JPS584576B2 - トクシユシユウチヤクザイ オヨビ ソノセイゾウホウホウ - Google Patents

トクシユシユウチヤクザイ オヨビ ソノセイゾウホウホウ

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JPS584576B2
JPS584576B2 JP50049229A JP4922975A JPS584576B2 JP S584576 B2 JPS584576 B2 JP S584576B2 JP 50049229 A JP50049229 A JP 50049229A JP 4922975 A JP4922975 A JP 4922975A JP S584576 B2 JPS584576 B2 JP S584576B2
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gel
reaction
peptide
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CHEKOSUROBUNSUKA AKADEMII BUEDO
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特にアフイニテイークロマトグラフイーに利
用可能であり、また、ペプチド的基質のＤ−類似体を用
いてアミノ酸やペプチドを親水性巨大気孔質ゲル上に結
合させることによってえられる特殊な収着剤、及びその
製法に関するものである。
とのようにして形成された優れた特性を有する合成イン
ヒビターは、アフイニテイークロマトグラフイーに利用
される。
不溶化インヒビターを用いるアフイニテイークロマトグ
ラフイーは、たんぱく加水分解用酵素（ ｐｒｏｔｅｏ
ｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）の単離用として最も最新の
方法の一つであるが、これらインヒビターはそめたんぱ
く加水分解性の故に２〜３回の使用により不可逆的な不
活性化が起り、工業的な目的にはあまり適当ではない。
本発明の目的は、アクリル酸およびメタクリル酸
のヒドロキシアルキルエステル類およびヒドロキシアル
キルアミド類と、架橋性アクリレートまたはメタクリレ
ート共単量体とを共重合反応せしめ、得られた重合体ゲ
ルにＤ−アミノ酸または１個ないしそれ以上のＤ−アミ
ノ酸単位を有するペプチド基を共有結合によって結合さ
せて得られる収着剤にある。
これらの特殊収着剤は、有利には巨大気孔質構造を有す
るものである。
土台となるゲル担体は、ジアミン類（たとえば、１，６
−へキサメチレンジアミン）、アミノ酸類（たとえば、
ε−アミノカプロン酸）およびジカルボン酸類．（たと
えば、グルタン酸）よりなる化合物群より選ばれたカル
ボキシ末端管能基またはアミノ末端管能基を有する化合
物との反応によって変性される。
このように変性されたゲル担体は、さらに常法によりＤ
−アミノ酸もしくはその誘導体または連鎖中に１個また
はそれ以上のＤ−アミノ酸を有するペプチド体（オリゴ
ペプテドを含む）と縮合せしめられる。
この縮合反応は、アミノ酸またはペプチドの活性なエス
テル（たとえば、トリクロロフェニルエステル）または
１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒ
ドロキ／リンのような縮合化剤とともに行なうことがで
きる。
また、この特殊収着剤は、担体表面に結合性のペプチド
を段階的に縮合結合させることによっても調製される。
かくしてえられるこれらの収着剤は、すべて酵素のアフ
イニテイークロマトグラフイーに用いられて、好結果を
与えるものである。
かくして、たとえば、ペプチド的基質のＤ−類似体のよ
うな低分子量の合成インヒビターよりえられる特殊収着
剤は、それがたんぱく加水分解性酵素の共存下に安定し
て存在しうるゆえに、プロテアーゼ類の単離に好適に用
いられる。
仮りにこの収着剤の能カが繰返し使用で減退しても、た
とえば、６Ｍのグアニジンヒドロクロリドの溶液で洗滌
することにより完全に回復しうる。
チェコスロヴアキア特許第１４８．８２８号および１５
０，８１９号によってえられるヒドロキシアルキルアク
リレートおよびヒドロキイアルキルメタクリレートゲル
、またはチェコスロヴァキア特許第１４７，１１３号、
１４７．１５２号、１ ４ ９，３７６号および１５４
，３８１５号およびチェコスロヴアキア特許出願ＰＶ２
８ ７ ９ − ７ ４によるヒドロキシアルキルア
クリルアミドおよびヒドロキシアルキルメタクリルアミ
ドゲルは効果的にこの特殊収着剤製造用担体として用い
られる。
しばしば用いられる担体アガロース（ ａｇａｒｏｓｅ
）とは異なり、これらは通常の有機溶媒中での反応に
より変性を受けることができる。
この方法でえられる収着剤の利点としてはさらに、保護
用の化合物を付加する必要なく容易に乾燥しうろことで
あり、乾燥状態で貯蔵可能なことが挙げられる。
顕著な機械的および加水分解安定性が、非特定収着効果
がないこととともに工業的規模での利用性を高めるもの
である。
高分子体マトリックスに結合したペプチドの低分子量性
を考えると、インヒビターとゲル表面との間にいわゆる
スペーサーと称する表面から管能性分子を離隔する連鎖
体を挿入する方が望ましい。
このことからこの特殊吸着剤は、たとえば、１，６−ヘ
キサメチレンジアミンまたはξ−アミノカプロン酸など
のような付加連鎖を含有するヒドロキシアルキルメタク
リレートゲルより製造されるほうが有利となる。
ヒドロキシアルキルメタクリレートゲルに結合したアミ
ノアシルないしペプチド誘導体の製法は、ペプチド合成
の原理に従って行なわれる。
有機溶媒が有効な反応媒体として（低溶解性ペプチド誘
導体の場合は、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムア
ミドまたはＮ，Ｎ’，Ｎ”−ヘキサメチルホスホトリア
ミドが最適である。
）通常の縮合剤（１−エトキシカルボニル−２−エトキ
シ−１，２−ジヒドロキノリンまたは活性なエステル類
が最適である。
）とともに用いられる。この反応は、また可溶性のカル
ボジイミドを用いて水性媒体中でも行なうことができる
。
アミン基の保護用に適した管能基としては、ｔｅｒｔ−
ブチルオキビカルボニル基（トリフルオロ酢酸によって
開裂可能）またはペンジルオキシカルボニル基（３３％
の具化水素酢酸溶液により開裂しうる。
）が挙げられる。２−ニトロベンゼンスルフエニル基は
、その開裂時に生じる着色性副生物（たとえば、メタノ
ール中塩化水素で開裂するとメチル−２−ニトロベンゼ
ンスルホネートが生じる。
）が洗滌一難であり、かつ、高分子体に不可逆的に結合
してしまうため不適当である。
カルボキシル基は、トリフルオロ酢酸によって開裂可能
なｔｅｒｔ−ブチルないしペンズヒドリル基で保護する
ことができる。
適当に保護されたアミノ酸誘導体ないしオリゴペプチド
は、結合した第一級アミン基を有する担体に付加される
。
すべての保護基または選択的にＮ−α−基は、反応完結
時に開烈され、反応に用いられた溶媒で洗滌され、６Ｍ
のグア斗ジンヒドロクロリド水溶液で洗滌され、そして
乾燥される。
組み込まれるアミノ酸成分の量は、その構造に左右され
る。
一般にグリシンがもつとも結合されやすく、アシルされ
うるゲル中に存在する−ＮＨ２基の量の測定用に用いら
れている。
アミン基含有の担体にペプチドを段階的に形成すること
は、カルボキシ末端基を有するアミノ酸残基とともに反
応を始めれば可能である。
１時的にＮ−α−基を保護する基は常法により開裂され
、その後のアミン酸誘導体またはペプチド体フラグメン
トの付加は再び活性なエステルまたは１−エトキシカル
ボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンによ
って実施される。
縮合反応においては、個々のアミノ酸残基が異なった反
応性を有するため、そのうちの幾つかが不完全な連鎖を
有するペプチド混合体は、ヒドロキシアクリレートゲル
重合体上へのペプチド体フラグメントの段階的な結合な
いし形成を行なってはじめて重合体表面に付加される。
ヒドロキシアルキルメタクリレートゲルの巨大気孔質構
造ぽ、従来通常の縮合反応に用いられているポリスチレ
ンゲルの均一膨潤性三次元網状構造体よりも縮合反応を
高収率で行なえる有利性を有するし、置換総量が少なく
ても均一性のある製品をえることができる。
例えばヘキサペプチドの合成は、以下の方法のいずれか
によって行なうことができる。
（ａ）ペプチド体を担体表面に段階的に結合させる。
（ｂ）トリペプチドを担体に結合させ、ついでこれを次
のトリペプチドと縮合させる。
（Ｃ）へキサペプチドを別途合成し、これを担体に結合
（不溶化）させる。
ヘキサペプチドの段階的形成（ａ）においてだけでなく
、二つのトリペプチドフラグメントの縮合においてさえ
も、収率は低くなるが、均一性のある製品を得ることが
できる。
また、ペプチドまたはアミノ酸とヒドロキシアルキ
ルメタクリレートゲルのカルボキシル誘導体とを結合さ
せるのに同じ方法が使われる。
反応ペプチド成分のカルボキシル基は、酸で開裂しうる
エステル基で保護されている。
アミノ酸およびペプチドをスフエロンのヒドロキシアル
キルメタクリレートゲルに結合させた結果を、以下の第
１表に示す。
ここで、スフエロンとは、２−ヒドロキシエチルメタク
リレートとエチレンジメタクリレートの共重合体につい
ての商標名である。
第１表には、対応する誘導体中に共有結合的に結合した
アミノ酸の量および反応の型を示す。
アフイニテイークロマトグラフイーにおける特殊収着剤
の利用の際の重要な点は、単離したプロテアーゼ類を高
収率、かつ、高純度でえることである。
すなわち、たとえば、きかび（ ｍｏｕｌｄＡｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｙｕｓ）よりえられるタンパク加
水分解操作でアミノペプチダーゼを単離する際に、一段
アフィニティークロマトグラフイーによる製品の活性（
２．１９単位／ｍｇ−プロテイン）は、日本の著者ら（
Ｎａｋａ−ｄａｉ ｅｔ ａｌ． Ａｇｒ．Ｂｉｓｌ
．Ｃｈｅｍ．１９７３，３７，７５７）によりアスペ
ルギウスオリザエ（ Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ ｏｒ
ｙｚａｅ ）よりの粗酵素溶液から竺離さ些たアミノペ
プチダーゼの活性（２．１２単位／ｍｇプロテイン）と
比肩することができる。
しかしながら、後者の単離は、非常に労力多い方法で行
なわれており、すなわち、アンバーライトＩＲＣ（メタ
クリル酸の架橋重合体）憾収着させ、硫酸アイモニウム
で分別させ、リバノールでの沈殿化、ＤＥＡＥセルロー
スによるクロマトグラフィ、ついでセファデックス（
Ｓｅｐｈａｄｅｘ ）Ｇ−２００とＧ− １ ０ ０上
でのゲルによるクロマトグラフイにようて単離操作が行
なわれている。
その収率は、処理原料の活性分の０．４３８％にしかな
らない。
しかし、本発明による特殊収着剤でのアミンぺプチダー
ゼ活性分収率は、ほとんど１００％である。
なお、ＤＥＡＥセルロースとは、フイブリル状もしくは
粒状セルロースのジエチルアミンエチル誘導体（Ｗｈａ
ｔｍａｎＣｏ．の製品）であり、セファデツクスＧ−２
００とは、分子量排除限界２００，０００ダルトンの架
橋均質ポリデキストラン（スウェーデン国ウプサラのフ
ァーマシア、フィン、ケミカルズ社の製品）であり、セ
ファデツクスＧ−１００とは分子量排除限界１００，０
００ダルトンを有する上記ポリデキストランである。
本発明の目的は以下の実施例でさらに説明されるが、こ
れら実施例により本発明の範囲は限定されるものではな
い。
実施例 Ｉ Ｚ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＮＨ−Ｓｐｈｅｒｏｎ２−ヒ
ドロキシエチルメタ：クリレートとエチレンジメタクリ
レートとの共重合体（１ｇ、Ｓｐｈｅｒｏｎ３００）を
特願昭４８−３５１４９号の方法にしたがい臭化シアン
で活性化しながら１，６−ヘキサメチレンジアミンとの
反応を行なわしめることにより化学的変性を行なった。
テトラヒドロフラン５ｍｌ中のこのゲルのサスペンジョ
ン中にトリエチルアミド（０．５ｍｌ）を加え、室温下
時折攪拌しながら１０分間放置した。
ついで、このゲルをろ別し、溶融ガラスフィルター上で
５ｍｌづつのテトラヒドロフランにより３回洗滌した。
ついで、．フラスコに移し、５ｍｌのテトラヒドロフラ
ン、８９ｍｇのベンジルオキシカルボニル（２と略称）
−グリシル−Ｄ−ロイシンと１２５ｍｇの１−エトキシ
がレボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシリン
を加えた。
この混合物をシェーカー中で５時間振とうし、ついで５
０ｍｇの試薬キノリンを加え、さらに、１０時間振とう
を続けた。
サスペンションは、ついで、５０ｍｌのテトラヒドロフ
ランで洗滌し、ゲルはろ別して乾燥した。
製品はアミノ酸含量が分析され、ついで、アフイニテイ
ークロマトグラフイーに用いられた（第１表中の１行目
参照）。
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＮＨ−Ｓｐｈｅｒｏｎ上での
アフイニテイークロマトグラフィーによる高活性キモト
リプシンの単離 キモトリプジン（１００ｍｇ、ＡＴＥＥ上でのエステラ
ーゼ活性１３２μモル／ｍｉｎ．ｍｇ）をｐＨ８．０の
０．０５ＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝溶液１０ｍｌ中に溶
解し、約４０ｍｌの体積のＺ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｎ
Ｈ−Ｓｐｈｅｒｏｎゲルのカラム（１００μモルＬｅｕ
／ｇゲルを含有）に浸した。
酵素状およびインヒビター分子の結合座の配向を許すよ
うに、浸漬後の最初の１０分間０．０５ＭのＴＲＩＳ−
Ｈｃｌ緩衝溶液での溶離を始のた。
第１のフラクションにはキモトリプシン活性のない物質
が含まれていた。
活性のキモトリプシジはアンモニアの添加によりｐＨが
３．１に調整された０．１Ｍ酢酸によりゲル中から溶離
した。
これを０．０２５Ｍの酢酸アンモニウム中でセファデツ
クスＧ２５（分子量排除限界２５０００ダルトンのポリ
デキストランゲル）により脱塩したのち、５４ｍｇのキ
モトリプシンがえられ、これはエステラーゼ活性２４８
μモル／ｍｉｎ．ｍｇを有していた。
エステラーゼ活性はＡｘｅｎとＥｒｎｂａｄｋ（Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｃｉｍ．１９７９，１８，３５１）に
よってＡＴＥＥ上で測定した。
実施例２ カルボキシーＳｐｈｅｒｏｎでアシル化されたＤ−フエ
ニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ−ＣＯＯ−Ｓｐｈｅｒｏｎ）
２−ヒドロキシエゲルメタクリレートとエチレンジメタ
クリレートとの共重合体（Ｓｐｈｅｒｏｎ７００）をξ
−アミノカプロン酸と反応させてえられたＨＯＯＣ−Ｓ
ｐｈｅｒｏｎ（０．９０ｇ）を、５ｍｌのゲトラヒドロ
フラン、２．２３ｇのＤ−ラエニルアラニンベンズヒド
リルエステルおよび０．１７２ｇの１−エトキシカルボ
ニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンと混合
した。
混谷物は６時間振とうし、さらに５０ｍｇの前記キノリ
ン誘導体を加え、ついで、４時間振とうを続けた。
固形物をろ別し、テトラヒドロフラン、水、エタノール
およびエーテルの順で洗滌し乾燥した。
試料（５０ｍｇ）のアミノ酸含量を分析した。
保護基を開裂するたのに、重合体は、３ｍｌのトリフル
オロ酢酸中に分散し、混合物はそのまま３０分間放置し
た。
ついで、水で希釈し、固形分はろ別し、フィルター上で
水で中性になるまで洗滌し、ついで、エタノール、エー
テルで洗滌し、乾燥した。
えられたものの遊離カルボキシル基を分析し、ナフイニ
テイークロマトグラフイーに使用した。
カルボキシペプチダーゼＡ（酵素Ｉ．Ｕ．Ｂ．Ｎｏ３．
４．２．１）１０ｍｇを、０．３ＮＮａｃｌを含むｐＨ
８．０の０．０５ＭのＴＲＩＳ−Ｈｃｌ緩衝溶液２ｍｌ
中に溶解した。
この液を体積８ｍｌ（１０×１００ｍｍ）のＤ−Ｐｈｅ
−ＣＯＯ−Ｓｐｈｅｒｏｎ（４０μモルＰｈｅ／ｇ−ゲ
ルを含む）のカラムに流した。
１０分経過して、カラムを緩衝液で溶離した。
すべての酵素は選択的に保持きれて、０．１Ｍ酢酸でこ
の緩衝溶液のｐＨを変えることによりはじのて分離した
。
実施例３ ＮＨ２−Ｓｐｈｅｒｏｎ上へのトリペプチドＺ−Ｇｕｙ
−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕの段階的結合 ２−ヒドロキシメタクリレートとエチレンジメタクリレ
ートとの共重合体（Ｓｐｈｅｒｏｎ５００）を１．６−
ヘキサメチレンジアミンとの反応で変性した３ｇのサス
ペンジョンを、１．５ｍｌのトリエチルアミンにより１
０分間時折攪拌しつつ処理した。
ゲルはろ別し、テトラヒドロフラン１０ｍｌづつで３回
洗滌し、ついで、１５ｍｌのテトラヒドロフランし０．
２１ｇ（０．９０ミリモル）のｔｅｒｔ−プチルオキシ
カルボニル−Ｌ−ロイシンおよび０．２３ｇの１−エト
キシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノ
リンを含有するフラスコに混合した。
混合物は８時間振とうし、ついで５０ｍｇの前記キノリ
ン誘導体を加え、さらに５時間振とうをつづけた。
固形物をろ別し、テトラヒドロフラン、エーテルの順で
洗滌し、乾燥した。
試料（７０ｍｇ）のアミン酸含量を分析した。
トリフルオロ酢酸（５ｍｌ）を２．５ｇの上記方法そえ
られた反応生成物に注ぎ、サスペンションを１５分間放
置し、ついで、水で希釈し、固形物を沢別し、中性化す
るまで水で洗滌し、さらにエタノールとエーテルで洗い
乾燥した。
そして１５ｍｌのテトラヒドロフランに分散させた。
このサスペンジョンに０．３３５ｇのｔｅｒｔ−ブチル
オキシカルボニルーＤ−フエニルアラニンジシクロヘキ
シルアンモニウム塩と０．１９２ｇの１−エトキシカル
ボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンを加
えた。
混合物は６時間振とうし、さらに５０ｍｇの試薬キノリ
ンを加え６時間振とうを続けた。
固形物はろ別し、継続的にテトラヒドロフラン、水、エ
タノールおよびエーテルで洗滌し、ついで、乾燥した。
試料のアミノ酸含量を分析した。えられた物（２ｇ）を
トリフルオロ酢酸４ｍｌ中に分散した。
サスペンジョンはそのまま１５分間放置し、ついで水で
希釈し、固形分はろ別し、中性になるまで水洗し、さら
にエタノールおよびエーテルで洗滌した。
ついで、乾燥し、１０ｍｌのテトラヒドロフラン中に分
散した。
このサスペンジョンに０．１１５ｍｌのジシクロヘキシ
ルアミン、０．１１３ｇのペンジルオキシカルボニルグ
リシンおよび０．１３８ｇの１−エトキシカルボニル−
２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンを加え、６時
間振とうし、さらに５０ｍｇの試薬キノリンを加え、６
時間振とうを続けた。
固体物を戸別し、テトラヒドロフラン、水、１Ｍ塩水、
エタノールおよびエーテルで洗滌し乾燥した。
えられた生成物はアミノ酸含量分析に供．され、また、
アフイニテイークロマトグラフイーに用いられた。
実施例４ Ｄ−Ｌｅｕ−ＮＨ７Ｓｐｈｅｒｏｎ Ｎ−ペンジルオキシカルボニルーＤ−ロイシン（１００
ｍｇ）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、ヘ
キサメチレンジアミンとの反応で変性された２−ヒドロ
キシエチルメタクリレートとエチレンジメタクリレート
との膨潤共重合体（Ｓｐｈｅｒｏｎ３００）１０ｍｌを
添加し、９のサスペンジョンを１Ｍの塩酸溶液でｐＨ４
．７に調整した。
ついで、１ｍｌの１−エチル−３（３’−９メチルアミ
ノプロピル）カルボジイミドメトイオダイドの１５％溶
液を５分間でこのサスペンジョンに適加した。
反応混合物は実験室温下２０時間攪拌した。
反応完結後、ゲルは、ジメチルホルムアミドの５０％溶
液および水で洗滌した。
えられたゲルを酸加水分解して得られた加水分解生成物
中のＤ−ロイシンを測定した。
Ｚ−Ｄ−ロイシンの３．６μモルが１ｍｌの膨潤ＮＨ２
−Ｓｐｈｅｒｏｎ３００に結合していた（１３μモル／
ｇ−ゲルに相当する）。
保護基であるペンジルオキシカルボニル基は、酢酸中臭
化水素溶液１５ｍｌとこの乾燥ゲル２．５ｇとの反応（
室温下、３０分）によりＺ−Ｄ−ロイシン誘導体から開
裂された。
ついで、ゲルは水、エタノールおよびエーテルで洗滌し
、きかびの粗たんぱく加水分解製剤よりのアミノペプチ
ダーゼのアフイニテイークロマトグラフイーに用いられ
た。
きかびよりの透析された粗たんぱく加水分解製剤（３０
０ｍｇ、培養液のアルコール沈殿物）を緩衝液Ａ（０．
０５ＭのＴＲＩＳＨｃｌ＋０．０１ＭＣａＣｌ２；ｐＨ
８．０）１００ｍｌに溶解した。
この溶液に吸引分離されたＤ−Ｌｅｕ＝ＮＨ−Ｓｐｈｅ
ｒｏｎ７０ｍｌを加え（１３μモルーＬｅｕ／ｇ−ゲル
）、そしてこの混合物をゆるやかに１５分間振とうした
。
この溶液をゲルとともに３鋼直径のカラムに移し、緩衝
液Ａで洗滌した。
１５分間に１８ｍｌの溜分がえられた。
ヘモグロビン活性を有するすべてのプロテアーゼを含む
物質が池の不活性成分と共に最初の６個の分溜分として
溶離した。
その後述続溶離によってえられた１４個の分溜分にはタ
ンパク加水分解活性分は含まれておらず、また２８０ｎ
ｍでの吸光度測定によってもプロテインは含まれていな
かった。
そしてカラムにはＬ−ロイシン−Ｐ−ニトロアリニドの
開裂により決定されたすべてのアミノペプチダーゼ活性
を示す化合物が保持されていた。
すべてのアミノペプチダーゼ活性は緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ
＋２Ｎ塩化ナトリウム溶液）とともに脱着され狭いピー
クで溶離された。
溶離物はヘモグロビンに対しタンパク加水分解活性は少
しも示さなかった。
アミノペプチダーゼ活性は、ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒの改
良法により決定された（Ｑ．ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒｐＭ
ｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９７０ｒ１９
，５１４）ｏ活性決定の基質は、１．６６ｍＭのＬ−ロ
イシンーＰーニトロアニリドをｐＨｓ．ｏの０．０５Ｍ
ＴＲＩＳ−ＨＣ７緩衝溶液に含ませたものである。
３７℃での１０分間の培養後ニトロアニリド分離量は４
０５ｎｍでの吸光度によって測定した。
変性されたヘモグロビン溶液はｐＨ６およびｐＨ８での
たんぱく加水分解活性の測定用の基質として供された。
溶液のプロテイン濃度はＬｏｗｒｙにより改良された方
法により、Ｆｏｌｉｎの試薬により決定された（Ｈ．０
．Ｌｏｗｒｙｅｔ ａｌ：Ｊ−Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１
９５１ ，１９３，２６５）。
アミノペプチダーゼの酵素的活性単位は、下記説明の実
験条件下１分間の間にｐ−ニトロアニリドを１μモル放
出する酵素の量として定義された。
比活性はプロテイン１ｍｇ当りの単位となるように決め
られた。
出発物質の比活性は０．３３６単位／ｍｇ−プロテイン
（０．５ｍｇのプロテインを含む透析されたタンパク加
水分解物３ｍｇ）であった。
使用に供された量から、比活性２．１７単位／ｍｇ−プ
ロテインを有する７．７ｍｇのアミノペプチダーゼかえ
られた。
実施例 ５ Ｚ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ−Ｓｐｈｅｒｏｎ２−ヒ
ドロキシエチルアクリレートとエチレンジアクリレート
との共重合体（１００ｇ、ＳｐｈｅｒｏｎＡ）を実施例
１と同様にして、１０ｇのペンジルオキシカルボニルー
グリシル−Ｄ−フエニルアラニンおよび１，６−へキサ
メチレンジアミンとの反応により変性した。
ｐＨ７．９でのＮ−アセチルーＬ−チロシンエチルエス
テル上でのエステラーゼ活性が１３５μモル／ｍｉｎ．
ｍｇの低活性キモトリプシン（１００ｍｇ）をｐＨ８．
０の０．０５ＭのＴＲＩＳ−Ｈｃｌ緩衝液２００ｍｌに
溶解し、吸引分離された４０ｍｌのＺ− Ｇｌｙ−Ｄ−
Ｐｈｅ−ＮＨ−ＳｐｈｅｒｏｎＡを加えた（７０μモル
Ｐｈｅ／ｇ−ゲルを含む）。
混合物は１５分間ゆっくりと振とうした。
この物は実施例１と同じパラメーターを有するカラムに
移され、０．０５ＭのＴＲＩＳ−Ｈｃ７緩衝溶液で溶離
し、実施例１におけると同様な結果をえた。
実施例 ６ 特願昭４ ８−３ ５，，１ ４９号の方法によって調
製された分子量排除限界３００，０００を有する２−ヒ
ドロキシプロピルメタクリルアミドとエチレンジメタク
リレートとの共重合体（１ｇ）をＢｒＣＮとの反応によ
り活性化せしめ、特願昭４８−３５，１４９号の方法に
より１，６−へキサメチレンジアミンとの反応をせしめ
た。
えられた生成物を実施例１におけると同様に５ｍｌのテ
トラヒドロフラン中９０ｍｇのペンジルオキシカルボニ
ルーグリシルーＤ−ロイシンと縮合させた。
えられた収着剤は洗滌し、乾燥し、そして、キモトリプ
シンのアフイニテイークロマトグラフイー用に使用され
た。
実施例 ７ チェコスロヴアキア特許第１５４，３８６号によって製
造された分子量排除限界１００，０００を有する２−（
ヒドロキシエチル）へキシルメタクリレートとトリメチ
ロールプロパントリメタクリレートとの共重合体（１ｇ
）を臭化シアンとの反応で活性化し、ついで、特願昭４
８−３５，１４９号の方法によりエチレンジアミンとの
反応に供した。
えられた生成物を実施例１におけると同じ方法で５０ｍ
ｌのテトラヒドフラン中Ｚ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−
ロイシン８０ｍｇと縮合させた。
えられた収着剤は、洗滌し、乾燥し、そしてトリプシン
のアフイニテイークロマトグラフイーにおいて使用され
た。
実施例 ８ 分子量排除限界５００，０００を有する、テトラエチレ
ングリコールモノメタクリレートと２，２′−ジメチル
プロパンジオールジメタクリレートとの共重合体（１ｇ
）を臭化シアンで活性化し、１，１０−デカンジアミン
との反応に供した。
えられた生成物は５ｒｎｌのテトラヒドロフラン中Ｄ−
フエニルアラニンと縮合させ、洗滌し、乾燥し、そして
キモトリプシンのアフイニテイークロマトグラフイーに
おいて使用された。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ ヒドロキシアルキルアクリレート、ヒドロキシアル
    キルメタクリレート、ヒドロキシアルキルアクリルアミ
    ドまたはヒドロキシアルキルメタクリルアミドと架橋性
    ジアクリレートまたはジメタクリレート共単量体との共
    重合により製造された親水性重合体ゲル担休を、 直接にまたは臭化シアンにより活性化した後、炭素数１
    〜１０を有するジアミン類、アミノ酸類および炭素数１
    〜６を有するジカルボン酸類よりなる群より選ばれたカ
    ルボギシ末端管能基またはアミン末端管能基を有する化
    合物と反応せしめ、その後、 これらのカルボキシ末端基またはアミン末端基を、Ｄ−
    アミノ酸もしくはその誘導体またはその連鎖中にＤ−ア
    ミノ酸単位を含有するペプチド体と常法で縮合反応せし
    めるか、あるいはその連鎖中にＤ−アシノ酸を含有する
    ペプチド体を、少なくとも１つの段階においてＤ−アミ
    ノ酸を使用して前記ゲル担体表面にアミノ酸を段階的に
    縮合反応せしめることによって形成させることを特徴と
    するアクリル酸またはメタクリル酸のヒドロキシナルキ
    ルエステル類またはヒドロキシアルキルアミド類の共重
    合反応によって調製された親水性重合体を基質とし、共
    有結合的に結合したＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸単
    位を有するペプチド体を所有し、さらに好ましくは巨大
    気孔質の性質を有してなる収着剤の製造方法。
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