CZ120298A3

CZ120298A3 - Use of protein obtained from chemokin of mammals

Info

Publication number: CZ120298A3
Application number: CZ981202A
Authority: CZ
Inventors: Louis Martin Pelus; Andrew Garrison King
Original assignee: Smithkline Beecham Corporation
Priority date: 1995-10-24
Filing date: 1996-10-24
Publication date: 1998-09-16
Also published as: ZA968896B; NO981818D0; EP0866806A4; HUP9802531A2; PL326364A1; EP0866806A1; BR9611173A; NZ321789A; AU712235B2; MX9803217A; JPH11512747A; TR199800742T2; KR19990066997A; WO1997015595A1; AU7520996A; NO981818L; HUP9802531A3; AR004093A1

Abstract

A method of mobilizing hematopoietic stem cells from the bone marrow to the peripheral circulation is provided by administering to an animal an effective amount of nature, modified or multimeric forms of KC, gro beta , gro alpha or gro gamma .

Description

Použití proteinu odvozeného z chemokinu savceUse of a protein derived from a mammalian chemokine

Oblast technikyTechnical field

Tento vynález se obecně týká způsobů mobilizace krvetvorných kmenových buněk.The present invention relates generally to methods of mobilizing hematopoietic stem cells.

**

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Všichni členové interkrinové neboli chemokinové skupiny jsou bazické polypeptidy vázající heparin mající čtyři cysteinové zbytky,, které tvoří dva disulfidové můstky. Všechny tyto proteiny, které byly funkčně charakterizovány, se zdají být zahrnuty do prozánétlivých a/nebo obnovujících funkcí.All members of the intercrin or chemokine moiety are basic heparin-binding polypeptides having four cysteine residues, forming two disulfide bridges. All of these proteins that have been functionally characterized appear to be involved in pro-inflammatory and / or restorative functions.

fF

V klinických situacích je při použiti chemoterapie o vysokých dávkách biomolekulou volby G-CSF. Obecně se při takové léčbě u pacientů zahajuje podáním nízké dávky chemoterapeutického prostředku, jako je cyklofosfamid. Během remise se pacient léčí pomoci některého CSF (faktor stimulující tvorbu kolonií), jako je G-CSF, který způsobuje připadnou mobilizaci buněk z kostní dřeně do periferní cirkulace pro získání leukoforezované krve. Pacientovi se potom podá vysoká dávka chemoterapie pro vyvolání klinické remise jejich karcinomu. Výsledné selhání funkce kostní dřeně se léčí infuzí dříve, odebraných a uložených krvinek. Tento postup se . může modifikovat, například vynecháním zahajovací dávky chemoterapie a/nebo léčebnými programy se'střídavými odběry krve.In clinical situations, high-dose chemotherapy is the biomolecule of choice for G-CSF. Generally, such treatment is initiated in patients by administering a low dose chemotherapeutic agent such as cyclophosphamide. During remission, the patient is treated with a CSF (colony stimulating factor), such as G-CSF, which eventually causes cell mobilization from the bone marrow to peripheral circulation to obtain leukophoresis blood. The patient is then given a high dose of chemotherapy to induce clinical remission of their cancer. The resulting bone marrow failure is treated with an infusion of previously collected and stored blood cells. This procedure does. may modify, for example, by omitting an initial dose of chemotherapy and / or treatment programs with alternate blood donations.

I když vypadají tato použití transplantačních techniky krvetvorných kmenových buněk slibně, požadují se několikanásobné postupy aferézy pro obdržení dostatečného množství kmenových'buněk“¹ projejiclfúspěšné naroubovaní pro**¹léčbu závažného útlumu kostní dřené při použití samotného G-CSF [viz například Bensinger a kol., Blood, 81, 3158 (1993) a R. Haas a kol., Sem. in Oncology, 21, 19 (1994)]. Proto přes tyto významné pokroky a dostupnost určitých regulačních biomolekul zůstává opožděná obnova krvetvorby závažnou příčinou morbidity a mortality pacientů s útlumem kostní dřeně.Although these appear to use techniques transplantation of hematopoietic stem cells promising, are required, multiple apheresis procedures for obtaining sufficient quantities kmenových'buněk ^"1 ** projejiclfúspěšné grafting for ^one treatment of severe myelosuppression when using the G-CSF alone [see, e.g., Bensinger et al. Blood, 81, 3158 (1993) and R. Haas et al., Sem. in Oncology, 21, 19 (1994)]. Therefore, despite these significant advances and the availability of certain regulatory biomolecules, delayed hematopoietic recovery remains a major cause of morbidity and mortality in patients with bone marrow depression.

V oboru je neustálá potřeba prostředků a způsobů pro zlepšeni obnovy krvetvorby, zejména v případech chemoterapie spojené s útlumem kostní dřené.There is a constant need in the art for means and methods for improving hematopoietic recovery, particularly in cases of chemotherapy associated with bone marrow depression.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Tento vynález ve svém jednom aspektu poskytuje použití některého chemokinu při přípravě léku pro stimulaci krvetvorných kmenových buněk. Tento chemokin zahrnuje proteiny odvozené od KC (killer cells - zabíječské buňky), grofi, groa a groi včetně zralých, modifikovaných a multimerních forem těchto chemokinů.In one aspect, the invention provides the use of a chemokine in the preparation of a medicament for stimulating hematopoietic stem cells. This chemokine includes proteins derived from KC (killer cells), grofi, groa and groi including the mature, modified and multimeric forms of these chemokines.

Ve svém dalším aspektru tento vynález poskytuje způsob mobilizace krvetvorných kmenových buněk u živočicha, zahrnující podáváni tomuto živočichovi účinného množství některého zralého nebo modifikovaného či multimerniho chemokinu, jak se zde popisuje.In another aspect, the invention provides a method of mobilizing hematopoietic stem cells in an animal, comprising administering to the animal an effective amount of a mature or modified or multimeric chemokine as described herein.

Další aspekty a výhody tohoto vynálezu se popisují dále v následujícím podrobném popisu preferovaných ztělesnění tohoto vynálezu.Other aspects and advantages of the invention are described below in the following detailed description of preferred embodiments of the invention.

A AA A

Popis obrázků na výkresechDescription of the drawings

Obr. 1 je graf ukazující účinek ρτοβ [aminokyselin 1 až 73. se SEQ ID č. (dále identifikační číslo sekvence) 3] při testu mobilizace s jedním prostředkem z příkladu 1.Giant. 1 is a graph showing the effect of βτβ [amino acids 1 to 73. of SEQ ID NO.

ώf . ' Obr. 2 je graf ukazující účinek modifikovaného ςττοβ (aminokyseliny 5 až 73 identifikačního čísla sekvence 3) při testu mobilizace jedním prostředkem z příkladu 1.ώf. ' Giant. 2 is a graph showing the effect of modified βττβ (amino acids 5 to 73 of SEQ ID NO: 3) in the single-agent mobilization assay of Example 1.

Obr. 3 je sloupcový graf ukazující srovnání fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS), interleukinu 8 (IL-8), grofi (aminokyseliny 1 až 73 identifikačního čísla sekvence 3) a modifikovaného gro$ (aminokyseliny 5 až 73 identifikačního čísla sekvence 3) při těstu mobilizace jedni τη prostředkem.Giant. 3 is a bar graph showing a comparison of phosphate buffered saline (PBS), interleukin 8 (IL-8), grofi (amino acids 1 to 73 of SEQ ID NO: 3) and modified gro $ (amino acids 5 to 73 of SEQ ID NO: 3) at mobilization dough one of the means.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.The following is a detailed description of the invention.

Tento vynález poskytuje modifikované proteiny, zejména chemokiny spojené se zánětlivými odpověďmi, krvetvorbou a tvorbou kostní dřeně, přičemž tyto modifikované proteiny jsou charakterizované zvýšenou biologickou aktivitou ve srovnání s odpovídajícími nemodifikovanými nebo neodřižnutými zralými proteiny. Tento vynález poskytuje způsoby pro léčbu útlumu kostní dřeně mobilizací krvetvorných kmenových buněk z kostní dřeně do periferní krve s použitím zralých nebo modifikovaných či multimerních chemokinů, které se zde popisují.The present invention provides modified proteins, particularly chemokines associated with inflammatory responses, hematopoiesis and bone marrow formation, wherein the modified proteins are characterized by increased biological activity as compared to corresponding unmodified or uncut mature proteins. The present invention provides methods for treating bone marrow depression by mobilizing hematopoietic stem cells from bone marrow into peripheral blood using the mature or modified or multimeric chemokines described herein.

I. DefiniceI. Definitions

Krvetvorný synergní faktor neboli HSF se podle této definice vztahuje k třídě proteinů zahrnující přirozené še* vyskytuj ici^1- chemokinyamodifikováné*chemokiny, které”jsou charakterizované tím, že mají synergní aktivitu při stimulaci krvetvorby při podání in vivo a in vitro s jiným krvetvorným faktorem, jako je faktor stimulující tvorbu kolonií (CSF) nebo v kombinaci s přirozeně cirkulujícími faktory CSF.Hematopoietic synergistic factor, or HSF, by definition, refers to a class of proteins comprising naturally occurring ^1- chemokinyamodified * chemokines that are characterized by having synergistic activity in stimulating hematopoiesis when administered in vivo and in vitro with another hematopoietic factor, such as colony stimulating factor (CSF) or in combination with naturally circulating CSF factors.

Termín zralé chemokiny, též známý jako interkriny, se zde používá pro definici proteinů, které se v oboru konvenčně uvádějí jako KC, groa, grop a groT. Sekvence aminokyselin myšího proteinového KC, který obsahuje 72 zbytků, se vhodným způsobem udává pod identifikačním číslem sekvence 1. Tyto sekvence lze obdržet od instituce Genbank pod přírůstkovým číslem J04596. Sekvence humánního proteinového groa (aminokyseliny 1-73) se uvádějí pod identifikačním číslem.sekvence 2. Sekvence humánního proteinového grop (aminokyseliny 1-73) se uvádějí pod identifikačním číslem sekvence 3. Sekvence humánního proteinového gro-r se uvádějí pod identifikačním číslem sekvence 4. Sekvence cDNA a aminokyselin pro groi se též udávají v mezinárodní patentové přihlášce, publikace č. WO 92/00326 (9. ledna 1992). Tyto sekvence groT jsou dále zveřejněné v Mezinárodní patentové přihlášce, publikace č.WO 94/29341 (22. prosince 1994), která se zde uvádí formou odkazu.The term mature chemokines, also known as intercrins, is used herein to define proteins conventionally referred to in the art as KC, groa, grop, and groT. The amino acid sequence of the mouse protein KC, which contains 72 residues, is suitably indicated under SEQ ID NO: 1. These sequences can be obtained from Genbank under accession number J04596. The sequences of the human protein groa (amino acids 1-73) are given under SEQ ID NO. 2. The sequences of the human protein grop (amino acids 1-73) are given under the sequence identification number 3. The sequences of the human protein groa are given under the sequence identification number 4. The cDNA and amino acid sequences for groi are also disclosed in International Patent Application Publication No. WO 92/00326 (Jan. 9, 1992). These groT sequences are further disclosed in International Patent Application Publication No. WO 94/29341 (December 22, 1994), which is incorporated herein by reference.

Termín modifikované chemokiny se definuje stejně jako ve výše citované mezinárodní přihlášce. Modifikované chemokiny se odvozují od KC, grop, groa a groT, přednostně od grop, gro a a gřoi a nej výhodně ji od grop. Modifikované chemokiny zahrnují deamino-proteiny charakterizované eliminací od zhruba 2 do zhruba 8 aminokyselin od aminového (N—) konce řetězce zralého proteinu. Tyto deamino-chemokinyThe term modified chemokines is defined as in the above-cited international application. The modified chemokines are derived from KC, grop, groa and groT, preferably from grop, gro a, and groi, and most preferably from grop. Modified chemokines include deamino-proteins characterized by elimination of from about 2 to about 8 amino acids from the amino (N -) end of the mature protein chain. These deamino-chemokines

použitelné při způsobu podle tohoto vynálezu jsou výhodně charakterizovány odstraněním od zhruba 2 do zhruba 8 'áminókysél in“ z * ámxňověříó*kónčě“ ře‘tězčě^wzřáléhó'’ proteinu / *-'“'··¹Nejvhodnější modifikované chemokiny jsou charakterizovány odstraněním prvních čtyř aminokyselin od tohoto aminového konce řetězce. Případně mohou deamino-chemokiny použitelné v rámci tohoto vynálezu obsahovat vložený N-terminální , methionin, zejména v případě rekombinantní exprese.useful in the method of this invention are preferably characterized by removal of about 2 to about 8 'Amino acids in "* z * ámxňověříó ends' ^w ře'tězčě mature 'protein / * -"' ¹ ·· best modified chemokines are characterized by removal of the first four amino acids from this amino terminus of the chain. Alternatively, the deamino-chemokines useful in the present invention may comprise an inserted N-terminal, methionine, especially in the case of recombinant expression.

N-terminální methionin, který se vkládá do proteinu za účelem exprese, může být štěpen bud během zpracování proteinu hostitelskou buňkou nebo synteticky s použitím známých způsobů. Alternativně může být v případě požadavku tato aminokyselina štěpena enzymatickou reakcí nebo jinými známými prostředky.The N-terminal methionine that is inserted into the protein for expression can be cleaved either during processing of the protein by the host cell or synthetically using known methods. Alternatively, if desired, the amino acid may be cleaved by enzymatic reaction or other known means.

Pod pojem modifikovaný chemokin se zahrnují též analogy či deriváty těchto proteinů, které sdílejí biologickou aktivitu zralého proteinu. Takové analogy a deriváty, jak se zde definuji, zahrnují modifikované proteiny, které jsou též charakterizovány změnami známé sekvence aminokyselin v proteinech, například v proteinech uvedených pod identifikační-* mi čísly sekvence 1 až 4. Tyto analogy jsou Charakteristické tím, že mají sekvenci aminokyselin, která se liší od sekvence ve zralém proteinu o 8 nebo méně aminokyselinových zbytků, přednostně o zhruba 5 nebo méně zbytků. Může se dávat přednost tomu, aby jakékoliv rozdíly v sekvencích aminokyselin proteinů zahrnovaly pouze konzervativní substituce aminokyselin. Konzervativní substituce aminokyselin nastávají tehdy, když má některá aminokyselina v podstatě stejný náboj jako aminokyselina, kterou nahrazuje, a daná substituce nemá žádný významný vliv na místní konformaci proteinu nebo na jeho biologickou aktivitu. Alternativně se mohou preferovat změny, jako je uvedení určité aminokyselinyModified chemokine also includes analogs or derivatives of these proteins that share the biological activity of the mature protein. Such analogs and derivatives, as defined herein, include modified proteins which are also characterized by changes in the known amino acid sequence of the proteins, for example, the proteins listed under SEQ ID NOs 1 to 4. These analogs are characterized by having an amino acid sequence which differs from the sequence in the mature protein by 8 or less amino acid residues, preferably by about 5 or less residues. It may be preferred that any differences in amino acid sequences of proteins include only conservative amino acid substitutions. Conservative amino acid substitutions occur when an amino acid has substantially the same charge as the amino acid it replaces, and that substitution has no significant effect on the local conformation of the protein or on its biological activity. Alternatively, changes such as the introduction of a particular amino acid may be preferred

•· •· «· *• · · ·

do sekvence, která může pozměnit stabilitu proteinu nebo umožnit jeho expresi v žádané hostitelské buňce. Další charakteristikou Vécrito' modiíikovaných'¹ proteinů může být zvýšená biologická účinnost ve srovnání se zralým proteinem.into a sequence that can alter the stability of the protein or allow its expression in a desired host cell. Another characteristic of many 'modified' ¹ proteins may be the increased biological activity compared to the mature protein.

Pojem multimerní protein neboli multimer zde znamená multimerní formy zralých a/nebo modifikovaných proteinů použitelných v tomto vynálezu, například dimery, trimery, tetramery a ostatní agregované formy. Takové multimerní formy se mohou připravit syntézou nebo rekombinantní expresí a mohou obsahovat chemokiny získávané kombinací syntetických a rekombinantních způsobů, jak se popisuje podrobněji níže. Multimery se mohou vytvářet přirozené při expresi nebo se mohou tvořit do těchto násobných forem. Multimerní chemokiny mohou zahrnovat multimery stejného modifikovaného chemokinu. Jiný multimer se může vytvářet, agregací různých modifikovaných proteinů. Ještě jiný multimer se vytváří agregací modifikovaného chemokinu podle tohoto vynálezu a známého zralého chemokinu. Přednostně by měl dimer nebo multimer použitelný v tomto vynálezu obsahovat nejméně jeden deamino-chemokinový protein a nejméně jeden další chemokin nebo další protein charakterizovaný tím, že vykazuje stejný typ biologické aktivity. Tento další protein může být přídavným deamino-chemokinem nebo jiným známým proteinem.The term multimeric protein or multimer here means multimeric forms of mature and / or modified proteins useful in the present invention, for example dimers, trimers, tetramers and other aggregated forms. Such multimeric forms may be prepared by synthesis or recombinant expression and may contain chemokines obtained by a combination of synthetic and recombinant methods, as described in more detail below. Multimers may be naturally expressed or may be formed into these multiple forms. Multimeric chemokines may include multimers of the same modified chemokine. Another multimer can be formed by aggregating various modified proteins. Yet another multimer is formed by aggregating a modified chemokine of the invention and a known mature chemokine. Preferably, the dimer or multimer useful in the present invention should comprise at least one deamino-chemokine protein and at least one other chemokine or other protein characterized by having the same type of biological activity. This additional protein may be an additional deamino-chemokine or other known protein.

II. Proteiny použitelné v tomto vynálezuII. Proteins useful in the present invention

Obecně zahrnují chemokiny použitelné při způsobu podle tohoto vynálezů zralé chemokiny nebo modifikované a multimerní proteiny odvozené od těchto chemokinů, které se podrobně popisují v mezinárodní patentové přihlášce, publikace č. WO 94/29341.. Je žádoucí volba těchto chemokinůIn general, chemokines useful in the method of the present invention include mature chemokines or modified and multimeric proteins derived from these chemokines, which are described in detail in International Patent Application Publication No. WO 94/29341. It is desirable to select such chemokines.

ze skupiny KC, groa, grofi a groi a nej vhodnějším chemokinem je grop.from the group KC, groa, grofi and groi and the most suitable chemokine is grop.

·ιιιιίιιΐι>.ιιι*ιιιιΐ!!·ιιΐι·ΐΜΐ·Ίιιιι I<* mu, n*1 >'i*n ι·ι ·|ΐιιί ***.. , - - — -A— **' ·ι- rΙ>>. Ϊ́ ΐ ΐ ΐ ΐ ΐ <<<<<<<<<<<<<*** *** *** *** *** *** .. .. .. .. .. ι- r

V jednom preferovaném ztělesnění využívá způsob podle tohoto vynálezu deamino-chemokinový protein podle tohoto vynálezu. Tento protein obsahuje sekvenci aminokyselin zralého chemokinu použitelného při tomto vynálezu odříznutou u svého konce řetězce nesoucího aminoskupinu mezi polohami aminokyselin 2 a 8 v sekvencích uvedených pod identifikačním číslem 1 až 4. Přednostně má deamino-protein podle tohoto vynálezu aminokyseliny rozmezí proteinové sekvence 5 až 73 v rámci identifikačních čísel sekvence 2 až 4 nebo aminokyseliny 5 až 72 v rámci identifikačního čísla sekvence 1. Nejvhodnějšim způsobem podle, vynálezu je deamino-grc^, který má aminokyseliny rozmezí sekvence aminokyselin proteinu 5 až 73 podle identifikačního čísla sekvence 3. Tento deamino-grrop je charakteristický tím, že má nejméně o zhruba dva řády vyšší 'biologickou účinnost než nemodifikovaný lidský grofi, jak bylo stanoveno v testu HSF v pracích citovaných výše.In one preferred embodiment, the method of the invention utilizes the deamino-chemokine protein of the invention. The protein comprises the amino acid sequence of a mature chemokine useful in the invention cut off at its amino-terminated chain between amino acid positions 2 and 8 in the sequences listed under ID numbers 1-4. Preferably, the amino acid protein of the invention has an amino acid range of 5 to 73 in The most preferred method of the invention is deamino-grc, having amino acid sequences within the amino acid sequence of protein 5 to 73 of SEQ ID NO: 3. This deamino-grrop is characterized by having at least about two orders of magnitude greater biological activity than unmodified human grofi, as determined by the HSF assay in the works cited above.

Jak se popisuje ve W094/29341, lze. podobným způsobem modifikovat proteiny KC, grroa a groi, které jsou použitelné při způsobech podle tohoto vynálezu. Tyto proteiny se všechny popisují v literatuře a jsou známé tomu, kdo má zkušenost v oboru.As described in WO94 / 29341, one can. in a similar manner to modify the KC, grroa, and groi proteins that are useful in the methods of the invention. These proteins are all described in the literature and are known to the person skilled in the art.

Preferované multimemí proteiny použitelné v tomto vynálezu zahrnuji dimery nebo multimery obsahující nejméně jeden deamino-chemokinový protein a nejméně jeden další chemokin nebo jiný protein charakterizovaný stejným typem biologické aktivity. Tento další protein může být dalším deamino-chemokinem nebo jiným známým proteinem. Například • ·Preferred multimeric proteins useful in the present invention include dimers or multimers comprising at least one deamino-chemokine protein and at least one other chemokine or other protein characterized by the same type of biological activity. This additional protein may be another deamino-chemokine or other known protein. For example, •

žádaný dimer použitelný v těchto způsobech podle tohoto vynálezu zahrnuje dva deamino-proteiny, jak se popisuje výše, přednostně navzájem spojené disulfidovými vazbami/žádaný ' multimer může být též agregátem dvou nebo více deamino-grop proteinů, zejména dvou proteinů skládajících se z aminokyselin 5-73 identifikačního čísla sekvence 3. Alternativně může být další dimer podle tohoto vynálezu deamino-grop protein podle tohoto vynálezu v kombinaci se zralým grofi proteinem. Podobně mohou různé kombinace dimerů nebo jiných multimerních forem zahrnovat kombinaci zralého nebo modifikovaného grop a jiných chemokinů, jako jsou proteiny KC, groa. a groi. Například deamino-grop protein podle tohoto vynálezu může vytvářet dimer s nemodifikovaným zralým proteinem groa. Ten, kdo má zkušenost v oboru, může obdržet další žádané multimery s použitím modifikovaných chemokinů podle tohoto vynálezu. Avšak použití multimerních forem dvou či více různých modifikovaných proteinů, jak se zde definují, je použitelné při způsobu podle tohoto vynálezu. Chemokin použitý v tomto způsobu může být též multimerní formou některého modifikovaného chemokinů, jak se diskutuje výše a dalšího známého zralého proteinu.the desired dimer useful in the methods of the invention comprises two deamino-proteins as described above, preferably interconnected by disulfide bonds / the desired multimer may also be an aggregate of two or more deamino-grop proteins, in particular two proteins consisting of amino acids 5- Alternatively, another dimer of the invention may be a deamino-grop protein of the invention in combination with a mature grofi protein. Similarly, various combinations of dimers or other multimeric forms may include a combination of mature or modified grops and other chemokines such as the KC, groa proteins. and groi. For example, the deamino-grop protein of the invention may form a dimer with an unmodified mature groa protein. One of ordinary skill in the art may receive other desired multimers using the modified chemokines of the invention. However, the use of multimeric forms of two or more different modified proteins as defined herein is useful in the method of the invention. The chemokine used in this method may also be a multimeric form of any modified chemokine as discussed above and another known mature protein.

Tyto proteiny a monomery se podrobné popisují v literatuře a'mohou se syntetizovat nebo vytvářet rekombinantně s použitím konvenčních způsobů a/nebo způsobů popsaných v mezinárodním patentu, publikace č. WO 94/29341.These proteins and monomers are described in detail in the literature and can be synthesized or produced recombinantly using conventional methods and / or methods described in International Patent Publication No. WO 94/29341.

III. Farmaceutické prostředkyIII. Pharmaceutical preparations

Je žádoucí, aby chemokiny použitelné při způsobu podle tohoto vynálezu byly užity při přípravě léků a/nebo aby byly použitelné ve formě farmaceutického prostředku. Chemokiny mohou být proto formulovány do farmaceutických prostředků « 4 • 4 4 · · · φφ φ ♦· 4 44 a podávány stejným způsobem, který se popisuje například v mezinárodních patentových přihláškách, publikace č. WO 9Ó/Ó2762^W(2'2?“Í3řezna7*í99ŮJ^^publík^cZc? WO 94/29341 ’(22 prosince 1994).It is desirable that the chemokines useful in the method of the invention be used in the preparation of medicaments and / or be in the form of a pharmaceutical composition. Chemokines may therefore be formulated into pharmaceutical compositions and administered in the same manner as described, for example, in International Patent Applications, Publication No. WO 9O / 762762 ^W (2'2? '). WO 94/29341 '(Dec. 22, 1994).

Tyto léky nebo farmaceutické prostředky použitelné při mobilizaci krvetvorných kmenových buněk obsahují terapeuticky účinné množství zralého, modifikovaného nebo multi^ merního chemokinu, jak se zde definuje, a přijatelný farmaceutický nosič. Pojem farmaceutický, jak se zde používá, zahrnuje veterinární aplikace podle tohoto vynálezu.The medicaments or pharmaceutical compositions useful in the hematopoietic stem cell mobilization comprise a therapeutically effective amount of a mature, modified or multimeric chemokine as defined herein and an acceptable pharmaceutical carrier. The term pharmaceutical as used herein includes veterinary applications of the invention.

Pojem terapeuticky účinné'množství” se týká takového množství chemokinu, ať v monomerní či multimerní formě, které je použitelné, pro mobilizaci kmenových buněk v dostatečné míře pro dosaženi požadovaného fyziologického účinku.The term "therapeutically effective amount" refers to an amount of chemokine, whether in monomeric or multimeric form, that is useful for mobilizing the stem cells to a sufficient degree to achieve the desired physiological effect.

Obecné se zralý chemokin, modifikovaný chemokin nebo deamino-chemokin použitelný v tomto vynálezu (například iGenerally, a mature chemokine, a modified chemokine, or a deamino-chemokine useful in the present invention (e.g.

grrop) podává v množství od zhruba 0,01 ňg/kg tělesné hmotnosti do zhruba 1 g/kg tělesné hmotnosti, přednostně od zhruba 0,01 ng/kg tělesné hmotnosti do 10 mg/kg tělesné hmotnosti na dávku. Je žádoucí, aby při .použití multimerniho chemokinu při způsobu podle tohoto vynálezu lék nebo prostředek obsahoval množství multimerniho proteinu blízké spodní hranici tohoto rozmezí. Přednostně se tyto farmaceutické prostředky podávají člověku nebo jinému savci injekčně.grrop) administered in an amount of from about 0.01 µg / kg body weight to about 1 g / kg body weight, preferably from about 0.01 ng / kg body weight to 10 mg / kg body weight per dose. Desirably, when using a multimeric chemokine in the method of the invention, the medicament or composition comprises an amount of the multimeric protein near the lower end of this range. Preferably, the pharmaceutical compositions are administered by injection to a human or other mammal.

Avšak podávání se může provést jakoukoliv vhodnou vnitřní cestou a může se opakovat podle potřeby, například jednou až třikrát denně po dobu od jednoho dné až do zhruba jednoho týdne.However, administration may be by any suitable intrinsic route and may be repeated as necessary, for example, one to three times daily for from one day to about one week.

vhodné farmaceutické nosiče jsou dobře známy tomu, « φ · φ φ · φ * ·♦· ♦ · φ φ · φφφ φφφ φφφ φφφ φφφφSuitable pharmaceutical carriers are well known in the art of «· φ · * · ♦ · ♦ · φ φ · φφφφφφφφφφφ φφφφφ

- 10 kdo má zkušenost v oboru, a jejich volba je snadná. V současné době je preferovaným nosičem fyziologický roztok. Pří’padně*mohou*f ármacéúťické*présťřědky^Lpodlé* tohoto“ vynálezu obsahovat též další účinné složky nebo se mohou podávat spolu s jinými terapeutickými prostředky. Vhodné případné složky nebo další terapeutické prostředky zahrnují ty látky, které jsou běžné pro léčbu stavů této.povahy, například mezi jinými ostatní protizánětlivé, diuretické a imunosupresivní prostředky. Je žádoucí, aby se tyto chemokiny zvláště dobře hodily pro podávání ve spojení s faktorem stimulujícím tvorbu kolonii.- 10 who have experience in the field, and their choice is easy. Currently, the preferred carrier is saline. Pří'padně * f * may ármacéúťické présťřědky * ^L * according to the present 'invention can also comprise further active ingredients or may be administered together with other therapeutic agents. Suitable optional ingredients or other therapeutic agents include those which are conventional in the treatment of conditions of this nature, for example, other anti-inflammatory, diuretic and immunosuppressive agents, among others. It is desirable that these chemokines are particularly well suited for administration in conjunction with a colony stimulating factor.

IV. Způsoby mobilizace krvetvorných kmenových buněkIV. Methods of mobilizing hematopoietic stem cells

Tento vynález poskytuje zlepšené způsoby léčby stavů charakterizovaných imunosupresí nebo nízkými počty krvetvorných kmenových buněk .a buněk od nich diferencovaných včetně, avšak bez omezení na tyto případy, zánětu, horečky, virové, mykotické a bakteriální infekce, rakoviny, myelopoetické dysfunkce, poruch krvetvorby, aplastické anémie a autoimunitních onemocněni a stavů charakterizovaných nízkou tvorbou a/nebo diferenciaci krvetvorných buněk a/nebo buněk kostní dřeně. Tento způsob zahrnuje podávání farmaceutického prostředku podle tohoto vynálezu zvolenému savci. Přednostně se tento prostředek podává spolu s faktorem stimulujícím tvorbu kolonii anebo obsahuje tento faktor. Vhodné zdroje faktoru stimulujícího tvorbu kolonií jsou dobře známy a zahrnuji například přírodní, syntetické a rekombinantní GM-CSF, M-CSF, G-CSF a IL-3. V dalším preferovaném ztělesnění je možno podávat in vivo některý deamino-chemokin použitelný při tomto vynálezu a umožnit jeho působení synergním způsobem s faktory stimulujícími tvorbu kolonii přítomnými v těle vybraného pacienta.The present invention provides improved methods of treating conditions characterized by immunosuppression or low numbers of hematopoietic stem cells and cells differentiated therefrom including, but not limited to, inflammation, fever, viral, fungal and bacterial infections, cancer, myelopoietic dysfunction, hematopoietic disorders, aplastic anemia and autoimmune diseases and conditions characterized by low production and / or differentiation of hematopoietic cells and / or bone marrow cells. The method comprises administering the pharmaceutical composition of the invention to a selected mammal. Preferably, the composition is administered with or contains a colony stimulating factor. Suitable sources of the colony stimulating factor are well known and include, for example, natural, synthetic and recombinant GM-CSF, M-CSF, G-CSF, and IL-3. In another preferred embodiment, one may administer in vivo any deamino-chemokine useful in the invention and allow it to act in a synergistic manner with colony stimulating factors present in the body of the selected patient.

v jednom preferovaném ztělesnění využívá způsob podle tohoto vynálezu deamino-chemokiny, které se zde popisuji, 7 spolu, s GM-CSF (nebo G-CSF). Použití některého modifikovaného chemokinu, jako je deamino-grop, v souladu se způsobem podle tohoto vynálezu v kombinaci s CSF (bylo pozorováno, že tato kombinace vykazuje synergrii účinek) umožňuje podávání nižších dávek CSF pacientovi, čímž snižuje mimořádně nepříznivé vedlejší účinky způsobené GM-CSF (G-CSF).in one preferred embodiment, the method of the invention uses the deamino-chemokines described herein 7 together with GM-CSF (or G-CSF). The use of a modified chemokine, such as a deamino-grop, in accordance with the method of the invention in combination with CSF (it has been observed that the combination exhibits a synergy effect) allows lower doses of CSF to be administered to the patient thereby reducing the extremely adverse GM-CSF side effects (G-CSF).

Zralé chemokiny a modifikované či multimerní chemoki- ny použitelné ve způsobu podle tohoto vynálezu lze charakterizovat schopností mobilizovat krvetvorné kmenové buňky při jejich samotném podávání nebo tím, že vykazují synergní aktivitu při stimulaci krvetvorby při použití in vivo a in vitro s jiným krvetvorným faktorem, jako je faktor stimulující tvorbu kolonií nebo růstový faktor nebo v kombinaci s přirozeně cirkulujícími, faktory stimulujícími tvorbu kolonii nebo při podáváni v léčebném programu v rámci chemoterapie.Mature chemokines and modified or multimeric chemokines useful in the method of the invention may be characterized by the ability to mobilize hematopoietic stem cells when administered alone or by exhibiting synergistic activity in stimulating hematopoiesis using in vivo and in vitro with another hematopoietic factor such as colony stimulating factor or growth factor, or in combination with naturally circulating, colony stimulating factors, or when administered in a chemotherapy treatment program.

Ve svém jednom ztělesnění tento vynález poskytuje způsob mobilizace krvetvorných kmenových buněk u živočicha podáváním tomuto živočichovi účinného množství prostředku nebo léku obsahujícího některý zralý chemokin zvolený ze skupiny zahrnující lidský grop (identifikační číslo sekvence 3), lidský groa (identifikační číslo sekvence 2), lidský groT (identifikační číslo sekvence 4) a myší KC (identifikační číslo sekvence 1).In one embodiment, the invention provides a method of mobilizing hematopoietic stem cells in an animal by administering to the animal an effective amount of a composition or medicament comprising any mature chemokine selected from the group consisting of human grop (SEQ ID NO: 3), human groa (SEQ ID NO: 2), human groT. (SEQ ID NO: 4) and mouse KC (SEQ ID NO: 1).

v dalším ztělesnění tohoto vynálezu zahrnuje jeden způsob mobilizace krvetvorných kmenových buněk u živočicha podáváni tomuto živočichovi účinného množství modifikovanéhoin another embodiment of the invention, one method of mobilizing hematopoietic stem cells in an animal is administering to the animal an effective amount of a modified

• v • · • v • · t t • · • · 99 99 • * • * • • • ··· · • ··· · • • • · • · • • • · • · • • • • 99 99 1« 1 «

• ♦ · • · ♦ ♦ • ♦ · ·· ·• ♦ · · ♦ ♦

- 12 proteinu odvozeného od některého chemokinu zvoleného ze skupiny ςττοβ, groa, groi a KC. Jako preferované ztělesnění se zde poskytuje způsob mobilizace krvetvorných kmenových buněk u živočicha podáváním tomuto živočichovi účinného množství modifikovaného proteinu odvozeného od chemokinu lidského grog (identifikační číslo sekvence 3).- 12 a protein derived from a chemokine selected from the group of ςττοβ, groa, groi and KC. As a preferred embodiment, there is provided a method of mobilizing hematopoietic stem cells in an animal by administering to the animal an effective amount of a modified human grog derived chemokine protein (SEQ ID NO: 3).

Ještě v dalším aspektu tento vynález poskytuje způsob mobilizace krvetvorných kmenových buněk u živočicha zahrnující podávání tomuto živočichovi účinného množství některého multimerního proteinu, který zahrnuje nejméně jeden z chemokinů popsaných výše ve spojení s některým druhým chemokinem.In yet another aspect, the invention provides a method of mobilizing hematopoietic stem cells in an animal comprising administering to the animal an effective amount of a multimeric protein comprising at least one of the chemokines described above in conjunction with a second chemokine.

V praxi způsobu mobilizace krvetvorných kmenových buněk lze pojem účinné množství těchto proteinů definovat jako takové množství,· které při podání pacientovi vhodnými způsoby mobilizuje.krvetvorné kmenové buňky a zvyšuje počet krvetvorných kmenových buněk v periferní krvi. Očekává se, že toto množství je vyšší než množství požadované pro stimulaci růstu nebo vývoje krvetvorných progenitorových buněk. Toto účinné množství zvyšuje počet buněk v krevním obéhu, které jsou diferenciované od krvetvorných kmenových buněk v použitelných klinických či veterinárních situacích. Žádané účinné množství může být zhruba od 0,01 ng/kg do 10 mg/kg tělesné hmotnosti na dávku.In the practice of the hematopoietic stem cell mobilization method, the term effective amount of these proteins can be defined as an amount that, when administered to a patient, mobilizes hematopoietic stem cells and increases the number of hematopoietic stem cells in peripheral blood. This amount is expected to be higher than the amount required to stimulate the growth or development of hematopoietic progenitor cells. This effective amount increases the number of cells in the bloodstream that are differentiated from hematopoietic stem cells in useful clinical or veterinary situations. The effective amount required may be from about 0.01 ng / kg to 10 mg / kg body weight per dose.

Vhodné způsoby podávání pro mobilizaci kmenových buněk zahrnuji, avšak bez omezení pouze na tyto způsoby, injekci bolusu nebo přírůstkové podávání účinného množství injekce, intravenózní kapací infúzi nebo další vhodnou vnitřní cestu podávání. Dávkování se může podle potřeby opakovat, například jednou až třikrát denně po dobu od jednoho • · · » * · * « ···· · • · · ·· · · · • ♦ · * · »Suitable modes of administration for stem cell mobilization include, but are not limited to, bolus injection or incremental administration of an effective amount of injection, intravenous drip infusion, or other suitable internal route of administration. The dosage may be repeated as necessary, for example, one to three times daily for one to one day.

- 13 dne do zhruba jednoho týdne.- 13 days to about one week.

Navíc se může způsob podle tohoto vynálezu používající zralé chemokiny nebo modifikované či multimerni chemokiny definované výše použít v léčebných schématech transplantace krvetvorných kmenových buněk periferní krve. Například po případně použité zahajovací dávce chemoterapeutického prostředku se výše identifikované zralé chemokiny nebo modifikované či multimerni chemokiny podávají místo faktorů stimulujících tvorbu kolonií, které se nyní používají pro mobilizaci krvetvorných kmenových buněk z kostní dřeně do periferní cirkulace pro jejich získávání stejně tak jako pro zpětné podání po vysokých dávkách chemoterapie. Vhodné chemoterapeutické prostředky zahrnuji, bez omezení na vyjmenované látky, dobře známé sloučeniny, jako je cyklofosfamid, cis-platina, ARA-C, 5-fluoruracil, etopsid, epirubicin, karboplatin, busulfan, mitoxantron a karmustin. Při podávání s chemokiny. podle, tohoto vynálezu jsou množství chemoterapeutik taková, jaká se používají konvenčně, to jest okolo 1,2 g/m² etopsidu, 800 pig/m² ARA-C, ‘200 mg/kg cyklofosfamidu, a tak dále. Ohledně těchto dávkování viz práci autorů Hass a kol., Seminars^lin Oncol., 21, 19-24 (1994),. která se zde uvádí formou odkazu.In addition, the method of the invention using mature chemokines or the modified or multimeric chemokines defined above may be used in peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation treatment schedules. For example, after the optionally used initial dose of the chemotherapeutic agent, the mature chemokines identified above, or modified or multimeric chemokines, are administered instead of colony stimulating factors that are now used to mobilize hematopoietic stem cells from the bone marrow into peripheral circulation to recover them as well as high doses of chemotherapy. Suitable chemotherapeutic agents include, but are not limited to, well known compounds such as cyclophosphamide, cisplatin, ARA-C, 5-fluorouracil, etopside, epirubicin, carboplatin, busulfan, mitoxantrone, and carmustine. When administered with chemokines. According to the invention, the amounts of chemotherapeutic agents are those conventionally used, i.e. about 1.2 g / m ^{2 of} etopside, 800 pig / m ^{2 of} ARA-C, 200 mg / kg of cyclophosphamide, and so on. For these dosages, see Hass et al., Seminars ^l in Oncol., 21, 19-24 (1994). which is incorporated herein by reference.

Chemokiny určené výše se mohou užívat pro doplněni konvenčně používaných faktorů stimulujících tvorbu kolonií v léčebných schématech. Alternativně lze použít výše určené chemokiny v kombinovaných léčbách spolu s jinými krvetvornými regulačními biomolekulami, jako jsou molekuly účastnicí se krvetvorby popsané v citacích výše nebo spolu s růstovými faktory, konvenčními léčivými prostředky a/nebo léky sloužícími pro stejné účely. Vhodné zdroje těchto růstových faktorů jsou dobře známé a zahrnují, bez omezení na tytoThe chemokines identified above can be used to supplement the conventionally used colony stimulating factors in treatment regimens. Alternatively, the aforementioned chemokines may be used in combination therapies together with other hematopoietic regulatory biomolecules, such as those involved in hematopoiesis described in the above references or together with growth factors, conventional medicaments and / or drugs serving the same purposes. Suitable sources of these growth factors are well known and include, but are not limited to, these

případy, přírodní, syntetické a rekombinantni GM-CSF, G-CSF, faktor kmenových buněk a ligand flt3. Ostatní vhodné biomolekuly zahrnují (S)-5-oxo-L-prolyl-a-glutamyl-L-a-aspartyl-N⁸-(5-amino-l-karboxypentyl)-8-oxo-N⁷-[N-/N-(5-oxo-L-prolyl)-L-a-glutamyl/-L-a-aspartyl]-L-threo-2,7,8-triaminooktanoyllysin [(pGlu-Glu-Asp)2-Sub-(Lys)₂l [Pelus a kol., Exp. Hematol., 22, .239-247 (1994)]. Ten, kdo má zkušenost v oboru, může snadno zvolit další léčiva a léky pro spolupodávání.cases, natural, synthetic and recombinant GM-CSF, G-CSF, stem cell factor and flt3 ligand. Other suitable biomolecules include (S) -5-oxo-L-prolyl-α-glutamyl-La-aspartyl-N ⁸ - (5-amino-1-carboxypentyl) -8-oxo-N ⁷ - [N- / N- (5-oxo-L-prolyl) -La-glutamyl / -La-aspartyl] -L-threo-2,7,8-triaminoctanoyllysine [(pGlu-Glu-Asp) 2-Sub- (Lys) ₂₁ L [Pelus et al., Exp. Hematol., 22, 2339-247 (1994)]. One skilled in the art can readily select other drugs and co-administration drugs.

Výhodami použití tohoto vynálezu namísto tradičních způsobů transplantace kmenových krvetvorných buněk v periferní krvi nebo ve spojení s těmito způsoby je rychlejší obnova polymorfonukleárních buněk a/nebo destiček ve srovnáni s transplantací kostní dřeně, snížení rizika infekce a umožnění potenciálně vyšších léčebných dávek chemoterapie nebo sérií dávek intensivní chemoterapie.The advantages of using the present invention in place of or in conjunction with traditional methods of stem cell haematopoietic stem cell transplantation are faster recovery of polymorphonuclear cells and / or platelets compared to bone marrow transplantation, reducing the risk of infection and allowing potentially higher treatment doses of chemotherapy or intense dose series. chemotherapy.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Následující příklady slouží pouze pro ilustraci a neomezují předmět tohoto vynálezu.The following examples are illustrative only and do not limit the scope of the invention.

Příklad 1Example 1

Test mobilizaceMobilization test

Chemokiny odvozené of KC (identifikační číslo sekvence 1), grrc3 (identifikační číslo sekvence 3) a groi (identifikační číslo sekvence 4) včetně modifikovaných a multimerních chemokinů se připraví s použitím známých způsobů, viz například WO 94/29341 ohledné další diskuse týkající se přípravy takových chemokinů. Tyto chemokiny se testují ♦ v *Chemokines derived from KC (SEQ ID NO: 1), grrc3 (SEQ ID NO: 3) and groi (SEQ ID NO: 4) including modified and multimeric chemokines are prepared using known methods, see for example WO 94/29341 for further discussion on preparation such chemokines. These chemokines are tested ♦ in *

- 15 ohledně schopnosti mobilizovat krvetvorné kmenové buňky u myší. Každý chemokin se testuje v koncentracích 50, 10 a 2 μ9/πιγΞ a podává se subkutánní, intramuskulární, intraperitoneální, intravenózní nebo perorální cestou. Kinetika chemokinové mobilizace krvetvorných kmenových buněk se monitoruje v 15-minutových intervalech po dobu 60 minut odebíráním vzorků krve myší kardiální punkci. Mobilizované krvetvorné kmenové buňky se frakčionují a sbírají oddělováním na základě gradientu hustoty s použitím Lympholyte-M™. Buňky se promyjí pro další použití.- 15 on the ability to mobilize hematopoietic stem cells in mice. Each chemokine is tested at concentrations of 50, 10 and 2 μ9 / πιγΞ and administered by the subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intravenous or oral route. The kinetics of chemokine mobilization of hematopoietic stem cells are monitored at 15 minute intervals for 60 minutes by collecting blood samples from mice by cardiac puncture. Mobilized hematopoietic stem cells are fractionated and collected by density gradient separation using Lympholyte-M ™. The cells are washed for further use.

.Zralé krevní elementy se spočítají s použitím hematologického analyzátoru Technicon™ H1 s veterinárním programovým vybavením. Mobilizace zralých zánětlivých. buněk, jako jsou polymorfonukleární buňky (PMN), eosinofily a basofily, se bere v úvahu při hodnocení celkového potenciálního zánětlivého profilu..The mature blood elements are counted using a Technicon ™ H1 hematology analyzer with veterinary software. Mobilization of mature inflammatory. cells, such as polymorphonuclear cells (PMN), eosinophils and basophils, are taken into account when assessing the overall potential inflammatory profile.

Pro monitorováni, časných a pozdních krvetvorných progenitorových buněk se provede test CFU-GM, to jest krevní vzorky odebírané během mobilizační fáze se vyhodnotí ohledně jednotek tvořících kolonie (CFU-GM) sedmého a čtrnáctého dne. Buňky se umístí, do McCoyova média bez séra v množství £To monitor early and late hematopoietic progenitor cells, a CFU-GM assay is performed, i.e. blood samples taken during the mobilization phase are evaluated for colony forming units (CFU-GM) on days 7 and 14. The cells are plated in serum-free McCoy's medium

buněk/ml. Použije se jednovrstvový agarový systém obsahující McCoyovo médium obohacené živinami (hydrogenuhličitan sodný, pyruvát, aminokyseliny, vitamíny a pufr HEPES), 0,3 % Bacto agar a 15 I fetální hovězí sérum. K agarovému systému se přidají buňky ze vzorků krve (konečná koncentrace 10⁵ buněk/ml). Agarové desky se inkubují při teplotě 37 °c za přítomnosti 7,5 % oxidu uhličitého po dobu 7 až 14 dnů. Kolonie proliferujících buněk (CFU-GM) se počítají s použitím mikroskopu.cells / ml. A single-layer agar system containing nutrient-enriched McCoy's medium (sodium bicarbonate, pyruvate, amino acids, vitamins and HEPES buffer), 0.3% Bacto agar and 15 L fetal bovine serum is used. To the system were added agar Cells from the blood samples (final concentration of 10 ⁵ cells / ml). The agar plates are incubated at 37 ° C in the presence of 7.5% carbon dioxide for 7-14 days. The proliferating cell colonies (CFU-GM) are counted using a microscope.

• ·Φ · Z · · · *·♦ *9 ··· * « · ·· ·· e 4« · ·*··· Z Z ♦ 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

- 16 Navíc se 14. dne pěstování jednotek tvořících kolonie spočítají časné krvetvorné progenitorové buňky s vysokým proliferačním potenciálem (HPP).In addition, early hematopoietic progenitor cells with high proliferative potential (HPP) are counted on day 14 of the colony forming units.

Chemokin IL-8, který mobilizuje krvetvorné kmenové buňky jako jednotlivý faktor, se v těchto studiích používá jako pozitivní kontrola.The chemokine IL-8, which mobilizes hematopoietic stem cells as a single factor, is used as a positive control in these studies.

Předběžné pokusy ukázaly, že podávání grrop (identifikační číslo sekvence 3) vede k dávkové dependentní mobilizaci CFU-GM podobné výsledkům u kontrolních stanovení. Modifikovaný ςττοβ, protein s odříznutými N-terminálními 4 aminokyselinami (aminokyseliny 5 až 73) od grrop, mobilizoval významné vyšší počty krvetvorných progenitorových buněk než samotný grofi (aminokyseliny 1 až 73) nebo IL-8. Nebyly pozorovány žádné významné změny (větší než 3násobné) u zralých buněčných elementů myší léčených gro$ ukazující na specifickou mobilizaci krvetvorných progenitorových buněk. Tento výsledek dokazuje, že modifikované deamino-chemokiny mohou zvyšovat mobilizačni charakteristiky ve srovnání se' zralými proteiny.Preliminary experiments have shown that administration of grrop (SEQ ID NO: 3) results in dose dependent mobilization of CFU-GM similar to the results of control assays. Modified βττβ, a protein with N-terminal 4 amino acids cut off (amino acids 5 to 73) from grrop, mobilized significantly higher numbers of hematopoietic progenitor cells than grofi alone (amino acids 1 to 73) or IL-8. No significant changes (greater than 3-fold) were observed in mature cell elements of gro $ treated mice indicating specific mobilization of hematopoietic progenitor cells. This result demonstrates that modified deamino-chemokines can enhance mobilization characteristics compared to mature proteins.

Příklad 2Example 2

Test mobilizace v kombinaci s hematostimulantyMobilization test in combination with hematostimulants

Hematostimulanty se používají v kombinaci s chemokiny udanými výše jako mobilizační faktory. Hematostimulanty zahrnuji G-CSF, GM-CSF, (S)-5-oxo-L-prolyl-a-glutamyl-L-α-aspartyl-N⁸- (5-amino-l-karboxypentyl) -8-oxo-N⁷- [ N-/N-(5-oxo-L-prolyl)-L-a-glutamyl/-L-a-aspartyl]-L-threo-2,7,8-triaminooktanoyl-lysin [(pGlu-Glu-Asp)₂-Sub-(Lys) ₂ ] (Pelus, viz citace výše) a ligand. flt-3. Lze použít jakékoliv * ·Hematostimulants are used in combination with the chemokines listed above as mobilizing factors. Hematostimulants include G-CSF, GM-CSF, (S) -5-oxo-L-prolyl-α-glutamyl-L-α-aspartyl-N ⁸ - (5-amino-1-carboxypentyl) -8-oxo-N ^7- [N- / N- (5-oxo-L-prolyl) -La-glutamyl] -La-aspartyl] -L-threo-2,7,8-triaminoctanoyl-lysine [(pGlu-Glu-Asp) ₂ -Sub- (Lys) ₂ ] (Pelus, supra) and ligand. flt-3. Any * can be used ·

- 17 G-cSF-mimetimum, to jest hematostimulant, který není CSF, jako G-CSF nebo GM-CSF, avšak má krvetvornou aktivitu.G-cSF-mimetime, i.e., a non-CSF hematostimulant, such as G-CSF or GM-CSF, but has hematopoietic activity.

Při testu kombinací se podává hematostimulant, například G-CSF, v dávce 50 gg/kg myším čtyři dny před podáním chemokinů nebo modifikovaných či multimerních chemokinů odvozených od KC (identifikační číslo sekvence 1), grop (identifikační číslo sekvence 3) a groi (identifikační číslo sekvence 4). Podobně jako v příkladu 1 se. mění dávka chemokinů a doba odběru krve.In the combination test, a hematostimulant, such as G-CSF, is administered at 50 gg / kg to mice four days prior to administration of KC-derived chemokines or modified or multimeric chemokines (SEQ ID NO: 1), grop (SEQ ID NO: 3) and groi (ID). sequence number 4). As in Example 1, the. changes chemokine dose and blood collection time.

Test CFU-GM se provede jak je popsáno výše v příkladu 1 s použitím SCF, IL-1 a GM-CSF jako zdroje aktivity stimulující tvorbu kolonií. Zralé krevní buněčné elementy, časné a pozdní progenitorové buňky, se měří jako v příkladu 1.The CFU-GM assay was performed as described in Example 1 above using SCF, IL-1 and GM-CSF as a source of colony stimulating activity. Mature blood cell elements, early and late progenitor cells, are measured as in Example 1.

Studie kombinací s předběžnou léčbou hematostimulantem používá jako pozitivní kontrolu ΜΙΡ-Ια.A study in combination with pretreatment with a hematostimulant uses ΜΙΡ-Ια as a positive control.

Příklad 3Example 3

Model transplantace myších kmenových buněk periferní krveModel of mouse peripheral blood stem cell transplantation

A. Mobilizace primitivních dlouhodobě repopulujících kmenových buněkA. Mobilization of primitive long-term repopulating stem cells

Následující pokus se provádí na modelu transplantace kmenových buněk in vivo pro zjištění, zda grop odříznutý na aminovém konci (aminokyseliny 5 až 73 identifikační číslo sekvence 3, nazývaný grop-T) mobilizuje primitivní dlouhodobě repopulující kmenové buňky. V tomto modelu jsou myši ozářené zářením τ příjemci buněk kostní dřeně. Přežívání myší se sleduje po dobu 100 dní.The following experiment is performed in a stem cell transplantation model in vivo to determine whether a grop cut off at the amino terminus (amino acids 5 to 73 of SEQ ID NO: 3, called grop-T) mobilizes primitive long-term repopulating stem cells. In this model, mice are irradiated with τ by recipients of bone marrow cells. Mouse survival is monitored for 100 days.

*· 9 9 9 9 9 99 9 99* 9 9 9 9 9 99 9 99

9 9 9 9 9 9 99 · «4 · «4449 9 9 9 9 9 99 99

Schopnost kmenových buněk krve odebíraných myším léčeným buď fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem, grop-T (50 pg v 15 až 30 minutě), G-CSF (1 pg/myš dvakrát denně x 4) nebo G-CSF a poté gro8-T k zachránění jinak le£ tálně ozářených myší. Krevní mononukleární buňky (do 10 ) odebírané od myší léčených fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem chrání 0 až 10 % zvířat 100 dnů po transplantaci. Myši dostávající dřeňové buňky jako pozitivní kontrola studie byly uvažovány jako 100% základ přežívání ke 100. dni. Mobilizované krevní buňky (10® buněk/myš) odebírané od myší . léčených samotným grop-T chránily 70 % příjemců. Mobilizované krevní buňky (10® buněk/myš) odebírané od dárců léčených G-CSF chránily 80 % příjemců. Mobilizované krevní buňky odebírané od dárců léčených G-CSF a grop-T mobilizují větší počty repopulujících buněk než samotný G-CSF.The ability of blood stem cells collected from mice treated with either phosphate buffered saline, grop-T (50 µg at 15-30 min), G-CSF (1 µg / mouse twice daily x 4) or G-CSF and then gro8-T to rescue otherwise lethally irradiated mice. Blood mononuclear cells (up to 10) taken from mice treated with phosphate buffered saline protect 0-10% of the animals 100 days after transplantation. Mice receiving marrow cells as a positive control of the study were considered as a 100% basis for survival at day 100. Mobilized blood cells (10 ® cells / mouse) collected from mice. treated with grop-T alone protected 70% of the recipients. Mobilized blood cells (10 ® cells / mouse) collected from G-CSF-treated donors protected 80% of the recipients. Mobilized blood cells taken from donors treated with G-CSF and grop-T mobilize larger numbers of repopulating cells than G-CSF alone.

B. Mobilizace kmenových buněk periferní krveB. Mobilization of peripheral blood stem cells

Vyhodnocuje se rychlost, se kterou se mobilizují kmenové buňky periferní krve pomocí linií zralých krevních buněk obnovených grop-T u ozářeného hostitele. Buňky periferní krve o nízké hustotě v množství 10® (LDPBC) se podají injek-. čně ozářeným příjemcům a krev se odebere kardiální punkcí 7 až 19 dnů po ozáření. LDPBC se odebírají od různých skupin za optimálních podmínek pro mobilizaci CFU-GM. Skupiny srovnávané v tomto pokusu dostávají fyziologický roztok pufrovaný fosfátem, samotný grop-T (50 pg, 15 min), samotný G-CSF (dvakrát denně x 5 dnů, 1 pg/myš) a grop-T + G-CSF. Denně se odebírá krev od normálních myší pro srovnání s transplantovanými zvířaty.The rate at which peripheral blood stem cells are mobilized using grop-T-restored mature blood cell lines in the irradiated host is evaluated. Low density peripheral blood cells at 10 ® (LDPBC) were injected. and blood is collected by cardiac puncture 7 to 19 days after irradiation. LDPBCs are collected from different groups under optimal conditions for CFU-GM mobilization. Groups compared in this experiment receive phosphate buffered saline, grop-T alone (50 µg, 15 min), G-CSF alone (twice daily x 5 days, 1 µg / mouse) and grop-T + G-CSF. Blood is collected daily from normal mice for comparison with transplanted animals.

Myši, které obdrží transplantát od dárců léčenýchMice receiving the transplant from donors treated

- 19 fyziologickým roztokem pufrovaný fosfátem, nejsou schopné obnovit zralé krevní buněčné elementy a-uhynou. Rychlost obnovy, neutrofilů u myší, které dostávají buňky mobilizované odříznutým grop, je rychlejší než u zvířat, která dostávají buňky mobilizované pomocí G-CSF. Myši, které obdrží LDPBC mobilizované kombinací grop-T + G-CSF vykazují rychlejší rychlost obnovy neutrofilú néž buňky mobilizované ^^οβ ^τ· ’ ‘ AWith phosphate buffered saline, they are unable to restore mature blood cell elements and die. The recovery rate of neutrophils in mice receiving cells mobilized by truncated grop is faster than in animals receiving cells mobilized by G-CSF. Mice that receive LDPBC mobilized by a combination grop-T + G-CSF show a faster neutrophil recovery rate than cells mobilized ^{^οβ τ} · ^ 'A

Obnova počtů krevních destiček u stejných myší ukazuje stejné pořadí: grop-T +. G-CSF > grop-T > G-CSF >> PBS. Avšak 19. dne počty destiček zdaleka nedosahuji návrat ’ k normálním hodnotám. Tyto údaje ukazují, že krevní kmenové buňky mobilizované gro^-T se u myších příjemců začleňují, což poskytuje výsledné rychlosti obnovy neutrofilů a krevt nich destiček stejné nebo lepši než v případě kmenových buněk mobilizovaných-pomocí G-CSF.Recovery of platelet counts in the same mice shows the same order: grop-T +. G-CSF> grop-T> G-CSF >> PBS. However, on day 19, platelet counts are far from returning to normal. These data indicate that blood stem cells mobilized by gro-T are incorporated in the murine recipients, providing a resultant recovery rate of neutrophils and platelet counts equal to or better than for the stem cells mobilized by G-CSF.

Četné modifikace a variace tohoto vynálezu zahrnuje výše uvedený popis a předpokládá se, že jsou zřejmé.tomu, kdo· má zkušenost v oboru. Tyto modifikace a změny prostředků a postupů podle tohoto vynálezu sé uvažuje zahrnout do rozsahu patentových nároků, které se, zde dále připojují.Numerous modifications and variations of the present invention include the foregoing description and are believed to be obvious to those skilled in the art. These modifications and changes to the compositions and methods of the invention are contemplated to be included within the scope of the claims which are hereby incorporated by reference.

- 20 Seznam sekvenci (1) OBECNÉ INFORMACE:- 20 Sequence Listing (1)

(i) PŘIHLAŠOVATEL: SmithKlíne Beecham Corporation Pelus, Louis M.(i) APPLICANT: SmithKline Beecham Corporation Pelus, Louis M.

King, Andréw G.King, Andréw G.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Použití proteinu odvozeného z chemokinu savce (iii) POČET SEKVENCÍ: 4 (iv) ADRESA PRO. KORESPONDENCI:(ii) NAME OF THE INVENTION: Use of a mammalian chemokine protein (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 4 (iv) ADDRESS FOR. CORRESPONDENCE:

(A) ADRESÁT: SmithKlíne Beecham Corporation -(A) ADDRESS: SmithKline Beecham Corporation -

Corporate Patents (B) ULICE: 709 Swedeland Road (C) MÉSTO: King of Prussia (D) STÁT: PA (E) ZEMĚ: USA (F) POŠTOVNÍ KÓD: 19406-2799 (v) FORMA PRO ČTENÍ POČÍTAČE:Corporate Patents (B) STREET: 709 Swedeland Road (C) CITY: King of Prussia (D) COUNTRY: PA (E) COUNTRY: USA (F) POST CODE: 19406-2799 (v) COMPUTER READING FORM:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) PROVOZNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMOVÉ VYBAVENÍ: Patentln Release #1.0,(A) MEDIA TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release # 1.0,

Verze #1.30 (vi) ÚDAJE O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:Version # 1.30 (vi) CURRENT APPLICATION DETAILS:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: WO (B) DATUM PODÁNÍ:(A) APPLICATION NUMBER: WO (B) DATE OF ADMINISTRATION:

(C) ZATŘÍDĚNÍ:(C) CLASSIFICATION:

·*9 > · «www • · · <* β 4 4 · ··· «· • · · « 4 4 · ·4 ·· · ·· 4 «4·· (vii) ÚDAJE O PRIORITNÍ PŘIHLÁŠCE:* 4 www 4 4 4 4 4 4 4 (4) v (vii) PRIORITY APPLICATION DETAILS:

(A) ČÍSLO.PŘIHLÁŠKY: US 08/547 262 (B) DATUM PODÁNÍ: 24. října 1995 (viii) INFORMACE O PŮVODNÍM ZÁSTUPCI:(A) APPLICATION NUMBER: US 08/547 262 (B) filing date: October 24, 1995 (viii) ORIGINAL REPRESENTATIVE INFORMATION:

(A) JMÉNO: Halí, Linda E.(A) NAME: Halí, Linda E.

(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 31763 (C) ČÍSLO SPISU: SBC P50161-2PCT (ix). TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:(B) REGISTRATION NUMBER: 31763 (C) FILE NUMBER: SBC P50161-2PCT (ix). TELECOMMUNICATION INFORMATION:

(A) TELEFON: 215-270-5015 (B) FAX: 215-270-5090 (2) INFORMACE PRO IDENTIFIKACI SEKVENCE ČÍSLO 1:(A) PHONE: 215-270-5015 (B) FAX: 215-270-5090 (2) SEQUENCE IDENTIFICATION INFORMATION NUMBER 1:

* (i) SEKVENČNÍ.CHARAKTERISTIKY:* (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) . DÉLKA:.. 72 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TVAR ŘETĚZCE:(A). LENGTH: .. 72 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN SHAPE:

(D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: ČÍSLO IDENTIFIKACE SEKVENCE: 1:(D) TOPOLOGY: unknown (ii) MOLECULA TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBER: 1:

Ala Pro Ile Ala Asn Glu Leu Arg Cys Gin Cys Leu Gin Thr Met 1 ' 5 .10 15Ala Pro Ile Ala Gn Leu Arg Cys Gin Cys Leu Gin Thr Met 1 '5 .10 15

Ala Gly Ile His Leu Lys Asn Íle Gin Ser Leu Lys Val LeuAla Gly Ile His Leu Lys Asn Il Gin Ser Leu Lys Val Leu

Pro • ·Pro • ·

Ser Gly Pro His Cys Ser Gly For His Cys Thr Thr Gin Gin Thr Glu Val 40 Thr Glu Val 40 Ile Ile Ala Thr Ala Thr Leu Leu Lys 45 Lys 45 35 35 Asn Asn Gly Gly Arg Arg Glu Glu Ala Ala Cys Cys Leu Leu Asp Asp Pro For Glu Glu Ala Ala Pro For Leu Leu Val Wall Gin Gin 50 50 55 55 60 60 Lys Lys Ile Ile Val Wall Gin Gin Lys Lys Met Met Leu Leu Lys Lys Gly Gly Val Wall Pro For Lys Lys Ϊ Ϊ ..65 ..65 70 70

(2) INFORMACE PRO IDENTIFIKACI SEKVENCE ČÍSLO 2:(2) INFORMATION FOR THE IDENTIFICATION OF SEQUENCE NO. 2:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 73 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TVAR ŘETÉZCE:(A) LENGTH: 73 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN SHAPE:

(D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY.: protein (Xi) POPIS SEKVENCE: ČÍSLO IDENTIFIKACE SEKVENCE: 2:(D) TOPOLOGY: unknown (ii) MOLECULA TYPE .: protein (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBER: 2:

Ala Ser Val 1 Ala Ser 1 Ala Thr Glu Leu 5 Ala Thr Glu Leu 5 Arg Arg Cys Gin Cys Leu Gin Thr Leu Cys Gin Cys Leu 10 10 15 15 Dec Gin Gly Gin Gly Ile Ile His His Pro For Lys Lys Asn Asn Ile Ile Gin Gin Ser Ser Val Wall Asn Asn Val Wall Lys Lys Ser Ser 20 20 May 25 25 30 30 Pro. Gly For. Gly Pro For His His cys cys Ala Ala Gin Gin Thr Thr Glu Glu Val Wall Ile Ile Ala Ala Thr Thr Leu Leu Lys Lys 35 35 40 40 45 45 Asn Gly Asn Gly Arg Arg Lys Lys Ala Ala Cys Cys Leu Leu Asn Asn Pro For Ala Ala Ser Ser Pro For Ile Ile Val Wall Lys Lys 50 50 55 55 60 60

- 23 Lys Ile Ile Glu Lys Meť Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn- 23 Lys Ile Ilu Glu Lys Me Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn

6570 (2) INFORMACE PRO ČÍSLO IDENTIFIKACE SEKVENCE 3:6570 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBER 3:

^; ( i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY: . ‘ (A) DÉLKA: 73 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TVAR ŘETĚZCE:’ (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: ČÍSLO IDENTIFIKACE SEKVENCE: 3: ^; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:. '(A) LENGTH: 73 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN SHAPE:' (D) TOPOLOGY: unknown (ii) MOLECULA TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBER: 3:

Ala Ala Pro For Leu Leu Ala Ala Thr Thr Glu Glu Leu Arg Leu Arg Cys Cys Gin Gin Cys Cys Leu Leu Gin Gin Thr Thr Leu Leu 1 1 5 5 10 10 15 15 Dec Gin Gin Gly Gly Ile Ile His His Leu Leu Lys Lys Asn Asn Ile Ile Gin Gin Ser Ser Val Wall Lys Lys Val Wall Lys Lys Ser Ser 20 20 May 25 25 3 0 3 0 Pro For Gly Gly Pro For His His Cys Cys Ala Ala Gin Gin Thr Thr Glu Glu Val Wall Ile Ile Ala. Ala. Thr Thr Leu Leu Lys Lys 35 35 40 40 45 45 Asn Asn Gly Gly Gin Gin Lys Lys Ala Ala Cys Cys Leu Leu Asn Asn Pro For Ala Ala Ser Ser Pro For Met Met Val Wall Lys Lys 50 50 55 55 60 60 Lys Lys Ile Ile Ile Ile Glu Lys Glu Lys Met Met Leu Leu Lys .Asn Gly Lys .Asn Gly Lys Lys Ser Ser Asn Asn 65 65 70 70

(2) INFORMACE PRO ČÍSLO IDENTIFIKACE SEKVENCE 4:(2) INFORMATION FOR SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBER 4:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 73 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TVAR ŘETĚZCE:(A) LENGTH: 73 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN SHAPE:

(D) TOPOLOGIE: neznámá(D) TOPOLOGY: unknown

Claims

PATENT CLAIMS

Use of a protein derived from a mammalian chemokine selected from the group consisting of (a) groa sequence number 2, (b) grofi sequence number 3, (c) grroT sequence number 4, and (d) KC sequence number 1 , for the preparation of a medicament suitable for mobilizing hematopoietic stem cells.

Use according to claim 1, wherein the chemokine is selected from the group consisting of (a) mature gr-τοβ,.

(b) amino acids 5 to 73 of SEQ ID NO: 3, (c) a multimeric chemokine protein comprising a linkage of two or more of (a) or (b) and (d) a multimeric chemokine protein comprising a linkage of (a) or (b) to a second chemokine.

Use according to claim 1, wherein the chemokine is selected from the group consisting of (a) mature grroa, (b) amino acids 5 to 73 of SEQ ID NO: 2, (c) a multimeric chemokine protein comprising: · * · · · · · · · · · · · · · · · · ·

Combining two or more of (a) or (b) and (d) a multimeric chemokine protein comprising combining of (a) or (b) with a second chemokine.

The use of claim 1, wherein the chemokine is selected from the group consisting of (a) mature grot, (b) amino acids 5 to 73 of SEQ ID NO: 4, (c) a multimeric chemokine protein comprising a linkage of two or more substances (a) or ( (b) and (d) a multimeric chemokine protein comprising a linkage of (a) or (b) a second chemokine.

The use of claim 1, wherein the chemokine is selected from the group consisting of (a) mature KC, (b) amino acids 5 to 73 of SEQ ID NO: 1, (c1 a multimeric chemokine protein comprising a linkage of two or more substances (a) or (b) and (d) a multimeric chemokine protein comprising combining (a) or (b) with a second chemokine.

9,999 99

9 99

9 98 9 <9999

The use of claims 1 to 5, wherein said chemokine comprises from about 0.01 ng to about 1 g of the medicament.

,

Use according to claims. 1-5, wherein the medicament is administered together with a growth factor or other hematopoietic biomolecule.

The use of claim 7, wherein said growth factor is selected from the group consisting of GM-CSF, G-CSF, stem cell factor and flt-3 ligand.

Use according to claim 7, wherein the biomolecule is (S) -5-oxo-L-propyl-α-glutamyl-La-aspartyl-N ⁸ - (5-amino-1-carboxypentyl) -8-oxo-N ⁷ - [N- / N- (5-oxo-L-propyl) -La-glutamyl] -La-aspartyl] -L-threo-2,7,8-triaminoctanoyllysine [(pGlu-Glu-Asp) ₂ -Sub- (Lys) 2) ·

Use according to claim 1, wherein the medicament is used in the treatment of a patient receiving a hematopoietic stem cell transplantation.

The use of claim 10, wherein the patient received a dose of the selected chemotherapeutic agent prior to treatment with the medicament, hematopoietic stem cells were obtained from the peripheral blood of the treated patient, the chemotherapeutic agent was administered, and the patient was re-infused with the recovered cells.

The use of claim 11, wherein the chemotherapeutic agent is selected from the group consisting of cyclophosphamide, cisplatin, ARA-C, 5-fluorouracil, etopside, epirubicin, carboplatin, busulfan, mitoxantrone and carmustine.