JPS5826745B2 - Ｎα−アシル−α−Ｌ−アミノ酸アニリド化合物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なα Ｌ−アミノ酸誘導体に関し、 （式中、Ｒは塩基性α−Ｌ−アミノ酸又は芳香族α−Ｌ
−アミノ酸の側鎖の基を示し、Ｒ１はアシル基を示し、
Ｒ２は水酸基、メトキシ基、ジメチルアミノ基又はジエ
チルアミノ基を示す）を有するＮ“−アシル−α−Ｌ−
アミノ酸パラー置換アニリドおよびその酸付加塩に関す
る。

前記一般式（１）において、塩基性α−Ｌ−アミノ酸と
はＬ−リジン、Ｌ〜アルギニンであり、芳香族α−Ｌ−
アミノ酸とはＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ
−）リプトファンであって、その側鎖の基とは４−アミ
ノブチル基、３−グアニジノフロビル基、ベンジル基、
ｐ−ヒドロキシベンジル基、インドール−３〜イルメチ
ル基である。

Ｒ１で示されるアシル基とはアセチル、ベンゾイル、カ
ルボキシプロピオニル、ベンジルオキシカルボニルのよ
うな基である。

本発明に係る前記一般式（１）を有する化合物はトリプ
シンまたはキモトリプシンの優れた基質として使用され
る。

これらの酵素は膵機能の診断の指標となるため、これら
酵素基質は臨床上有意義な知見を得るに役立つ。

従来、トリプシンおよびキモトリプシンの発色基質とし
ては主としてそれぞれアシル化塩基性アミノ酸バラニト
ロアニリド、アシル化芳香族アミノ酸バラニトロアニリ
ドが使用されていた。

しかしながら、これらの化合物は酵素反応を行なうため
の緩衝液に往々にして難溶であり、安定した測定値を得
るための濃度に溶解させるためには界面活性剤を加える
など特別な操作を必要とした。

本発明者等は溶解性のよい安定な測定値の得られる化合
物について種々研究を重ねた結果、前記一般式（Ｉ）を
有する化合物が優れた基質であることを見出した。

本発明に係る前記一般式（Ｉ）を有する化合物は常法に
よって製造することが出来るが、一例をあげると次の通
りである。

例えばアミン基を保護された一般式 （式中、Ｒは前述した塩基性アミノ酸および芳香族アミ
ノ酸の側鎖の基を示す）を有するアミノ酸を活性化剤の
存在下でパラ一置換アニリンと反応させるか、前記一般
式（］］）を有するアミノ酸のカルボキシル基における
反応性誘導体をパラー置換アニリンと反応させて得られ
る。

使用した保護基が目的とするアシル基の場合はこのまま
でよいが、目的とするアシル基と異る場合は一旦これを
除去したのち改めて目的とするアシル基を導入するため
にアシル化を行なう。

また、リジンのように二個のアミノ基を有する場合はε
−アミノ基を選択的除去可能な保護基で保護し、最後に
その脱離を行なう。

活性化剤或いは反応性誘導体としては通常のペプチド合
成の際に使用し得るものを特に限定なく使用することが
出来る。

例えばジシクロへキシルカルボジイミド、カルボニルジ
イミダゾール等の活性化剤、混合酸無水物、活性エステ
ル等の反応性誘導体があげられる。

この反応の除のアミノ基の保護基としては後に緩和な条
件で除去しうる基で通常のペプチド合成に使用し得る基
例えば臭化水素処理、接触還元などで除去し得るベンジ
ルオキシカルボニル基、ヒドラジンで除去しうるフタリ
ル基、弱い酸性条件下で除去しうるｔｅｒｔ−ブトキシ
カルボニル基、弱い塩基性条件下で除去しうるトリフル
オロアセチル基等があげられる。

保護基を除去された遊離のアミノ酸アニリドには、酸無
水物、酸塩化物などにより目的とするアシル基を導入す
る。

得られたアシル化アミノ酸アニリドのうち、アシル化塩
基性アミノ酸アニリドは所望により常法によって種々の
鉱酸、有機酸による酸付加塩に変換することが出来る。

酵素活性は、適当な緩衝液中で酵素と基質とを接触させ
、酵素反応によって遊離したパラー置換アニリンを定量
することによって測定される。

次に実施例および試験例をあげて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれによって限定されるものでは
ない。

実施例 Ｉ Ｎ″−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アルギニン パ
ラ−ヒドロキシアニリド Ｎｃｔ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ −フルギニン
３．０８ｆをアセトン３０ＴＬｌに懸濁させ、これに６
規定塩酸５ｒＩＬｌを加えて全溶させる。

この溶液を減圧で濃縮乾固し、シロップ状の残渣をジメ
チルホルムアミド３０ｍ１に溶かして一２０℃に冷却し
、Ｎ−メチルモルホリン１．０１Ｐを加える。

混合物をよく攪拌しながら、これにクロルぎ酸エチル１
．０’ｌを加え、１５分後にパラ−アミノフェノール１
，２１を加える。

混合物の温度を０℃に上げ一夜攪拌を続げた後減圧で濃
縮する。

シロップ状の残渣に塩化メチレンを加え攪拌して洗い、
塩化メチレンを傾瀉して除くと目的化合物が得られる。

この化合物０．４’ｌをシリカゲル〔ワコーゲル Ｃ−
２００（商品名）、２５ｙ〕を使用したカラムクロマト
グラフィー〔展開溶剤：クロロホルム−エタノール−酢
酸（２０：５：１）、ｌで精製し酢酸エチルで結晶化す
ると融点１００〜１０２℃を有する純品０．３３Ｐが得
られる。

実施例 ２ Ｎ −ヘンシルオキシカルボニル−Ｌ−）リブトファン
パラ−ジエチルアミノアニリドＮ″−ベンジルオキシ
カルボニル−Ｌ−）ＩＪブトファン３．３８？およびＮ
−Ｎ−ジエチル−パラ−フェニレンジアミンｉ、ｓｉｙ
をテトラヒドロ７ラン３０ｒＩＬｌに溶かし、水冷下に
ジシクロへキシルカルボジイミド２．２１’をテトラヒ
ドロフラン５−に溶かした冷溶液を加え、０℃で２時間
次いで室温で一夜攪拌する。

析出せるジシクロへキシルウレアを沢去し、ｐ液を減圧
で濃縮すると固体残渣が得られる。

これをエタノールから再結晶するとと無色針状晶の目的
化合物４．２７？が得られる。

融点１８９〜１９０℃。

実施例 ３ Ｎｃｔ−アセチル−Ｌ−）リプトファンパラージエチル
アミノアニリド Ｎ″−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−）！Ｊブトファ
ン パラ−ジエチルアミノアニリン３．４１をメタノー
ル５０Ｔｎｌに溶かし、■規定塩酸１４ＴｒＬｌを加え
た後１０％パラジウム−炭素０．５１を使用して接触還
元する。

２時間後触媒を沢去し、ｐ液を減圧で濃縮し真空で乾固
する。

残渣をジメチルホルムアミド３０ｍ１に溶かし、水冷下
にトリエチルアミンＬ４２ｆＩ′を加え、攪拌しながら
無水酢酸（１７１Ｐを加える。

０℃で３時間攪拌した後無水酢酸０．１ ｆＩを加え４
０分間攪拌を続ける。

不溶物を汗去し、ｐ液を減圧で濃縮し、残渣を酢酸エチ
ル５０ｒＩＬｌに溶かす。

この溶液を水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後減
圧で濃縮し、シロップ状の残渣に少量のエタノールを加
えて溶かし、放置すると結晶が析出する。

これを沢取してエタノールから再結晶すると無色針状晶
の目的化合物２．０１が得られる。

融点１９０〜１９１℃０〔α、）Ｄ ４０．３（Ｃ＝１
．０，０．５規定塩酸）。

実施例 ４ Ｎ″−３−カルボキシプロピオニル−Ｌ−リジン パラ
−メトキシアニリド ａ 、 Ｎ −ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｎε
ベンジルオキシカルボニル＝Ｌ−リジン パラメトキシ
アニリド Ｎα−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｎεベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−リジン４．１７２およびパラ−ア
ニンジンｌ＝ ３５ Ｆをテトラヒドロンラン３０７７
１１に溶かし、水冷下ジシクロヘキシルカルボジイミド
２．２１’をテトラヒドロフラン５ｍｌ！に溶かした溶
液を加え、０℃で２時間、次いで室温で５時間攪拌する
。

析出せるジシクロへキシルウレア’ｆ去し、ｐ液を減圧
で濃縮し真空で乾固する。

固体残渣をエタノールから再結晶すると無色Ｑ針状晶と
してこの工程の目的化合物３．５りが得られる。

融点１６７〜１６９℃。ｂ、Ｎ−３−カルボキシプロピ
オニル−Ｎεベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ＩＪフラ
ンパラ−メトキシアニリド Ｎ −ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｎεベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−ＩＪフランパラメトキシアニリ
ド２．５ｆ？を５０％のトリフルオル酢酸を含む塩化メ
チレン５０１１Ｌｌに溶かし、室温で１５分間攪拌する
。

減圧で反応混合物を濃縮し、残渣にベンゼンｌＱｍＡ’
を加えて再び減圧で濃縮し真空で乾固する。

この操作を２度繰返した後シロップ状の残渣をジメチル
ホルムアミド１０ｍ１に溶かして氷冷する。

混合物にトリエチルアミン０．４９ｆ？次いでコハク酸
無水物０．７２’ｉを加えた後４０℃で７時間攪拌する
。

反応混合物より減圧で溶剤を留去し、シロップ状の残渣
に１０％クエン酸水溶液を加えて放置すると結晶が析出
する。

これを戸数し、水、メタノールおよびエーテルで順次洗
うとこの工程の目的化合物１．３８Ｐが得られる。

融点１４８〜１５３℃。

ｃ、Ｎ −３−カルボキシプロピオニル−Ｌ−リジン
パラ−メトキシアニリド Ｎ −３−カルボキシプロピオニル−Ｎεベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−リジン パラメトキシアニリド１
．６８Ｓ’をメタノール３０ｍ１および酢酸２０ｍ１の
混合液に懸濁させ、１規定塩酸３．４′ｒ／Ｌｌを加え
、１０％パラジウム−炭素０、：ｌを使用して接触還元
する。

１．５時間還元を行なった後触媒を１去し、ｐ液を減圧
で濃縮する。

シロップ状の残渣にトリエチルアミン０、３４ Ｐを含
む塩化メチレン２０ｖｔｌを加え、沈澱を戸数し、塩化
メチレン次いでエーテルで洗い真空で乾燥する。

このものを熱メタノール中で攪拌し、冷却後戸数すると
目的化合物０．７ Ｐが得られる。

融点２０３〜２０４℃。〔α〕記実施例 ５ Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−チロシン パラ−ジメチルアミノ
アニリド パラ−ジメチルアミノアニリン ジ塩酸塩５ｙ′をジク
ロルメタン１００ｒｆＬｌに懸濁し、トリエチルアミン
７、０ ｍ／を加えて溶解せしめる。

これにＮベンジルオキシカルボニル−Ｌ−チロシン６．
３１を加え、次いで水冷下にジシクロへキシルカルボジ
イミド５．３１を少量のジクロルメタンに溶かして加え
る。

室温で一夜攪拌し析出したジシクロへキシルウレアを汗
去し減圧にて濃縮する。

残渣に酢酸エチルを加え抽出し水洗後無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥し減圧濃縮する。

残渣にイソプロピルアルコールを加えると粉末５．８ｆ
Ｉが得られる。

ここに得られた粉末２．５１をメタノール７０ｍ１およ
び水３０−の混合溶媒に懸濁し、６Ｎ塩酸２１７１１を
加える。

これに５％パラジウム炭素触媒０．２５Ｐを加え、２時
間接触還元を行なう。

触媒を戸去し、ｐ液を濃縮すると若干黒く着色した油状
物が得られる。

上記油状物に水５０１ｒＬｌを加え、更にテトラヒドロ
フラン５０ＴＬｌ及び重炭酸ナトリウム１．１’を加え
る。

次いでベンゾイルクロリド０．９Ｐを加え水冷下激しく
攪拌する。

２．５時間後減圧にてテトラヒドロフランを留去し、析
出した粉末を１取する。

ツタノールより再結晶すると目的物１．７５？が得られ
る。

融点２３７〜２３９℃。〔α〕。＋６４．７（Ｃ＝１．
０、酢酸エチル） 試験例 キモトリプシン活性の測定 Ｎ −ヘンジイルチロシン パラ−ジメチルアミノアニ
リド８■をアセトン０．５ ｍＡ’に溶かし、１％のツ
ウイン８０および５ｍＭの無水塩化カルシウムを含む０
．１ Ｍ ）リス緩衝液（ｐＨ８−０）１０１ｒＬｌを
加えこれを基質緩衝液とする。

基質緩衝液１ ｍｌを試験管にとり、３７℃に加温し、
結晶キモトリプシン溶液（１，５■／ｍ１Ｈ２０）０．
０５ｍ１を加えてインキュベートする。

３０分後に反応停止呈色液（後記）５１ｒＬｌを加え、
２０分室温に放置した後６６０ｎｍにおける吸光度を測
定する。

別に上記操作中キモトリプシン液の代りに水０．０５
ｒｕｌを用る以外は全（同様にしてブランク値とする。

この両値の差からキモトリプシン活性が得られる。

このようにして測定された上記基質に対するキモトリプ
シンのｋｍ値は０．６１ ｍＭ。

Ｖｍａｘは０．１２３ μｍｏｌｅ ／ｍｉｎ、／ｍｙ
キモトリプシンであった。

この方法は結晶キモトリプシン液の代りにキモトリプシ
ン活性を有する生体抽出液、血清等にも使用することが
できた。

反応停止呈色液：ナトリウム ペンタシアノアミノフェ
ロエート２ｉを水２０ｍ７に溶かし、０．３％過酸化水
素水６０ｄを加え、更に１０％炭酸水素ナトリウム水溶
液２０ｒｎｌを加える。

この溶液に低分子デキストリン４ｔを加えて溶かし呈色
原液とする。

この原液ＩＴＬｌＫ０．２５Ｍ乳酸緩衝液（ｐＨ４，５
，１％塩化ナトリウムを含む）５０ｄを加えて反応停止
呈色液とする。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （式中、Ｒは塩基性α−Ｌ−アミノ酸又は芳香族α−Ｌ
   −アミノ酸の側鎖の基を示し、Ｒ１はアシル基を示し、
   Ｒ２は水酸基、メトキシ基、ジメチルアミノ基又はジエ
   チルアミノ基を示す）を有するＮ（ｔ−アシル−α−Ｌ
   −アミノ酸パラー置換アニリドおよびその酸付加塩。