JPS58138392A - β−Ｄ−グルカン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本Ｉ＆＠紘、優れ−に拡膳藝懺を有するＩ−励−グ（２
） ルカンＫｌｌするものである。

近年、種々の担子菌類より抗腫瘍性物質が得られて―る
。サルノコシカケ科の担子菌プクリ冒つの菌核は扶苓と
して古くから貴方処方に用いら飄ま九日本１Ｉ１４方に
も採用され、利尿作用、鎮静作用を有する物質として多
用されている。このプクリ１つの菌核より、人工培養に
よって得た菌糸体を水及び／又は水溶性有機媒質を用い
て抽出地層することｋより、抗腫瘍性物質が直接得られ
ることが本発明者らの一部によって見出された（４１１
１１昭５５−１１１７９１号公＠）。

しかしながら、この方法によって得られる抗腫瘍性物質
は、十分な抗腫瘍性効果を得るためには多量に投与する
必要がＴｏＤ、抗腫瘍剤としては実用上問題のあるもの
である。

本発明らは゛、種々の研究を重ね九績果、プクリ曹つの
菌核より培養によって得られる菌糸体を水又はアルカリ
性水溶液で抽出し、得られる抽出物に特定の分画操作を
施すととくよって優れ九抗踵瘍性を有する物質が得られ
ることを見出し、更に（３） 前記抗腫瘍性を有する物質の有効成分を特定し得たこと
により完成されえものである。＊ち、前記抽出物よ妙、
［Ｄ′ＢムＥ−セルロース」着しくは「ＤＩ２ムＥ−セ
ファデックス」などを用いるり薗マトグ２フィー、トリ
ク−鑓酢酸、ｎ−ブチルアルコールなどの除タン白剤に
よる処理、或いは硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムな
どの塩析剤による処１１により、優れえ抗腫瘍性を有す
る物質が得られることが判明していたが、その有効成分
が如何なる物質であるか紘解明されていなかった０本発
明は、抗腫瘍性を有する物質として卓越し九作用を有す
るβ−Ｄ−グ★カンを提供することを目的とする。

本発明に係る／−Ｄ−グルカン（以下「本発明物質」と
いう。）＃ｉ、フェノール硫酸反応、ア／スロンｉｉ＊
反応、α−？７）−ル１ｉｉｉ＊ｘ応及びオルシノール
硫酸反応の何れＫといても穂としての呈色反応を呈し、
光款区妹による分子量が２００万〜６００万であり、か
り比ｍ前置が−１０”　−−１０’であることによって
４１１１１１１づけられる。無味無臭の以下本発明物質
の物理化学的性質についてｍ嘱する。

ｌ）呈色反応 本発明物質を水に溶解させ、次の各呈色反応を行なうと
、各々右に示した呈色が−められた。

フェノール硫酸反応　　　　褐色 アンスロン硫酸反応　　　　緑色 α−ナフトール硫酸反応　　赤色 オルシノール硫酸反応　　　褐色 この呈色反応より、本発明物質が纏類であることが認め
られる。

２）溶解性 本発明−質鉱水に溶解するが、ジメチルスルホキシド、
ジメチルホルムアきドに対する溶解性は低く、エチルア
ルコール、メチルアルコール、アセトン、クロロホルム
、ベンゼン及びヘキナンには不溶であった。

３）融点 本発明物質は、温度３ｏｏ’ｃｔで加熱しても変化（６
） はなかつ九。

４）　　Ｓ１）１ 本発明物質の６．１重量−水滴液のｐａ＃ｉｉｉ〜７、
０であってほぼ中性であった。

５）旋光性 本発明物質の０．１５重量−水溶液の比論装置（ζは、
−１０°〜−５０”であった。このこと及び呈色反応よ
り、本発明物質が！−ダルカンであることが推定される
。

６）赤外線吸収スペクトル 本発明物質のＫＩＡｒ　錠剤法による赤外線１駅スペク
トルは嬉１ｆｉＫ示す通りである。このスペクトルにお
いて、Ｉ４４０６ａｍ−”　　付近のブロードなｒＩｋ
ＩＩＬＰｉは、分子内及び分子間におｉて水嵩請合を形
成している水酸基の０−Ｈ伸纏纏動によるものと推定さ
れる。　　１ｏｏｏ〜１２００＃ｌ−’の徴賦Ｐ雪は、
棚のピラノース環のＣ−０−Ｃ紬會におけ為非対称伸縮
線−に基〈ものと推定される。を九、−・Ｏ−−３のピ
ークＰ３は、＠ｒ）ｃＩ−ｕの変角緩動（由来するもの
と推定される。これらのこと紘、零発鳴物（・） 質が／−ｎ−グルカンであることを裏づけるものである
。

７）　　　Ｃ−核磁気共鳴ＩｊｋＩｉｉＬスペクトル本
発明物質の４重量−Ｄ、０溶液中で調定された１１Ｃ−
槁確気共鳴吸収スベクトルは第２図に示す通りである。

このスペクトルにおいて、１４４ｊ９ＰＨＡのシグナル
８１は、β−１，３−グル力／のＣ−３位の炭素原子に
＃＃属され、６９．９ｐｐｍの７グナルＳ２は、分岐点
、卸ち−Ｇ−（Ｇはグルコースを１＠ 示す。）のグルコシド結合を形成しているＣ−６位の炭
素原子に由来するものである。その麹の、８３で示すｌ
ＯＬ９１）ｉ）ｍのジグｆｋ、８４で示すｙｓ、ｓｐｐ
ｍｏジグｆｋ、８ｓで示す’ＩＬ６９ＰａａＯｙｌナル
、８６で示す６　ｇ、５　ｐ　ｐｔｘｈのシグナル及び
Ｓ７で示す６１．ＩＰＰｍのシグナル線、それぞれ／−
１，Ｓ−グルカンにおける、Ｃ−１位の炭素原子、Ｃ−
５位の炭素原子、Ｃ−２位の炭素原子、Ｃ−４位の炭素
原子及びＣ−６位の炭素原子に由来するものと推定され
るが、ｉｏ２．ｅｐｐｍ以下のシグナルには、！−１，
６−グルカンの炭素原子に由来する（１） シグナルの一部が重なりて現われてｉる回部性もある。

また、Ｓ８で示す６９．７ｐｐｍ及び４９１Ｐ９１１ｍ
の２つのシグナルは、／−１，・−グルカンのＣ−４位
の炭素原子及びｃ−６ｔｔｔの炭素原子に由来するもの
と推定される。

以上の事実もまえ、本発明物質がｌ−１ｔｓ−結合及び
β−１，４１−緒会を含むグルカンであることを示すも
のである。

本発明物質の化学的構造の特徴は１次の方味によって明
かにされ丸。

ｌ）　構成単糖 本発＠吻質ｓｏｓｇＫＩＮ硫歇２−を加えて８時間の間
加熱して加水分解を行ない、その後常識に従って水素化
ホウ素ナトリウムによ一還元し丸上、ピリジンと無水酢
酸とによ一アセチル化し、ガスクロ１トゲラフイー（カ
ラム：３重量−ＩｉＡＣＮ８Ｂ−Ｍ／クロ毫ソルプＷ（
ガスクー工業社員）温度：１９０°Ｃ、キャリアガス゛
：窒素ガス、キャリアガス流量ｅ３Ｇｓｇ／分）によ−
分析し九とζろ、９９−以上がグルコースであ−、マノ
ノース及びラムノース＃１ｓｓｓ度しか検出されなかっ
た。このグルコースの比旋光度（〔α）’；　　）Ｕ＋
５０’テあ抄、Ｄ−グルコース（文献値〔α’：ｌ、　
＋　５ＳＬ８′″〔「有機定性分析」第２７６頁、広用
書店〕）であることが認められる。

２）グルコースの結合様式 グルコースの結合様式鉱メチル化分析の績果力為ら求め
丸、即ち、本発明物質を超音波照射下におイテ箱守法（
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　５！Ｌ　２０５（１９６４）
）によって完全に水酸基をメチル化し、濃！［５１６の
メチルアルコール性塩化水嵩により、完全メチルイヒし
九本発明物質のメタツリシスを行な−）九。ここに得ら
れるメチルグル　コすイドと、これを更に加水分解して
得られるメチル纏をアルジトールアセテートとしてガス
クロマトグラフィーにより分析し、本発明物質の結合様
式を求め丸。それぞれのガスクロマトグラフィーの条件
は次の通りである。

〔メチルグルコナイドの分析条件」 ＊　９　Ａ　：　３重量＄Ｘ１ｉ−＠Ｏ／）０４＝ソに
プＷ（９） （ガスクロ工業社Ｉｉ） 温度：１４５°Ｃ 中ヤリアガス二窒素ガスキャリアガス流量＝３０−７分 （メｆ−ルＩＩＣアルジトールアセテート）の分析条件
〕 °カラム：３重１に参ｍＩＣＮ８８−Ｍ／タロ毫ソルプ
Ｗ（ガスクロ工業社員） 温度：　１６０’Ｃ キャリアガス：窒素ガス　キャリアガス流量：３０−７
分 上記ガスクロマトグラフィーの細事に基いて求め九本発
明物質の結合様式を第１１１Ｋ示す。表中、モル比で表
わし丸量比社、ガスクロマトグラムの画積より、本発明
物質の非還元末端（ＱＬ）を１として示した。

（１Ｇ） ＃Ｉ　　ｌ　　衆 ｍ１１１ｍの結果から、本発明物質は、β−１，３−結
合を主体とし、少量のβ−１，６−結合を含むβ−１，
３−１，６−Ｄ−グルカンであることが判明した。この
ことは、本発明物質をスミス分解（［生化学夷験購座４
、糖質の化学（下）」第４７９頁、東京化学同人）する
と、ソルビトールとグリセミコールとが生成比２．０〜
４．０　：　Ｌ、０の割合で得られたことからも証明さ
れた。更に、本発明′物質を緩和スミス分解（「生化学
実験講座４、糖質の化学（丁）　Ｊ　ｇ　４８８頁、東
京化学同人）し続いて完全ス（１１） ミス分解（「生化学夷験講塵４、糖質の化学σ月ｍ　４
８Ｇ貢、東京化学同人）シ、得られ丸生成物のガスクロ
マトグラフィー（カラム：２０重量−ＰｇＧ２０Ｍ／ク
ロモソルプＷ（ガスタロ工業社員入温度＝１８１°Ｃ、
キャリアガス：窒素ガス、命中リアガス流量：　３５ｓ
ｇ／分）Ｋよりてエチレングリコールが検出された仁と
により、１．３−結合と１．６−結合が相互に紬会して
いるものと推定される。なお、本手法は、ツ建ナリン（
／−１，Ｓ　−グルカン）に１．６−４１１１合が少量
存在することを証明した方法（Ｆ、　８ｍｇ＋ムｔｈ　
ａｎ−ム、Ｍ、　Ｕｎｒａｍ　、Ｃｈ＠ｗｓ。

Ｒ，Ｉｎｄ、　、　４１８１　（１９５９）　）　Ｋ阜
じたものである。

３）　　ＩＩ嵩分解 本発明物質を、ｐＨＬｏの０．０５　Ｍ酢酸緩衝液中で
、β−１，３−結合を分解する酵素「Ｌｙｓｉｎｇ　ｍ
ｓ＊ｘｙｍｓ−＄」（７グマ社展）により温度３７”Ｃ
で２４時閾処理したところ、その７０〜７５１Ｇが分解
された。プントロールとしてのツＺナリンも７５憂が分
解され、従って本発明物質が／−１，３−紬會を主紬合
とするものであることが嘴かである。

特開昭５８−１３８３９；？　（４） ４）分子量 本発明物質の分子ｊ１は、光散乱法によって調定したと
ころ、２００万〜６００万の輻−内であった。

以上の通り、本発明物質は新規なβ−１，３−１゜５−
Ｄ−グル力／であることが呪かである。

次に本発明物質の製造法について説明する。

本発明物質の原料としては、プクリ田つ（マノホト）　
、Ｐｏｒｉａ　ｃｏｃｏａ　（Ｆｒ、　）　Ｗｏｌｆを
例示することができる。この担子画線「菌類図鑑」（宇
田用挟−著、講談社発行、１９７８　）等に記載されて
おり、この担子−は、微生物１東技術研究所にνいて保
管寄託されている（ｇＬ生物受託番号倣工研薗寄第４７
６６号）。この担子−は通常子夷体を形成しないため、
この担子菌のＩＩ核の内部組絨片を人工培地に移植し、
菌糸の純粋培養を行なうことにより繭糸体を得、その菌
糸体より本発明４［［の慣用、分画を行なう。

上記の培養は固体培地もしくは液体培地のどちらでも行
ない帰るが、コントロールのＷ易な液体通気培養が特に
好適である。以下この液体通気培（１３） 養を例にとって説明する。

１４に１１基祉、通常の微生物培養の場合と同様に炭素
源、窒素−１無機塩類及びビタンンｌｌｌ１勢、例えハ
クルコース、フルクトース、マルトース、スタロ〜ス、
スターチ、デキストリン、廃糖蜜、クエン酸、フマール
酸、硫安、塩化アンモニウ＾、リン酸アンモニクム、硝
酸ナトリウム、尿素、アミノ＃Ｉ＠、ペグト／、大豆ホ
エー、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンステ
イクリカー、マグネシウム塩、リン酸塩、ビタミンＢ１
、ビタミンＢｈ　、ビタミンＣ等から適宜適訳し、これ
らを用いて＠属される。

培養操作は通常、温度１５〜４０°Ｃ１通気量２〇−〜
Ｉ　Ｌ　／　ｗｉｎ培地１を時間ｌ〜５０日関根度で行
うのが望ましいが譬に限定されるものではなへ１４！ｉ
！ｉｋ終Ｔ後、培養生成物を濾過又は遠心分離などの手
段によね処理して、菌糸体を墳り出す。この繭糸体を水
又はアルカリ性水溶液を用いて例えば５〜１２０°Ｃの
温度で３０分〜３１日−程度抽出操作を行なう、好まし
い抽出繊は、８０〜１２０＠Ｃの（１４） 熱水による艙出又扛アルカリ性水溶液による抽出である
。アルカリ性水溶液に用いるアルカリとしては、水に溶
解させ九と無アルカリ性を示す化合物ならばいずれも使
用可能であるが、通常水酸化リチウム、水酸化ｔトリウ
ム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、
炭酸アンモニウム、炭酸水嵩ナトリウム、炭酸水素カリ
ウム、炭酸水素アンモニウムなどを使用する。アルカリ
性水ｓｉｉを用いる場合の換度は目的とする本発明物質
の一分の溶解度、操作性などの点から０．１〜１０Ｍ／
４の範−が好ましい。用いる水又はアルカリ性水溶液の
量は通常、菌糸体重量の５〜１００倍程度である。抽出
終了後、濾過又は遠心分離などの手段で、固形物を除去
し透明な液体を得る。水で抽出した場合の抽出液は減圧
磯縮することによって後記の操作を容易にすることがで
きる。また、アルカリ性水溶液で抽出した時は酸による
中和ヤ、透析などＫよって低分子化合物を除去し、水で
抽出した場合と同様に減圧織縮することによって後記の
操作中分画を容１にすることができる。

（１５） 水又はアルカリ性水−濠の抽出物（以下「＠抽出物」と
記す、）は、例えば （１）低分子量化合物（例えば光散を法による分子量１
万以下程度）の除去 （２）タン白質の除去 （３）水に不溶のグルカンの除去 などを行っ死後、アフィニティークロマトグラフィーを
行うことｋよりて本発明物質を得る仁とができる。

上記（１）の低分子量化合物を除去する方法としては、
例えば１〜１０重量ｌ５ｓｉ度のａｍ出物水滴液に１〜
５重量僑程度のエタノール、メタノール、アセトンなど
の水溶性有機＊ｍを注ぐ方法を挙げることができる。こ
の場合は低分子化金物が溶液中に残り、本発明物質を含
有する画分が沈澱として得られる。また別の方法として
紘セルーースチェープなどによる透析を挙げることかで
自る。

上記（２）のタン白質を除去する方法としては、例えば
除タン白剤による方法を挙げることができる。

瞼タン白剤として、例えばトリクロロ酢酸、りんタング
ステン酸、ピクリン酸、過塩素酸、フラピアン酸などの
酸性物質を使用する場合はこれらの酸性物質をｍ＊出物
水溶液に加えることによりタン白質を沈澱させる。この
場合のｌ１ｌＩｌｌｌ出物水溶液の鎖度は１〜１０重量
−が好ましく、酸性物質の使用量は粗抽出物水溶液１０
０重量部に対し２〜２０重量部が好ましい。

除タン白剤としてｎ−ブタノール、ｎ−ブタノール／ク
ロロホルムなどの有機溶媒を使用する場合は、粗抽出物
水溶液にこれらの有機溶媒を加え攪拌することによりタ
ン白質が沈澱し、本発明物質を含有する一分は水相中に
残る。この場合の観ＩＩＩＩ出物水溶液の濃度は１−１
０重量−が好ましく、を九有機＊ｍの使用量はｌ１１１
１１出物水溶液１００重量部に対し１Ｇ−１００重量部
が好ましい。また、除り／白剤としてロイド試薬ヤカオ
リンなどの執着剤を使用する場合は、＠ｍ出物水滴液に
吸着剤を加え、攪拌しタン白質を執着させることによっ
て、本発明物質を含有する両分を水溶液として得る。

この場合の粗抽出物水溶液の濃度Ｕｌ〜１０ｘ量（１７
） −が好ましく、吸着剤の量は粗抽出物水溶液１００重量
部に対し、２〜１０重量部が好ましい、上記の除タン白
剤の中て社トリクＥ１０酢酸又紘勢んタングステン酸が
％に好適なものである。

また別の方法として鉱り−マトグシフィーによる方法を
挙げることができる。クロマトグラフィーに用いる担体
としては腟イオン交換ＩＩＩ１ｍｌが好ましい。特に好
ましい鴫イオン交換樹脂は脂肪族又は芳香族アンノ基を
交換基とするものてあ妙、例えばダウエックス−１（ダ
ウケミカル社）、ＤＩ１ｍ！−セルロース（ワットマン
社）、Ｄｊ！ムＢ−セファデックス（ファルマシア社）
、ｎｃ’ｒｇｏＬム−セルロース（メルク社）等を挙げ
ることができる。

例えばＤＩ！ムＥ−セルロース（ＯＨ−握）　を使用し
た場合は水溶出両分に、ＤＩムＥ−セルロース（Ｃｚ〜
薯）又はＤＩＡｉｊｉ−竜７アデックス＜ｃｔ−瀧ンを
使用し丸場合Ｆｉ０．００１〜ＩＭ、　ｊｌＫ　０．０
１〜Ｇ、！ＩＭトリスー塩酸緩衡液（ｐＨ７〜’；ｊ）
　　１ｉｌｉ分にタン白質を除去され九・本、発、＠物
質を含有する一分が溶出してくる。を死重イオン交換樹
脂以外にゲルＰ（１８） 通則もクロマトグラフィーに用いる担体として有効であ
る。具体的にはセファデックス（ファルマシア社）、セ
ファロース６Ｂ（ファルマシア社）などを挙げることが
できる。これらのゲル１遍剤を使用し九場合には、例え
ば０．Ｏ１〜ｌｓ塩化ナトリウム水溶液で展開した時の
Ｖｏ　　（ゲル粒子間液量）に本発明物質を含有する両
分が溶出し、タン白質は本発明物質を含有する画分の後
に溶出する。

上記（３）の水に不溶なグルカンを除去する方法として
は、例えば１〜１０重量ｓｓ度の粗抽出物のアルカリ性
水溶液を酢酸、クエン酸、塩酸、硫酸などの酸で中和す
ることＫよる方法を挙げることができる。この場合に水
に不溶のグルカンは沈澱として除去することができ、本
発明物質を含有する一分は滓渣として回収される。を死
別の方法としては、単に本発明物質を含有する画分を水
で抽出する方法を挙げることができる。

上記（１）、（２）及び（３）の操作を行なう順序は特
に隈定されるものではないが、操作の害鳥性から（１）
、（匂、（３）の順序で行なうことが好まし＾。

（１９） なお、上記（１）　、　（ａ及び（３）の操作以外に、
塩析などによりて本発明物質以外の穂を除去する操作を
行ってもよい。この場合の塩析剤として紘例えば硫安、
硫酸ナトリクム、硫酸！グネシクム、タエ／酸ｔトリウ
ム、塩化ナトリウムなどの塩頒が効果的である。好まし
一塩析剤は硫安である。これらの塩析剤は粗抽出物水溶
液に混合することにより、本発明物質の画分をｍｓさせ
、濤鎗申Ｋｍる本発明物質以外の糠を分離することがで
きる。この場合、ａｍ出物水溶液の績度ａｌ〜１０重量
憾が好ましく、塩析剤は観抽出物水１１ｔＫ４１０〜９
０−飽和するように使用するのが好ましい。

また塩析以外に水酸化バリウム処理などの方法も有効で
ある。この場合は粗抽出物水滓渣に水酸化バリウムを添
加することによって本発明物質を含有する一分は滴液と
して回収され、抗膳瘍性が不活性な一分は沈澱として除
去される。

なお、ｍ抽出物から低分子量化合物、タン白質及び水に
不溶のグルカンを除去する丸めに用Ｉ／％九県品、例え
ばＳ出濠中Ｏ展謁瑞、塩瞬珊、除タンにより得られる一
分から除去することが必要である。

上記の方法などによって本発明物質の含有率が高められ
九−分をアフィニティークロマドグ２フイーで分画する
ことによ抄、本発明物質を分離することができる。アフ
ィニティークロマトグラフィーに用いる担体としては、
例えばコ／力ｔバリンムを担持し九担体を挙げることが
でき、具体的ニ抹コンカナバリン人−セファロース（フ
ァルマシア社）などを挙げることができる。そしてこの
場合のａｍ液としては通常ｐＨ５，５〜８．６　の緩衝
液を用いる。好ましい緩勤液としては例えばリン酸緩ａ
ｍ、酢酸緩１１波、トリス塩酸緩ＩＩｉ液、クエン酸緩
衝液、バルピタール酸緩１１箪などを例示できるが、ホ
ウ酸緩憤液などのように一体を形成する緩衝液は好まし
くない。緩ｌｌ１ｉ［の濃度は１通常０．０１〜０，２
Ｍである。また緩＊ｉｉには非％Ａａ着を回避する九め
に塩化ナトリウムなどを約１重量−程度添加することが
好ましい、なお、アフイニテイ（２１） −りｇｖ　）グラフィー鳶行なうＫあ九りてれ、通常本
発明物質を含有する画分を０．１〜１　ｍｇ　／−の割
合でクロマトグラフィーの担体に負荷する。このような
条件でアフィニティータロマドグラフィーを行なりえ場
合はＪ最初の画分に本発明物質が流出してくる。

次に本発明物質の有用性について説鴨する。

本発明物質＆ｌ；を抗腫瘍剤として有効であり、具体的
には腫瘍の横釧、生成部位などに応じて種々の剤層、例
えば液剤、粉剤、粒剤、錠剤、展剤、軟膏剤、カプセル
剤などＫｌｌ剤化することができる。

製剤化に際しては必要に応じて適轟な助剤、添加剤など
を使用し、通常のｍ蘂晶の膨剤手段を任意に利用すれば
よい。他の抗腫瘍剤を始めとして植種のａｍ着しく抹栄
養剤などと共に展剤化することも可能である。

このようにして得られる本発明物質を有効成分として含
有する拭腫瘍ｍは、対象とする腫瘍の種類及びその生成
Ｓ位、！！びＫ１１ｌｊｌｌの鍋温などに応じて、峠ロ
投与、静鳳内投与、履腺内黴与、鏝肛（２２） 門投与勢適宜の方法によりｊｌ蟻量を投与することがで
きる。投与量は患者の症状、製剤の剤層、投与方法など
によって異るが、粉末物質の量に換算して、麿証内投与
による場合にＦｉｌ　−ｔｏｏｏ　ｍｇ／〜／ａ　ｍ口
投与による場合には１０〜ｌＯＱＯＱｍｇ／〜／日　程
度である。

以下本発明物質の製造、抗ａＳ作用、急性毒性について
の実験並びに製剤に関する実施例について１ｉｉ１＠す
る。

実施例１ ａ）曹糸体の培養 石川県加賀市で採集したプクＩＪ　、つの１ｌｌＩ禎か
ら常法Ｋｉｔりて岨紙片をとり、ボグトデキストロース
寒天斜面培地で純粋培養し、保存しておいたものを、後
述する組成のＧＰＹ墳地２００−を入れた容量ｓｏｏｗ
ｏ三角フラスコに移して静置培養し、１ヶ月齢潮後に墳
養物全体をホモゲナイず−でスラリー化し、このように
して得られるスラリー五りを嘗曹として、３０　ｔＯＧ
ＰＹ　１１１１１１４を入れ九讐量６０４のジャーファ
ーメンタ−により、過気量（２３） Ｓｔ１分培地、温度２５＠Ｃの条件下において１０日間
通気壕培養行なり九、培養終了後画体をＰ別し、温風乾
燥して２００　ｇの乾燥画体を得九。

繭記ＧＰＹ培地は、次の組成のものである・グルコース
　　　　ｓｏｇ ペプトン　　　　　′Ｌｉｇ 酵母エキス　　　　ｔＢ ＫＨｘＰＯ−ａ　　　　　　　ＬＯ９ Ｍｇ８０４・７Ｈ冨ｏ　　　　ａｉｇ ＣａＣｌｍ−２ｋｈＯ、、、。

ｓＩＩ水　　　　　　　　１４ 微量成分１［１０ｍｇ ここに黴量成分箪鉱次の組成を有するものである。

Ｆ＠Ｃ１ｓ・６Ｈｘ０　　　０４ｇ ＭＥＩＣＩ　ｇ　−４Ｈ！ＯＱ、３６ｇｚｎＣ１ｍ　　
　　　　　　　　　　（ｋ、２ＭＣｕ８０ａ　−６１１
ａ０　　　０．ＯＳ　ｇｓＩｌ水　　　　　１１ １！１１ｍ昭５８−１３８３９２　（７）ｂ）籠瘍麿性
物質の＊造 上達のｔ−一体１３１　ｔをコーＬ−ミル管用いて粉砕
し、２Ｊ　ｔのｔＮｋ酸化カリウム水皺液ｔ−加えてｍ
議で４Ｓ時陶攪拌しえ。次に瀘心分−を行なって分離し
え上＃ｌ液を一献で中相し、この中和液をｍ度４０℃で
減圧（２０−ＳＯ鳳鵬Ｈｇ）下に、ＩＡになｈまで一纏
し良。これに低分子化合物ｔ−瞼去するえめに４．４１
のエチルアルコールを加え、生じ九沈鹸を遠心分−し喪
後エチルアルコールによって１回洗浄し良。

ここに得られ九沈鹸物を水に不溶のグルカンを瞼★する
ために、ｚｔ７−の水を用いて室瓢で４−一出し、この
−出液を減圧下でＩＩＩＩＩＩＬ、凍結乾燥せしめて３
１　ｔ　　の褐色の粉末を得喪。これは転轍一体に対し
て２４重量−の収率である。

次にこの粉末の１０　ｆを５００−の水に癖鰐させ、攪
拌しなから＊＃アンモニウム２４０　ｆ　ｔ−少量づつ
加えて塩析を行ない、温度４°Ｃで４時間装置し九債達
心分−によ一沈澱を分け、これ七本に＃解せしめ丸後セ
ルロースチ為−プ中で透析しえ。透析（２５） 内液を凍結乾燥せしめ、硫酸アンモニウム沈澱部から灰
白色の粉末（以下ｒＡＪという。）７．４Ｆ　を得た。

更に人の５．２ｔを５０−の０．１Ｍ　）リスー塩酸緩
債液（ｐＨ８）　　に溶解せしめたものを試料とし、Ｄ
Ｅｊｌ−セファデックスム−２５（ＣＬ−型、ワットマ
ン社１１）を上記と同様の緩衝液で平衡化し九ものを充
填した４、４　ａｍ　Ｘ　７０　ａｍ　　のカラムを用
い、上記と同様の緩衝液を展−剤としてクロマドグシフ
イーを行ない、以りてムについて分画を行なった。

ここに得られ九−分を凍結乾燥し、ｔｔｓｔの白色の粉
末（以下「人−１」という。）を得え。

この−仕入−１の４００　ｑを２０−の０．０１　Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ５，８）　Ｋ溶解せしめ、コンカナバリ
ン人−セ７アロース（ファルマシア社１１）を上［同様
の緩衝液で平衡化しえものを充填し九４４ａｇｘ２５１
のカラムを使用し、０．９　％塩化ナトリウム１０．０
１Ｍ酢酸緩衝ｔ　（ｐ）ｉ５．８　）を嶽闘剤としてク
ロマドグシフイーを行なり九、そしてカラムに吸着され
九部分を０．１　Ｍ　　のメチル−α−Ｄ−グルコジッ
ドによ抄溶出させえ。フェノール硫酸法によ（２６） り糖の溶出を追跡し九結釆、−仕入−１は３つの成分に
分画された。これらを画分ム−１−１、画分Ａ−１−２
及び−分Ａ−１−３とする。これらの−分ノ各々につい
て、セルロースチ嘉−プ中で２日間透析を行ない、凍結
乾燥した。各自分の収量は第２表に示す通りである。

籐　２　表 Ｃ）抗腫瘍性試論 す退会ｏＩＣＲ−ＪＣＬ　　マウス（オス）の右鼠盪部
皮下に、予め１週間に１０の割合で継代しておルｆル’
　　−ｖ　１＠ｏ　（８ａｒｃｏｓｎａ　１８０　）の
腹水膿瘍を１０＠個／匹接種し、２４時間後から１日１
回の（２７） 割合で生理貴塩水ＫＭ解せしめた検体をマウスの腹腔内
に１０日関Ｋ　１１２て連続投与した。腫瘍績樵ｉ３０
日目にマウスを１ｊｌｌｌｌシ、腫瘍を摘出し丸。

摘出した腫瘍の重量を固定し、コントロールの無処置Ｉ
Ｐ（腫瘍接種後、生還食塩水のみを投与し九群）のそれ
とにより、下記式によって与えられる阻止率（ＩＲ）を
求めた。

１　ｍ　−（１−７）　Ｘ　Ｚｏｏ　ｌ！但しＴ：処置
群の平均膿瘍重量（ｒ） Ｃ：無処置群の平均腫瘍重量（ｔＪ 紬ｓＦｉ第３表に示す通りである。

ｊＩＫ３表 １１１３１！の結果から明らかなように、画分Ａ−１−
１（本発明物質）は卓越した抗腫瘍性を有するが、他の
両分は阻止率が１０〜ＳＯ＊であってその抗腫瘍性が低
いものである。

ｄ）急性毒性試験 試験例１ ５過食のＩＣＲ−ＪＣＬマウス（オス、平均体重２８．
５Ｆ）１０匹を１８時間絶食させた後、その各（２９） 各の腹腔内に、生理食塩水に溶層せしめ九ム−１＝１を
５ｏｏｏｑ／ｌＥｒ投与して７日間観察した。

各マウスにおいては、投与直後に僅かに立毛が１！察さ
れたがそれは中がて回復し、その＊＃ｉ体重の増加も正
常であ抄、他の員當は認められなかった。また死亡何社
１例もなかった。

試験例２ 投与の方法を腹腔内投与に代えて経口投与とし、ま九投
与量を２００００　ｑ／へとし九ほか祉試験例１と同様
にして試験管行なった。

試験例１と同様に、僅かに立毛が捩察されたがそれはす
ぐに１復し、その後は体重の増加も正常であり、他の異
常も諺められなか−）九、′＊九死亡例は１例もなかつ
た。

Ｃ）理化学的性質 画分入−１−１の理化学的性質は１ｓａ表に示す通りで
ある。また赤外線吸収スペクトル及び１１Ｃ−核磁気共
鳴吸収スペクトルは、それぞれＮ１図及び第２図に示す
通りである。

実施例２ （３０） ａ）　　ＩＩ糸体の培養 菌糸体の培養を実施例１におけると同様にして行なった
。

ｂ）抗騰瘍性物質の製造 繭糸体の培養によって１替られた乾嫌繭体２６５ｆにｌ
Ｎ水酸化カリウム水溶液５ｔを加え、温度４０　ｃ′Ｃ
で２４時間攪拌した。次に遠心分離を行なって分離し九
上澄液に同量のエチルアルコールを加えた。

遠心分離によって得られ九沈鹸を２回エチルアルコール
で洗浄し、更にエチルエーテルで洗浄した後、デシケー
タ中で減圧−ドで乾嫌し、黄白色の粉末７０．Ｏｆを優
良。

この粉末７０．Ｏｆを水に不溶のグルカンを除去するた
めＫＩＮ水酸化カリウム水溶液２．５４に溶解せしめ酢
酸で中和し、生じ九沈鐵を遠心分離し良後、エチルアル
コールで２回、更にエチルエーテルで１回洗浄し、黄白
色の粉末（以Ｆ　ｒＢＪという。）　４４．６７　Ｆ　
　を得た。コノＢノ４０．０５Ｆを１１の水に溶解せし
め、本発明物質を一一する虎めに攪拌下１ｔの飽和水酸
化バリウム水滓渣を加え、遣（３１） 心分諭して得られ走水溶液を６Ｎ硫酸で中和し、再び遠
心分離して沈澱を除去し良６次に上澄液を透析し、透析
内液を凍結乾燥し、白色粉末（以下ＦＢ−ＩＪという。

）　３．１８　ｆを得え。

０．１　Ｍ　　エチレンジアミン４酢酸２ナトリ９ム塩
（以ＦＦＥＤＴ人」と記す。）水＊＊と２Ｎ水酸化ノー
）　＋７ウム水溶液とを容量で５：ｌの割合で混合し九
混合液１００−中に、上記のＢ−１のり、Ｏｆを完全に
溶解させ、２日間透析して金属イオンを除去した後全量
が１４０−となるまで減圧下で濃縮し、容量比か５：ｌ
のクロロホルム−ｌ−ブチルアルコール混合液２８−を
加えて強く攪拌しえ。

その後水層を分離し、再び同様のクーロホルム−〇−ブ
チルアルコール混合液２８−を加えて同様の処理を行な
ってタン白質を除去し、水層を凍結乾燥して白色粉末６
８４ｑを優良。

この粉末１５０　ｑを３０ｍの０．０１Ｍ　酢酸緩倚液
（ｐＨ５，８）に溶解せしめ丸ものを試料とし、コンカ
ナバリン人−セ７アロース（ファルマシア社１１１１）
を上記と同様の緩衝液で千両化しえものを充填し＊　４
．４　ａｍ　Ｘ　２５　ａｓ　　のカラムを使用してり
μマドグラフィーを行なった。その後は実施例１と同様
に処理して３つの画分、即ち画分Ｂ−１−１、画分Ｂ−
１−２及び画分Ｂ−１−３を得た。各−分の収量は＃Ｉ
４表に示す通りである。

第　４　＃ Ｃ）抗腫瘍性試験 実施例ＩＫおけると同様にして抗腫瘍性試験を行なった
１、結果は第５表に示す通りである。

（３３） 嬉　　Ｇ　　表 ｇｓ＊の結果から嘴かなように、画分ｊｌｌ−１−１（
本発明物質）は卓越し九抗腫瘍性を有するが、他の一分
線阻止率が３５−以下でありてその抗腫瘍性が低いもの
である。

５、　　　ｄ）急性毒性試験 実施例１におけると同様にして、画分Ｂ−１−１につい
て急性毒性試験を行なったが、実施例１と同様の結果が
得られた。

（３４） Ｃ）理化学的性質 画分Ｂ−１−１の理化学的性質はＢＳ表に示す通りであ
る。また赤外線吸収スペクトル及び１１Ｃ−被磁気共鳴
吸収スベクトルは何れも実施例１の画分ムー１−１と御
飯するものであった。

実施例３ ａ）繭糸体の培養 繭糸体の培養を実施例１におけると同様にして行なった
。

ｂン　抗腫瘍性物質の製造 繭糸体の培養によって得られた乾燥菌体２０ｔＫＭ留水
４００ｍｇを加え、温度２５°Ｃで７時間攪拌した。次
に遠心分離を行ない得られ九残渣にＩＮ水酸化カリウム
水溶液４００−を加え、温度２５°Ｃで４ｓ時間攪拌し
た。遠心分離により得られた上澄液はこれを酢酸で中和
し、生じ九不溶物を遠心分離により除去することによっ
て水に不溶のグルカンを除き、その上澄液を減圧下で全
量が２００−となるまで濃縮し、＄００−のエチルアル
コ−ｓ７を加えた。遠心分離により得られた沈澱はこれ
を再（３ｓ） び水ｚｏｏＴＭ１ｔｃｉｌ解せしめ、不濃物を除去し良
後凍結乾燥せしめて黄色の＠＄　Ｌｉ２　ｔを得え。

この粉末を６０−０本に連鋳せしめ、攪拌下硫酸アン毫
ニウム２９９を少量づつ加えて塩析を行ない、更に実施
例ＩＫおけると同様の旭ｌを行なって硫酸アンモニウム
の沈澱部から灰白色の粉末（以下１−ＣＪという。）　
ｏ、ｔｓ　ｔを得え。このＣの０．６５ｆを３２−の０
．１　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐｉｆ魯）Ｋ溶解せし
め九ものを試料とし、Ｄｌｉム罵−セファデックスムー
２５ＣＣ１−濁、ファルマシアａｌｌ）を上記緩ａｍで
平衡化し友ものを充填しえλ２−Ｘ３５−の力２ムを使
用してクロマトグツフィーを行ない、その後は実施例１
におけると同様の処理を行なりて白色粉末（以下ｒ　Ｃ
−ＩＪという。）０．２６ｔを優良。

このＣ−１の０．１ｆを！Ｏ−の０．０１　Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ５ｊ）　Ｋ１１１１解せしめえものを試料とし
、コンカナパンムーセファロース（ファルｉシア社ｌｌ
）を上記と同様の緩ｓｍで平衡化しえものを充填し九４
４ａａＸ２５ｍ　　のカラムを使用してタ翳嘴トダｌ開
昭５８−１３８３９２（１の ラフイーを行ない、その後紘実施１１１におけると同様
Ｋ４６通して３つの画分、澤ち画分Ｃ−１−１゜画分Ｃ
−１−２及び画分Ｃ−１−３を優良。４に両分の収量は
ａＳ表に示す通りである。

菖　６　真 Ｃ）抗腫瘍性試験 実施例ＩＫおけると同様にして抗腫瘍性試験を行なつえ
。結果は第７表に示す通りである。

（３７） ＄１７ＩＩ 第７表の結果から明かなように、画分Ｃ−１−１（本発
明物質）は卓越しえ抗腫瘍性を有するが、他の一分は阻
止率が５８−以下であってその抗腫瘍性が低いものであ
る。

ｄ）急性毒性試験 実施例１におけると同様にして、画分Ｃ−１−１につい
てム性毒性試験を行なっ九が、実施例１と同様の結果が
得られえ。

Ｃ）理化学的性質 一分Ｃ−１−１の理化学的性質は第８表に示す通りであ
る。まえ赤外線ＷｋＩＩＬスペクトル及び１１Ｃ−核磁
気共鳴吸収スベクトル紘例れも実施例１０画（３８） 公人−１−１と一歇するものであっ九。

菖　　＄　　表 （そのｌ） （３９） 第　　５Ｓｔ （そのり １柵翁８−１３８３９２　（１１） 第８表において、 ｒｓ解性」は、試料１ｆを温度２５”Ｃの濤媒１００−
中に混合して判定し九もの、 「融点」は、微量融点測定装置（＠本製作所勇）によ１
１Ｉｌ定し良値、 ｒ　ｐＨＪ　社、試料の０．１重量−水溶液のｐＨＯ値
、 「比旋光度」は、試料の０．１重量多水溶液の比旋光度
の値、 ［Ｄ−グルコースの一合」及び結合様式に関する「相対
モル比」は、何れ一本文に記載した方法による値、 「＃素分解率」は、酵素Ｌｙｓｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅｓ
により温度３７°Ｃで２４時間処鳳したときの分解率の
値、 １分子量」は、光散乱法により調定し丸値である。

【図面の簡単な説明】

第ｉｌｌは本実１ｊｉＫ係るβ−Ｄ−グルカンの赤外線
吸収スペクトルのチャート、ｊ１２１ｉｌｌは岡じ〈（
４１） １１Ｃ−核磁気共鳴吸収スペクトルのチャートである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ）フェノール硫酸反応、７ンメロン硫酸反応。 （１−ｔ７）−ル硫酸反応及びオルシノール硫酸反応の
   何れにおｉでも輪としての１色反応を呈し１電数１！＆
   による分子量が２００万〜６００万の範囲内であ砂、か
   つ比Ｉ１１党度が一１０’〜−５００であることを特徴
   とする／−Ｄ−グルカン。 ２）非還元末端Ｑ−（Ｇはグルコースを表わ−ｒ、）の
   毫ｋＩｋを１とするとき、−〇−を有するももののモル
   敏がＱ、１〜１５である轡許錆求の範囲ｊ１１１項記載
   の／−Ｄ−グルカン。