JPS58146513A - 鳥感染性気管支炎ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な感染性気管支炎ワクチン、生もしくは
失活し九感染性気管支炎ワクチンの製造方法、感染性気
管支炎に対する免疫化方法、ならびに新規な感染性気管
支炎ウィルス株に関するものである。

鳥類の冠ウィルス（ｃｏｒｏｎａ　ｖｉｒｕｓ　）は、
気管支雑音、咳、くシやみおよび鼻汁排出を特徴とす°
る若い雛および成長雛における急性の高度感染性呼吸病
に対する作用因子となることが知られている。

感染性気管支炎（ＩＢ）と呼ばれるこの病気は、特に着
い雛において高い死亡率をもたらし、さらに腎臓および
繁殖管に影響を与え、後者の損傷はそれぞれ飼育種の鶏
における卵の産卵低下をもたらしうる。多くの場合、こ
の産卵低下症は下痢性腸炎を伴う。

雛は唯一のＩｎウィルス（ＩＢＶ）の天然宿主であると
考えられてい念が、最近七面鳥からもこのウィルスが単
離され九。鳥類のＩＢＶの他に、七面鳥の冠ウィルス腸
炎を引起こす因子（ＧＥＴ、幼鶏病）は他の鳥類の冠ウ
ィルス種類として記載されている。

鳥讃におけるＩＢを抑制するため、ワクチンが大規模〈
使用されている。たとえば、ブロイラーの雛、および産
卵種および育成種の若鳥や雛の免疫化の念めに、主とし
て生の減成ワクチンの投与が行われている。□生ワクチ
ンウィルスの種類は、それらの免疫学的性質の他に、そ
の抗原スペクトルおよび低病原性をも考慮して選択され
ている。

九とえば、コネクチカット（たとえばコネクチヵット・
アイソレート人　５ｓａａ）を九はｉサチヱーセツツ（
たとえばパウデット型ＩＢＭ　４２　）のような特定の
血清型（魯・ｒｏｔｙｐｅ）を含有するワクチンが文献
に記載されているが、これらは同族型に対してのみ保護
を与えるものである。また、たとえばＨ株として知られ
る比較的巾広い抗原スペクトルを有することが示された
特定のウィルス株から得られるワクチンも使用される◇ 生ワクチンでは、互いに異なる複数のＩＢ血清型の組合
せも試みられているが、大抵の場合相互の反応の結来各
血清型に対して与えられる保護は最適ではなかった。

し九がって、これらのしはしは使用されるＩＢウィルス
株もしくはその組合せに基づ〈従来の■Ｂワクチンは、
ＩＢの発生に対し完全な免疫を与えないと思われる。

しかしながら、本発明による新規な１Ｂワクチンは、鴬
くことに感染性気管支炎に対し一層効果的である。

これらの新規なワクチンは、雛の赤血球を自然に血球凝
集させる（　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｌｎａｔｅ　）感染性
気管支炎ウィルスから得られることを特徴とする。

雛の赤血球を自然に血球凝集する性質を有するＩｎウィ
ルスは、たとえば−Ｖ？チューセツツ型およびコネクチ
カット型の各種のｘＢｖ血清型の中から生ずることが判
かった力１、さらに新しい血清型に属するウィルスも確
認された。

雛の赤血球の自然血球凝集を示すウィルス株の免疫能力
は、同じそれぞれの血清型に属するが赤血球を自然に凝
集させないウィルスの免疫能力よりもはるかに大きい。

さらに、雛の赤血球を０然に＃集させるＩＢウ−イルス
の組合せから得られるＩＢワクチンは、雛の赤血球の凝
集をもたらさない異なる血清型からのＩＢＶ株の組合せ
に基づくワクチンよりも、良好な保Ｓを示すことが判っ
た。

さらに、本発明によるＩｎワクチンは、１種もしくはそ
れ以上の非血球凝集性ＩＢウィルスから得られるワクチ
ンと組合せた場合、ならびにマレツクス病、ニューキャ
ッスル病または産卵低下病に対するワクチンのような他
のウィルス単離物かも得られるワクチンと組合せた場合
、優秀な免疫化特性を示した。

本発明による新規なＩｎワクチンは、たとえば雛の赤血
球を自然に血球凝集させる性質を有する新規なＩＢウィ
ルス株から得ることができ、これらは英国ウェイブリッ
ジ州、ニューハウ所在ノセントラル・ペテリナリイ・ラ
ボラドソーに寄託され、寄託番号ＶＬＯ１０１１０／Ａ
ＶＩ／３　：　ＶＬＯ１０１１Ｇ／ＡＶＩ／４：　ＶＬ
ｏ　１０１１０／ＡＶＩ１５：　ＶＬＯ１０１１０／＊
ＶＩ／ｓおよびＶＬＯ１０１１０／ＡＶＩ／７として登
碌されており、そしてこれらは、Ｄ２７４．Ｄ１４６６
゜１）５８０，２４６Ｇおよび２４９Ｇの部内名称でそ
れぞれ示された種類に対応するものである。

新規なＩＢＶ株は種々の血清型に属することが示された
。２４６ＧおよびＤ５８０株はそれぞれマサチューセッ
ツ型およびコネクチカット型である。Ｄ２７４，２４９
Ｇおよび０１４６６株は新規の従来未報告の血清型に属
する。第１表には一定の血清希釈されたウィルス法を用
いる卵におけるウィルス中和試験（ＶＮ）の結果を要約
し、これらは新規な単離物Ｄ２７４および０１４６６の
いずれもｉサチューセツツ血清型ＫＭせず（オランダワ
クチン株ＨＩｍによって、これら実験において示される
）また８株ワクチンにより包含されないような北アメリ
カＩＢ血清型にも補さないことを示している。血球凝集
株Ｄ２７４は、新たな血清型０２０７に分類することが
でき、血球凝集性ウィルス０１４６６はＤ２１．２型に
属する。２４９Ｇ株はＤ２７４株と同じ血清型である。

これは、新規な単離物と、％定の病源菌を包有しない（
ＳＰＦ）＠で調製された特定抗血清との間の交差中和実
験〔雛の胚繊維芽（Ｃ１ｉ２Ｆ）細胞におけるブラック
減少試験を使用する〕で示される。

新規な血清型ＩＢＶ株Ｄ２７４．２４９Ｇおよび０１４
６６に対する適切なワクチン化が可能なことは、雛の単
離物におけるこれら血清型の高度の出現によって示され
る。第３表には、新規な血清型ＩＢウィルス（３人）に
対する抗体を有する群の相対数および群（３ｂ）から各
血清型のＩＢウィルスが単離される頻度を示す。

これら新規なウィルスは、鳥類の冠ウィルスとして同定
しうる次の性質によって特徴づけられる：１、）これら
はＲＮＡ型の核酸を有し、雛の胚腎臓紙胞（ＣＥＫ）培
養物におけるウィルス再生は、培地に対する５−７０オ
ロデスオキシーウリジンの添加によってたいして影響を
受けなかった。

２．２　　これらウィルスはリピド溶剤に対し鋭敏であ
る。ＳＰＥ胚子含有卵内でウィルスを増殖させて得られ
た感染性羊水−尿膜液（ＡＡＦ）をクロロホルムで処理
したときには、その結果として、感染性タイターが著し
く減少した。これは、必須リビドを含有するエンペロブ
ウィルスが有する典型的な性質であう、また、鳥類の冠
ウィルスの特性でもある。

３、）感染人ｋＦを超遠心分離により濃縮して作成した
ウィルス標本を電子顕微鏡で検査すると、冠ウィルスに
特徴的な寸法および形状を有しかつ表面に典型的な突起
部（長さ耳５〜２０ｎｍ）を有するウィルス粒子が認め
られた。突起部を除く該粒子の直径は７５〜１２０ｎｍ
であった。

４、ンゲル拡散試験を用いることにより、これらウィル
スは公知の鳥類上ウィルス、たとえばＩＢ／Ｖ比較株ダ
ウデッドと共通の抗原を含有することが示された。しか
しながら、他の鳥類ウィルスと共通の抗原は、検出する
ことができなかった。ＳＰＦ確における新規法に対し調
製された特定の抗血清は、鳥類上ウィルス以外の鳥類ウ
ィルスから生成された抗原と反応しなかつ友。

５．）新規なウィルス株は、感染細胞の細職質中で増殖
する。試験管内の系で適するものは、次のものである： 査胚子含有のＳＰＦ卵（好ましくは尿膜経路によって感
染される）； 裔気管支器官培養物； ☆雛の細胞および ☆雛の胚細胞（好ましくはＣＥＫ細胞）Ｑ上記のデータ
により、鳥類の冠ウィルスに属しそして他の鳥類ウィル
ス（たとえば鳥類インフルエンザウィルス、ニューキャ
ッスル病ウィルス（ＮＯＶ）ＲＥＶウィルス、アデンク
イルス、ロイコレスウィルス、細網内皮症ウィルス、鳥
類脳を髄炎ウィルス、感染性喉頭気管支ウィルスを含む
ヘルペスウィルス、マレク病ウィルス、鳩おヨヒ七面鳥
のヘルペスウィルスおよび感染性滑液のり病ウィルスか
ら区別される前記の新規ウィルスが充分に同定できた。

さらに、本発明は、上記し友自然血球凝集を示す鳥類の
冠ウィルスのワクチンの製造に関するものである。

このウィルスは、胚子含有のＳＰＦ＠卵または、好まし
くは鳥の組織からの細胞培養物で増殖させることができ
る。

減成生ワクチンを生産すべき場合、減成は、ウィルス単
離物を胚子含有卵または細胞培養物（好ましくはＣＥＫ
細胞）に適合させかつウィルスをこれら培養物中に、た
とえば１０〜２００倍で通すことにより行なうことがで
きる。安全な生ワクチンを製造するためのその他の方法
は、鳥類の冠ウィルスの適当なりローンを選択しかつ培
養することであり、念だしこれらはまだ自然凝集の性質
を有するものとする。

新規なウィルスから失活ワクチンを＃造するＫは、ＡＡ
Ｆ’もしく　ｔ／ｉｉａｍ培ｌｌ液を九とえはホルムア
ルデヒドまたは！−プロビオラクトーンによって失活さ
せることができる。

失活させかつ必要に応じ田を調整し失活剤を中和した後
、失活抗原をアジュバント（助剤）と混合することがで
きる。アジュバントは、たとえば水酸化アルミニウムま
たは鉱油〔たとえばｉルコール（登碌商ｍ’）８２　）
もしくは植物油と１糧もしくはそれ以上のツイーン（登
碌商標）８０およびスパン（登碌商標）８０とよりなる
組成物であり得る。

生ワクチンは点眼薬０点鼻薬、飲料水または噴霧法によ
って１日令〜産卵令（約１８週）にわたる年令の鳥に投
与することができる。

通常、失活ワクチンは、１０〜２０週令において皮下注
射ま九は筋肉内注射によって投与することができる。

生ワクチンについては、鳥１羽当り一３〜ｋｌ１７ｇＩ
Ｄ、。の範囲、好ましくはｌｏｇ４〜−５　ＥＩＤ、０
の範囲の投与量を使用することができる。

失活ワクチンは、鳥１羽当りｉｏｇ５〜−８　ｇＩＤ、
。、好ましくは−６〜−８ＫＩＤ■・の抗原当晩を含有
することができる。

ワクチン（生または失活）が１種より多い冠ウィルス株
を含む場合、それぞれの株は上記した投与量レベルで存
在させるべきである。

新規な鳥類冠ウィルスの１種−もしくはそれ以上とたと
えばＮＤＶ感染性滑液のう病ウィルス、ＥＤ８７６ウイ
ルス、アゾンもしくはレオウィルスのような特に失活ワ
クチンにおける１種もしくはそれ以上の無関係の鳥類ウ
ィルスとの粗汁せも、本発明の一部を構成する。

以下、本発明を実施例によシ説明する。

実施例！ 感染性気管支炎ウィルスの単離 次の手順を用ｉて、盲種鶏および産卵鶏の群において単
離を行なつ九二 気管支採集物シよび／または盲腸領域からの腸掻取り物
を、抗生物質を含有するトリプトースホスフェートプロ
ス中に懸濁させた。少なくとも１０個の９〜１１日令の
胚子含有８ＰＦ雛卵に１各ウイルス試料の懸濁物を尿８
Ｉ紐路によって接種した。

接種の４８〜７２時間後、尿膜液とＣＡＭとを１０個の
卵のうち４個から収穫し、さらに８ＰＦ卵に対し接種し
た。少なくとも３連の盲実験を各試料につき行なった。

各実験における残余の卵（通常１０個のうち６個）を７
日間培養し、そしてまだ生存している胚を発育阻害およ
びＩＢに典型的な病巣につき検査した。

声和す 生ワクチン Ａ−２−づ−北−シ５ｚλ月晩憚− 胚子含有ｓｐｙ’−卵（１０〜１１日培養）に、尿膜孔
経路で、種ウィルスの５０Ｙ；卵感染投与量（ＥＩＤ、
・）のに１３〜−４を接種した。卵ｔ−接種の１８〜２
４時間後に検査し、非特異性の死滅胚を捨てた。１８〜
７２時間の培養時間（使用したウィルス株に応する）の
後、ＡＡＦを収穫し、遠心分離および／または濾過によ
って清澄させ、最終的に適当濃度の抗生物質（示した場
合）と混合した。

Ｂ、ワクチンの製造 次いで、ＡＡＦをそれ自体公知の方法により医薬製剤ま
で処理することができる。安定化は、たとえばソルビト
ール、マニトールなどの炭水化物またはアルブミン、カ
ゼインのような蛋白質または適当な混合物の如き適当な
安定剤の添加によって行なうことができる。このＡＡＦ
を一３５℃以下の温度で凍結させ、次の処理まで貯蔵す
ることができる。或いは、とのＡＡＦを後の処理まで、
＋４℃で貯蔵することもできる。ウィルス含量を測定す
る丸め、試料を採集する。安定化されたＡＡＦ（材料が
凍結されている場合は解凍した６１）を・１〜２−の量
で凍結乾燥瓶中に満たす。ウィルス含量は、凍結乾燥後
のタイターが少なくとも島１羽当、９４．　Ｏ＃　ＥＩ
Ｄ、。の投与量となるように調整する。この試験風を減
圧下もしくは窒素下に凍結乾燥後封止する。

実施例璽 失活ワクチン Ａ−？−ブー乃−灸ｑ刺滓 ■人の項で記載したと同様にウィルスを増殖させる。失
活式せる前の物質の貯蔵およびその後の処理は、−３５
℃未満の温度で行なうことができる。

Ｂ−乞づ−ｙ４Ω大活 凍結ＡＡＦを解凍させ、試料を採集してウィルスタイタ
ー（ＥＩＤ、。）を決定し、ＡＡＦを最終濃度０．４％
までのホルマ°Ｊンの添加により失活させる。

室温にて２４時間後、ホルマリンをメタ亜硫酸ナトリウ
ムによって中和することができる。鋭敏なＳＰＦ雛の胚
にもしくはＣＥＦ培養物に少なくとも１回接種すること
により、試料を失活につき試験する。失活のための他の
方法は、！−グロビオラクトン、エチレン−イミンまた
はその籾導体の使用である。失活したＡＡＦを、タイタ
ーの要求に応じて希釈または濃縮する。濃縮は、失活に
先立って行なうことができる。適する方法は、限外濾過
ｔｉはポリエチレングリコール沈澱による濃縮である。

失活ＡＡＦは＋４℃で貯蔵することができる。

Ｃ，ワクチンの製造 失活した油性エマルジョンワクチンを製造するため、ツ
イーン（登碌商標）８０を３．５％のｒｌｋ度で失活抗
原懸濁物へ加える。抗原含量を鳥１羽当如少なくとも７
．０　′に＠ＥＩＤｇｏの投与量に調整する。

抗原物質は、酵素免疫法によって決定することができる
。次いで、懸濁物をアジュバントの油相中へ、油対水の
比７０　：　３０もしくは５５：４５１Ｃて乳化させる
。アジュバントの組成は次の通シである。

マルコール（登鎌商標）５２　　　９０％ツイーン（登
碌商標）８０　　　３．５％ス　パ　ン（登鎌商標）８
０　　　６．５％水相の平均粒子寸法は、１．０μ帛未
満でおる。

哀農！ｌ 混合ワクチン 人、混合生ワクチン 混合生ワクチンを製造するため、異なるウィルス株（実
施例厘によシ調製）を含有するＡＡＦを、各特定株に対
する所要の最少ウィルス含量が最終生産物中に達成され
るように混合せねばならない。

Ｂ、混合失活ワクチン 実施例ＩＡにしたがってウィルス株を増殖させ、−３５
℃にて貯蔵する。各ウィルス株の抗原を実施例ＩＢにし
たがって失活させ＋４℃にて貯蔵する。ツイーン（登録
商標）８０を３．５％の濃度にて各抗原懸濁物へ加える
。各特定ウィルス懸濁物の抗原含有量は、各ウィルス株
が１羽当り少なくとも７．　Ｏｂｇ　ＥＩＤｓｏの抗原
当量を有するワクチンの投与量にて含有するように調整
される。多価ワクチンを実施例ＩＣに記載したように乳
化させる。

乳化させる前に水相を混合するか、或いは個々の抗原を
混合前に別々に乳化させることもできる。

実施例Ｖ 雛赤血球の血球凝集 ２容量の感染ＡＡＦ（実施例！Ａにしたがって９゛□ 調製）または感染組織培養物の上澄液を、１容量の２％
雛赤血球懸濁物と室温において混付した。

凝集は約２分間かかり、場合によって５分以内で起こる
。血球凝集は、＋４℃で培養して促進させることができ
る。

プロメリアン（ｂｒｏｍ＠１ｉａｎ　）処理によって示
されるように、ヘムアグルチニンはウィルス粒子と結合
する。

実施例■ 血球凝集の抑制（ｆ（Ｉ　） Ａ、新規なＩＢ株によってもたらされる雛赤血球の血球
凝集が特異的であってウィルス抗原によるものかどうか
は、赤血球を加える前に特定ウィルスに対し特定の抗血
清を添加することにより、血球凝集反応の抑制で示す仁
とができる。

ＳＰＦ卵に接種の４８時間後、血球凝集性の株Ｄ２７４
を接種し、培養し、そしてＡＡＦを回収した・　　　　
　　　、。

未処理ＡＡＦをそのまま、或いは血清もしくは抗血清で
ｌ：１に希釈して使用した。その後、雛の赤血球を加え
九。その結果を下記の表に示す。

Ｂ、新規なＩＢウィルスはヘムアグルチニンを含有しく
プロメリアン処理によって示される）かつ各種の血清型
に属ｊるため、これら新規ウィルス間の区別を行なうた
めにＨＩ試験を用いることもできる。

使用する方法はアレクサンダーにより〔Ｄ・Ｊ等（Ａｖ
ｌａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ第５巻、第１２５〜１３４
阪（１９７６））〕に記載されている。各抗原を処理す
るため、ホスホリパーゼＣが使用されている。

このように得られるタイターは、２−とじて表わされる
。デー／ｌ−下記の表に示す。

！ｊ通！ ワクチン化実験ＳＰＦ雛 Ａ、ウィルスの増殖およびワクチンの製造Ｄ２０７株（
非血球凝集性（ＨＡ−））および０２７４株（血球凝集
性（ＨＡ十））のウィルスをＳＰＦ卵上で培養し、５４
〜５２個の卵の試験でそれぞれ減成させた。これら減成
ウィルス株のワクチンを実施例ＩＫｔ、たがって調製し
念。

Ｂ、ワクチン化 ６週令のそれぞれ１０羽の５ＰＦｌｌｊよシなる２つの
群に、点眼によって上記各ワクチンの４．０−ＥＩＤ、
。をワクチン接種した。鶏を隔離容器に収容し、１週間
間隔で出血させて血清試験を行なった。

これら血清のＨ！タイターは、実施例ＶＩＢＩ／（記載
した方法にしたがいＩＢＶＤ２７４かも調製された抗原
を用いて決定した。表に示した結果は、上記２つの群の
ワクチン化層において１２週間後、Ｄ２７４抗原に対し
免疫の発現を示した。非ワクチン化鶏を用い九比較もこ
の実験に含ませた。

同じ２群のワクチン化局の血清において、同族株Ｄ　２
７４　（５２＠試験）忙対する中和反応（＞４．０−）
を試験した。反応を示す動物の数（ワクチン化された１
０匹のうち）を下記の表に示す。

Ｃ０免疫実験 ワクチン化の１２週間後、ワクチン化された群およびワ
クチン化されない群の嗜をＤ２７４株（ＳＺ回の試験の
後）の４．０　ｋｇ　ＫＩＤ、・で免疫感染にかけた。

４日後、鳥の気管支部分を標準技術による免疫螢光分析
（ＩＦＴ）によって組織学的に検査した。顕微鏡的病巣
または陽性ＩＦＴを示す鳥の数（ワクチン化され九ｌＯ
羽のうち）を下表に示す。

新規な血球凝集性株Ｄ２７４から調製されたワクチンは
、ワクチン化の１週間後に早くも高レベルのｆ（Ｉおよ
び中和性抗体タイターを発生し、これは少なくとも１２
週間にわたシ保纏性であることが知られたレベルに維持
されると結論される。

これは、免疫反応に対するＤ２７４グループの１００％
保護によって確認することができた。

これに対し、同じ血清型の非血球凝集性Ｄ２０７株は、
実験期間中に極めて低いレベルのｆ（Ｉ抗体−しか発生
しなかった。さらに、中和抗体タイターは血球凝集性Ｄ
２７４でワクチン化されたグループと比較してワクチン
化後１２週間にわたり著しく低いものであり、これはＤ
２０７群における著しく低い保唖割合（僅か約５０Ｘ）
によって確認される。

実施例■ 混合生ワクチンによるワクチン化 Ａ、ウィルスの繁殖およびワクチンのｌｌＩ製血球凝集
性Ｄ２７４株およびＤ１４６６株のウィルスを実施例Ｉ
ＡＫ記載した方法にし九がって増殖させ、そしてこれら
の１価および多価ワクチンを実施例ＩＢおよびｆｆＡに
したがってそれぞれ４、０　Ｉ＃ｌｉｉｌＤｇ・の各棟
を用いて調製し九。

Ｂ、ワクチン化 １０週令の８ＰＦ−の４群につき、それぞれを４個の別
々の隔離装置内に収容した。これら鶏に点眼によってワ
クチン化した。グループムには０２７４株ワクチンをワ
クチン接種し、グループＢＫはＤ１４６６ワクチンを接
種し、グループＣには混合ワクチンを接種し、そしてグ
ループＤは非ワクチン化比較群とした。

Ｃ０免疫化の試験 ワクチン化の尚日およびそのｆ＆２．４　、　ｓおよび
８週間目に血液を集めた。血清を、異なる原型株（Ｍ４
１．Ｄ２？４およびＤト１６）によシ調製された抗原を
用いて、同質および異質の■工抗体反応につきここに試
験した。これらの結果を第９表に示す。　、 Ｄ２７４をワクチン接種した雛（グループ人）は、実験
の終了まで２週間目から同質１（Ｉ抗体の高レベルに反
応また。ワクチン化後２週問および４週間にて、異質抗
［Ｍ４１およびＤ１４６６に対し顕著な交差反応が１！
察され、これは６〜８週間で消失した。グループＢの雛
は比較的低いメイターレベルにおいて同様な反応を示し
た。同質の反応は、少なくとも実験の終了時（接種ｖｋ
８週間後）まで保護レベルに止まった。混合ワクチン（
グループＣ）は両ワクチン株に対し長期持続性の高レベ
ルのＩＩ抗体を誘発した。Ｍ４１抗原に対する顕著な異
質反応も、接種後２週問および４週間で見ることができ
る。早期の異質反応は、抗原％異性のグループに対し反
応する免疫グロブリンの高割合によって説明することが
できる。この実験から判かるように、２種の血球凝集性
株Ｄ２７４および０１４８６は単−生ワクチンおよび混
合生ワクチンの両者において免疫能力を表わす。

実施倒置 ワクチンのフィールド実゛ Ａ、　　、’１．−ｊ−ニーろ粟惰ともｐ−ｒ７冬ｉと
員湾非血球凝集性Ｈ１２０，Ｄ２０７株および血球凝集
性Ｄ２７４株ウィルスの生ワクチンを実施例電ＡＫ記載
したように調製した。

Ｂ、ワクチン化 白色レグホーンおよび褐色種鶏の群に、１日令にてＨ１
２０ワクチンを接種した。１０週令にて白色レグホーン
および褐色種の鶏にそれぞれＤ２０７およびＤ２７４の
ワクチンを接種した。投与量は、鳥１羽当ｆｉ　４．５
　ｋ＠　ＥＩＤ、。とじた。平均グループサイズは１５
，０００羽の鳥とし、ワクチンはスプレーによって投与
した（ナツプザック−スプレイヤー）。

Ｃ１採血 ０２０７およびＤ２７４ワクチンを接種した当日、血液
サンプルを各群につき採取し、血清学的検査を行ない、
これをワクチン化の後４週間反復した。

Ｄ、免疫化比較 中和係数（ＮＺ　）を保護のバラメータとして使用した
。各血清型に対し４−より大きい平均ＮＩを、有効ワク
チン化に関連すると考えた。

この表において、保護性であることが知られた中和反応
に反応する群の割合は、Ｄ２０７ワクチングループと比
較してＤ２７４グループにおいて著しく高いものである
ことが示される。

実施例Ｘ ワクチン化フィールド実　の、のＨｌ　　　タイターの
発現および分 血球凝集性ワクチン株Ｄ２７４を接種した後の産卵鶏お
よび盲橿鶏グループの血清学的反応を監視した。

平均サイズ１５，０００羽の鳥を有する全部で１３７群
に、ｌＯ〜１２週令においてナツプザックスプレー投与
によりＤ２７４生ワクチン（血清型Ｄ−２０７）の単一
投与を接種したつマプチューセツツ型のワクチン接種を
同じ年令のグループ（Ｈ１２０）と約１５週令（Ｈ５２
）において行なつ走。各グループをそれぞれの血清型マ
サチューセッツＤ−２０７およびＤ−２１２に対し１８
〜２０週令においてＨＩ抗体に一つき試験した。

ＨＩｌタイター分布パターンを第１図に示す。

すなわち第１図は、Ｄ−２７４生ワクチンを接種した後
の３種のＩＢ血清型に対するｆ（Ｉ抗体タイターの分布
を示すグラフである。１３７グループのうち１６グルー
プを、３８週令まで追跡し、Ｈｌタイターを４週間間隔
で測定した。、その結果を第２図に示す。すなわち第２
図は、１日令にてｌ１１２０をワクチン接種し、１６週
令にて１（５２を接ａｌＬ、（マサチューセッツ型）４
および１２週令にて、Ｄ２７４を接種した１６の群にお
けるＨＩｌタイター観察結果を示すグラフである。１３
７グーループのうち８６％け７よシ大きいＨＩｌタイタ
を示し、６３％は８より大きく、かつ２５Ｘは血清型Ｄ
−２０７に対し９より大であっ九。非血球凝集性株を２
回接種した後、マサチューセッツ血清型に対する反応は
劣っていた。グループの６６％は７より小さいＨｌタイ
ターを有した。Ｄ−２１２血清型に対する反応（ワクチ
ン化なし）は予想通シ低いものであり、グループの６２
％は７よシ小さいＨ１／イタ−を有した。

第２図から判るように、Ｄ−２７４株を一層ワクチン接
種し念後に達成されるＨｌタイターは慣用のマサチュー
セッツワクチンを２回接種して誘発されるものと比較し
てより高いものであると結論することができる。

実施例Ｉ ！堡奥！９皇屋１３に４川− 実施例Ｖおよび■において行なった迅速プレー）ＨＡ試
験で示され九と同様な新規ＩＢＶ株の自然血球凝集活性
を、１イクロタイター板において、ゆつくシしたＨＡ試
験により一層定量的に試験し、この場合自然血球凝集は
必らずしも示さない。

マイクロメイタ−板における定量的な緩徐のＨ人試験に
よる血球凝集性株と非血球凝集性株との間の差は望まし
いものである之め、濃縮されかつ部分的に精製されたウ
ィルス懸濁物を使用してＨ人情性を示した。

Ａ、ウィルス懸濁物の調製 １０日令の胚子含有卵からの尿膜液収獲物を、接種の２
４〜４８時間後に回収した。ＡＡＦを１０００Ｘ９にて
１０分間遠心分離によって清澄させ九。５Ｗ−２８０−
タ（ペックマン社）ヲ用いｓｏ、ｏｏｏｘ９にて６０分
間遠心分離して３５ｄＡＡＦのウィルス含量をベレット
化させた。このように得られ之ベレットを、１−のＰＢ
Ｓ（＠酸緩衝塩水）中に再懸濁させた。

Ｂ、　　Ｉｋｉ球凝集の試験 マイクロ測定板においてウィルス懸濁物の２倍の希釈系
列を作成した。２５μｔのＲＢＣ（１％）をフィルス希
釈物の最終容量５０μＬへ加えた。

プレートを４℃にて２〜１８時間培養の後に計数した。

タイターは、７５％より多い凝集を示す最高希釈の再現
値として示す（ｎ＝実験の回数）。

結果を第１１表ＫＪ約する。

ここで試験した３種の自然血球凝集性株Ｄ　−２７４，
２４６ＧおよびＤ−１４６６は全て３５倍の濃縮工程の
後２〜８のＨＡタイターを示すのく対し、未感染のＡＡ
Ｆ（陰性比較）と非血球凝集性比較株Ｍ４１は同じ処理
の後陰性のままであった。

これらの実験は、ゆつくシしたプレー）Ｈ人試験および
迅速なプレートＨ人試験の両者により新規なＩＢＶ株の
血球凝集が見られることを示している。濃縮工程を正規
に使用して、濃縮しかつ■ＢＶ粒子を部分的に精製し念
。これは、上記の株のＨＡ特性がウィルス粒子に関連す
ることを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＩメイターの分布パターン図であり、第２図
は４週間間隔で測定したＨＩタイターのグラフである。 出願人子７７′や１ヌ・ウェー 代ｎ人弁理士用　　口　　義　　知 代理入ｓｍ士今　　村　　　　几 手続補正書 昭和５８年４月４日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示　　　昭和５８年特許願第１６８６３号
２、発明の名称　　　感染性気管支炎ワクチン３、補正
をする者 中性との関係　　特許出願人 名　称　　　　アクゾ・エヌ・ヴ工− ４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４
号　山田ビル（郵便番号１６０）電話（０３）　　３５
４−８６２３（６２００”）　　　弁理士　　川　口　
銭　−一）（ほか１ ５、補正命令の日付　　　自　発 ６、補正により増加する発明の数 ７　補正の対象　　　図面　　　　　　　　梗ｆ８、補
正の内容　　　正式図面を別紙の通り補充する。 （内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）雛鳥の赤血球を自然に血球凝集させる感染性気管
   支炎ウィルスから得られることを特徴とする新規な感染
   性気管支炎ワクチン。 （２）雛鳥の赤血球を自然に血球凝集させる感染性気管
   支炎ウィルスの組合せから得られることを特徴とする特
   許請求の範′８第１項に記載の感染性気管支炎ワクチン
   。 （３）１種もしくはそれ以上の非血球凝集性の感染性気
   管支炎ウィルスから得られるワクチンをさらに含有する
   。ことを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項
   に記載のワクチンからなる感染性気管支炎ワクチン。 ＋４１　　セント２ル・ペテリナリイ・ラボラトリ−（
   英国ウェイブリッヂ拳ニューハウ所在）に登碌番号ＶＬ
   ０１０１１０／ＡＶＩ／８：ＶＬＯ１０１１Ｇ／ＡＶＩ
   ／４　：　ｖＬＯ１０１１０／ＡＶＩ／Ｓ　：　ｖＬＯ
   ｉ　Ｏ１１０／ＡｖＩ／６及びＶＬＯ１０１１０／ＡＶ
   Ｉ／７テ寄託された雛鳥赤血球を自然に血球凝集させる
   新規な感染性気管支炎ウィルス株。 ＋５１　ｍ、　　雛鳥の赤血球を自然に血球凝集させる
   １種もしくはそれ以上の感染性気管支炎ウィルス株を、
   ］ｌＩ当な培地における培養で増殖させ、ｂ、感染した
   培養物を培養培地から収得し、Ｃ１収得し丸物質を、必
   要に応じウィルスを減少させまたは失活させた後、処理
   して特許請求の範囲第１項または第２項に記載の医薬製
   剤を製造することを特徴とする生のもしくは失活した感
   染性気管支炎ワクチンの製造方法。 （６）　　特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか
   に記載のワクチンを投与することを特徴とする、産卵し
   た鳥を感染性気管支炎に対し免疫化させる方法。 （７）　　鳥１羽嶋シー３〜−７　ＫＩＤ、・の範囲の
   投与量にて生ワクチンを投与することを特徴とする特許
   請求の範囲第６項に記載の方法。 ｆ８１　　鳥１羽当シー５〜−８　ｇｔｏ、、。の範囲
   の投与量にて失活ワクチンを投与することを特徴とする
   特許請求の範囲第６項に記載の方法。