低ビタミンＢ１２試料大前 記の測定方法によシ測定し、そしてその結果を確かな参照測定と比較する段階を 含んでなるビタミンＢ１２測定用試料の調製方法及び測定を確認する方法。 ４３、測定用試料の調製方法を周囲条件において行う請求の範囲第４２項記載の 方法。 必、異状に高い内因性結合蛋白質を伴う対象からの実質的数の試料を前記の方法 によシ処理し、そして結果を確かな参照測定と比較する段階を含んで成るビタミ ンＢ１□測定用試料の調製方法、及び測定を確認する方法。 ４５、測定用試料の調製方法を周囲条件下で行う請求の範囲第４４５項記載の方 法。 ４６、異状に高い内因性結合蛋白質を伴う試料源が慢性骨髄性白血病患者である 請求の範囲第４４項又は第４５項記載の方法◎ ４７、放射性ビタミンＢ、２が組成物中に含まれる請求の範囲第２７項又は第２ ４項記載の組成物。