JPH11512623A

JPH11512623A - Non-genetically modified mammals as a model for multiple sclerosis

Info

Publication number: JPH11512623A
Application number: JP9532343A
Authority: JP
Inventors: リージェ，フランソワ; ペロン，エルヴェ; ベンジェルン，ナビラ
Original assignee: ベーイーオーメリュー
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 1999-11-02
Also published as: FR2745974B1; WO1997033466A1; AU2165897A; FR2745974A1; CA2221028A1; EP0825811A1

Abstract

(57)【要約】ゲノムには影響を与えずに修飾された非−ヒト哺乳類であって、（ａ）脳実質組織に非特異的な水溶性血液分子に対して開放又は透過性である血液脳障壁；（ｂ）特に生理学的ネットワークの混乱、毛細管周囲の星状足の消失、およびグリオーシスによって現れる星状細胞異常；（ｃ）ミクログリア細胞活性化；（ｄ）特に脳幹及び／または脳白質に存在する脱髄プラク；及び（ｅ）中枢神経系グリア細胞及び内皮細胞障害のうち少なくとも２つの徴候を有する哺乳類、前記動物の用途が開示される。 (57) Abstract: A non-human mammal modified without affecting the genome, wherein (a) blood is open or permeable to water-soluble blood molecules non-specific to brain parenchyma tissue Cerebral barrier; (b) astrocytic abnormalities manifested by disruption of physiological networks, in particular, pericapillary stellate foot, and gliosis; (c) microglial cell activation; (d) especially in brain stem and / or white matter And (e) mammals having at least two manifestations of central nervous system glial cells and endothelial cell damage, the use of said animals is disclosed.

Description

【発明の詳細な説明】多発性硬化症モデルとしての非−遺伝子修飾哺乳類本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）に罹患した患者に生理病理学的な類似性を示す修飾非−ヒト哺乳類の製造、および、そのようにして得られた動物の使用に関する。血液−能障壁（blood brain barrier（ＢＢＢ））の変化は、多発性硬化症（ＭＳ）病変の進行における非常に重要な要素であることが知られている（Gay & Esiri 1991，Hawkins 等，1991，Thompson 等，1992，Poser 1993）。病理学的試薬、おそらくウイルス源と組み合わせた遺伝子のプレ配置(predisposition)が、自己免疫の脱髄および炎症過程を進行させるので、これらの病変を引き起こすことができることがわかっている（Waskman 1985）。逆転写酵素（ＲＴ）活性、および、ＭＳ罹患患者からの培地の軟髄膜細胞ラインおよび単球におけるウイルス性粒子の存在に関する Perron 等の観察（1989，1991）は、ＭＳの、ウイルス、特にレトロウイルスの病因論に基づく主張を提供する。本発明者等によって証明された最近の仮説は、ＭＳにおいて、レトロウイルスに感染したと思われる単球は、in vitro でグリア毒性(glyotoxic)分子を放出する。確かに、発作状態のＭＳ患者から回収して in vitro で培養した単球の上清を、ラット胎児の皮質外植片の培養培地に添加すると、星状細胞を選択的に標的とする毒性を示す（本出願人による特許出願 PCT/FR95/00178を参照し、その内容を本明細書に参考文献として取り人れる）。in vitro で活性な、ＭＳ患者の単球の上清の精製は、主に１７ｋｄのフラクションであって、僅かに２１ｋｄにバンドで表される毒性因子を開示した。この因子は、in vitro で、星状細胞ラインのアポプトシス、また、オリゴ樹状細胞を誘発する（特許出願 PCT/FR95/00178参照）。これら２つのフラクションは、ＭＳ罹患患者の脊髄液（ＳＦ）および漿液にも存在する（Do bransky 等，提出済）。本著者は、驚くべきことに、上記の毒性因子の動物への接種が、その動物に、多発性硬化症の罹患患者に観察されるのと同じタイプの、生理病理学的、特に脳の病変を生ぜしめることを見出した。従って、本発明は、ヒトに観察されるような多発性硬化症に特徴的な徴候即ち異常が見られる修飾した非−ヒト哺乳類に関する。本発明の修飾動物は、同じ科、同じ属、および同じ種の対照動物と比較して、自発的修飾を施された動物を意味すると解される。この自発的修飾は、動物のゲノムには影響を与えず、特にその動物はトランスジェニックである。これは、多発性硬化症の罹患患者から回収した生物学的流体から得たようなグリア毒性因子による動物の乾癬に関連した生理学病理学的状態によって特徴づけられる。本発明の種々の主題は以下の通りである。・ゲノムには影響を与えずに修飾された非−ヒト哺乳類であって、（ａ）脳実質組織に非特異的な水溶性血液分子に対して開放又は透過性である血液脳障壁；（ｂ）特に生理学的ネットワークの混乱、毛細管周囲の星状足の消失、およびグリオーシスによって現れる星状細胞異常；（ｃ）ミクログリア細胞活性化；（ｄ）特に脳幹及び／または脳白質に存在する脱髄プラク；（ｅ）中枢神経系グリア細胞及び内皮細胞障害、特に、少なくとも部分的な、星状細胞タイプのグリア細胞のＤＮＡの、注入位置から離間した場所における、モルホロジーの変化及び／又は切断のうち少なくとも２つの徴候を有する哺乳類であり、好ましくは、前記徴候（ａ）、（ｄ）、及び（ｅ）のうち少なくとも２つの生理学的徴候を有する哺乳類である。本発明の他の変形例では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｄ）の全ての徴候を有する動物である。・ゲノムには影響を与えずに修飾された非−ヒト哺乳類であって、多発性硬化症の罹患患者からの生物学的流体で得られるグリア毒性因子の接種によって得られる哺乳類。・上記の動物を製造する方法であって、多発性硬化症の罹患患者からの生物学的流体から得られるグリア毒性因子の感染有効量を用意し、前記感染有効量を動物に接種することからなる製造方法である。・本発明の動物の、治療方法、特に抗−炎症または抗−毒性医薬の治療効果の測定のための使用である。・本発明の動物の、治療方法、特に多発性硬化症治療用医薬の治療効果の測定のための使用である。・本発明の動物の、治療方法、特に医薬の、動物の病理学的脳に対する有害性即ち安全性の評価のための使用である。・治療方法、特に抗−炎症医薬の治療効果の測定方法であって、本発明の動物を用意し、該動物に、前記治療処置、特に医薬を投与し、グリア毒性因子を受けたが治療方法を施されていない対照動物、及び、前記治療方法で処理されているがグリア毒性因子を全く受けていない平常対照動物と比較して、上記の病理学的徴候が低減したこと又は無いことを観察することにより治療方法の有効性を測定することからなる方法である。・治療方法、特に多発性硬化症治療用医薬の治療効果の測定方法であって、本発明の動物を用意し、該動物に、前記治療処置、特に医薬を投与し、グリア毒性因子を受けたが治療方法を施されていない対照動物、及び、前記治療方法で処理されているがグリア毒性因子を全く受けていない平常対照動物と比較して、上記の病理学的徴候が低減したこと又は無いことを観察することにより治療方法の有効性を測定することからなる方法である。・治療方法、特に医薬の、本発明の動物の病理学的脳に対する有害性即ち安全性の評価方法であって、本発明の動物を用意し、該動物に、前記治療処置を施し、上記の病理学的徴候の組織病理学的に観察によって該治療方法の反応を測定することからなる方法である。本発明の修飾した動物の他の用途は、グリア毒性因子に対するモノクローナル抗体であって、前記動物から回収されたＢリンパ球から導かれ、ハイブリドーマ製造に適した腫瘍細胞（Kohler 及び Mi lstein，1975）によるラット／ラットまたはラット／マウスハイブリドーマ）と融合され,たハイブリドーマの製造にある。従って、本発明は、グリア毒性因子に対する及び／またはグリア毒性因子の影響で誘発又は修飾された分子に対するモノクローナル抗体の製造方法であって、本発明の記載の動物から回収したＢリンパ球を、ハイブリドーマ生成に適した腫瘍細胞と融合し、選択した後に得られたハイブリドーマに前記抗体を製造させることからなる製造方法にも関する。また、本発明の主題は、上記の製造方法によって得られるグリア毒性因子に対する及び／またはグリア毒性因子の影響で誘発又は修飾された分子に対するモノクローナル抗体である。好ましくは、本発明の修飾動物は、ネズミ科(Muridae family)に属すること、特にマウスまたはラットである。しかし、本発明の動物はサルでもモルモットでもよい。以下の実験部分は、図１から１１に関連する実施例１から３は、in vivo での雌ラットにおけるグリア毒性因子の病理学的影響を例示しており、この影響の決定により、ＭＳにおいて観察される病変過程との関係が確立される。実施例１及び２において、星状細胞に影響する病変の進行は、ラットへのこの因子の脳室間注入の後に試験した。図１は、毒性因子注入後の、脳室周辺(periventrical)星状細胞の組織及び定位を示す写真である。図１Ａ：対照：左側脳室に近接したＧＦＡＰ⁺細胞は、線維タイプである；細胞体は密にラベルされる；伸展は比較的厚い；ＧＦＡＰ⁺細胞は、断面（鉛直正面切断面）に平行に配列する。図１Ｂ：毒性因子で処理した雌ラット：左側脳室近傍に観察されるＧＦＡＰ⁺ 細胞は、肥満した及び／または多形性の、細胞質伸展の組織破壊を持つ体幹を有する；これらの細胞の方向は切断面に垂直であり、細胞組織は観兵式配列タイプである。図１Ｃ：高倍率における図１Ｂであり、正常な星状細胞が観察される。図１Ｄ：高倍率における図１Ｂであり、細胞質伸展が左側脳質に向いた星状細胞が観察される。図２は、毒性因子で処理したラットのＳＮＣにおける小節を例示する。図２Ａ：対照雌ラットの線条において、ＧＦＡＰ⁺細胞のサイズは小さく、星形であり、伸展は短くて細い。図２Ｂ：毒性因子で処理した雌ラットにおいて、星状細胞の体は肥満し、異常な細胞質伸展を有する（極めて微細で多数）。図２Ｃ：因子で処理した雌ラットにおいて、線条に小節が観察された。図３は、グリア毒性因子の注入に続く脳質周辺星状細胞の組織を示す。図３Ａ：対照ラットにおいて、星状才能の伸展が、管の周囲にＧＦＡＰ⁺免疫反応性パッチを形成する。図３Ｂ：処理した雌ラットにおいて、管周囲の星状細胞伸展が退行又は消失する；さらに、管環境からの星状細胞の”消滅”が観察された。図３Ｃ：処理した雌ラットにおいて、ある管の近傍に、星状細胞グリオーシス病巣が形成される；星状細胞は、ＧＦＡＰで密にラベルされる；細胞質伸展は厚い。図４は、病変の１０日後での、皮質における星状細胞の分布を示す。図４Ａ：対照動物において、梨状皮質の辺縁領域で、星状細胞は”キャンドル ”形状をなし、それらの細胞質伸展は、軟膜に向けてその表面に垂直に向いている。図４Ｂ：処理した雌ラットの梨状皮質のＩ層において、生理学的配置を失ったＧＦＡＰ⁺細胞の構造的変化が見られる。図４Ｃ：対照動物において、皮質のＩ及びＩＩ層で、ＧＦＡＰ⁺細胞は星形を有する；多数の細胞質伸展が、細胞間空間を占める。図４Ｄ：処理した雌ラットにおいて、細胞質伸展の退行、細胞間空間の増加、及び星状細胞の星形モルホロジーの消滅が観察された。バー：４０μｍ図５は、毒性因子での処理の後の、タネル(TUNEL)技術による細胞ＤＮＡの切断を表す。図５Ａ：処理した雌ラットにおいて、側脳質の壁にＴＵＮＥＬ⁺細胞が観察される。図５Ｂ：処理した雌ラットにおける、小脳の白質での観察。図５Ｃ：処理した雌ラットにおける、小脳の顆粒層の観察。図５Ｄ：処理した雌ラットにおける、くも膜管レベルでの観察。図５Ｅ：処理した雌ラットにおいて、小脳に、切断されたＤＮＡが細胞質に存在することが観察される。図５Ｆ：処理した雌ラットにおいて、対比染色により、ＴＵＮＥＬ⁺細胞は脈絡膜叢に観察される。バー：４０μｍ図６：毒性因子で処理した雌ラットにおいて、ＧＦＡＰ−陽性細胞はＴＵＮＥＬ−陽性である；内皮細胞も、ＴＵＮＥＬ−陽性である場合もある。図６Ａ：皮質におけるＧＦＡＰ⁺細胞（ブルー）、ＴＵＮＥＬ⁺（ブラウン）。図６Ｂ：線条において、細胞質伸展の不存在及びＧＦＡＰラベリングの希薄化が観察された。図６Ｃ：小脳におけるＧＦＡＰ／ＴＵＮＥＬ二重ラベルした細胞。図６Ｄ：管壁における二重ラベル細胞（ＦＶＩＩＩ／ＴＵＮＥＬ）；ＦＶＩＩＩラベルは極めて弱い。バー：４０μｍ図７は、毒性因子で処理した雌ラットにおける血液−脳障壁の開口を示す写真である。図７Ａ：広い脳質周辺領域において、血液免疫グロブリンの拡散が観察される。免疫ラベルは散漫である。図７Ｂ：高倍率において、管周囲にＩｇＧリングが観察される。バー：Ａ２０μｍ、Ｂ４０μｍ図８は、ミクログリア−マクロファージ反応性を示す。図８Ａ：対照において、ＯＸ４２⁺細胞が線条に観察される；ミクログリアは休止形態であり、ラベリングは弱い；観察される細胞は僅かである。図８Ｂ：処理した動物において、ＯＸ４２⁺細胞のモルホロジー修飾及びその数の増加が見られる。図８Ｃ：図８Ｂの高倍率における、休止形態のミクログリア細胞。図８Ｄ：図８Ｂの高倍率における、分枝タイプの反応性ミクログリア細胞。バー：Ａ、Ｂ２０μｍ、Ｃ、Ｄ４０μｍ図９は、脳幹における反応性ミクログリア病巣を例示する。図９Ａ：脳幹におけるＯＸ４２⁺細胞の病巣。図９Ｂ：高倍率において、ＯＸ４２⁺細胞は、反応性で、分枝かつ偽足タイプである。バー：Ａ１０μｍ、Ｂ２０μｍ図１０は、ミエリン分解を例示する。図１０Ａ：明確に定められた広い領域において免疫ラベルの希薄化が記された小脳の白質。図１０Ｂ：強いミエリン分解が観察された小脳におけるミエリン鞘。図１０Ｃ：高倍率の図１０Ｂ：非常に明白なミエリン分解。バー：Ａ、Ｂ１０μｍ、Ｃ２０μｍ図１１は、患者生検（ＭＳ）の星状細胞に関連する、星状細胞とＴＵＮＥＬ⁺ 細胞の共検出(codetection)を示す。図１１Ａ：ＴＵＮＥＬ⁺細胞（ブラウン）に囲まれた反応性星状細胞（ブルー）。図１１Ｂ：小サイズで、抗−ＧＦＡＰで弱くラベルされ、細胞質伸展が無く、プラクの周辺に配置されたＧＦＡＰ⁺細胞。図１１Ｃ：内皮フェノタイプを持つ、管壁のＴＵＮＥＬ⁺細胞。バー：４０μｍ実施例１：材料及び用いた技術の説明ａ）グリア毒性因子ＭＳ罹患患者から、ＳＦ又は尿サンプル、即ち単球を回収する。毒性因子は、国際特許出願 PCT/FR95/00178 の実施例１１に従って、処理後にイオン交換カラム、次いで、排除分離カラムで部分的に精製する。グリア毒性因子は、１７Ｋｄの軽い分画と２１Ｋｄの重い分画からなり、それらは共にコンカナバリンに親和性を有する。ＭＳ罹患患者からの単球／マクロファージの培地の上清原料からのグリア毒性因子の単離を以下に詳細に述べる。＊ＭＳ罹患患者からの単球／マクロファージの培地を調製する。この培養媒質は、RPMI1640(Boehringer)、ペニシリン−ストレプトマイシン(b ioMerieux)、Ｌ−グルタミン(bioMerieux)、ピルビン酸ナトリウム(Boehringer) 、１００×非必須アミノ酸(Boghringer)、周知の血液誘導物によって全ての伝染性ウイルスに陰性の(zero negative)健常ドナーからのヒトＡＢ血漿を含む（Per ron 等，The Lancet，337巻，862-863頁，1991年4月6日参照）。リンパ細胞は、血漿及び他の組織化された血液成分からFicoll勾配（Lymphopr ep（登録商標）,Flow）での遠心分離で分離した後、７５ｃｍ³のプリマリア培養フラスコ(Falco)内で培養する。これらのリンパ細胞を得るために、ヘパリン化無菌チューブ（リチウムヘパリン）の管穿刺により５０ｍｌの血液を回収した。血液及びヘパリンは、血液回収直後に徹底的に混合する。あるいは、血液はＥＤＴＡを含有するチューブに収集してもよい。次いで、このチューブを、＋４℃に保持して、無菌下の”バイオハザード”層流培養キャビネットで取り扱う研究所に即座に輸送することが重要である。単球の培養には、１００−１５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０媒質、ペニシリン及びストレプトマイシンの混合物、４％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ベーリンガー非必須アミノ酸（１００Ｘ）を含む”ＲＰＭＩ”媒質が調製される。上記”ＲＰＭＩ”媒質を含む３つの５０ｍｌ円錐底無菌チューブ（Falcon）、及び、２０ｍｌのFicolを含む４つの５０ｍｌ無菌チューブを用意する。ヘパリン化チューブは、ヘパリン化チューブを開いて血液をピペットで取り出し、前記媒質を含むチューブに入れて、媒質と穏やかに混合する。５ｍｌの”ＲＰＭＩ”媒質を回収し、ヘパリン化チューブの壁をリンスする。このリンスは、チューブの壁に接着しているかもしれない任意の細胞を剥がすために、及び、これを”ＲＰＭＩ”媒質で希釈された血液を含むチューブに入れるために、プラスチックピペットを用いて、連続的な吸引／放出によって内容物を穏やかに混合することによる軽微なスクラッピングを伴う。これらの操作は、ヘパリン化チューブが清浄になるまで繰り返す。”ＲＰＭＩ” 媒質で希釈した血液は、次いで、極めて穏やかに（振動しないように）５０ｍｌチューブのFicollの表面に入れ、次いで、Ficollを含むチューブの表面に注意深く入れるために、上記のように残りの希釈血液をリンスして回収するために用いた”ＲＰＭＩ”媒質をいれる。次に、Ficollを振動させることなく、チューブを遠心分離バケットに入れ、水を入れたチューブで平衡させ、＋１５℃で２０分間、遅い減速モードの１８００ｒｐｍで遠心分離する。遠心分離の後、チューブを回収し、その中にピペットを最上の”Ficoll／血漿界面のレベルまで優しく押し入れ、Ficollの上方の白色層を優しく吸引し、壁から開始される同心円を描き、次いでFicoll表面の一方の側から他方の側へ”ジグザグ”を描く。吸引された媒質を、５０ｍｌチューブに入れ、少なくとも３倍量のＲＰＭＩ媒質で希釈し、無菌下で反転させることにより穏やかに混合する。次いでチューブは、＋１５℃で１０分間、遅い減速モードの１８００ｒｐｍで遠心分離する。遠心分離の後、これらのチューブ上清をゆっくりかつ規則的に流すことにより廃棄する一方、細胞の白色ペレットが剥がれないよう注意する。ペレットは、１０ｍｌのＲＰＭＩ媒質に、連続的な吸引／放出によって再懸濁し、この懸濁液を、＋１５℃で１０分間、遅い減速モードの１８００ｒｐｍで遠心分離する。サンプル毎、即ち回収した血液５０ｍｌ毎に、２つの小さな正に帯電した７５ｃｍ³のプラスチック培養フラスコ（Falcon "PRIMARIA"）及び１０ｍｌの”ＲＰＭＩ”媒質を用意し、そこに上記の”ＡＢ”ヒト漿液（ＨＳ）が添加される。遠心分離の後、上清を上記のように除去し、ペレットは１５％ＨＳを含む５ｍｌの”ＲＰＭＩ”媒質中に優しく再懸濁し、再懸濁細胞は、平坦かつ僅かに高く配置されたフラスコ中に分散する。懸濁液は、各フラスコを平らに振動させることにより即座に分散する。遠心分離チューブは、１５％ＨＳを含む”ＰＲＩＭ”媒質の５ｍｌでリンスし、上記のように懸濁液を添加して２つのフラスコに分散させる。好ましくは、これらの工程に使用する全ての媒質は３７℃である（ウォーターバスで加熱）。一度フラスコを閉じた後、それらは、湿気のあるオーブン内、３７℃かつ５％ＣＯ₂で、翌朝まで放置した。翌朝に、懸濁液の細胞と共に全ての上清を吸引すること、フラスコを４ｍｌのＲＰＭＩのみに５分間浸漬し残った媒質を吸引する前にフラスコをゆっくり引き上げてリンスすることにより非接着細胞を除去するのが好ましい。フラスコは、次いで１５％のＨＳを含むＲＰＭＩ媒質で満たし、再びオーブンに入れて４時間動かさないように注意する。この工程から、接着工程の細胞が脱離し、起こりうる細胞病理学的影響をうけないようにジェットを上壁に向けることにより直立したフラスコを常に満たすのが好ましい。細胞懸濁液は、培養の２４時間後に回収し、＋１５℃で１０分間、遅い減速モードの１８００ｒｐｍで遠心分離する。続いて、細胞ペレットは、１０％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むウシ胎児血清に取り込み、生きた細胞を維持する方法に従って液体窒素で−８０℃で凍結させる。対応する上清は、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞の残骸を除去し、浄化した上清を等分し、２４時間培養のサンプル、即ちＤ１とぢて記録し、冷凍機内で−８０℃で保存した。オーブンで４８時間経過後、フラスコを取り出し、上清を吸引し、上記のように、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞の残骸を除去した。浄化した上清は等分し、３日培養サンプル、即ちＤ３として記録し、−８０℃の冷凍庫で保存した。フラスコは即座に、５％のＨＳを含む５ｍｌのＲＰＭＩ媒質で満たし、オーブンに入れた。このときから、培養媒質は５％のＨＳしか含まず、この比率は媒質の全ての置換について用いられる。次いで、フラスコ内の媒質を回収し、細胞残骸について浄化した媒質を等分して上記のように−８０℃で保存し、顕微鏡観察でフラスコ内に接着細胞の残りが見られなくなるまで、３又は４日毎に、５％ＨＳを含む”ＲＰＭＩ”媒質を入れ換える。＊グリア毒性因子の単離培養上清のサンプルを、解凍の後にグループ分け（Ｄ１から最後のＤ）し、予め５６℃で３０分間加熱し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次いで上清を回収し、２０倍容量のＤ−ＰＢＳで、１回目は２時間、２回目は終夜、４℃で２回投石する。このように回収した上清はサンプルを構成し、そこから、特許出願PCT/FR95/00178に記載の技術に従ってグリア毒性因子が単離される。ｂ）大脳脳質間注入実験は、実験開始時の体重が２００−２５０ｇの大人（２ヶ月）のルイス雌ラットについて行う。動物は、腹膜間経路で注入されたクロラルヒドラート(chlor al hydrate)（４００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔する。５から１０μｇの活性タンパク質の５μｌの無菌ＰＢＳ（リン酸緩衝塩液）溶液からなる毒性溶液の注入は、左即脳室（ＡＰ：０．８、Ｌ：１．５、Ｐ：４）において定位法で行う。注入は、２５μｌのハミルトンシリンジを具備するマイクロピペット（２２μｍ径）を用いて行う。動物は手術後１０日に犠牲にする（ｎ＝９）。６匹の対照動物は、同条件で５ μｌの無菌ＰＢＳ溶液を注入され、同様に犠牲にされる。全ての動物は、致死量のクロラルヒドラート（０．５ｇ／ｋｇ）を受け、上行大動脈を通した血管経路で、４％のパラホルムアルデヒドを含む０．１２Ｍの燐酸緩衝液を注入される。頸髄を持つ脳は、同じ固定剤でポスト固定され、次いで液体窒素で−４０℃に冷却されたイソペンタン中で冷凍されて−８０℃で保存される。前頭頂(verticofr ontal)凍結セクションは、１０μｍで連続して切断され、１００μｍ毎に１％ゼラチンスライドに回収される。幾つかの切片は、クレシルバイオレットまたはヘマトキシリンエオシンで染色される。ｃ）抗体星状細胞をラベルするために、１／２００に希釈した抗−グリア原線維酸性タンパク質（抗-ＧＦＡＰ）モノクローナル抗体（BOEHRINGER）を用いる。ミエリンは、１／５００に希釈した抗−ミエリン塩基性タンパク質（抗−ＭＢＰ）抗体（BOEHRINGER）で可視化する。１／５００に希釈したモノクローナル抗体ＯＸ４２（SEROTEC）は、ミクログリア−マクロファージ細胞の同定に使用する。ＢＢＢが開いている間、特定の血液成分が免疫グロブリンのように大脳実質組織において検出される（Dusart 等，1993）。１／２００に希釈した抗−ラット免疫グロブリン抗体（AMERSHAM）は、ＢＢＢに起こりうる破断を可視化するために用いられる。抗−ＦＶＩＩＩ抗体は、内皮細胞の可視化に用いられる。全ての場合において、断片は、適当な濃度の一次抗体とともに４℃で終夜インキュベートされ、それらは、０．１ＭのＰＢＳ、２％のＢＳＡ（ウシ胎児血清アルブミン）、０．３％のTrion-Xで希釈される。抗−ＭＢＰでラベルされるべき断片は、予め、５％酢酸を含む無水アルコール中に４℃で２５分間おかれ、次いで９５及び７０℃のアルコールバスに各々５分間浸漬され、次いでＰＢＳで数回リンスされて脂肪を含まないようにされる。１／２００に希釈した二次抗体（ビオチン化抗−マウスＩｇＧ、AMERSHAM）が、室温で約２時間、断片と接触するようにされる。断片は、次いで、ストレプトアビディン−ビオチン／ペルオキシダーゼ複合体（１／２００）とともにインキュベートされる。ペルオキシダーゼ活性は、その特異的基質Ｈ₂Ｏ₂及びＤＡＢの存在下で現れる。内因性ペルオキシダーゼを飽和させるために、断片を、０．４％過酸化水素を含む０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）で１０分間インキュベートし、次いで２％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液に３０分間浸漬した後に、一次抗体とインキュベートする。抗−ＧＦＡＰ及び抗−ＦＶＩＩＩ抗体で処理した幾つかの断片は、ＡＢＣ−ＡＰ技術に従って現される。次いでこれらの断片は、以下のＴＵＮＥＬ法に従って処理する。ｄ）ＴＵＮＥＬ法（Gavrieli 等，1992）断片は、プロテイナーゼＫ（Boehringer）（２０μｇ／ｍｌ）で１５分間処理し、次いでＴｄＴ及びビオチニル化ＵＴＰとともに３７℃で１時間インキュベートする。次に断片はストレプトアビディン−ビオチン／ペルオキシダーゼ複合体（１／２００）（Amersham）に接触させる。ペルオキシダーゼ活性は、Ｈ₂Ｏ₂及びＤＡＢの存在下で現れる。ＴＵＮＥＬ法に従って処理された幾つかの断片は、ヘマトキシリンで対比染色される。実施例２：結果この実施例で与えられる結果は、手術後１０日に犠牲にされた雌ラットに対してなされた観察に関する。特に、グリア毒性因子が、グリア細胞及び内皮細胞の死を誘起するか否かが探究された。このために、ミクログリアマクロファージ反応の進行、ＢＢＢの状態に対するミエリン及び星状細胞のモルホロジーが記述される。ａ）毒性因子の星状細胞に対する衝撃病変は二側性(bilateral)であり、ラットのＣＮＳの全ての星状細胞の分布、配向及び組織に影響する。星状細胞は、それらの位置に応じて変化する深いモルホロジー変化を示す。病変は、脳室周辺空間から始まって軟膜下空間に至るように記述される。図１Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ｂ及び３Ｃによれば、幾つかの場合を分けることができる。・長い細胞質伸展を持つ異常なモルホロジーのＧＦＡＰ陽性（ＧＦＡＰ⁺）細胞は、柵状組織化され、側脳室に向けて配列する（図１Ｂ）。・脳室空間から離れて、特に線条において、線維形態のＧＦＡＰ細胞は、互いに入れ子状に密に重なって小節を形成するのが観察される（図２Ｂ、２Ｃ）。これらの小節は、全ての終脳領域で観察される。・通常は管周囲の星状細胞伸展によって形成される免疫反応性領域は、毒性因子で処理した雌ラットの殆どの管の周囲には見られない（図３Ｂ）。・体幹が肥満し、その伸展が厚いことを特徴とする反応性形態を示す星状細胞が観察され、それらは、ＧＦＡＰで密にラベルされ、しばしばある種の管に隣接した細胞性病巣中に配置される（図３Ｃ）。・皮質中において、深層に位置するＧＦＡＰ⁺細胞は、その伸展を失って希薄になる。表層では、細胞質伸展が軟膜に配向した星状細胞は、一般に異常なモルホロジー及び無秩序な配向を有する（図４Ｂ）。・対照ラットにおける星状細胞の分布は正常であり、Kalman & Hajos 1989 に記載されたものに匹敵する。グリア毒素を持たない対照におけるアストログリオーシス(astrogliosis)（即ち、プラシーボが注入されるところ）は、注入部位のレベルの限られる。ｂ）ラットのＣＮＳでの毒性因子によって誘発された細胞ＤＮＡの切断（ＴＵＮＥＬ法によって示す）ＴＵＮＥＬ法で陽性の結果を与える細胞（ＴＵＮＥＬ⁺）が、ラットの全ＣＮＳで観察される。それらは、上衣タイプ細胞に対応する脳室の壁においてより頻繁である（図５Ａ）。それらは小脳において観察されるが（図５Ｂ）、僅かに顆粒にも位置し（図５Ｃ）、他は、くも膜下空間（図５Ｄ）実質組織間、及びコロイド叢（図５Ｅ）に位置する血管の壁にある。幾つかのＴＵＮＥＬ⁺細胞は、その細胞質に切断したＤＮＡを有する。他のＴＵＮＥＬ⁺細胞はコロイド叢に観察される（図５Ｆ）。幾地下のＧＦＡＰ⁺細胞はＴＵＮＥＬ⁺細胞である。それらは、全体としてＣＮＳ中に観察される（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ）。ＦＶＩＩＩでラベルされたＴＵＮＥＬ⁺細胞も観察される（図６Ｄ）。この特異な場合におけるＦＶＩＩＩラベリングは極めて弱いことに注意すべきである。対照動物においてはＤＮＡ切断は観察されない。１または２のＴＵＮＥＬ⁺細胞は、プラシーボ溶液の注入部位に見られることがある。しかし、大脳実質組織に散在するＴＵＮＥＬ⁺細胞の存在は、グリア毒性⁺動物に特異的である。ｃ）血液−脳障壁の開口毒性因子で処理した全ての動物において、大脳実質組織中で血液免疫グロブリンの拡散が観察される。これは、ある種の管周囲の脳室周辺で、より顕著である（図７Ａ、７Ｂ）。この現象は、対照では観察されない。ｄ）ミクログリア−マクロファージ反応性ＯＸ４２＋細胞は特徴的な反応性形態を示し、分枝かつ仮足を持つ形態が識別できる。これらは、対照雌ラットに見られるものに比較して多数である（図８Ａ）。脳幹及び大脳のある領域では、ＯＸ４２⁺細胞の小さな病巣が観察される（図９Ａ、９Ｂ）。ｅ）ラットにおける毒性因子に誘発される脱髄脱髄領域は、明確に定められた病巣におけるＭＢＰラベリングの希薄化によって可視化される。これらの病巣は、脳幹及び大脳白質において極めて明確に観察できる（図１０Ａ）。ミエリン分解の場合も、特にラットの全ＣＮＳに散在して観察される（図１０Ｂ、１０Ｃ）。実施例３：得られた結果の解釈ＭＳ罹患患者からの、ＳＦ、尿または単球培地から精製される毒性因子は、ラットのＳＦに注入されると、ＣＮＳのグリア及び内皮タイプの細胞に影響を与える。この毒性因子は、脳室中、次いでくも膜下空間を循環するＳＦによって寄与されると思われる。これはくも膜管、次いで静脈ｓｉｎｕｓｅｓによって吸収される。ＴＵＮＥＬ⁺細胞は、脳室壁（上衣タイプ細胞）及びくも膜管に位置する。上衣細胞の疾患は、ＳＦと脳との界面を変化させ、脳室周辺空間における病変の形成を進行することが可能である。ＭＳにおいて、病変プラクは脳室系に隣接して、しばしば小脈の周囲に位置する。脳においてＳＦ又は血液から拡散する酵素又は免疫性などの試薬の存在に言及した著者がいる（Marburg 1936、Lumsden 1979 参照）。注入された毒性因子は、ＳＦを循環することがわかり、ある種の細胞タイプに標的作用を有する。従って、ＳＦから大脳実質組織へ拡散可能であり、そこである種の細胞群に影響する。星状細胞に影響する病変は複雑である。これらの細胞のポプトシスによる死を触発する星状細胞ＤＮＡの切断が観察される。星状細胞は、管周辺細胞質伸展（星状細胞足）を介して、それらがＢＢＢを構成しない場合にも、その形成及び維持を誘起する（Stewart & Wiley 1981）。管周辺の星状細胞の損傷が星状細胞足の反応を触発し、それがＢＢＢの堅牢性を変化させる。従って、大脳内皮細胞のＤＮＡの切断は、それらの本来の性質を変化させ、ＢＢＢの開口が導かれると思われる。ラットの脳における血液免疫グロブリンの検出は、このことの証拠となる。極めて早期に起こる管周辺の星状細胞のモルホロジー変化が可能であり、それは、内皮細胞のフェノタイプの変化、従ってＢＢＢの損傷を導く。ＭＳ慢性プラクの血管レベルにおける異常性を力説する著者もいる（Jellinge r 1969、Weller 1985、Gay & Esiri 1991）。毛細管の内皮細胞は、免疫グロブリン及びα１−アンチグロブリンを含有し、そのプラクの周辺での内皮を通した小胞輸送の増加を示す。ホルモン性及び細胞性免疫メディエータも検知され、これもＢＢＢの開口を反映している（Compst 等，1989）。ある管の近傍におけるアストログリオーシス、及び、ラットの全ＣＮＳにおける線維性星状細胞の極めて顕著な増殖が観察された。星状細胞は、刺激の後、種々の免疫調整分子を生成する。それらは、ＩＬ−１（Fomtana 等，1982）、ＩＬ −６（Frei 等，1989）、ＩＦＮ−γ（Tedeschi 等，1986）、及びＴＮＦ−α（ Robbins 等，1987、Sawada 等，1989、Chung 等，1990）を誘発する。ＴＮＦ− αは、内皮細胞に毒性である（Deguchi 等，Ishii 等，1992）。これは、ＭＳにおける病変の進行において重要な役割を有する（Sharief 等，1991）。ＭＳ罹患患者におけるＢＢＢの開口とＴＮＦ−αの生成速度との間には相関がある（Shar ief & Tompson 1992）。ＴＮＦ−αは、オリゴ樹状細胞に直接的な細胞毒性効果を与え、ミエリンの分解を生ぜしめる（Selmaj & Raine 1988）。これは、in vi tro の星状細胞の増殖を誘発する（Barna 等，1990）。炎症反応の接合点に星状細胞が存在することは知られている。それらはＣＮＳに存在する免疫能力細胞を表す（Fontana 等，1987）。ＭＳの病変における星状細胞の第一の損傷は、ＣＮＳの恒常性平衡を不安定化させ、かつ、脱髄を導く炎症タイプのカスケードをトリガーする。単球またはリンパ球起源の溶解性因子は、星状細胞の生物学的活性を害し（Ch ung 等，1990）、シトキンを誘発し、脱髄を起こすものもある。毒性因子で処理した雌ラットにおいて、ミクログリア−マクロファージ増殖が観察される。この反応性は、白質内、特に脳幹に局在するＯＸ４２⁺病巣の形態で見られる。また、活性化したミクログリアも、ＴＮＦ−α（Frei & Fontana 1 989、Hetier 等，1990）、ＩＬ−６（Frei 等，1989）等のシトキンを生成する。ＭＳにおけるミクログリア−マクロファージ反応性が記述され、脱髄過程に参加しうる（Woodroofe 等，1986、Esiri 等，1987）。脱髄も観察される。脱髄領域は、脳幹及び大脳白質内で極めて明確に定められる。これらの知見は、ＭＳに観察されるのと非常に類似している。得られた結果は、ＭＳ患者のＳＦから単離した毒性因子が、ラットのＣＮＳの広い領域に病変を誘発することを示唆している。これらの病変は、その性質及びその分布によって、ＭＳにおける病変、特に、脱髄、線維性アストログリオーシス、ミクログリア−マクロファージ反応性、及び、実質組織間血漿免疫グロブリンの拡散によって具現化される浮腫形成を伴うＢＢＢに開口に類似している。これらの結果は、この新規な実験動物モデルを、ＭＳの神経病理学的研究、及び、それらのグリア毒性因子の合成又はその作用を阻害するため、及び、そのその効果に拮抗させるための、モデルにおけるin vivo での治療特性の戦力を開発するのに用いることが重要であることを示している。実施例４：グリア毒性によって誘発した動物モデルを用いた、多発性硬化症の治療効果の評価第一に、精製したグリア毒性因子のサンプルを、実施例１及び特許出願PCT/FR 95/00178の記載に従って調製した。第二に、ルイスラットの系列を、実施例１に記載した基準に従って選択した。これらの動物の約３０以上に、実施例１に記載のプロトコールに従って、０日目においてグリア毒性因子を脳室間定位注入で投与する。（例えば、）グリア毒性因子の注入後０、１、３、８及び１０日目に、十分な量の、治療薬、例えば、 Rolipram（登録商標）、β−インターフェロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、抗−グリア毒素抗血清、又は他の評価すべき治療手段を投与する。この ”Ａ”系列は、活性製品又は方法で処理された疾患動物（グリア毒素⁺）であり、全ての変形例の間で、投与のための最適な定量的及び定性的プロトコールを評価するために、幾つかの変形例で再生できる。これらの動物の約３０（以上）に、実施例１に記載のプロトコールに従って、０日目においてグリア毒性因子を脳室間定位注入で投与するが、Ａ系列で定義された処理のために、不活性なプラシーボを厳密に同条件で投与する。この”Ｂ” 系列は、非治療の正の対照をなす疾患動物（グリア毒素⁺）である。これらの動物の約３０（以上）に、０日目においてグリア毒性因子のプラシーボを注入（血清アルブミンを含む緩衝液注入）するが、Ａ系列で定義された治療活性プロトコールは受けない。この”Ｃ”系列は、処理された負の対照をなす健常動物（グリア毒素^-）であり、グリア毒性因子の影響ではなく活性治療と結びついた効果の評価を可能にする。治療効果は、系列Ａ、Ｂ及びＣの動物を、実施例１に記載したプロトコールに従って、グリア毒性因子又はそのプラシーボの注入後、１０日、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、又は必要なら１年後に犠牲にして評価される。動物の脳は、実施例１の技術的記載に従って研究される。動物Ａ、Ｂ及びＣ系列の動物間の比較には、特に以下の基準が選択される。一般的外観：・一般的状態・体重減少・挙動の変化大脳組織病理学（注入点から離間した場所）・（前記実施例に記載したような）星状細胞のモルホロジー及び組織学的異常・主に星状細胞における、任意に特に上衣又は内皮細胞における、ＤＮＡの切断（ＴＵＮＥＬ陽性技術）・血清免疫グロブリンの実質組織間拡散の少なくとも１つの領域におけるＢＢＢ開口の可視化・ミクログリア細胞のマクロファージ活性化・ミエリン構造及び／またはオリゴ樹状細胞のモルホロジー及び組織学的異常・リンパ球、特に、管周辺浸潤物の存在又は不存在。治療効果は、Ａ系列（グリア毒素⁺／活性処理）とＢ系列（グリア毒素⁺／プラシーボ処理）の動物の間に見られる上記異常の頻度、強度、表面積、加重に有意な相違（統計学的に分析できる数の動物に再現性のある相違）があるか否かで示される。上記の基準に従って、Ａ系列で記録された観察とＣ系列で報告される観察との間に有意な相違が少なければ、より良い治療効果である。この効果は、治療に適用される種々のプロトコール（Ａ系列の変形）に従って評価でき、終点における効果は、グリア毒性因子の注入後の経過時間の関数として、各系列の動物を、上記のように時間を増加させながて犠牲にすることによって評価できる。実施例５：抗−グリア毒性因子及び／またはグリア毒性因子の影響で誘発又は変性した分子に対する特異的抗体の製造実施例１に従う動物系列へのグリア毒性因子の（大脳間、軟膜下即ちＩＰ、静脈内即ちＩＶ、筋肉内即ちＩＭ、または皮下即ちＩＤ）注入。１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月又はそれ以上経過後の、ＩＰ、ＩＶ、ＩＤまたはＩＭによる追加抗原刺激。１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月又はそれ以上経過後の、動物からの脾臓（臓器）の取り出し。実施例１に従う疾患の神経病理学的検査。精製された抗体の研究のための固定した脳断片の保存。脾臓からのリンパ球の抽出、及び、免疫グロブリン分泌ハイブリドーマの産生のための適当な形質転換細胞と融合させるための培養培地への取り込み。生存融合クローンの選択。ハイブリドーマによって製造された抗体の特異性のスクリーニング：グリア毒素：１−活性阻害試験：種々のクローンによって生成された抗体の懸濁液を、特許出願PCT/FR95/00178 に記載されたバイオアッセイで定義されたようなグリア毒性因子の溶液を含む培養ウェルに添加する。グリア毒素プラシーボを注入した対照動物の懸濁液を、対照ウェルに添加する。各ウェルにおけるグリア毒性活性を、上記の特許出願の記載に従って測定する。最低対照値（３つの標準的偏差未満の対照抗体を含むウェルの平均）より低いグリア毒性活性を示す抗体の懸濁液で得られた有意な相違が、抗−グリア毒素阻害活性を示す。これらの阻害性抗体は、グリア毒性因子の検出（ＥＬＩＳＡ等）のためだけでなく、（任意に、抗体の定常部をヒトＩｇ鎖で置換し、動物抗体の可変部を変換することによるヒト化の後に、）抗−グリア毒素治療のためにも興味深い。２−血清学的試験：グリア毒性因子は、適当な血清学的技術に従って種々の抗体の懸濁液さらされ、特異的な抗体が陽性反応を示す。また、組み換えグリア毒素またはその配列から導かれた合成ペプチドの源が、このスクリーニングのために用いられる。注目するクローンのハイブリドーは、モノクローナル抗体を生成させるために引き続いて培養される。組織抗原：血清学的試験は、疾患動物の組織から抽出した抗原に適用でき、グリア毒性因子の影響で誘発又は変化した分子を同定するために、対照動物からの等価な組織と比較される。これらの抗体は、対象物の診断用、あるいは治療用であってよい。参考文献 Barna B.P.，Estes M.L.，Jacobs B.S.，Hudson S.（1990）「ヒト星状細胞は腫瘍壊死因子αに応答して増殖する(Human astrocytes proliferate in respons e to tumor necrosis factor alpha)」J．Neuroimmunol．30，239-243. 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Pathological Predisposition of the gene, possibly in combination with the reagent, Cause these lesions, progressing autoimmune demyelination and inflammatory processes We know we can do that (Waskman 1985). Reverse transcriptase (RT) activity, And virus in leptomeningeal cell lines and monocytes in medium from MS affected patients Perron et al. (1989, 1991) on the existence of viral particles show that MS In particular, provide claims based on the etiology of retroviruses. Proof by the present inventors A recent hypothesis that has been revealed is that in MS, a single infection that appears to have The spheres release glyotoxic molecules in vitro. Certainly, in seizure states Monocyte supernatants collected from MS patients and cultured in vitro were collected from extracorporeal rat fetuses. When added to the culture medium of explants, it exhibits toxicity that selectively targets astrocytes (see See applicant's patent application PCT / FR95 / 00178, the contents of which are incorporated herein by reference. As a person). Purification of monocyte supernatants from MS patients, active in vitro, is mainly Is a 17-kd fraction, and a toxic agent expressed as a band at only 21-kd Child disclosed. This factor is responsible for apoptosis of astrocytic cell lines and in vitro. In addition, oligo-dendritic cells are induced (see patent application PCT / FR95 / 00178). These two Fraction is also present in spinal fluid (SF) and serous fluid of patients with MS (Do bransky, etc.). The authors show that, surprisingly, inoculation of an animal with the virulence factor described above The same type of physiopathological, especially brain, that is observed in patients with multiple sclerosis Was found to cause lesions. Thus, the present invention is directed to a characteristic feature of multiple sclerosis as observed in humans, namely It relates to a modified non-human mammal in which an abnormality is found. The modified animals of the present invention are compared to control animals of the same family, same genus, and same species, It is understood to mean an animal that has undergone a spontaneous modification. This spontaneous modification is It has no effect on nom, especially the animal is transgenic. This is Glial toxic factors as obtained from biological fluids collected from patients with multiple sclerosis Characterized by a physiopathological condition associated with psoriasis in animals. Various subjects of the present invention are as follows. A non-human mammal modified without affecting the genome, comprising: A blood-brain barrier that is open or permeable to water-soluble blood molecules that are non-specific to tissue quality; (B) disruption of physiological networks, loss of stellate feet around capillaries, and Astrocyte abnormalities manifested by ryosis; (c) microglial cell activation; (d ) Demyelinating plaques, especially in the brain stem and / or brain white matter; (e) central nervous system glia Cell and endothelial cell damage, especially glial fibrils of at least partial astrocyte type Morphological changes and / or changes in the vesicle DNA at a distance from the injection site Or a mammal having at least two signs of amputation, preferably Have at least two physiological signs of the signs (a), (d) and (e) It is a mammal. In another modification of the present invention, (a), (b), (c), (d) and An animal with all the signs of (d). A non-human mammal that has been modified without affecting the genome, Inoculation of glial toxic factor obtained from biological fluids from patients with multiple sclerosis Mammal obtained by. A method of producing the above animal, Sensation of glial toxic factors obtained from biological fluids from patients with multiple sclerosis Prepare a dye effective amount, A production method comprising inoculating an animal with the effective amount of the infection. The method of treatment of the animals of the invention, in particular of the therapeutic effect of anti-inflammatory or anti-toxic drugs; Use for measurement. The method of treating the animal of the present invention, particularly the therapeutic effect of a drug for treating multiple sclerosis. Is for use. -Harmfulness of the therapeutic method of the animal of the present invention, particularly the medicament, to the pathological brain of the animal That is, it is used for safety evaluation. A method of treatment, in particular a method of measuring the therapeutic effect of an anti-inflammatory drug, Prepare an animal of the present invention, Administering to said animal said therapeutic treatment, in particular a medicament, A control animal that has received a glial virulence factor but has not been treated, and Compared to normal control animals treated with a therapeutic method but not receiving any glial toxic factor By observing that the above pathological signs have been reduced or absent, It consists of measuring the effectiveness of the treatment method. A method of treatment, particularly a method of measuring the therapeutic effect of a drug for treating multiple sclerosis, Prepare an animal of the present invention, Administering to said animal said therapeutic treatment, in particular a medicament, A control animal that has received a glial virulence factor but has not been treated, and Compared to normal control animals treated with a therapeutic method but not receiving any glial toxic factor By observing that the above pathological signs have been reduced or absent, It consists of measuring the effectiveness of the treatment method. -Harm or safety of the treatment method, especially the medicament, to the pathological brain of the animal of the present invention. Sex evaluation method, Prepare an animal of the present invention, Subjecting said animal to said therapeutic treatment; The response of the treatment method is determined by histopathological observation of the above pathological signs. It is a method that consists of Other uses for the modified animals of the present invention include: A monoclonal antibody against glial virulence factor, recovered from said animal Tumor cells derived from B lymphocytes and suitable for hybridoma production (Kohler and Mi lstein, 1975) and rat / rat or rat / mouse hybridomas) In the production of hybridomas. Therefore, the present invention relates to a glial toxic factor To For and / or molecules induced or modified by the effects of glial virulence factors. A method for producing a noclonal antibody, comprising the step of recovering B-phosphorus from an animal according to the present invention. Papocytes obtained after fusing and selecting tumor cells suitable for hybridoma production The present invention also relates to a production method comprising causing a hybridoma to produce the antibody. The subject of the present invention also relates to a glial toxic factor obtained by the above-mentioned production method. And / or molecules induced or modified by the effects of glial toxic factors It is a clonal antibody. Preferably, the modified animal of the present invention belongs to the rodent family (Muridae family), Especially mice or rats. However, the animals of the present invention can be monkeys or guinea pigs. Is also good. The following experimental part shows that Examples 1 to 3 relating to FIGS. Illustrates the pathological effects of glial toxic factors in female rats, and The determination establishes a relationship with the pathological process observed in MS. Example 1 and In cases 2 and 2, the progression of lesions affecting astrocytes depends on the interventricular potential of this factor in rats. Tested after injection. FIG. 1 shows the tissue and characterization of periventrical astrocytes after injection of toxic factors. It is a photograph showing the rank. FIG. 1A: Control: GFAP close to left ventricle⁺Cells are of the fiber type; The endoplasmic reticulum is tightly labeled; the extension is relatively thick; GFAP⁺Cells are cross-sectional (vertical (Plane cut surface). FIG. 1B: Female rat treated with virulence factor: GFAP observed near left ventricle⁺ The cells have an obese and / or polymorphic, trunk with tissue destruction of cytoplasmic extension. The direction of these cells is perpendicular to the cutting plane, and the cell organization is It is. FIG. 1C: FIG. 1B at high magnification, where normal astrocytes are observed. FIG. 1D: FIG. 1B at high magnification, with a stellate cell with cytoplasmic extension pointing to the left brain. Bubbles are observed. FIG. 2 illustrates the nodules in rat SNCs treated with virulence factors. FIG. 2A: GFAP in the striatum of control female rats⁺Cell size is small and stars form The extension is short and thin. FIG. 2B: Astrocyte bodies become obese and abnormal in female rats treated with virulence factors (Extremely fine and numerous). FIG. 2C: Nodules were observed in the striatum in female rats treated with the factor. FIG. 3 shows the tissue of pericerebral astrocytes following injection of glial toxic factor. FIG. 3A: In control rats, the extension of stellate talent shows GFAP around the tube.⁺Immunity Form a reactive patch. FIG. 3B: Peritubular astrocytic outgrowth regresses or disappears in treated female rats In addition, "extinction" of astrocytes from the tubular environment was observed. FIG. 3C: In treated female rats, astrocyte gliosis near a certain tube. Foci are formed; astrocytes are tightly labeled with GFAP; No. FIG. 4 shows the distribution of astrocytes in the cortex 10 days after the lesion. FIG. 4A: In control animals, in the marginal area of the piriform cortex, astrocytes are “candles”. "In shape, their cytoplasmic extensions are oriented perpendicular to the surface towards the buffy coat You. FIG. 4B: Loss of physiological configuration in layer I of piriform cortex of treated female rats GFAP⁺Structural changes in cells are seen. FIG. 4C: GFAP in layers I and II of the cortex in control animals⁺Cells have a star shape Has; a large number of cytoplasmic extensions occupy the intercellular space. Figure 4D: In treated female rats, regression of cytoplasmic extension, increase in intercellular space, And the disappearance of the star morphology of the astrocytes was observed. Bar: 40 μm FIG. 5 shows the cutting of cellular DNA by TUNEL technology after treatment with a toxic factor. Represents a break. FIG. 5A: TUNEL on the lateral cerebral wall in treated female rats⁺Cells observed It is. FIG. 5B: Observation of cerebellar white matter in treated female rats. FIG. 5C: Observation of granular layer of cerebellum in treated female rats. FIG. 5D: Observation at the arachnoid level in treated female rats. FIG. 5E: In treated female rats, cleaved DNA is present in the cytoplasm in the cerebellum. Is observed. FIG. 5F: TUNEL in treated female rats by counterstaining.⁺Cells are pulse Observed in the choroid plexus. Bar: 40 μm Figure 6: In female rats treated with virulence factors, GFAP-positive cells were TUNE L-positive; endothelial cells may also be TUNEL-positive. FIG. 6A: GFAP in cortex⁺Cells (blue), TUNEL⁺(Brown). FIG. 6B: Absence of cytoplasmic extension and dilution of GFAP labeling in the striatum. Was observed. FIG. 6C: GFAP / TUNEL double-labeled cells in the cerebellum. FIG. 6D: Double-labeled cells (FVIII / TUNEL) on tube wall; FVII I-labels are extremely weak. Bar: 40 μm FIG. 7 is a photograph showing the opening of the blood-brain barrier in female rats treated with a toxic factor. It is. FIG. 7A: Diffusion of blood immunoglobulin is observed in a large area around the brain. . Immunity labels are diffuse. FIG. 7B: At high magnification, an IgG ring is observed around the tube. Bar: A 20 μm, B 40 μm FIG. 8 shows microglia-macrophage reactivity. FIG. 8A: OX42 in control⁺Cells are observed in the striatum; microglia Resting morphology, weak labeling; few cells observed. FIG. 8B: OX42 in treated animals⁺Morphological modification of cells and its There is an increase in numbers. FIG. 8C: Resting form microglial cells at high magnification of FIG. 8B. FIG. 8D: Branched-type reactive microglial cells at high magnification in FIG. 8B. Bar: A, B 20 μm, C, D 40 μm FIG. 9 illustrates reactive microglial foci in the brain stem. FIG. 9A: OX42 in the brain stem⁺Foci of cells. FIG. 9B: OX42 at high magnification⁺Cells are reactive, branched and pseudopod-type It is. Bar: A 10 μm, B 20 μm FIG. 10 illustrates myelin degradation. FIG. 10A: Dilution of immunolabeling in a clearly defined large area White matter of the cerebellum. FIG. 10B: Myelin sheath in cerebellum where strong myelin degradation was observed. FIG. 10C: High magnification FIG. 10B: Very obvious myelin degradation. Bar: A, B 10 μm, C 20 μm FIG. 11 shows astrocytes and TUNEL related to astrocytes in patient biopsies (MS).⁺ Figure 4 shows codetection of cells. FIG. 11A: TUNEL⁺Reactive astrocytes (blue) surrounded by cells (brown) ). FIG. 11B: Small size, weakly labeled with anti-GFAP, no cytoplasmic spreading, GFAP placed around plaque⁺cell. FIG. 11C: TUNEL of tube wall with endothelial phenotype⁺cell. Bar: 40 μm Example 1: Description of materials and techniques used a) Glial toxic factor SF or urine samples, ie monocytes, are collected from MS affected patients. Toxic factors are According to Example 11 of International Patent Application No. PCT / FR95 / 00178, the ion-exchange color And then partially purified on an exclusion column. The glial toxicity factor is 17Kd And a heavy fraction of 21 Kd, both of which are compatible with concanavalin. Has the property. Glial toxicity from supernatant material of culture medium of monocytes / macrophages from patients with MS Factor isolation is described in detail below. * Prepare medium for monocytes / macrophages from MS affected patients. This culture medium was RPMI 1640 (Boehringer), penicillin-streptomycin (b ioMerieux), L-glutamine (bioMerieux), sodium pyruvate (Boehringer) 100x non-essential amino acids (Boghringer), all transmitted by well-known blood derivatives Contains human AB plasma from zero negative healthy donors (Per negative) ron et al., The Lancet, 337, 862-863, April 6, 1991). Lymphocytes are derived from plasma and other organized blood components using Ficoll gradients (Lymphopr ep (registered trademark), Flow), and then centrifuged to 75 cm.^ThreePrimaria culture Culture in flask (Falco). To obtain these lymphocytes, heparinization 50 ml of blood was collected by puncture of a sterile tube (lithium heparin). Blood and heparin are mixed thoroughly immediately after blood collection. Alternatively, the blood is ED It may be collected in a tube containing TA. The tube was then brought to + 4 ° C. Laboratory that holds and handles in a sterile "biohazard" laminar flow culture cabinet It is important to transport immediately. For monocyte culture, 100-150 ml of R PMI 1640 medium, mixture of penicillin and streptomycin, 4% L-G Lutamine, 1% sodium pyruvate, 1% Boehringer non-essential amino acids (10 An "RPMI" medium containing OX) is prepared. 3 including the above “RPMI” medium 50 ml conical bottom sterile tubes (Falcon) and 4 containing 20 ml Ficol Prepare a 50 ml sterile tube from. The heparinized tube is a heparinized tube. Open the pipette, take out the blood with a pipette, put it in the tube containing the medium, And mix gently. Collect 5 ml of "RPMI" medium and place in heparinized tube Rinse the wall. This rinse may be adhered to the tube wall. To remove cells of interest and to remove cells containing blood diluted with "RPMI" medium. Continuous aspiration / discharge using a plastic pipette to place in a tube With slight scraping by gently mixing the contents on exit. These operations are repeated until the heparinized tube is clean. "RPMI" The blood diluted with the medium is then very gently (not vibrated) in 50 ml Place on the surface of the tube's Ficoll, then carefully look at the surface of the tube containing Ficoll. Used to rinse and recover the remaining diluted blood as described above. Add the "RPMI" medium. Next, without vibrating the Ficoll, Centrifugation Place in a separation bucket, equilibrate in a tube with water, and delay at + 15 ° C for 20 minutes. Centrifuge at 1800 rpm in slow deceleration mode. Collect tubes after centrifugation And gently push the pipette into it to the level of the top "Ficoll / plasma interface" Gently aspirate the white layer above Ficoll, draw a concentric circle starting from the wall, and then Draw a “zigzag” from one side of the Ficoll surface to the other. The sucked medium , Place in a 50 ml tube, dilute with at least 3 volumes of RPMI medium, Mix gently by inverting with. The tubes are then placed at + 15 ° C. for 10 Centrifuge for 1 minute at 1800 rpm in slow deceleration mode. After centrifugation, these Discard the supernatant of the tube by running it slowly and regularly, while keeping the cells white. Be careful not to peel off the color pellets. Pellets in 10 ml RPMI medium Resuspend by continuous aspiration / discharge, and suspend the suspension at + 15 ° C. for 10 minutes Centrifuge at 1800 rpm in slow deceleration mode. For each sample, ie collected blood 2 small positively charged 75 cm for every 50 ml of liquid^ThreePlastic culture hula Prepare Sco (Falcon "PRIMARIA") and 10 ml of "RPMI" medium, "AB" human serum (HS) as described above is added. After centrifugation, remove the supernatant as described above. And pellet gently in 5 ml of "RPMI" medium containing 15% HS. Resuspend and resuspend cells in flat and slightly elevated flask . The suspension disperses immediately by shaking each flask flat. Centrifugation The release tube was rinsed with 5 ml of "PRIM" medium containing 15% HS and Add suspension and disperse in two flasks as described. Preferably, these steps All media used are at 37 ° C (heated in a water bath). Once frus After closing the cells, they are placed in a humid oven at 37 ° C. and 5% CO 2._TwoIn the next Left until morning. The next morning, aspirate all supernatant with cells in suspension, flush The scorch was immersed in 4 ml of RPMI only for 5 minutes and the flask was sucked before sucking the remaining medium. It is preferable to remove non-adherent cells by slowly lifting and rinsing . The flask is then filled with RPMI medium containing 15% HS and again oven Be careful not to move it for 4 hours in From this step, cells in the adhesion step Release and direct the jet toward the upper wall to avoid possible cytopathological effects. It is preferable to always fill the upright flask. The cell suspension is used for two cultures. 4 hours later And centrifuged at 1800 rpm in slow deceleration mode for 10 minutes at + 15 ° C. You. Subsequently, the cell pellet contains 10% DMSO (dimethyl sulfoxide). -8 in liquid nitrogen according to the method of incorporating live fetal bovine serum and maintaining live cells. Freeze at 0 ° C. The corresponding supernatant is centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes and The vesicle debris was removed, the clarified supernatant was aliquoted, and a 24-hour culture sample, D1 And stored at -80 ° C in a refrigerator. After 48 hours in the oven, Remove Lasco, aspirate supernatant and centrifuge at 3000 rpm for 30 minutes as described above. The heart was separated to remove cell debris. The purified supernatant is aliquoted and a 3 day culture sample, That is, it was recorded as D3 and stored in a -80 ° C freezer. Flask immediately 5% With 5 ml of RPMI medium containing HS and placed in an oven. From this time The culture medium contains only 5% HS, and this ratio is used for all displacements of the medium. Can be Next, the medium in the flask is collected, and the medium purified for cell debris is removed. Aliquot and store at −80 ° C. as described above, and observe microscopic observation of adherent cells in flask. "RPMI" medium containing 5% HS every 3 or 4 days until no residue is seen Replace * Isolation of glial toxic factor Samples of the culture supernatant are grouped after thawing (from D1 to last D) and Heat at 56 ° C for 30 minutes, centrifuge at 1500 rpm for 10 minutes, and then , Collected in a 20-fold volume of D-PBS, first time for 2 hours, second time overnight at 4 ° C. Rock twice. The supernatant thus collected constitutes a sample from which a patent is issued. The glial toxic factor is isolated according to the technique described in application PCT / FR95 / 00178. b) Intracerebral injection The experiment was performed by an adult (2 months) Lewis female rat weighing 200-250 g at the start of the experiment. About the set. Animals were treated with chloral hydrate (chlor chloride) injected via the intraperitoneal route. al hydrate) (400 mg / kg). 5 to 10 μg of active protein in 5 μl of sterile PBS (phosphate buffered saline) Injection of a toxic solution consisting of a liquid is performed in the left immediate ventricle (AP: 0.8, L: 1.5, P: 4) In the localization method. Injections were performed with a 25 μl Hamilton syringe. This is performed using a clopipet (22 μm diameter). Animals are sacrificed 10 days after surgery (n = 9). Six control animals were 5 μl of sterile PBS solution is injected and sacrificed as well. All animals are lethal Vascular route through the ascending aorta receiving chloral hydrate (0.5 g / kg) Inject 0.12 M phosphate buffer containing 4% paraformaldehyde. Brains with cervical spinal cord are post-fixed with the same fixative and then cooled to -40 ° C with liquid nitrogen. Store in frozen isopentane at -80 ° C. Frontal vertex (verticofr ontal) The frozen section is cut continuously at 10 μm and 1% zeolite per 100 μm. Collected on a ratin slide. Some sections stained with cresyl violet or hematoxylin eosin Is done. c) Antibody To label astrocytes, anti-glial fibril acidic solution diluted 1/200 A protein (anti-GFAP) monoclonal antibody (BOEHRINGER) is used. Mieri Anti-myelin basic protein (anti-MBP) antibody diluted 1/500 (BOEHRINGER) to visualize. Monoclonal antibody OX4 diluted 1/500 2 (SEROTEC) is used to identify microglial-macrophage cells. While the BBB is open, certain blood components are cerebral parenchyma like immunoglobulins. Detected in tissue (Dusart et al., 1993). Anti-rat diluted 1/200 Immunoglobulin antibody (AMERSHAM) is used to visualize possible breaks in the BBB Used for Anti-FVIII antibodies are used for visualization of endothelial cells. In all cases, fragments were incubated overnight at 4 ° C with appropriate concentrations of primary antibody. Cuvated, they were made up with 0.1 M PBS, 2% BSA (fetal bovine serum). Albumin), diluted with 0.3% Trion-X. Should be labeled with anti-MBP The fragments were previously placed in absolute alcohol containing 5% acetic acid at 4 ° C. for 25 minutes, then For 5 minutes each in an alcohol bath at 95 and 70 ° C. and then several times with PBS Rinse and be fat free. Secondary antibody (biotinylated anti-mouse IgG, AMERSHAM) diluted 1/200 , Allowed to come in contact with fragments for about 2 hours at room temperature. The fragment is then used as a streptavidin-biotin / peroxidase complex. (1/200). Peroxidase activity is Specific substrate H_TwoO_TwoAnd in the presence of DAB. Saturates endogenous peroxidase To allow for fragmentation, fragments were placed in 0.1 M phosphate buffer containing 0.4% hydrogen peroxide (pH = Incubate at 7.4) for 10 minutes and then add 3% PBS solution containing 2% BSA. After soaking for 0 minutes, incubate with the primary antibody. Some fragments treated with anti-GFAP and anti-FVIII antibodies were ABC-A Represented according to P technology. These fragments are then separated according to the following TUNEL method: To process. d) TUNEL method (Gavrieli et al., 1992) Fragments were treated with proteinase K (Boehringer) (20 μg / ml) for 15 minutes And then incubate with TdT and biotinylated UTP for 1 hour at 37 ° C. To The fragment is then a streptavidin-biotin / peroxidase complex (1/200) (Amersham). The peroxidase activity is H_TwoO_TwoPassing And in the presence of DAB. Some sections treated according to the TUNEL method were counterstained with hematoxylin. Is done. Example 2: Results The results given in this example show that female rats sacrificed 10 days after surgery Regarding the observations made. In particular, glial virulence factors are associated with glial cells and endothelial cells. Whether it would induce death was explored. Because of this, microglia macrophage anti- Morphology of myelin and astrocytes for BBB status It is. a) Impact of virulence factors on astrocytes The lesions are bilateral, with a distribution of all astrocytes in the rat CNS, Affects orientation and texture. Astrocytes are deep moles that vary depending on their location. Shows horological changes. Lesions may start in the periventricular space and extend into the subpial space Is described in According to FIGS. 1A, 2B, 2C, 3B and 3C, some cases can be separated. Wear. -GFAP-positive abnormal morphology with long cytoplasmic extension (GFAP⁺) The vesicles are fenced and arranged toward the lateral ventricle (FIG. 1B). -Apart from the ventricular space, especially in the striatum, fibrous GFAP cells Nests are observed to form nodules (FIGS. 2B, 2C). This These measures are observed in all telencephalic regions. The immunoreactive region, usually formed by astrocytic cell spreading around the duct, It is not found around most tubes of female rats treated with pups (FIG. 3B). ・ Astrocytes exhibiting reactive morphology characterized by obesity of the trunk and thick extension Are observed, they are tightly labeled with GFAP and are often adjacent to certain vessels Located in the established cellular lesion (FIG. 3C). -GFAP located deep in the cortex⁺Cells lose their extension and become sparse become. At the surface, astrocytes with cytoplasmic extension oriented to the buffy coat are generally abnormal moles. It has horology and disordered orientation (FIG. 4B). The distribution of astrocytes in control rats was normal and was reported by Kalman & Hajos 1989. Comparable to those described. Astroglia in controls without glial toxin Astrogliosis (ie, where the placebo is injected) Limited in level. b) Cleavage of cellular DNA induced by virulence factors in rat CNS (TU (Indicated by NEL method) Cells giving a positive result in the TUNEL method (TUNEL⁺) Is the total CN of the rat Observed in S. They are more frequent in the ventricular wall corresponding to ependymal type cells. Traditional (FIG. 5A). They are observed in the cerebellum (FIG. 5B), but slightly Others are also located in the granules (FIG. 5C), others in the subarachnoid space (FIG. 5D) On the wall of the blood vessel located in the id plexus (FIG. 5E). Some TUNEL⁺The cells Has the DNA cut in the cytoplasm. Other TUNEL⁺Cells observed in colloid plexus (FIG. 5F). Underground GFAP⁺Cells are TUNEL⁺Cells. They are generally CN Observed during S (FIGS. 6A, 6B, 6C). TUNE labeled with FVIII L⁺Cells are also observed (FIG. 6D). FVIII labelin in this unique case It should be noted that bugs are extremely weak. No DNA breaks are observed in control animals. 1 or 2 TUNEL⁺Fine Vesicles may be found at the site of injection of the placebo solution. But cerebral parenchyma TUNEL scattered in⁺The presence of cells is glial toxic⁺Specific to animals. c) opening of blood-brain barrier In all animals treated with virulence factors, blood immunoglobulin Diffusion is observed. This is more pronounced around certain periductal ventricles (FIGS. 7A, 7B). This phenomenon is not observed in the control. d) Microglia-macrophage reactivity OX42 + cells show characteristic reactive morphology, distinguishing morphologies with branching and pseudopodia it can. These are more numerous than those found in control female rats (FIG. 8A ). In certain areas of the brainstem and cerebrum, OX42⁺Small foci of cells are observed (Fig. 9 A, 9B). e) Toxin-induced demyelination in rats The demyelinated area is due to the dilution of MBP labeling in well-defined lesions. Is visualized. These lesions are very clearly observed in the brainstem and cerebral white matter (Figure 10A). In the case of myelin degradation, especially in the whole CNS of rats, Observed (FIGS. 10B, 10C). Example 3: Interpretation of the results obtained Toxicity factors purified from SF, urine or monocyte cultures from patients with MS are Affects CNS glial and endothelial type cells when infused into SF You. This toxic factor is contributed by SF circulating in the ventricles and then in the subarachnoid space It seems to be. It is absorbed by the arachnoid tube and then by the venous sinuses It is. TUNEL⁺Cells are located in the ventricular wall (ependymal-type cells) and in the arachnoid . Ependymal cell disease alters the interface between SF and brain, causing lesions in the periventricular space. Can proceed. In MS, lesion plaque is adjacent to ventricular system And often located around small veins. Enzymes that diffuse from SF or blood in the brain Some authors have mentioned the presence of reagents such as elemental or immunological (Marburg 1936, Lumsden 1979). The injected toxic factor was found to circulate in the SF, It has a targeting effect on cell types. Therefore, it is possible to spread from SF to cerebral parenchyma. And affect certain groups of cells there. Lesions affecting astrocytes are complex. The death of these cells Inspired astrocyte DNA cleavage is observed. Astrocytes have a cytoplasmic extension around the duct ( Through the astrocytic feet), even if they do not constitute the BBB, their formation and retention (Stewart & Wiley 1981). Astrocyte damage around vascular canal , Which alters the robustness of the BBB. Therefore, cerebral endothelial cells DNA cleavage is thought to change their intrinsic properties, leading to the opening of the BBB. Will be Detection of blood immunoglobulins in rat brain provides evidence of this. You. It is possible to alter the morphology of the astrocytes around the tube very early, It leads to a change in the phenotype of endothelial cells and thus to BBB damage. Some authors emphasize the abnormalities at the vascular level of MS chronic plaque (Jellinge r 1969, Weller 1985, Gay & Esiri 1991). Capillary endothelial cells are immunoglobulin Contains phosphorus and α1-antiglobulin and passes through the endothelium around the plaque Shows increased vesicle transport. Hormonal and cellular immune mediators are also detected, These also reflect the opening of the BBB (Compst et al., 1989). Astrogliosis in the vicinity of a certain tube and in the whole CNS of rats A very pronounced proliferation of fibrous astrocytes was observed. Astrocytes are seeded after stimulation Generates various immunomodulatory molecules. They include IL-1 (Fomtana et al., 1982), IL-1 -6 (Frei et al., 1989), IFN-γ (Tedeschi et al., 1986), and TNF-α ( Robbins et al., 1987, Sawada et al., 1989, Chung et al., 1990). TNF- α is toxic to endothelial cells (Deguchi et al., Ishii et al., 1992). This is for MS It has an important role in the development of lesions in mice (Sharief et al., 1991). MS morbidity There is a correlation between BBB opening and the rate of TNF-α production in patients (Shar ief & Tompson 1992). TNF-α has direct cytotoxic effect on oligo dendritic cells To cause degradation of myelin (Selmaj & Raine 1988). This is in vi tro induces astrocyte proliferation (Barna et al., 1990). It is known that astrocytes are present at the junction of the inflammatory response. They are CNS Represents immunocompetent cells that are present in F. (Fontana et al., 1987). Stars in MS lesions Primary damage to cells destabilizes the homeostasis of the CNS and leads to demyelination Trigger a cascade of disease types. Lytic factors of monocyte or lymphocyte origin impair the biological activity of astrocytes (Ch ung et al., 1990), some induce cytokines and cause demyelination. Microglial-macrophage proliferation in female rats treated with virulence factors To be observed. This reactivity is due to OX42 localized in white matter, especially in the brain stem.⁺Focal morphology Seen in. In addition, activated microglia is also TNF-α (Frei & Fontana 1). 989, Hetier et al., 1990), producing cytokins such as IL-6 (Frei et al., 1989) . Microglia-macrophage reactivity in MS has been described and participated in the demyelination process. (Woodroofe et al., 1986; Esiri et al., 1987). Demyelination is also observed. The demyelination area is very clearly defined in the brain stem and cerebral white matter. You. These findings are very similar to those observed in MS. Result obtained Indicates that a virulence factor isolated from the SF of MS patients affects a large area of the rat CNS. Suggests that These lesions depend on their nature and their distribution. And pathology in MS, especially demyelination, fibrous astrogliosis, microglia A-macrophage reactivity and diffusion of plasma immunoglobulin between parenchyma It resembles an opening in the BBB with edema formation embodied. These results indicate that this new experimental animal model has been used in neuropathological studies of MS and And to inhibit the synthesis or action of these glial toxic factors, and Of in vivo therapeutic properties in models to antagonize the effects of Indicates that it is important to use Example 4: Treatment of multiple sclerosis using an animal model induced by glial toxicity Evaluation of therapeutic effect First, a sample of the purified glial virulence factor was prepared according to Example 1 and the patent application PCT / FR. Prepared as described in 95/00178. Second, a series of Lewis rats was selected according to the criteria described in Example 1. Approximately 30 or more of these animals were treated on day 0 according to the protocol described in Example 1. Glial toxic factors are administered in the eye by stereotactic intraventricular infusion. Glial venom (for example) On days 0, 1, 3, 8, and 10 after injection of the sexual factor, a sufficient amount of a therapeutic agent, e.g. Rolipram®, β-interferon, azathioprine, cyclophosph Administer amide, anti-glia toxin antiserum, or other therapeutic measure to be evaluated. this The "A" series is diseased animals (glial toxin) treated with the active product or method.⁺) Among all variants, evaluate the optimal quantitative and qualitative protocols for administration. For the sake of value, it can be reproduced in several variants. According to the protocol described in Example 1, about 30 (or more) of these animals On day 0, a glial toxic factor is administered by stereotactic intraventricular infusion, Inactive placebos are administered under exactly the same conditions for the appropriate treatment. This "B" The series consist of untreated positive control diseased animals (glial toxin⁺). Approximately 30 (or more) of these animals had a glial virulence factor Injection (buffer injection containing serum albumin), but treatment defined in A series No activation protocol is received. This "C" series is the treated negative control Ordinary animal (glial toxin^-), Which is associated with active treatment rather than the effects of glial toxic factors Enables evaluation of the effects that have been used. Therapeutic effects were determined using animals from lines A, B and C according to the protocol described in Example 1. Therefore, 10 days, 1 month, 3 months after injection of glial toxic factor or its placebo It is assessed at the expense of, after 6 months, or 1 year if necessary. Animal brains are studied according to the technical description of Example 1. In particular, the following criteria are selected for comparison between animals of the animals A, B and C series. General appearance: ・ General condition ·Weight loss ・ Change in behavior Cerebral histopathology (space away from injection point) -Astrocyte morphological and histological abnormalities (as described in the previous example) Cutting of DNA, mainly in astrocytes, optionally especially in ependymal or endothelial cells Disconnection (TUNEL positive technology) BB in at least one area of parenchymal interstitial diffusion of serum immunoglobulin Visualization of B opening ・ Macrophage activation of microglial cells -Morphological and histological abnormalities of myelin structure and / or oligodendritic cells The presence or absence of lymphocytes, especially perivascular infiltrates. Therapeutic effect is A series (glia toxin⁺/ Activity treatment) and B series (glia toxin)⁺/ Pla Significant in the frequency, intensity, surface area and weight of the above abnormalities seen between animals Significant differences (reproducible differences in the number of animals that can be analyzed statistically) Is done. According to the above criteria, the observations recorded in the A series and those reported in the C series The less significant differences between them, the better the therapeutic effect. This effect depends on the various protocols applied to the treatment (A variant of the A series). The effect at the endpoint can be assessed as a function of the time elapsed after infusion of the glial toxic factor. By sacrifice each line of animals with increasing time as described above. Can be evaluated. Example 5: Induced or altered by the effects of anti-glial and / or glial toxic factors Of Specific Antibodies Against Sex Molecules Glial virulence factors (animal, subpial or IP, static) on animal strains according to Example 1 Intravenous or IV, intramuscular or IM, or subcutaneous or ID) injection. IP, IV, ID or IM after 1 month, 2 months, 3 months or more Booster stimulation. Removal of spleens (organs) from animals after one month, two months, three months or more Start. Neuropathological examination of the disease according to Example 1. Immobilization for the study of purified antibodies Preserved brain fragment. Extraction of lymphocytes from spleen and production of immunoglobulin secreting hybridoma Incorporation into culture media to fuse with appropriate transformed cells for Selection of surviving fusion clones. Screening for specificity of antibodies produced by hybridomas: Glial toxin: 1-Activity inhibition test: Suspensions of antibodies produced by the various clones were prepared in patent application PCT / FR95 / 00178. Medium containing a solution of glial virulence factor as defined in the bioassay described in Add to the wells. Control animal suspensions injected with glial toxin placebo were Add to control wells. The glial toxic activity in each well was determined by Measure as described. Lowest control value (Weight containing control antibody less than 3 standard deviations) Significant difference obtained with suspensions of antibodies with lower glial toxic activity Shows anti-glia toxin inhibitory activity. These inhibitory antibodies are only for the detection of glial toxic factors (ELISA, etc.) (Optionally, replacing the constant region of the antibody with a human Ig chain to convert the variable region of the animal antibody Interestingly, after humanization by) anti-glia toxin treatment. 2-Serologic test: Glial toxicity factors are exposed to various antibody suspensions according to appropriate serological techniques. , A specific antibody shows a positive reaction. Further, the source of the recombinant glial toxin or a synthetic peptide derived from the sequence thereof, Used for this screening. Hybrids of the clones of interest are used to generate monoclonal antibodies. It is subsequently cultured. Tissue antigen: Serological tests are applicable to antigens extracted from diseased animal tissues and Equivalent tissue from control animals to identify molecules induced or altered by the offspring Is compared to These antibodies may be for diagnostic or therapeutic use in a subject. References Barna B.P., Estes M.L., Jacobs B.S., Hudson S. (1990) "Human astrocytes are Proliferate in response to tumor necrosis factor α (Human astrocytes proliferate in response e to tumor necrosis factor alpha) ". Neuroimmunol. 30, 239-243. Chung I.Y. And E.N. benveniste (1990) "Astrocyte tumor necrosis factor- Induction by α, ribopolysaccharide, INF-γ and IL-1β (Turmor necr osis factor-alpha production by astrocytes, Induction by lipopolysacchar ide, NF-gamaa and IL-1 beta.) " Immunol, Vol. 144, no. 8, pp. 2999-30 07. Compson D.A.S., Morgan B.P., Campbell, A.K., Wilkins, P., Gole, G., Th omas, N.D. And Jasani, B. (1989) "Terminal complement complexes in multiple sclerosis. 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Claims

[Claims] 1. In a non-human mammal modified without affecting the genome, (A) blood that is open or permeable to water-soluble blood molecules that are nonspecific for brain parenchyma Fluid brain barrier, (B) disruption of physiological networks, loss of stellate feet around capillaries, and Astrocytic abnormalities manifested by ryosis, (C) microglial cell activation, (D) demyelinating plaques, especially present in the brain stem and / or brain white matter; (E) Central nervous system glial cell and endothelial cell damage A mammal comprising at least two of the following: 2. The above-mentioned disorder (e) is that at least the DNA of glial cells of astrocyte type is 2. A partial morphological change and / or truncation. The animals described. 3. At least two physiological signs of said signs (a), (d) and (e) The animal according to claim 1 or 2, comprising: 4. In a non-human mammal modified without affecting the genome, Inoculation of glial toxic factor obtained from biological fluids from patients with multiple sclerosis A mammal obtained by: 5. 5. A rat belonging to the rodent family, in particular a rat. An animal according to any one of the above. 6. Glial toxic factors derived from biological fluids from patients with multiple sclerosis Prepare an effective amount of infection, The method according to any one of claims 1 to 5, comprising inoculating an animal with the effective amount of the infection. The method of producing the animal described above. 7. A method of treating an animal according to any of claims 1 to 5, in particular an anti-inflammatory medicament. Use for measuring therapeutic effect. 8. A method for treating an animal according to any one of claims 1 to 5, particularly for treating multiple sclerosis. Use for measuring the therapeutic effect of a medicinal drug. 9. A method of treating an animal according to any of claims 1 to 5, in particular a medicament, of an animal. Use for assessment of harm or safety to pathological brain. 10. A method of treatment, particularly a method of measuring the therapeutic effect of an anti-inflammatory drug, comprising: An animal according to any one of claims 1 to 5 is prepared, Administering to said animal said therapeutic treatment, in particular a medicament, A control animal that has received a glial virulence factor but has not been treated, and Compared to normal control animals treated with a therapeutic method but not receiving any glial toxic factor In comparison, the reduction or absence of the pathological signs defined in claims 1 to 3 Measuring the effectiveness of the treatment method by observing Method. 11. A method of treatment, particularly a method of measuring the therapeutic effect of a drug for treating multiple sclerosis, An animal according to any one of claims 1 to 5 is prepared, Administering to said animal said therapeutic treatment, in particular a medicament, A control animal that has received a glial virulence factor but has not been treated, and Compared to normal control animals treated with a therapeutic method but not receiving any glial toxic factor In comparison, the reduction or absence of the pathological signs defined in claims 1 to 3 Measuring the effectiveness of the treatment method by observing Method. 12. A method of treatment, in particular of a medicament, for the pathology of an animal according to any of claims 1 to 5. A method for evaluating the harm to the brain, that is, safety. Prepare the animal, Subjecting said animal to said therapeutic treatment; 4. The treatment by histopathological observation of pathological signs as defined in claims 1 to 3. Measuring the response of the method. 13. Induced or repaired by glial and / or glial A method for producing a monoclonal antibody against a decorated molecule, A B lymphocyte recovered from the animal according to any one of claims 1 to 5, which is hybridized. Fused with tumor cells suitable for doma generation, Causing the selected hybridoma to produce the antibody, Manufacturing method. 14． A glial virulence factor obtained by the production method according to claim 13, and Monoclonal for molecules induced or modified by the effects of glial virulence factors Antibodies.