【発明の詳細な説明】
造血幹細胞の動員方法
発明の分野
本発明は概して造血幹細胞の動員方法に関する。
発明の背景
インタークリン（intercrine）またはケモカインファミリーの全メンバーは、
２個のジスルフィド架橋を形成する４個のシステイン残基を有する塩基性ヘパリ
ン結合ポリペプチドである。機能的に特徴があるこれらの全てのタンパク質は、
炎症前（proinflammatory）機能および／または修復機能に関与すると考えられ
る。
化学療法剤を高用量投与する臨床の場において、選択される生分子は、Ｇ−Ｃ
ＳＦである。一般に、このような処置をする場合、シクロホスファミドのような
化学療法剤の低用量を予め患者に投与する。緩解期の間に、白血球泳動血液（le
ukophoresed blood）を回収するために骨髄から末梢循環へ細胞を結果的に動員
させるＧ−ＣＳＦのごときＣＳＦで患者を処置する。その後、高用量の化学療法
剤を患者に投与して、癌の臨床的な緩解を引き起こす。結果的に起こる骨髄不全
は、予め回収した保存血液細胞の注入により処置する。この方法は、例えば、化
学療法剤の最初の投与の省略および／または血液回収プロトコルの変更により修
飾できる。
これらの造血幹細胞移植技術の使用は、有望であるように思われるが、繰り返
しアフェレーシス法（multiple apheresis procedure）は、Ｇ−ＣＳＦを単独で
使用する場合、重篤な骨髄抑制を処置するために、連続的移植に十分な幹細胞の
回収が必要とされている［例えば、Bensinger et al.，Blood，81:3158（1993）
およびR.Haas et al.,Sem.in Oncology,21:19（1994）を参照のこと］。したが
って、このような著明な進歩および特定の調節生分子の利用性にも関わらず、造
血の回復の遅延は、相変わらず、骨髄抑制患者についての羅病率および死亡率の
重要な原因である。
当該技術分野では、特に化学療法に関連する骨髄抑制の場合、造血素の回復を
増強するための組成物および方法が、依然必要とされている。
発明の概要
一の態様として、本発明は、造血幹細胞の刺激薬の調製におけるケモカインの
使用を提供する。このケモカインは、ＫＣ、groβ、groαおよびgroγ由来のタ
ンパク質を包含し、これらのケモカインの成熟、修飾、および多量体形態を包含
する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載する成熟または修飾または
多量体ケモカインの有効量を動物に投与することからなる、動物における造血幹
細胞の動員方法を提供する。
本発明の他の態様および長所は、以下のこれらの好ましい具体例の詳細な記載
においてさらに記載する。
図面の簡単な説明
図１は、実施例１の単一薬物動員アッセイにおけるgroβ（配列番号３のアミ
ノ酸１−７３）の効果を示すグラフである。
図２は、実施例１の単一薬物動員アッセイにおける修飾groβ（配列番号３の
アミノ酸５−７３）の効果を示すグラフである。
図３は、単一薬物動員アッセイにおけるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＩＬ
−８、groβ（アミノ酸１−７３；配列番号３）および修飾groβ（配列番号３の
アミノ酸５−７３）の比較を示す棒グラフである。
発明の詳細な説明
本発明は、炎症反応、造血および骨髄造血に関与する修飾タンパク質、具体的
にはケモカインを提供するものであり、この修飾タンパク質は、対応する修飾し
ていないまたは切断していない成熟タンパク質と比較して、生物活性が増強され
ていることにより特徴付けられる。本発明は、本明細書に記載した成熟または修
飾または多量体ケモカインを用いて、造血幹細胞を骨髄から末梢血に動員するこ
とによる骨髄抑制の処置方法を提供する。
Ｉ．定義
本明細書に定義するように、「造血素相乗因子」または「ＨＳＦ」とは、in v
ivo および in vitro でコロニー刺激因子のごとき別の造血因子と共に投与した
場合または自然に循環するＣＳＦと組み合わせた場合、造血を刺激する際に相乗
活性を有することにより特徴付けられる、天然ケモカインおよび修飾ケモカイン
を包むタンパク質のクラスを意味する。
本明細書で用いる場合、「インタークリン（intercrine）」としても知られて
いる「成熟ケモカイン」なる用語は、当該技術分野で慣用的にＫＣ、groα、gro
βおよびgroγと称されるタンパク質を定義する。便宜上、７２残基を含有する
ネズミタンパク質ＫＣのアミノ酸配列を配列番号１に提示する。これらの配列は
、ジーンバンクから受託番号Ｊ０４５９６で入手可能である。ヒトタンパク質gr
oα（アミノ酸１−７３）の配列を配列番号２に提示する。ヒトタンパク質groβ
（アミノ酸１−７３）の配列を配列番号３に提示する。ヒトタンパク質groγの
配列を配列番号４に提示する。groγのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列はまた、国
際特許出願公開番号WO 92/00326（1992年１月９日）に提示されている。これら
のgroγ配列は、さらに、国際特許出願公開番号WO 94/29341（1994年12月22日）
に公表されている（引用して本明細書の記載とする）。
「修飾ケモカイン」なる用語は、前記で引用した国際出願で定義するとおりで
ある。修飾ケモカインは、ＫＣ、groβ、groαおよびgroγ、より好ましくはgro
β、groαおよびgroγ、最も好ましくはgroβに由来する。修飾ケモカインとし
ては、成熟タンパク質のアミノ末端で約２個〜約８個のアミノ酸が排除されてい
ることにより特徴付けられる脱アミノタンパク質が挙げられる。本発明の方法に
有用なこれらの脱アミノケモカインは、好ましくは、成熟タンパク質のアミノ末
端から約２個〜約８個のアミノ酸が除去されることにより特徴付けられる。最も
好ましくは、修飾ケモカインは、アミノ（Ｎ−）末端で最初の４個のアミノ酸が
除去されていることにより特徴付けられる。所望により、特に組換えにより発現
した場合、本発明に有用な脱アミノケモカインは、挿入されたＮ−末端Ｍｅｔを
含有していてもよい。発現目的でタンパク質に挿入されたＮ−末端メチオニンは
、宿主細胞によるタンパク質のプロセシングの間かまたは既知の技術を用いて合
成
的に開裂できる。別法として、所望により、このアミノ酸は、酵素消化または他
の既知の手段により開裂できる。
修飾ケモカインとしては、成熟タンパク質の生物活性を共有するこれらのタン
パク質のアナログまたは誘導体をも包含する。本明細書に定義するように、かか
るアナログおよび誘導体としては、例えば配列番号１−４に提示されるタンパク
質のようなタンパク質の既知アミノ酸配列においてなされた改変により特徴付け
られる修飾タンパク質が挙げられる。かかるアナログは、８個以下のアミノ酸残
基、好ましくは５個以下のアミノ酸残基により成熟タンパク質のアミノ酸配列と
は異なるアミノ酸配列を有することにより特徴付けられる。タンパク質のアミノ
酸配列の任意の差異は、保存アミノ酸置換のみを含むことが好ましい。アミノ酸
が、置換されており、かつ、その置換がタンパク質の局所的な配位またはその生
物活性に有意な影響を及ぼさないアミノ酸と同一の電荷を実質的に有する場合に
保存アミノ酸置換が起こる。また別に、タンパク質の安定性を変え得るかまたは
所望の宿主細胞において発現させることができる、配列における特定のアミノ酸
の導入のごとき変化は好ましい。これらの修飾タンパク質の別の特徴は、成熟タ
ンパク質と比較した場合、生物活性が増強され得ることである。
「多量体タンパク質」または「多量体」なる用語は、本明細書において、本発
明に有用な成熟タンパク質および／または修飾タンパク質の多量体形態、例えば
二量体、三量体および他の集合形態を意味する。かかる多量体形態は、合成また
は組換え発現により製造でき、以下に詳細に記載する合成および組換え技術を組
み合わせて製造したケモカインを含有できる。多量体は、発現時に天然に形成で
きるか、またはかかる多量体形態に構築できる。多量体ケモカインは、同一の修
飾ケモカインの多量体を包含してよい。別の多量体は、異なる修飾タンパク質を
集合させることにより形成できる。さらに別の多量体は、本発明の修飾ケモカイ
ンおよび既知の成熟ケモカインを集合させることにより形成する。好ましくは、
本発明に有用な二量体または多量体は、少なくとも１個の脱アミノケモカインタ
ンパク質、および少なくとも１個の他のケモカインまたは同じ型の生物活性を有
することにより特徴付けられる他のタンパク質を含有できる。この他のタンパク
質は、さらなる脱アミノケモカインまたは別の既知タンパク質でよい。
ＩＩ．本発明で有用なタンパク質
概して、本発明の方法で有用なケモカインは、成熟ケモカイン、またはそれに
由来する修飾および多量体タンパク質を包含し、これらの詳細は、国際特許出願
公開番号WO 94/29341に開示されている。望ましくは、これらのケモカインは、
ＫＣ、groα、groβおよびgroγから選択され、最も好ましくはケモカインは、g
roβである。
一の好ましい具体例では、本発明方法は、本発明の脱アミノケモカインタンパ
ク質を利用する。当該タンパク質は、配列番号１−４のアミノ酸位置２および８
の間のＮ末端で切断された本発明において有用な成熟ケモカインのアミノ酸配列
を有してなる。好ましくは、本発明の脱アミノタンパク質は、配列番号２−４の
アミノ酸５〜７３、または配列番号１のアミノ酸５〜７２にわたるタンパク質配
列を有する。最も好ましくは、本発明の方法は、配列番号３のアミノ酸５〜７３
にわたるタンパク質配列を有する脱アミノgroβである。この脱アミノgroβは、
前記で引用したＨＳＦアッセイで判定されるように、非修飾ヒトgroβよりも少
なくとも約２ロガリズム高い生物活性を有することにより特徴付けられる。
WO 94/29341に開示されるように、本発明方法において有用なＫＣ、groαおよ
びgroγタンパク質に類似の修飾を行うことができる。これらのタンパク質は、
全て文献に開示されており、当業者に公知である。
本発明において有用な好ましい多量体タンパク質としては、少なくとも１個の
脱アミノケモカインタンパク質および少なくとも１個の他のケモカインまたは同
型の生物活性を有することにより特徴付けられる他のタンパク質を含有する二量
体または多量体が挙げられる。この他のタンパク質は、さらなる脱アミノケモカ
イン、または別の既知タンパク質でよい。例えば、本発明方法において有用な望
ましい二量体は、好ましくはジスルフィド結合により連結された、前記の２個の
脱アミノタンパク質を有してなる。望ましい多量体は、２個またはそれ以上の脱
アミノgroβタンパク質、とりわけ配列番号３のアミノ酸５〜７３からなる２個
のタンパク質の集合体でよい。また別に、本発明の別の二量体は、成熟groβタ
ンパ
ク質と組み合わせた本発明の脱アミノgroβタンパク質でよい。同様に、二量体
または他の多量体形態の種々の組み合わせは、成熟または修飾groβおよびＫＣ
、groαおよびgroγタンパク質のごとき他のケモカインを組み合わせたものを含
有できる。例えば、本発明の脱アミノgroβタンパク質は、非修飾成熟groαタン
パク質と二量体を形成できる。当業者は、本発明の修飾ケモカインを用いて他の
望ましい多量体を得ることができる。しかしながら、本明細書に定義する２個ま
たはそれ以上の異なる修飾タンパク質の多量体形態の使用は、本発明の方法にお
いて有用である。本発明の方法において使用するケモカインは、前記した修飾ケ
モカインおよび別の既知成熟タンパク質の多量体形態でもよい。
これらのタンパク質および単量体は、文献に詳細に開示されており、慣用技術
および／または国際特許公開番号WO 94/29341 に開示された技術を用いて、合成
できるか、または組換えにより産生できる。
ＩＩＩ．医薬組成物
望ましくは、本発明方法において有用なケモカインは、医薬品の製造に使用さ
れ、および／または医薬組成物の形態で有用である。したがって、該ケモカイン
は、医薬組成物に処方でき、例えば国際特許出願公開番号WO 90/02762（1990年3
月22日）および公開番号WO 94/29341（1994年12月22日）に記載された方法と同
一の方法で投与できる。
造血幹細胞の動員において有用なこれらの医薬品または医薬組成物は、本明細
書で定義される成熟、修飾または多量体ケモカインの治療上有効量および許容で
きる医薬用担体を含有する。本明細書で用いる場合、「医薬用」なる用語は、本
発明の獣医学的適用を包含する。
「治療上の有効量」なる用語は、単量体形態であろうと多量体形態であろうと
、望ましい生理学的効果を達成するに十分な量の幹細胞を動員するのに有用なケ
モカインの量を意味する。
概して、本発明において有用な成熟、修飾または脱アミノケモカイン(例えばg
roβ)は、投与あたり約０.０１ng／kg体重〜約１g／kg体重、好ましくは約０.０
１ng／kg体重〜約１０mg／kg体重の量を投与する。望ましくは、多量体ケモカイ
ンを本発明方法に用いる場合、医薬品または組成物は、この範囲の最低量の多量
体タンパク質を含有する。好ましくは、これらの医薬組成物は、ヒトまたは他の
哺乳動物対象に注射により投与する。しかしながら、投与は、いずれの適当な内
部経路によるものであってもよく、必要に応じて、例えば１日〜約１週間１日１
〜３回繰り返すことができる。
適当な医薬用担体は、当業者によく知られており、容易に選択できる。現在、
好ましい担体は、生理食塩水である。所望により、本発明の医薬用アッセイは、
他の活性成分を含有でき、他の治療薬と組み合わせて投与できる。適当な任意の
成分または他の治療薬としては、この病状を処置するために慣用的なもの、例え
ば、とりわけ、他の抗炎症剤、利尿剤および免疫抑制剤が挙げられる。望ましく
は、これらの修飾ケモカインは、特に、コロニー刺激因子と組み合わせて投与す
るのに非常に適している。
ＩＶ．造血幹細胞の動員方法
本発明は、限定するものではないが、炎症、発熱、ウイルス感染、真菌類感染
および細菌感染、癌、骨髄造血機能不全、造血障害、再生不良性貧血、および自
己免疫疾患、ならびに造血細胞および／または骨髄細胞の産生および／または分
化の低下により特徴付けられる症状を包含する免疫抑制または造血幹細胞および
それから分化した細胞の数の低下により特徴付けられる症状の改良された処置方
法を提供するものである。この方法は、選択された哺乳動物に本発明の医薬組成
物を投与することを含む。好ましくは、この組成物は、コロニー刺激因子と共に
投与されるか、または該因子を含有する。コロニー刺激因子の適当な供給源は、
よく知られており、例えば天然、合成および組換えＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、
Ｇ−ＣＳＦおよびＩＬ−３が挙げられる。別の好ましい具体例では、本発明にお
いて有用な脱アミノケモカインは、in vivo で投与でき、選択された患者におい
て見出される天然のコロニー刺激因子と相乗作用させることができる。
一の好ましい具体例では、本発明方法は、ＧＭ−ＣＳＦ（またはＧ−ＣＳＦ）
と組み合わせて本明細書に記載する脱アミノケモカインを使用する。ＣＳＦと組
み合わせた本発明方法（この組み合わせは、相乗効果を有することが観察されて
いる）によれば、脱アミノgroβのごとき修飾ケモカインを使用することにより
患者に投与すべきＣＳＦの用量を低下させることができ、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇ−Ｃ
ＳＦ）により引き起こされる非常に好ましくない副作用を軽減させることができ
る。
本発明方法において有用な成熟ケモカインおよび修飾または多量体ケモカイン
は、単独で投与した場合に造血幹細胞を動員する能力により、または in vivo
および in vitro でコロニー刺激因子もしくは成長因子のごとき別の造血因子と
共に投与した場合または自然に循環しているＣＳＦと組み合わせた場合または化
学療法を伴うプロトコルで投与した場合に造血を刺激することにおいて相乗する
効果を有することにより特徴付けられる。
一の具体例では、本発明は、ヒトgroβ［配列番号３］、ヒトgroα［配列番号
２］、ヒトgroγ［配列番号４］、およびネズミＫＣ［配列番号１］から選択さ
れた成熟ケモカインを含有する組成物または医薬品の有効量を動物に投与するこ
とによる動物における造血幹細胞の動員方法を提供するものである。
本発明の別の具体例では、動物における造血幹細胞の動員方法は、groβ、gro
α、groγおよびＫＣから選択されたケモカインに由来する修飾タンパク質の有
効量を動物に投与することを含む。好ましい具体例では、ケモカインヒトgroβ
［配列番号３］に由来する修飾タンパク質の有効量を動物に投与することによる
動物における造血幹細胞の動員方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、前記した少なくとも１つのケモカインを第２
のケモカインと組み合わせたものを有してなる多量体タンパク質の有効量を動物
に投与することからなる、動物における造血幹細胞の動員方法を提供するもので
ある。
造血幹細胞の動員方法を実施する場合、これらのタンパク質の「有効量」なる
用語は、適当な手段により患者に投与する場合、造血幹細胞を動員し、末梢血中
の造血幹細胞数を増加させる量と定義される。この量は、造血系前駆細胞の成長
または発達を刺激するのに必要な量よりも高いであると考えられる。有効量は、
適用可能な臨床または獣医学の場において造血幹細胞から分化される細胞を循環
中に増加させる。望ましい有効量は、投与あたり約０.０１ng／kg〜１０mg／kg
体
重でよい。
幹細胞を動員するのに適した投与手段としては、限定されないが、ボーラス注
射もしくは注射による有効量の漸増投与、点滴静注、または任意の他の適当な内
部経路が挙げられる。投与は、必要に応じて、例えば１日から約１週間１日に１
から３回繰り返してよい。
さらに、成熟ケモカイン、または前記で同定した修飾もしくは多量体ケモカイ
ンを用いる本発明方法は、末梢血造血幹細胞移植治療法において使用できる。例
えば、化学療法剤の任意の初期用量の投与後、回収目的で造血幹細胞を骨髄から
末梢循環に動員するためおよび化学療法剤の高用量投与後の再投与のために現在
使用しているＣＳＦの代わりに成熟ケモカインまたは前記で同定した修飾もしく
は多量体ケモカインを投与する。適当な化学療法剤としては、限定されないが、
シクロホスファミド、シスプラチナム、ＡＲＡ−Ｃ、５−フルオロウラシル、エ
トプシド、エピルビシン、カルボプラチン、ブスルファン、ミトキサントロンお
よびカルムスチンのごときよく知られている薬剤が挙げられる。本発明に準じて
ケモカインと共に投与する場合、化学療法剤の用量は、慣用的に用いられる量、
すなわち、エトプシド約１.２g／m2、ＡＲＡ−Ｃ ８００μg／m2、シクロホスフ
ァミド２００mg／kgなどである。かかる用量に関しては、Hass et al.，Seminar
s in Oncol.，21:19-24（1994）(引用して本明細書の記載とする)を参照のこと
。
前記で同定したケモカインは、治療法で慣用的に用いられるＣＳＦを補足する
ために使用できる。また別に、前記で同定したケモカインは、前記で引用した造
血に関与する分子のごとき他の造血調節生分子、または同一目的の成長因子、慣
用的な医薬品および／または薬物と組み合わせた治療法において使用できる。か
かる成長因子の適当な入手源は、よく知られており、限定されないが、天然、合
成および組換えＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、ならびにＦlt−３リガ
ンドが挙げられる。他の適当な生分子としては、(Ｓ)−５−オキソ−Ｌ−プロリ
ル−α−グルタミル−Ｌ−α−アスパルチル−Ｎ8−(５−アミノ−１−カルボキ
シペンチル)−８−オキソ−Ｎ7−[Ｎ−{Ｎ−(５−オキソ−Ｌ−プロリル)−Ｌ−
α−グルタムイル}−Ｌ−α−アスパルチル]−Ｌ−スレオ−２,７,８−トリアミ
ノオクタノイル−リジン［(ｐＧlu−Ｇlu−Ａsp)2−Ｓub-(Ｌys)2］［Pelus et
al.，Exp．Hematol.，22:239-247(1994)］が挙げられる。同時投与するためのさ
らに他の医薬品および薬物は、当業者に容易に選択できる。
末梢血造血幹細胞移植の伝統的な方法の代替えとして、またはこれらの方法と
組み合わせた本発明の使用の利点は、ＰＭＮおよび／または血小板の骨髄移植に
よるよりも迅速な回復が生じ、感染の危険性が軽減され、この方法により化学療
法剤の治療有効量潜在的に高めるか、または投与すべき化学療法剤の一連の投与
量を増加させることができることである。
以下の実施例は単に説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するもの
ではない。
実施例１ − 動員アッセイ
周知の技術を用いて、修飾および多量体ケモカインを包含するＫＣ［配列番号
１］、groβ［配列番号３］およびgroγ［配列番号４］に由来するケモカインを
製造する。かかるケモカインの製造に関するさらなる記載については、例えば、
WO94/29341 を参照のこと。これらのケモカインを、マウスにおける造血幹細胞
を動員する能力について試験する。各ケモカインを５０、１０および２μg／マ
ウスの濃度で検定し、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内または経口経路により投与
する。造血幹細胞のケモカイン動員の動態を、マウスから心臓穿刺により血液サ
ンプルを回収することにより６０分間にわたり１５分間隔でモニターする。動員
された造血幹細胞を、リンホライト−Ｍ（Ｌympholyte−ＭTM）密度勾配で分離
することにより分画し回収する。将来の使用のために細胞を洗浄する。
獣医学用ソフトウェアを装備したテクニコン（ＴechniconTM）Ｈ１ヘマトロジ
ーアナライザーを用いて成熟血液細胞要素を数える。潜在的炎症プロフィルの全
体像を評価する場合、多形核（ＰＭＮ）細胞、好酸球および好塩基球のごとき成
熟炎症細胞の動員を考慮に入れる。
初期および後期造血系前駆細胞をモニターするために、ＣＦＵ−ＧＭアッセイ
を行う。すなわち、動員期の間に回収した血液サンプルを、７日目および１４日
目にコロニー形成ユニット（ＣＦＵ−ＧＭ）について評価する。細胞を、無血清
マッコイ培地中１０6細胞／mlに調整する。栄養素（ＮaＨＣＯ3、ピルビン酸塩
、アミノ酸、ビタミンおよびＨＥＰＥＳバッファー）に富んでいるマッコイ培地
、０.３％ バクト（Ｂacto）寒天および１５％ウシ胎児血清からなる単層寒天系
を使用する。該寒天系に血液サンプルからの細胞（最終濃度１０5細胞／ml）を
添加する。寒天プレートを３７℃、７.５％ＣＯ2で７〜１４日間インキュベート
する。増殖細胞のコロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）を顕微鏡を用いて数える。
さらに、初期造血系高増殖ポテンシャル（ＨＰＰ）前駆細胞を１４日ＣＦＵ培
養において数える。
単一の因子として造血幹細胞を動員するケモカインＩＬ−８を陽性対照として
これらの試験に加える。
予備試験では、groβ［配列番号３］の投与により、対照の結果と類似するＣ
ＦＵ−ＧＭの用量依存的動員が生じることが示された。修飾groβである、groβ
のＮ−末端４アミノ酸切断タンパク質（アミノ酸５−７３）は、groβ（アミノ
酸１−７３）またはＩＬ−８よりも有意に多くの造血系前駆細胞を動員した。gr
oβ処置マウスでは、成熟細胞要素における有意な変化（＞３倍）は観察されず
、これは、造血系前駆細胞の特異的動員を示している。この結果は、修飾脱アミ
ノケモカインが成熟タンパク質と比較して動員特性を増強したことを示している
。
実施例２ − 血液刺激物質と組み合わせた動員アッセイ
前記で動員因子と同定したケモカインと組み合わせて、血液刺激物質を検定す
る。血液刺激物質としては、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、(Ｓ)−５−オキソ−Ｌ
−プロリル−α−グルタミル−Ｌ−α−アスパルチル−Ｎ8−(５−アミノ−１−
カルボキシペンチル)−８−オキソ−Ｎ7−[Ｎ−{Ｎ−(５−オキソ−Ｌ−プロリ
ル)−Ｌ−α−グルタムイル}−Ｌ−α−アスパルチル]−Ｌ−スレオ−２,７,８
−トリアミノオクタノイル−リジン［(ｐＧlu−Ｇlu−Ａsp)2−Ｓub−(Ｌys)2］
［Pelus、前掲］およびＦＬＴ−３リガンドが挙げられる。任意のＧ−ＣＳＦ擬
似物質、すなわちＧ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどのＣＳＦではないが、造血
活性を有する血液刺激物質を使用できる。
組み合わせアッセイでは、マウスに血液刺激物質、例えばＧ−ＣＳＦ ５０μ
g
／kgを投与して、４日後にＫＣ［配列番号１］、groβ［配列番号３］およびgro
γ［配列番号４］に由来するケモカインまたは修飾もしくは多量体ケモカインを
投与する。実施例１におけるように、ケモカインの投与量および血液回収の時期
を変化させる。
実施例１において前記するように、コロニー刺激活性の供給源としてＳＣＦ、
ＩＬ−１およびＧＭ−ＣＳＦを用いてＣＦＵ−ＧＭアッセイを行う。成熟血液細
胞要素、初期および後期前駆細胞を実施例１のように測定する。
血液刺激物質前処置との組み合わせ試験では、陽性対照としてＭＩＰ−１αを
使用する。
実施例３ − ネズミ末梢血幹細胞移植モデル
Ａ．原始長期再増殖幹細胞の動員
in vivo 幹細胞移植モデルで以下の試験を実施して、Ｎ末端で切断されたgro
β［配列番号３のアミノ酸５−７３；groβ−Ｔと称する］が原始長期再増殖幹
細胞を動員するかを決定する。このモデルでは、γ線放射したマウスが骨髄細胞
の受容体である。マウスをその後１００日間生存させる。
ＰＢＳ、groβ−Ｔ（１５〜３０分で５０μg）、Ｇ−ＣＳＦ（１μg／マウス
ＢＩＤｘ４）、またはＧ−ＣＳＦのいずれかで処置し、次いでgroβ−Ｔで処置
して生存させたマウスまたは致死的に放射線照射したマウスから血液幹細胞の能
力を回収した。移植後１００日目のマウスのＰＢＳ処置マウスタンパク質０〜１
０％から血液単核細胞（１Ｅ＋６まで）を回収した。アッセイ陽性対照として骨
髄を受容したマウスは、１００日で生存率１００％であった。groβ−Ｔ単独で
処置したマウスから回収した動員血液細胞（１Ｅ＋６細胞／マウス）は、受容体
の７０％を保護した。Ｇ−ＣＳＦ処置ドナーから回収した動員血液細胞（１Ｅ＋
６細胞／マウス）は、受容体の８０％を保護した。Ｇ−ＣＳＦおよびgroβ−Ｔ
で処置したドナーから回収した動員血液細胞は、Ｇ−ＣＳＦ単独よりも非常に多
くの再増殖細胞を動員する。
Ｂ．末梢血幹細胞の動員
放射線照射された宿主においてgroβ−Ｔにより動員された末梢血幹細胞が成
熟
血液細胞系列を回復する速度を評価した。放射線照射した受容体に１Ｅ＋６低密
度末梢血細胞（ＬＤＰＢＣ）を注射し、照射後７〜１９日目に心臓穿刺により出
血させた。異なるグループからのＬＤＰＢＣをＣＦＵ−ＧＭ動員に最適な条件下
で回収した。この試験で比較したグループは、ＰＢＳ、groβ−Ｔ単独（５０μg
、１５分）、Ｇ−ＣＳＦ（ＢＩＤｘ５日、１μg／マウス 単独）およびgroβ−
Ｔ＋Ｇ−ＣＳＦであった。移植動物と比較するために、正常のマウスを毎日出血
させた。
ＰＢＳ処置ドナーから移植を受けたマウスは、成熟血液細胞要素を回復できず
、死亡した。切断groβにより動員された細胞を受容したマウスの好中球の回復
速度は、Ｇ−ＣＳＦ動員細胞を受容したマウスよりも速かった。groβ−Ｔ＋Ｇ
−ＣＳＦを組み合わせたもので動員されたＬＤＰＢＣを移植したマウスは、gro
β動員細胞よりも好中球の回復速度が速かった。
これらの同一マウスにおける血小板数の回復は、同一のパターンをたどった：
groβ−Ｔ＋Ｇ−ＣＳＦ ＞ groβ−Ｔ ＞ Ｇ−ＣＳＦ ＞＞ ＰＢＳ。しかしなが
ら、１９日目では、血小板数は、正常値への回復にはまだほど遠かった。これら
のデータは、Ｇ−ＣＳＦ動員幹細胞と等しいかまたはそれよりも速い結果的好中
球および血小板回復速度を有するgroβ−Ｔ動員血液幹細胞が受容マウスにおい
て移植されることを示す。
本発明の非常に多くの修飾および変種が前記で規定した明細書に包含され、当
業者には明白であると思われる。本発明の組成物および方法に対するかかる修飾
および変更は、本明細書に添付する請求の範囲の範囲内であると考える。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Methods for Recruiting Hematopoietic Stem Cells Field of the invention The present invention relates generally to a method for recruiting hematopoietic stem cells. Background of the Invention All members of the intercrine or chemokine family are basic heparin binding polypeptides with four cysteine residues forming two disulfide bridges. All these functionally characterized proteins are thought to be involved in proinflammatory and / or repair functions. In clinical settings where high doses of chemotherapeutic agents are administered, the biomolecule of choice is G-CSF. Generally, for such treatment, a low dose of a chemotherapeutic agent such as cyclophosphamide is administered to the patient beforehand. During the remission phase, patients are treated with a CSF, such as G-CSF, which results in the recruitment of cells from the bone marrow to the peripheral circulation to collect leukophoresed blood. Thereafter, a high dose of a chemotherapeutic agent is administered to the patient, causing a clinical remission of the cancer. The resulting bone marrow failure is treated by infusion of previously collected stored blood cells. This method can be modified, for example, by omitting the initial administration of the chemotherapeutic agent and / or changing the blood collection protocol. Although the use of these hematopoietic stem cell transplantation techniques seems promising, a multiple apheresis procedure is used to treat severe myelosuppression when using G-CSF alone. Sufficient stem cell recovery is required for continuous transplantation [eg, Bensinger et al., Blood, 81: 3158 (1993) and R. Haas et al., Sem. In Oncology, 21:19 (1994). checking]. Thus, despite such remarkable progress and the availability of certain regulatory biomolecules, delayed hematopoietic recovery remains an important cause of morbidity and mortality for myelosuppressed patients. There remains a need in the art for compositions and methods for enhancing hematopoietic recovery, particularly in the case of myelosuppression associated with chemotherapy. Summary of the Invention In one aspect, the invention provides the use of a chemokine in the preparation of a stimulator of a hematopoietic stem cell. The chemokines include proteins from KC, groβ, groα and groγ, including the mature, modified, and multimeric forms of these chemokines. In a further aspect, the invention provides a method of mobilizing hematopoietic stem cells in an animal, comprising administering to the animal an effective amount of a mature or modified or multimeric chemokine described herein. Other aspects and advantages of the present invention are further described below in the detailed description of these preferred embodiments. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 is a graph showing the effect of groβ (amino acids 1-73 of SEQ ID NO: 3) in the single drug mobilization assay of Example 1. FIG. 2 is a graph showing the effect of modified groβ (amino acids 5-73 of SEQ ID NO: 3) in the single drug mobilization assay of Example 1. FIG. 3 shows a comparison of phosphate buffered saline (PBS), IL-8, groβ (amino acids 1-73; SEQ ID NO: 3) and modified groβ (amino acids 5-73 of SEQ ID NO: 3) in a single drug mobilization assay. FIG. Detailed description of the invention The present invention provides modified proteins involved in the inflammatory response, hematopoiesis and myelopoiesis, specifically chemokines, which are compared to the corresponding unmodified or uncleaved mature proteins. And characterized by enhanced biological activity. The present invention provides a method of treating myelosuppression by mobilizing hematopoietic stem cells from the bone marrow to peripheral blood using the mature or modified or multimeric chemokines described herein. I. Definitions As defined herein, "hematopoietic synergistic factor" or "HSF" refers to CSF that is administered in vivo and in vitro with another hematopoietic factor, such as a colony stimulating factor, or that circulates naturally. When combined, it refers to a class of proteins that encompass native and modified chemokines, characterized by having synergistic activity in stimulating hematopoiesis. As used herein, the term "mature chemokine", also known as "intercrine", defines proteins commonly referred to in the art as KC, groα, groβ and groγ. I do. For convenience, the amino acid sequence of murine protein KC containing 72 residues is provided in SEQ ID NO: 1. These sequences are available from GeneBank under accession number J04596. The sequence of the human protein groα (amino acids 1-73) is presented in SEQ ID NO: 2. The sequence of the human protein groβ (amino acids 1-73) is presented in SEQ ID NO: 3. The sequence of the human protein groγ is presented in SEQ ID NO: 4. The groγ cDNA and amino acid sequences are also provided in International Patent Application Publication No. WO 92/00326 (January 9, 1992). These groγ sequences are further published in International Patent Application Publication No. WO 94/29341 (December 22, 1994) (incorporated herein by reference). The term "modified chemokines" is as defined in the international application cited above. The modified chemokines are derived from KC, groβ, groα and groγ, more preferably groβ, groα and groγ, most preferably groβ. Modified chemokines include deaminoproteins characterized by the elimination of about 2 to about 8 amino acids at the amino terminus of the mature protein. These deaminated chemokines useful in the methods of the present invention are preferably characterized by the removal of about 2 to about 8 amino acids from the amino terminus of the mature protein. Most preferably, the modified chemokines are characterized by the removal of the first four amino acids at the amino (N-) terminus. If desired, and particularly when expressed recombinantly, deamidated chemokines useful in the present invention may contain an inserted N-terminal Met. An N-terminal methionine inserted into a protein for expression purposes can be cleaved during processing of the protein by host cells or synthetically using known techniques. Alternatively, if desired, the amino acid can be cleaved by enzymatic digestion or other known means. Modified chemokines also include analogs or derivatives of these proteins that share the biological activity of the mature proteins. As defined herein, such analogs and derivatives include modified proteins that are characterized by alterations made in the known amino acid sequence of the protein, such as, for example, the proteins presented in SEQ ID NOs: 1-4. Such analogs are characterized by having an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence of the mature protein by no more than 8 amino acid residues, preferably no more than 5 amino acid residues. Any differences in the amino acid sequence of the protein preferably include only conservative amino acid substitutions. A conservative amino acid substitution occurs when an amino acid has been substituted and has substantially the same charge as an amino acid that does not significantly affect the local coordination of the protein or its biological activity. Alternatively, changes, such as the introduction of certain amino acids in the sequence, that can alter the stability of the protein or be expressed in a desired host cell, are preferred. Another feature of these modified proteins is that their biological activity can be enhanced when compared to the mature protein. The term "multimeric protein" or "multimer" as used herein refers to multimeric forms of mature and / or modified proteins useful in the invention, such as dimers, trimers and other aggregated forms. means. Such multimeric forms can be produced by synthetic or recombinant expression and can contain chemokines produced by a combination of synthetic and recombinant techniques described in detail below. Multimers can be naturally formed upon expression or can be assembled into such multimeric forms. Multimeric chemokines may include multimers of the same modified chemokine. Another multimer can be formed by assembling different modified proteins. Still other multimers are formed by assembling the modified chemokines of the invention and known mature chemokines. Preferably, a dimer or multimer useful in the present invention comprises at least one deaminated chemokine protein and at least one other chemokine or other protein characterized by having the same type of biological activity. Can be included. This other protein may be an additional deaminated chemokine or another known protein. II. Proteins Useful in the Present Invention Generally, chemokines useful in the methods of the present invention include mature chemokines, or modified and multimeric proteins derived therefrom, the details of which are disclosed in International Patent Application Publication No.WO 94/29341. Have been. Desirably, these chemokines are selected from KC, groα, groβ and groγ, most preferably the chemokine is groβ. In one preferred embodiment, the method of the invention utilizes a deaminated chemokine protein of the invention. The protein comprises the amino acid sequence of a mature chemokine useful in the invention truncated at the N-terminus between amino acid positions 2 and 8 of SEQ ID NOs: 1-4. Preferably, the deaminated protein of the present invention has a protein sequence spanning amino acids 5-73 of SEQ ID NO: 2-4, or amino acids 5-72 of SEQ ID NO: 1. Most preferably, the method of the invention is a deaminated groβ having a protein sequence spanning amino acids 5 to 73 of SEQ ID NO: 3. This deaminated groβ is characterized by having at least about 2 logarithm more biological activity than unmodified human groβ, as determined by the HSF assay cited above. As disclosed in WO 94/29341, similar modifications can be made to the KC, groα and groγ proteins useful in the methods of the invention. All of these proteins are disclosed in the literature and are known to those skilled in the art. Preferred multimeric proteins useful in the present invention include dimers containing at least one deaminated chemokine protein and at least one other chemokine or other protein characterized by having the same type of biological activity. Multimers. This other protein may be an additional deaminated chemokine, or another known protein. For example, a desired dimer useful in the method of the invention comprises the two deaminoproteins described above, preferably linked by disulfide bonds. The desired multimer may be a collection of two or more deaminated groβ proteins, especially two proteins consisting of amino acids 5-73 of SEQ ID NO: 3. Alternatively, another dimer of the invention may be a deaminated groβ protein of the invention in combination with a mature groβ protein. Similarly, various combinations of dimeric or other multimeric forms can include combinations of mature or modified groβ and other chemokines such as KC, groα and groγ proteins. For example, a deaminated groβ protein of the invention can form a dimer with an unmodified mature groα protein. One skilled in the art can use the modified chemokines of the present invention to obtain other desirable multimers. However, the use of multimeric forms of two or more different modified proteins as defined herein is useful in the methods of the invention. The chemokines used in the method of the present invention may be multimeric forms of the modified chemokines described above and another known mature protein. These proteins and monomers are well-disclosed in the literature and can be synthesized or recombinantly produced using conventional techniques and / or the techniques disclosed in International Patent Publication No. WO 94/29341. . III. Pharmaceutical Compositions Desirably, chemokines useful in the methods of the invention are used in the manufacture of a medicament and / or are useful in the form of a pharmaceutical composition. Accordingly, the chemokines can be formulated into pharmaceutical compositions, for example as described in International Patent Application Publication No. WO 90/02762 (March 22, 1990) and Publication No. WO 94/29341 (December 22, 1994). It can be administered in the same manner as described above. These medicaments or pharmaceutical compositions useful in recruiting hematopoietic stem cells contain a therapeutically effective amount of a mature, modified or multimeric chemokine as defined herein and an acceptable pharmaceutical carrier. As used herein, the term “pharmaceutical” includes veterinary applications of the present invention. The term "therapeutically effective amount" means the amount of a chemokine that is useful to recruit a sufficient amount of stem cells to achieve the desired physiological effect, whether in monomeric or multimeric form. I do. Generally, a mature, modified or deaminated chemokine (eg, groβ) useful in the present invention will comprise from about 0.01 ng / kg body weight to about 1 g / kg body weight, preferably from about 0.01 ng / kg body weight to about 10 mg per dose. / Kg body weight. Desirably, when a multimeric chemokine is used in the method of the invention, the medicament or composition will contain the lowest amount of multimeric protein in this range. Preferably, these pharmaceutical compositions are administered to a human or other mammalian subject by injection. However, administration may be by any suitable internal route, and may be repeated as necessary, eg, 1-3 times daily for 1 day to about 1 week. Suitable pharmaceutical carriers are well known to those skilled in the art and can be readily selected. Currently, the preferred carrier is saline. If desired, the pharmaceutical assays of the present invention can contain other active ingredients and can be administered in combination with other therapeutic agents. Suitable optional ingredients or other therapeutic agents include those customary for treating this condition, for example, other anti-inflammatory, diuretic and immunosuppressive agents, among others. Desirably, these modified chemokines are particularly well suited for administration in combination with a colony stimulating factor. IV. Methods for recruiting hematopoietic stem cells The present invention includes, but is not limited to, inflammation, fever, viral infection, fungal infection and bacterial infection, cancer, bone marrow hematopoietic dysfunction, hematopoietic disorders, aplastic anemia, and autoimmune diseases, And improved methods of treating immunosuppression or conditions characterized by reduced numbers of hematopoietic stem cells and cells differentiated therefrom, including conditions characterized by reduced production and / or differentiation of hematopoietic cells and / or bone marrow cells. To provide. The method comprises administering to a selected mammal a pharmaceutical composition of the invention. Preferably, the composition is administered with or contains a colony stimulating factor. Suitable sources of colony stimulating factors are well known and include, for example, natural, synthetic and recombinant GM-CSF, M-CSF, G-CSF and IL-3. In another preferred embodiment, the deaminated chemokines useful in the present invention can be administered in vivo and synergize with natural colony stimulating factors found in selected patients. In one preferred embodiment, the method of the present invention uses a deaminated chemokine described herein in combination with GM-CSF (or G-CSF). According to the method of the invention in combination with CSF, which combination has been observed to have a synergistic effect, the use of modified chemokines, such as de-amino groβ, reduces the dose of CSF to be administered to the patient. And can reduce the very undesirable side effects caused by GM-CSF (G-CSF). Mature chemokines and modified or multimeric chemokines useful in the methods of the present invention may be combined with the ability to recruit hematopoietic stem cells when administered alone, or with other hematopoietic factors such as colony stimulating factors or growth factors in vivo and in vitro. It is characterized by having a synergistic effect in stimulating hematopoiesis when administered or combined with naturally circulating CSF or when administered in protocols involving chemotherapy. In one embodiment, the invention comprises a mature chemokine selected from human groβ [SEQ ID NO: 3], human groα [SEQ ID NO: 2], human groγ [SEQ ID NO: 4], and murine KC [SEQ ID NO: 1]. The present invention provides a method for mobilizing hematopoietic stem cells in an animal by administering to the animal an effective amount of the composition or pharmaceutical agent to be used. In another embodiment of the invention, a method of recruiting hematopoietic stem cells in an animal comprises administering to the animal an effective amount of a modified protein derived from a chemokine selected from groβ, groα, groγ and KC. In a preferred embodiment, there is provided a method of mobilizing hematopoietic stem cells in an animal by administering to the animal an effective amount of a modified protein derived from the chemokine human groβ [SEQ ID NO: 3]. In yet another aspect, the present invention provides a method of treating a hematopoietic stem cell in an animal comprising administering to an animal an effective amount of a multimeric protein comprising a combination of at least one of the above chemokines with a second chemokine. It provides a mobilization method. When practicing the method of recruiting hematopoietic stem cells, the term `` effective amount '' of these proteins refers to an amount that, when administered to a patient by appropriate means, mobilizes hematopoietic stem cells and increases the number of hematopoietic stem cells in peripheral blood. Defined. This amount is believed to be higher than is necessary to stimulate the growth or development of hematopoietic progenitor cells. An effective amount increases the number of cells differentiated from hematopoietic stem cells in the circulation in applicable clinical or veterinary settings. Desirable effective amounts may be about 0.01 ng / kg to 10 mg / kg body weight per administration. Suitable means of administration for recruiting stem cells include, but are not limited to, bolus injection or escalating administration of an effective amount by injection, infusion, or any other suitable internal route. Administration may be repeated as needed, for example, one to three times a day for about one day to about one week. Furthermore, the methods of the present invention using mature chemokines, or the modified or multimeric chemokines identified above, can be used in peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation therapy. For example, following administration of any initial dose of a chemotherapeutic agent, CSFs currently used for recruiting hematopoietic stem cells from the bone marrow to the peripheral circulation for recovery purposes and for re-administration after high dose administration of the chemotherapeutic agent. Instead, a mature chemokine or a modified or multimeric chemokine identified above is administered. Suitable chemotherapeutic agents include, but are not limited to, well-known agents such as cyclophosphamide, cisplatinum, ARA-C, 5-fluorouracil, etopsid, epirubicin, carboplatin, busulfan, mitoxantrone and carmustine. No. When administered with chemokines according to the present invention, the dose of the chemotherapeutic agent may be the amount conventionally used, ie, about 1.2 g / m 2 of etopsid. Two , ARA-C 800 µg / m Two , Cyclophosphamide 200 mg / kg and the like. For such doses, see Hass et al., Seminars in Oncol., 21: 19-24 (1994), which is incorporated herein by reference. The chemokines identified above can be used to supplement CSF commonly used in therapeutic methods. Alternatively, the chemokines identified above may be used in other hematopoietic regulatory biomolecules, such as those cited above for hematopoiesis, or in therapies in combination with growth factors of the same purpose, conventional pharmaceuticals and / or drugs. it can. Suitable sources of such growth factors are well known and include, but are not limited to, natural, synthetic and recombinant GM-CSF, G-CSF, stem cell factor, and Flt-3 ligand. Other suitable biomolecules include (S) -5-oxo-L-prolyl-α-glutamyl-L-α-aspartyl-N 8 -(5-amino-1-carboxypentyl) -8-oxo-N 7 -[N- {N- (5-oxo-L-prolyl) -L-α-glutamyl] -L-α-aspartyl] -L-threo-2,7,8-triaminooctanoyl-lysine [(pGlu -Glu-Asp) Two -Sub- (Lys) Two [Pelus et al., Exp. Hematol., 22: 239-247 (1994)]. Still other medicaments and drugs for co-administration can be readily selected by those skilled in the art. The advantage of using the present invention as an alternative to, or in combination with, the traditional methods of peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation is that a faster recovery occurs than with bone marrow transplantation of PMNs and / or platelets and the risk of infection That the method can potentially increase the therapeutically effective amount of the chemotherapeutic agent or increase the series of doses of the chemotherapeutic agent to be administered. The following examples are merely illustrative and do not limit the scope of the invention. Example 1-Mobilization Assay Using well-known techniques, chemokines from KC [SEQ ID NO: 1], groβ [SEQ ID NO: 3] and groγ [SEQ ID NO: 4], including modified and multimeric chemokines, are produced. See, for example, WO 94/29341 for further description of the production of such chemokines. These chemokines are tested for their ability to recruit hematopoietic stem cells in mice. Each chemokine is assayed at a concentration of 50, 10 and 2 μg / mouse and administered by subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intravenous or oral route. The kinetics of chemokine recruitment of hematopoietic stem cells is monitored at 15 minute intervals over 60 minutes by collecting a blood sample from the mouse by cardiac puncture. The recruited hematopoietic stem cells were converted to Lympholyte-M TM ) Fractionate and collect by separating on a density gradient. Wash cells for future use. Technicon with veterinary software TM ) Count mature blood cell components using H1 hematology analyzer. When assessing the overall picture of a potential inflammatory profile, the recruitment of mature inflammatory cells such as polymorphonuclear (PMN) cells, eosinophils and basophils is taken into account. A CFU-GM assay is performed to monitor early and late hematopoietic progenitor cells. That is, blood samples collected during the mobilization phase are evaluated for colony forming units (CFU-GM) on days 7 and 14. Cells were cultured in serum-free McCoy's medium at 10 6 Adjust to cells / ml. Nutrients (NaHCO Three , A monolayer agar system consisting of McCoy's medium rich in 0.3% Bacto agar and 15% fetal bovine serum, pyruvate, amino acids, vitamins and HEPES buffer. Cells from a blood sample (final concentration 10 Five Cells / ml). Plate the agar plate at 37 ° C, 7.5% CO Two And incubated for 7-14 days. Proliferating cell colonies (CFU-GM) are counted using a microscope. In addition, early hematopoietic high growth potential (HPP) progenitor cells are counted in 14 day CFU culture. The chemokine IL-8 recruiting hematopoietic stem cells as a single factor is added to these tests as a positive control. Preliminary studies showed that administration of groβ [SEQ ID NO: 3] resulted in a dose-dependent recruitment of CFU-GM similar to control results. The modified groβ, the N-terminal 4 amino acid truncated protein of groβ (amino acids 5-73) recruited significantly more hematopoietic progenitor cells than groβ (amino acids 1-73) or IL-8. No significant changes (> 3-fold) in mature cell elements were observed in groβ treated mice, indicating specific recruitment of hematopoietic progenitor cells. This result indicates that the modified deaminated chemokine has enhanced recruitment properties compared to the mature protein. Example 2-Mobilization assay in combination with blood stimulants Blood stimulants are assayed in combination with the chemokines identified above as mobilization factors. Examples of blood stimulants include G-CSF, GM-CSF, (S) -5-oxo-L-prolyl-α-glutamyl-L-α-aspartyl-N 8 -(5-amino-1-carboxypentyl) -8-oxo-N 7 -[N- {N- (5-oxo-L-prolyl) -L-α-glutamyl] -L-α-aspartyl] -L-threo-2,7,8-triaminooctanoyl-lysine [(pGlu -Glu-Asp) Two -Sub- (Lys) Two [Pelus, supra] and FLT-3 ligand. Any G-CSF mimetic, ie, a blood stimulant that is not a CSF, such as G-CSF or GM-CSF, but has hematopoietic activity can be used. In the combination assay, mice are dosed with a blood stimulant, for example 50 μg / kg of G-CSF, and after 4 days are derived from KC [SEQ ID NO: 1], groβ [SEQ ID NO: 3] and gro γ [SEQ ID NO: 4] Administer chemokines or modified or multimeric chemokines. As in Example 1, the dose of chemokine and the time of blood collection are varied. As described above in Example 1, a CFU-GM assay is performed using SCF, IL-1 and GM-CSF as sources of colony stimulating activity. Mature blood cell components, early and late progenitor cells are measured as in Example 1. MIP-1α is used as a positive control in combination tests with blood stimulant pretreatment. Example 3-Murine Peripheral Blood Stem Cell Transplant Model A. Recruitment of primitive long-term repopulating stem cells The following test is performed in an in vivo stem cell transplant model to determine whether N-terminally truncated groβ [amino acids 5-73 of SEQ ID NO: 3; referred to as groβ-T] recruits primitive long-term repopulating stem cells. I do. In this model, gamma-irradiating mice are receptors for bone marrow cells. The mice are allowed to survive for the next 100 days. Mice that were treated with either PBS, groβ-T (50 μg in 15-30 min), G-CSF (1 μg / mouse BID × 4), or G-CSF and then treated with groβ-T or survived The ability of blood stem cells was recovered from mice that had been irradiated. Blood mononuclear cells (up to 1E + 6) were collected from 0-10% of the PBS-treated mouse protein of the mice 100 days after transplantation. Mice that received bone marrow as an assay positive control had 100% survival at 100 days. Recruited blood cells (1E + 6 cells / mouse) recovered from mice treated with groβ-T alone protected 70% of the receptor. Recruited blood cells (1E + 6 cells / mouse) collected from G-CSF treated donors protected 80% of the receptors. Recruited blood cells collected from donors treated with G-CSF and groβ-T recruit significantly more repopulated cells than G-CSF alone. B. Mobilization of peripheral blood stem cells The rate at which peripheral blood stem cells recruited by groβ-T in irradiated hosts restored the mature blood cell lineage was evaluated. Irradiated receptors were injected with 1E + 6 low density peripheral blood cells (LDPBC) and bled by cardiac puncture 7-19 days after irradiation. LDPBC from different groups were recovered under conditions optimal for CFU-GM mobilization. The groups compared in this study were PBS, groβ-T alone (50 μg, 15 min), G-CSF (BID × 5 days, 1 μg / mouse alone) and groβ-T + G-CSF. Normal mice were bled daily for comparison with the transplanted animals. Mice receiving transplants from PBS-treated donors failed to recover mature blood cell components and died. The recovery rate of neutrophils in mice that received cells recruited by truncated groβ was faster than in mice that received G-CSF recruited cells. Mice transplanted with LDPBC mobilized with the combination of groβ-T + G-CSF recovered neutrophils faster than groβ mobilized cells. Recovery of platelet counts in these same mice followed the same pattern: groβ-T + G-CSF>groβ-T> G-CSF >> PBS. However, on day 19, the platelet count was still far from returning to normal. These data indicate that groβ-T mobilized blood stem cells with resulting neutrophil and platelet recovery rates equal to or faster than G-CSF mobilized stem cells are transplanted in recipient mice. Numerous modifications and variations of the present invention are included in the above-defined specification and will be apparent to those skilled in the art. Such modifications and alterations to the compositions and methods of the present invention are considered to be within the scope of the claims appended hereto.
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(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 31/675 Ａ６１Ｋ 31/675
31/70 31/70
33/24 33/24
38/00 Ｃ０７Ｋ 14/47
Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ
，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，
ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ
Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ
，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，
ＵＺ，ＶＮ────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI A61K 31/675 A61K 31/675 31/70 31/70 33/24 33/24 38/00 C07K 14/47 C07K 14/47 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY) , KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, BB, BG, BR, CA, CN, CZ, EE, GE, HU, IL, IS, JP, KG, KP, KR, LK, LR, T, L V, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, SG, SI, SK, TR, TT, UA, US, UZ, VN