JPS5843789A - 固定化グルコアミラ−ゼ組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は水に不溶でかつ酵素的垂こ活性な固定化グルコ
アミラーゼ昶成物嘔こ関する。更ｅこ詳しくはマクロ多
孔性フェノールホルムアルデヒド系両性イオン交換樹脂
を担体としＣリゾプス、デレマー起源のグルコアミラー
ゼを吸着させた後、さらにこれに多官能性架橋剤を作用
せしめることによっＣ得られる固定化グルコアミラーゼ
組成物に関する。本発明の固定化グルコアミラーゼ組成
物は実用的な基質濃度条件下においＣ１反応後の糖化液
のグルコース組成が９５％以ヒという高いグルコース生
成率を与え、またオリゴ糖分解活性が高く、安定で水・
ζ不溶である。

グルコアミラーゼは澱粉の糖化に利用される工業的１こ
有用な酵素である。グルコアミラーゼを用いる澱粉の糖
化法においＣは最終糖化液中に６％ないし８％の三糖お
よび三糖類を主体とするオリゴ糖が副生じ、このオリゴ
糖を分離、徐去しない場合は、このオリゴ糖が最終侠品
まで混入し製品価値を下げる、又、例えばイオン交換ｍ
脂カラムを通しＣＯ離した場合はこのオリゴ糖区分の再
利用が問題であるなどのＸ点が指摘され、デキストリン
濃度が２０（ｗ／ｖ）％以上という濃厚な、すなわち実
用的な基質＃変条件下１こおいＣ反応後の最終糖化液の
糖組成が９５％以ヒのグルコースを与える糖化技術、或
いはオリゴ糖区分の再利用すなわち単糖への分解が要望
されＣいる。

この様な目的の為にグルコアミラーゼと共にプルラナー
ゼ（或いはアミロ−１，６−グルコシダーゼ）を同時に
作用させる方法が開示されＣいるが、後者の酵素が高価
であり、かつ前者と後者の酵素の作用至ＭＰＨが異るこ
と等から有効な方法とは言えない。

また、一方では従来より糖化に使用されＣいるグルコア
ミラーゼを固定化しＣ有効にかつ効率的響こ使用する方
法１と強い関心が持たれＣいる。とりわけ、α−アミラ
ーゼによる糖化液をバッチ法による通常の方法で糖化し
、４６±６％のグルコース生成率に達した後、固定化グ
ルコアミラーゼのカラムに通液する二段ｗＩｉ化法は加
水分解に要する時間が短く、経済曲番こ非虜に有利な方
法として最近、大きな関心が持ｔコれている。本発明、
の固定化グルコアミラーゼ組成物はこの二段糖化法の固
定化グルコアミラーゼとしても用いることができる。

本発明の目的は実用的な基質ｆＩＡｌ！条件下で反応後
の最終糖化液のグルコース組成が９５％以ヒの糖化液を
与え、また澱粉の糖化の際１こ生成してくるオリゴ糖の
分野に使用可能な固定化グルコアミラーゼ組成物を提供
すること（こある。

グルコアミラーゼを固定化する方法としては、吸着法、
共有結合法、包括法などが知られている。吸着法は共有
結合法にくらべて酵素の結合がきわめて容易に行なうこ
とができる点で工業的スチールへの応用１こ有利である
。

しかし担体と酵−との結合力′か弱いため、酵素の脱離
が避けられず、固定化した酵素の活性が不安定であると
いう欠点を有している。

共有結合法の例としては多孔性ガラスのアミノシラン誘
導体やコラーゲンシートを担体として用いた例があるが
、担体を活性化する工程が煩雑である。比較的簡単な共
有結合法として米国特許８，７６７．５８１号明佃書に
は酵素固定化担体として）千ノール性水酸基トメチロー
ル基のみを有し、アミノ基、置換アミノ基およびカルボ
キシメチル基というイオン性の官能基を有していないマ
クロ多孔性のフェノールホルムアルデヒド朗■旨にアス
ペルギルス、ニガー起源のグルコアミラーゼをグルタル
アルデヒドで固定化した実施側が挙げられている。この
方法は吸着法と簡単な共有結合法を組み合せた固定化方
法としての特徴を有しているが、担体はフェノール性水
酔基とメチロール基のみを有し、アミノ基、置換アミノ
基あるいはカルボキシメチル基の官能基を持っていない
からグルコアミラーゼの特異的吸着が起っていす、従っ
て酵素固定化量は乾９＃樹脂重壜当１）１８■と極度・
こ低く、固定化グルコアミラーゼの活性も非常に低く、
とても実用に供せられるものではない。また通常高いグ
ルコース生成率を得やすい２（Ｗ／ｖ）％という希薄な
基質条件下でもグルコース生成率は８５％と低く、この
発明において目的に合う固定化グルコアミラーゼが得ら
れていないことは明白である。

本発明者らは本発明の目的１こ金敷する固定化グルコア
ミラーゼ組成物を得るべく鋭意研究の＠眼、リゾプス、
プレン−起源のグルコ〜−ぐ アＣ７−７が特開昭５４−１１９０８４号公扉／９以ヒ
、孔径１００Ａないし２００ＯＡのマクロポア−の細孔
容量の合計が０．Ｉ　ＣＣ／ｆ以ヒ、アミノ基あるいは
置換アミノ基に基づく陰イオン交換容量が１　ｍｅｑｉ
ｙ以ヒ、かつカルボキシメチル基ｌこ基づく陽イオン交
換容量力０．５　ｍｅｑ／ｒ　ｄヒであるマクロ多孔性
フェノール、ホルムアルデヒド系両性イオン交換−Ｉｌ
ｌ！１に特異的・こよく吸着され、さら１こ、これに多
官能性架橋剤を作用させて得られる固定化グルコアミラ
ーゼ組成物は実用的な基質一度条件下で反応後の最終糖
化液のグルコース化の担体からの脱離がなく、安定であ
ることを見い出し本発明に至っすこ。以下、本発明につ
いて更に詳紬に説明する。

本発明昏こおける担体は比表直噴が１　ｙ／　／　ｙ以
ヒ、孔径１００Ａないし２，０ＯＯＡのマクロポア−の
細孔容量の合計が０．１　ｃｃ　／　ｆ　以ヒ、アミノ
基あるいは置換アミノ基ｔこ基づく陽イオン交換容量が
ｌ　ｍｅｑ／ｆαヒ、カルボキシメチル基に基づく陽イ
オン交換容量が０．５ｍｅｑ／ｆ以ヒであるマクロ多孔
性フェノールホルムアルデヒド系両性イオン交換蒙詣で
ある。このような特性を有していれば：いかなる方法で
製造されたものでもよい。本発□明を具体曲番こ説明す
るため（こ使用した担体は市販のフェノールホルムアル
デヒドを母核とするマクロ多孔性陰イオン交換樹脂にカ
ルボキシメチル基を付与し両性イオン交換樹脂としたも
のであり、その製造法は特開昭５４−１１９０８４号公
報１こ開示されている。形状はグラニュー状またはビー
ズ状であってその大きさはおよそ１４１０μ（１２メツ
シユ）から１７７μ（°８０メツシュ）程度のものが好
ましい。特に好ましいのは５９０μ（２８〆メツシユ）
から２５０μ（６０メツシユ）程度のものである。あま
り大きいと空隙体債が大きくなり体積当りの活性は小さ
くなる。一方、あまり細かい破片では圧損が太き（なり
過ぎすこり、あるいは固定化酵素と反応液の分離がむつ
かしくなったりして好ましくない。

本発明Ｉこおけるグルコアミラーゼはリゾプス、デＬ／
　ｖ　−（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ　）　　
起源の１．４ グルコアミラーゼであ机ばよ（粗製、精軛に　′かかわ
らず用いることが出来る。本発明のリゾプス、デレマー
起源のグルコアミラーゼは通常の溶液状酵素の形態にお
いても、実用ヒ多用せられているアスペルギルス、ニガ
ー起源のグルコアミラーゼよりも実用基質濃度における
グルコース生成率が高いが、本発明特態のものよりも更
にオリゴ糖の分解能が増大する。なお、リゾプス、デレ
マーの亜糖であるリゾプス、ニベウス起源のグルコアミ
ラーゼも使用可能である。活性に関しては固定化グルコ
アミラーゼの工業的利用を目的とする本発明の主旨から
もあまり低活性の酵素を用いることは意味がない。従っ
て未固定の粉末酵素１％当り５　ＩＡＧＵ　　９ヒの活
性を持つものを使用するのが好ましい。更に好ましくは
１５ＩＡＧＵ／＃以ヒである。同定化のための酵素１■
入量は乾燥担体ｉｆ当り５０■ないし８００１ 討、好しｔは８０ＴＩＱないし２００１Ｎの範囲が経済
的である。

本発明における担体へのグルコアミラーゼの吸着に際し
てはｐ　Ｈ８，５ないしｐ　Ｈ７，６の範囲の緩衝液・
こ溶解したグルコアミラーゼ溶液ｌこ担体を浸漬し、こ
のＰＨ範囲でグルコアミラーゼを担体に吸着させる。特
に好ましいのはＰ　Ｈ４，０からＰ　Ｈ６，５の範囲で
ある。あまりに低いｐＨおよび高いｐＨではグルコアミ
ラーゼの失活がおこる。吸着温度は熱失活が起こらない
範囲の温度であればよいが実際的１こは５−℃ないし４
５℃の範囲がよい。吸着時間は１時間ないし１０時間で
よく、吸着温度が高い場合ｌこけ短時間でよいが、振と
うあるいは、攪拌によって行なうのが効率的である。ま
た吸着時に用いる緩衝液−こ溶解したグルコアミラーゼ
溶液量は乾燥担体重量の２倍ないし１５倍であればよく
、より好しくは５倍ないし１０倍である。溶液量があま
り少ないと吸着時の振とりあるいは、攪拌葛こよって担
体の破損を生じ易くなる。一方溶液吸が多くなると酵素
の吸着率は減少してくる。

本発明１こおける多官能性架橋剤としては、例えば、グ
リオキザール、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒ
ド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒド澱粉などのポリ
アルデヒド類が好ましく、ジエチＩしンロンイミド、ジ
エチーレアジピイミドなどのポリイミテート類も使用可
能である。グルコアミラーゼ吸着担体への多官能性架橋
剤の反応はｐ）１２．０ないしｐＨ８，０程度のｐＨ範
囲内で可能であるが、あます＋こ低いｐＨ１或いは高い
塩基性ｐＨ領域ではグルコアミラーゼの失活が起る。結
局、実際的Ｉこはｐ　Ｈ８，５ないしＰ　Ｈ７，０の範
囲より好しくはｐ　ｌ（４，０ないしＴ）　Ｈ６，５の
ｐＨ範囲内で反応させると先１こ吸着したグルコアミラ
ーゼが架橋剤の反応中に溶出することがない。

使用する多官能性架橋剤の温度は０．１　（ｗ／ｖ　）
％ないし５（ｗ／ｖ）％程度が適当であり、特番と０．
２（Ｗ／ｖ）９６ないし８（ｗ／ｖ）％程度が好ましい
。多官能性架橋剤の反応温間は４５℃以下であれば良い
。実際には５℃ないし４５℃で十分である。低湿はど担
体に吸着した酵素の脱離が起こり啄こくいが多官能性架
橋剤の反応性が劣ること−こなり、結果的竪こは１５ｃ
ないし８５℃が最も好ましい。多官能性架橋剤を反応さ
せる時間は温度および瀝ｔ’ｌ＋とよって異なってくる
が０．５・時間ないし２０時間程度である。１５℃ない
し８５℃程度で多官能性架橋剤を反応させる場合は１時
間ないし６時間椎間で十分である。なお多官能性架橋剤
を反応せしめた後、高濃度の緩衝液および水によって固
定化グルコアミラーゼ組成物を十分１と洗浄し、不十分
な結合の為に脱離しやすいグルコアミラーゼは全て除去
した方がよい。

本発明の固定化グルコアミラーゼ組成物は次の特徴を有
する。

（１）乾慢担体Ｉｆ当り最大２００吋程変椎間末グルコ
アミラーゼを固定化することが可１・： 能である。１′ １ （２）固定化グル１コアミラーゼ組成物の活性は１５　
Ｑ　ＩＡＧＵ　　以ヒ／ｌ−ＩＭＡＧであり、変々２５
０　ＩＡＧＵ／ｆ−ＩＭＡＧよりも大きくなる。本発明
特定の担体の両性イオン交喚基の為に活性発曳率は大き
く、従って本発明特定の固定化グルコアミラーゼ組成物
の活性は高い。

（８）溶液状酵素の至適ｐＨはｐＨ５付近にあるが、固
定化すること１こよって酸性側−こ移動する。１　（ｗ
／ｖ　）％＃質の可溶性澱粉を基質とした場合の相対活
性のｐＨ依存性を図に示す。至適ｐＨの酸性側・＼の移
動は糖化反応時の基質の腐敗防止のうえで好ましい。

（４）固定化グルコアミラーゼ組成物は殺菌、洗浄剤に
対する耐薬性にすぐれている。従って、連続糖化反応中
、微生物汚染がはげしい場合墨こは固定化グルコアミラ
ーゼ組成物をカラム中、または取り出して殺菌洗浄でき
る。

（５）　１０℃ｒ、ＫＬ’し５０　℃（７）間テＰ　Ｈ
４，５テ測定した活性化エネルギーＥａは多官能性架橋
剤の種類と温度によりやや異るが、Ｅａ−一１０±２　
Ｎｅａｒ／′ｍｏｄｅである。

（６’１２０（舎／ｖ）ないし４０（Ｗ／Ｖ）％の実用
基質製電のデキストリンを、最終糖化液の糖組成−が９
５％以ヒのグルコースである様に保ちながら長一時間、
カラムで連続的に糖化する能力がある。

（７）　　カラムによる連続糖化反応を４５Ｃあるいは
それ以下で行い、十分精＃濾過された基質液を使用する
かあるいは固定化グルコアミラーゼ組成物を十分洗浄し
さえすれば、１５００時間αヒにおける連続糖化反応に
おいても活性の低下は少く、安定なカラム反応を行なう
ことができ、生産性も非線に高い。

次に実施例を挙げて本発明を更１こ具体的に説明するが
、その主旨を戦えない限り以下の実施例によって限定さ
れるものではない。本発明における固定化グルコアミラ
ーゼ組成物の活性測定条件下、溶液状（未固定）グルコ
アミラーゼの活性測定条件下、固定化グルコアミラーゼ
組成物および担体の乾燥重量測定条件等について先・こ
記しておく。なお、本発明−とおいては、酵素活性は通
常の還元糖による表示ではなく、生成したグルコース等
によって表示していること・こ注意を要する。

固定化グルコアミラーゼ組成物の活性測定腟− ｐ　Ｈ４，５で０．０５Ｍ溌哩の酢酸塩緩衝液１５耐に
固定化グルコアミラーゼ組成物０．８　ｍｌないし０．
４　ｔｓｌ程度を懸濁し、別番こ用意した同一緩衝液の
２（Ｗ／Ｖ）％可溶性澱粉（メルク社製）溶液１５ｇ／
を加えて最終１１４　ｒｔ　ｌ　（ｗｔｖ　）％となる
ようｔこする。４０℃で２０分間往復振とう（１００ｒ
ｐｍ、振巾８．５　ｒｍ　）　したのち固定化グルコア
ミラーゼ組成仲を炉別し、枦液中のゲルコール含量をグ
ルコースオキシダ□ 一ゼーパーオキシダーゼー色素系を用いて定□６゜　　
　　　パ□”゛ １分間に１／７ｔｎｏｅｅのグルコースを生成する酵素
量をもって１単位（ｌ　ＩＡＧＵ　）とする。

溶液状グルコアミラーゼの活性測定法 Ｐ　Ｈ４，５Ｍ一度の酢酸塩緩衝液の２（ｗｔｖ）％可
溶性澱粉（メルク社！！ｉり溶液８　ｗｔに測定しよう
とするグルコアミラーゼ含有溶液（蚤白質含ｔ　Ｏ，８
＊　／　１１／ないし０．４　’Ｒ／　ｔｅｌ　）を８
　ｍｌを加えて最終濃度１（ｗｔｖ）％となるようにす
る。

４０℃で１０分間反応させる。１０分間、反応後、反応
液の２００１ｔｅに０．　Ｉ　Ｎ　　Ｎａ０ＨＯ，８ｍ
ｌを加えて反応を止める、この反応液中のグルコース含
量をグルコースオキシダーゼ−パーオキシダーゼ−色素
系を用いて定量する。１分間に１μｍｏｄｅのグルコー
スを生成する酵素量をもって１単位（ＩＩＡＧＵ）とす
る。

適当９″固定化″−′・：１７ｔ−７一−ｔｒ組成物・
または担体を２鰭程度は下の厚さに広げ５０℃で８時間
以ヒ減ＥＥ　（５部ｍＨｔ　Ｑ下）乾燥する。

その後固定化グルコアミラーゼ組成物または担体を１．
５時間以ヒ室温（１８〜２５℃）のデシケータ−中に放
置した後重歇を測定し、恒暇に達するまでこの乾燥操作
を繰り返し恒量に達した時の重量を乾燥重量とする。明
細書中１こ記載されている固定化グルコアミラーゼ組成
物および担体の重量は全て本性で測定した乾燥重量であ
る。この乾燥固定化グルコアミラーゼ組成物の略号をＩ
ＭＡＧとＨｅ載する。

ｌ　ｇ／　ニＩ　Ｎ　ＨＣｅ　２０　譚／　’ｅ加え２
時間、９５℃から１００℃の熱湯中で加水分解を行なっ
ｔこ。

加水分解後、室温まで放冷し、その後ｌＮＮａ０■を加
えて中和し中和後の溶液の１部を取ってネルソン、ソモ
ギー法によって還元糖量を測定した。この操作を５回く
り返してその平均１元糖量を全糖量としナコ。

本発明におけるグルコース生成率は た、オリゴ糖生成率は１００−グルコース生成率％で表
喫する。

なお、実施例１〜５で用いた制脂はいずれも特開昭５４
−１１９０８４号公綴で公知である。

実施例１ リゾプス、プレ７−起源の乾燥粉末グルコアミラーゼ（
新日本化手製、ｐＨ４，５゜４０℃における活性が１６
．　Ｂ　ＩＡＧＵ　／■　−粉末）１５．Ｏｆをｐ　Ｈ
５，０で０．０５Ｍ潮度表面債が約３２ゴ／ｆ、孔径が
１００Ａないし２．ｏｏｏＡｔでのマクローア−の細孔
容眼の合計が０．５８ｃｃ／ｆで、アミノ基および置換
アミノ基に基づく陰イオン交換容幸が６．０８　ｍｅｑ
／ｆ　、か・クカルボキシメチル基に基づく陽イオン交
換容量が２．６５ｍｅｐ／ｌテアルマクロ多孔性フェノ
ールホルムアル） デヒド系両性イオン交換樹脂〔市販のデュの　　　　　
　　　　　　　９ オライド　Ａ−７樹ｔｌ旨（ダイヤモンドジャムロック
社製）にカルボキシメチル化反応を行ったもの〕を１０
ｏｆ浸漬し、温間３０℃に保ちながら６時間、約１２Ｏ
ｒｐｍで回転しながら吸着同定を行った。吸着後、イオ
ン交換水２ｅで洗浄し吸着されなかった酵素蛋白質を除
いた。

この時吸着された酵素量は焼浄液中の蛋白質から１１２
■／ｆ−担体と算出された。

かくして得られたグルコアミラーゼ吸着固定化担体を１
％＃度のグルタルアルデヒド溶液（ｐＨ４，５に調装）
７５０露ｌに浸漬し、約２０　Ｃｉこ保ちながら２時間
１２　Ｏｒｐｍ程ｑ　にＮ拌し−り一つグル１ルアルデ
ヒドと反応：：、、。

させ仁。次いでＯ，’２Ｍ＄１［の酢酸塩緩衝液および
イオン交換水で十分に洗浄した結果、グルタルアルデヒ
ド反応後に固定化されている酵素量はｌ　ｌ　ＯＨ／ｆ
−担体と算出された、得られた固定化グルコアミラーゼ
組成物の活性はＰ）ｉ４．５．４０℃において２７５　
ＩＡＧＵ／ｆ−ＩＭＡＧであった。

本固定化ゲルコアミラーゼ組成物を８　ｍｌ外套管付き
カラムに充填し、カラム温間を４’ＯＣに保ちながら０
．８Ｍ１１度の酢酸塩緩衝液（ＰＨ４，５）を空間速ｆ
ｌ１８Ｖ　＝５．Ｑｈｒで４８時間流下させた。ｙ＊液
を流し始めた最初の数時間内に、固定化酵素量の０．５
％程一度が流失する事が流出液の紫外線吸収スペクトル
より算定される。

しかしその後全く流出がなく、４８時間流下実実検後本
固定化グルコアミラーゼ組成物の活性はＰＨ４，５，４
０℃において２７６１ＡＧＵ／ｆ−ＩＭＡＧであり、活
性の低下は１ 化酵素であることがわかる。

Φ ８６（ｗ／ｖ）％アルコール　Ａ　ｌ　’　（８澱化学
社製のデキストリンの商品名で遺元塘分率一本固定化グ
ルコアミラーゼ組成物ｌｏｇ／をジャケット管付きカラ
ムに充填し、４５℃に保温する。基質として８５（ｗ／
ｖ）の ％アミコール　庖１溶液（ｐＨ４；５）を流下させた。

その際、固定化グルコアミラーゼ組成物によって分解生
成してくるグルコースの生成率が９５％以ヒにな・るよ
う・こ、活性の低下とともに空間速度（８■）を下げて
ゆき１８００時間、連続的に通液した。

その結果を表１に示す。

表　　　１ 表１より１８００時間後でも初期活性の５４．０％の活
性が維持されている。

■ （Ｗ／Ｖ）％からなる殺菌消毒剤オスパン（販売：式日
薬品工業ＫＫ）の原液を５００倍倫こ希釈した液および
殺菌剤で固定化グルコアミラーゼ組成物を洗浄した。

グルコースの二次製品である異性化糖から分′解される
オリゴ糖区分（別名ラフィネートと呼ばれる）の１０（
ｗ／ｖ）％溶液の連続分解を行った。この溶液の各成分
の最終組成比率はグルコース７８％、三糖類７％、三糖
類Ｑ１１１５％であることが高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）によって分析された。本固定化グルコア
ミラーゼ組成物１０ｔ／をジャプツト管付きカラムに充
填し、４５℃に保温する。これにヒ記オリゴ糖区分の１
０（ｗ／ｖ）％溶液を空開速度（ＳＶ）２．５ｈｒ　　
で−週間流下させた。その時の流出液中の各成分の組成
比率をＨＰＬＯによって分析した。結果を表２に示す。

表　　　　　２ 一週間、安定してオリゴ糖の分解が行なわれていること
がわかる。この糖液Ｒ成のグルコース分率はわずかｆζ
９５％より低いが、この目であれば１．、に、、二％以
上のグルコース生成率を有する本　　糖化液に混ぜるこ
とにより高品質の異性化糖原料糖として用いることがで
きる。なお、本ラフィネート液５０　ｍｌにリゾプス、
デレマー起源の粉末グルコアミラーゼ４００＊を投入し
、１２時間後に糖液をＨＰＬＯで分析したところ二接類
は８％とむしろ増加し、三糖類以、Ｌは１４．５％と極
くわずか減少したのみで、実検誤差を考慮すれば全く反
応していないと言える。

（１）２％ヨウ素と１１％の非イオン界面活性剤を主成
分とする市販殺菌洗浄剤ダイヤザ［株］ ン　（ヨウ素２％、非イオン性界面活性剤１１％、８５
％リン酸ｌＯ％、精製水７７％）（発売；旭硝子ＫＫ）
の８００倍および５００倍希釈液に本固定化グルコアミ
ラーゼ組成物の１部を浸漬し、室温で１′７−月装置し
た後、ＰＨ４”、５．４０℃で残存活性己 を測定したところ９２％と９８％であっｔこ。

活性の低下は浸漬直後に起りその後低下しない。

液（販売；式日薬品１乾ＫＫ）の８００倍および５００
倍希釈液に本固定化グルコアミラーゼＭＡ我物の一部を
浸漬し、室温で１−ゝテ月放置した後、ｐＨ４，５，，
４９℃で残存活性を測定しｒコところ初期活性の９５％
と９８％であまり活性の低下は起っていない。

実施例２ 物の快造に用いたのと同じ担体を乾燥状態でｌｏｆ秤殴
し、イオン、交換水に浸漬し？ｌｉｉ！潤状態にした後
、実物例１で用いたのと同じ乾燥粉末グルコアミラーゼ
１．４２をＰＨ５，０で０．０５Ｍｆｌ変の酢酸塩緩衝
液５０譚ｌに溶解しｒコ溶液中に浸漬し、液温を８０’
Ｃに保ちなから１２Ｏｒｐｍで４時間かく拌しつつ吸着
を行った。吸菅後イオン交換水５００　ｖｔｌで洗浄し
吸着されなかった酵素蛋白ｉｔヲ除＜。この時吸着され
た酵素、ｔは１２１．８卿／ｆ−担体と算出された１か
くして得られたグルコアミラーゼ吸着固定化担体を２（
Ｗ／Ｖ）％連間のジアルデヒド澱粉溶液（ｐＨ４，５に
調製）７５ｇ／に浸漬し、液温を１８±１℃に保ち、１
２０ｒｐｍに攪拌しながら２時間反応を行った３゜反応
後、担体を０．２Ｍ？１度の酢酸塩緩衝液およびイオン
交換水で十分に洗浄した結果、固定化されている酵素量
は１１８哩／ｆ　−担体と算出された。得られた固定化
グルコアミラーゼの活性はＰＨ４，５，４０℃において
２５８　ＩＡＧ［］／ｆ−ＩＭＡＧである。実施例１と
同様番ζ本固定化ゲルコア疋ラーゼ組成物を８　ｍｌ外
套管付きカラムに充填し、カラム温度を４０℃に保ちな
がら０．８Ｍ瀞連間酢酸塩緩衝液（ＰＨ４，６）を空間
速度８Ｖ＝５、ｒ）ｈｒ　で４８時間流下させた。その
結果、固定化酵素量の０．８　％粗塵が流失する事が流
出液の紫外線吸収スペクトルより算定される。

流下実験後の本固定化グルコアミラーゼ組成物の活性は
ｐ）（４，５，４０℃において２６０　ＩＡＧＵ／ｒ−
ＩＭＡＧであり一１活性の低下は全くない。

゛本固定化グルコアミラーゼ組成物１０ｇ／をジャチッ
ト管付きカラムに充填し、５０℃に保温する。基質とし
て８５（Ｗ／Ｖ）％ア、−７−ゎ、溶液（ＰＨ４，５）
や流下させた。その際固定化グルコアミラーゼによって
分解生成してくるグルコースの生成率が９５％以ヒにな
るように、活性の低下とともに空間速度Ｓ■を下げてゆ
き８５０時間連続的に通液し、た。その結果、反応開始
２０時間後、１００時間後、８００時間後、５００時間
後、８５０時間後の１１ｖはそれぞれ２．８６ｈｒ（グ
ルコース生成率９７％）、２．７４ｈｒ（９６％）、２
．５１ｈｒ（９８％）、２．２１　ｈｒｊ　９７％）、
−１，８４ｈｒ（９８％）であった。８５０時間後でも
初期活性の６４．８％の活性が維持されていた。この間
、１週間に２回づつ、日本薬局方、塩化ベンザルコニウ
ムの１０（ｗ／ｖ）■ ％からなる殺菌消毒剤オスパン　液（販売′：武式日品
工４ＫＫ）の原液を８００倍に希釈した液および滅菌水
で固定化グルコアミラーゼ組成物を洗浄した。

実施例８ 固定化グルコアミラーゼ組成物の製造 実施例１の固定化グルコアミラーゼ組成物の製造舎と用
いたのと同じ乾燥粉末グルコアミラーゼ１．８０ｆをＱ
、１１５Ｍ濃変の酢酸塩緩衝液（ｐＨ５，０）６０ｇ／
に溶解した。

この溶液に粒子径がＪ”５０μないし約５９ＯＡないし
２．００’ＯＡまでのマクロポア−の細孔容量の合計が
Ｏ，、５６ＣＣ／　ｔ　、陰イオン交換容量が８．６２
　ｍｅｑ／ｆかつカルボキシメチル基に基づく陽イオン
交換容量が１．８５ｍｅｑ／ｆであるマクロ多孔性フェ
ノールホルムアルデヒド系両性イオン交換樹脂〔市販の のデュオライトＡ−４（ダイヤモンドジャムロック社製
）にカルボキシメチル化反応を行ない変性しｒこもの〕
を１０ｆ浸階し、液温を８０±２℃に保ちながら４時間
、約１２　ＯＲＰＭで回転攪拌を続はグルコアミラーゼ
担体・と吸着させｔコ。吸着後、イオン交換水５００−
で洗浄し吸着されなかった酵累蚤白質を除く。この時吸
着されｌコ酵素°量は洗浄液中の蛋白質から９６１ＫＩ
／？−担体と算出されｒこ。かくして得られたグルコア
ミラーゼ吸着同定化担体を１（Ｗ／Ｖ）％濃度のグルタ
ルアルデヒド溶液１００　Ｗ／に浸漬し、約２０℃に保
ちながら２時間１２０ｒｐｍｌｉｔｌに攪拌しつつグル
タルアルデヒドと反応し？コ。次いで０．２Ｍ濃製電酢
酸塩緩衝およびイオン交換水で十分に洗浄した。

その結果、固定化されている酵素量は９２＃／９−担体
と算出された。得られた固定化ゲルコア主ラーゼ組成物
の活性はＰＨ４，５。

４０Ｃにおいて２１　Ｑ　ＩＡＧＵ／ｆ−ＩＭＡＧであ
った。

分解 本固定化グルコアミラーゼ組成物２０ｇ？をジャケット
管付きカラムに充填し、４５℃に保温する。基質として
８５　（ｗ／ｖ）％アの ミコール　＆１溶液（ｐＨ４，５）を流下させｔこ。そ
の際、固定化グルコアミラーゼ組成物によって分解生成
してくるグルコースの生成率が９５％以ヒ（こなるよう
に空間速２（ｓｖ）を調節しながら５００時聞連続カラ
ム反応を行なった。

その結果、反応開始２５時間後の空間速ｔｆ（ｓｖ）は
１．９８ｈｒ　でグルコース生成率９９％であった。１
００時間後、８００時間後、５００時間後のＳｖとグル
コース生成率は、それぞれ１．９１ｈｒ（９８％）。

％）であった。５００時間後でも初期活性・フニ（７）
８２．８％の活性が維持されていた。グイ［株］ ヤザン　のｊＱ液を５００倍に希資した液および謔菌水
で固定化グルコアミラーゼ組成物を洗浄した。

実施例４ リゾプス、デレマーｆ、１の乾燥粉末グルコアミラーゼ
（新日本化学工業袈、ｐＨ４，５。

４０℃における活性が２．６５単位／呼−粉末）　１８
．２　ｆヲＰＨ５，５（７）０．０５Ｍｇ度の酢酸塩緩
衝液５００　ｙｅｔに溶解した。この溶液に実施例１の
固定化グルコアミラーゼ組成物のφ・ＡＰＩこ際して、
使用しｔこのと同一の粒子径、比表面積および細孔容所
を持ち、陰イオン交換が６．２６　ｍｅｑ／ｆかつカル
ホキ、８７．。７，２よ６．．６オ゛・、じゅ□□３゜
、８６ｍｅｑ／ｌあるマクロ多孔性フェノールホルムア
ルデヒド系両性イオン交換剛着１００ｔ（整燥状態時の
重量）を浸漬し、液、温を８０℃に保ちながら４時間、
約１５　Ｏｒｐｍで回転攪拌を続けながら吸着を行なっ
た。吸着後８００　ｍｌのイオン交換水で洗浄した。

この時担体に吸着されている酵素看は １２１岬／を一担体と算定され？：。

次いで、このグルコアミラーゼ吸着担体を０．７５（Ｗ
／マ）％＃変のグルシルアルデヒド溶液（ＰＭ　４．５
の０．１’）５Ｍ酢酸塩緩衝溶液にグルタルアルデヒド
を溶解したもの）７５０　ｍｌに浸漬し、液温を１９℃
ないし２０℃に保ちながら８時間、１２０ｒｐｍで回転
攪拌しながらグルクルアルデヒドを作用させた。８時間
後０．２Ｍ＃度の酢酸塩緩衝液およびイオン交換水で十
分洗浄した後、固定化されているグルコアミラーゼ囃は
１１６＆／ｆ−担体と算出中れ、活性は８５０ＩＡＧＯ
／ｆ−ＩＭＡＧであっ、〜。

本固定化グルコアミラーゼ組成物１０ｇ／をジャケット
管付きカラムをこ充填し、４５℃１こ保温すう。基質と
して２０　（ｗ／ｖ）％マルトース溶液（ｐＪ４４．５
）を流下させた。

その際、固定化グルコアミラーゼ組成物によって分解生
成してくるグルコースの生成率が９５％以ヒになるよう
に空間速度（８ｖ）を調節しながら１２００時ＩＧｉ連
続カラム反応を行っ？こ。その結果を表８１こ示す、表
　　　　　３ １２００時１ＬＣ５後でも初期活性の８２．１％の活性
が紺持されていた、この間、１週間智こ一２回づつ、日
本薬局方塩化ベンザルコニウムのｌ　Ｏ（ｗ／ｖ　）％
からなる殺菌消毒剤の オスパン　液の原液を５００倍に希釈した液および滅菌
水で固定化グルコアミラーゼ組成物を洗浄した。

実施例５ 固定化ゲルコア主ラーゼ組成物 実施例１の固定化グルコアミラーゼ組成物の製造に用い
ｔこのと同じ乾燥粉末グルコアミラーゼ１．４Ｏｆを０
．０５Ｍ濃度の酢酸塩緩衝液（ＰＨ５，０）６０ｇ＋／
に溶解した。

この溶液に粒子径が２５０μないし８４０μで比表面積
が約８２ｎ／／ｆ、孔径が１００Ａないし２，０ＯＯＡ
までのマクロポア−の細孔容竜の合計が０．５８ω／ｆ
でアミノ基および置換アミノ基に基づく陰イオン交換容
量が６．２６　ｍｅｌＱ／ｆかつカルボキシメチル基に
よＳ陽イオン交換量が２．８６　ｍｅｑ／ｆあるマクロ
多孔性フェノールホルムアルデヒド系両性イオン交換樹
ｔ１１１０ｒｔ乾燥状態時の重ｔ）を浸γにし、液温を
８０Ｃに保ちながら４時間約１５　Ｏｒｐｍで回転攪拌
を続けながら吸着を行なった。吸着後８００　ｍｌのイ
オン交換水で洗浄した。

゛この時、担体竜こ吸着されている酵累歌は１１８＃７
／タ一担体と算定された。次いで（ｗ／ｖ　）％の水浴
液）溶液（Ｐ））４．５のｏ、　ｏ　５　ｈｉ酢酸塩緩
衝溶液装グリオキザールを溶解しｔこもの）　７５　ｍ
ｌに浸漬し、液温を約２０℃に味もなから８時間、ｌ　
２　Ｏｒｐｍで回転攪拌しながらグリオキザールと反応
した。８時間後、０．２Ｍ軸度の酢酸塩緩衝液およびイ
オン交換水で十分洗浄した後、固定化されているグルコ
アミラーゼ看は１１４ダ／を一担体、、１り算出され、
活性は；Ｉｓ　ｂ　（ｗ／ｖ）％アミコール　＆ｌｌ液
液ｐＨ４、ｊ　）　＋こ０．０７５　（ｗ／ｖ）％の粉
末グルコアミラーゼを投入し、５５℃で４時間反応を行
なった後、温度を８０ＩＣまで加熱して反応を停止させ
る。この掃作で１日おき各こ４回基實を調岱した。この
反応操作會こよって生成してくるグルコース組成は４５
±５％である。こうして得られｒこ部分糖化液を基質と
して次に本固定化グルコアミラーゼ組成物によって二段
階糖化を行なった。すなわち、本固定化グルコアミラー
ゼ組成物１０ａｔをジャチット管付きカラムらこ充填し
、４５Ｃ１こ保温しつつヒ記基質を流下させた。その際
固定化グルコアミラーゼ１こよって分解生成してくるグ
ルコースの組成率が９５％以ヒになるように活性の低下
とともに空間速Ｂ（ｓｖ）を下げてゆき、１週間連続的
に通液しｔこ。ｉの結果を表４曝こ示す。

表　　　　　４ 一週間、Ｊ７−’＃して二段！Ｖ糖化が行なわれている
ことがわかる。この二段階糖化法によって非潜６乙短時
１ｊυのうち１こグルコース組成率、９５％、ｌヒを達
成することができも。

【図面の簡単な説明】

図の曲線Ａｆｉ本発明の固定化グルコアミラーゼ組成物
の構成要素の一つであるリゾプス・デレマー起源のグル
コアミラーゼの相対活性のｐＨ依存性を示すグラフであ
る。 実験温度はｑ　ｏ　Ｃｓ基質ｉｊ／（ｖ／Ｖ）−の可溶
性澱粉（メルク社製品）を用いて行なり友。 図の曲線Ｂは本発明の固定化グルコアミラーゼ組成物の
相対活性のｐＨＩ依存性を示すグラフである〇 実験温度はダｏＣ，基質は／（ｖｒ／ｖ）チの可溶性澱
粉（メルク社製品）ｆ用いて行なった。 ＰＨ 手続補正書（自発） 昭和５６年ｌσ月７２日 特許庁長官　島田春樹殿 １、事件の表示 昭和３６年　特許願第　／クー４フ４Ｚ　　号２、発明
の名称 Ｊし 固定化グＶコアミラーゼ組成物 ３、補正をする者 ５、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明、・」、の欄６、補正の内
容 （１）　　明細書を以下のとおり補正する。 手続補正書（方式） ％式％ ■、事件の表示 昭和５６年　特許願第１ダコｔ７ダ号 ２、発明の名称 固定化グル１アミ、ラーゼ組成物 ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 住　所　　大阪市東区北浜５丁目１旙地名称　（２０９
）住友化学工業株式会社代表音　　　　　土　　方　　
　　　武４、代理人 ｊ、補正命令の日付 昭和５７年１月２を日（発送日） ６、補正の対象 明細書の「図面の簡単な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）明細書の第３Ｉ頁の図面の簡単な説明の欄を下記
のとおり補正する。 「図面の簡単な説明 図は固定化されていないグルコアミラーゼと本発明の固
定化グルコアミラーゼ組成物のそれぞれの相対活性のＴ
）Ｈ依存性を示すグラフである。 図の縦軸は相対活性（％）を表わし、横軸はｐＨを表わ
す。 図の曲線ＡＨ本発明の固定化グルコアミラーゼ組成物の
槽数”□要素の一つであるリゾ一 ブス・デレマー起源のゲルコアｌラーゼの相対活性のｐ
ｉ（依存性を示すグラフである〇実験温度にダｏ　Ｃｓ
基質ｎ　／　（ｖｒ／Ｖ　）　％１７）可溶性澱粉（メ
ルク社製品）管用いて行なった。 図の曲線Ｂｉ本発明の固定化グルコアミラーゼ組成物の
相対活性のｐＨ依存性を示すグラフである〇 実験温度はダＯＣ，基質は／（Ｗ／Ｖ）チの可溶性澱粉
（メルク社製品）を用いて行なった０　」 １、　　　　以上 胃、。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 比表面噴がｌ　Ｗｆ／　ｆ以ヒ、孔径１００Ａないし２
   ，０ＯＯＡのマクロポア−の細孔容散の合計が０．１　
   ｃｃ　／　９９ヒ、アミノ基あるいは置換アミノ基に基
   づく陰イオン交換容歌が１ｍｅｇ／１９ヒ、かつカルボ
   キシメチル基１こ基づく陽イオン交換容量が０．５　ｍ
   ｅｑ／ｇ　ｄヒであるマクロ多孔性フェノールホルムア
   ルデヒド系両性イオン交換樹脂を担体としＣリゾプス、
   デＬ／　？　−（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ）
   起源のグ＋ｌｚコアｔラーゼを吸着させた後、さら−こ
   これに、多官能性架橋剤を反応せしめること−こより得
   られる固定化グルコアミラーゼ組成物。