JP2002542156A - Immunomodulatory glycopeptide - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 病気、特に癌、の治療又は診断において使用するためのT細胞の超増殖を引き起こす製品。一の態様において製品は、MUC1タンデム反復由来のアミノ酸配列を有する糖ペプチドである。製品はインビトロで細胞を処置するために用いられるか、又はアジュバントとして用いられる。 (57) [Summary] A product that causes T cell hyperproliferation for use in treating or diagnosing a disease, especially cancer. In one embodiment, the product is a glycopeptide having an amino acid sequence from a MUC1 tandem repeat. The product is used to treat cells in vitro or as an adjuvant.
Description
【0001】 本発明は、治療又は診断方法において使用するためのT細胞の超増殖(sup
er−proliferation)を引き起こす製品、そのような製品を同定
するアッセイ、当該製品及び当該製品を含有するワクチンにより処置したエック
スビボ(ex−vivo)の細胞、及び当該エックスビボの細胞に関する。[0001] The present invention relates to the hyperproliferation (sup) of T cells for use in therapeutic or diagnostic methods.
er-proliferation), assays to identify such products, ex-vivo cells treated with the products and vaccines containing the products, and the ex-vivo cells.
【0002】 免疫系は、抗原特異的な態様で、病原による感染又は癌の発生に対して応答す
ることができる。従って、適当な抗原によるワクチン接種は、感染及び癌の予防
又は治療に用いることができる。しかし、個体への抗原のみの投与はしばしば、
抗原に対して有効な免疫応答を発生させるのに不充分である。もし感染又は癌が
免疫抑制を生じると、これは特に当てはまる。従って、作られる免疫応答の規模
を増すため、抗原と共にアジュバントが投与される。The immune system is able to respond to infection by pathogens or the development of cancer in an antigen-specific manner. Thus, vaccination with the appropriate antigen can be used to prevent or treat infections and cancer. However, administration of an antigen alone to an individual is often
Insufficient to generate an effective immune response to the antigen. This is especially true if the infection or cancer results in immunosuppression. Thus, an adjuvant is administered with the antigen to increase the magnitude of the immune response produced.
【0003】 感染又は癌のもう一つの治療法は、養子免疫治療である。この方法では、イン
ビトロで作られ、かつ要求される抗原に対して特異的なT細胞が患者に投与され
る。これは一般的に、当該患者からT細胞を取り、増殖によりその数を増やし、
それらを患者に投与することにより行われる。しかし、要求される数までT細胞
をインビトロで複製することは困難である。[0003] Another treatment for infection or cancer is adoptive immunotherapy. In this method, T cells made in vitro and specific for the required antigen are administered to the patient. This generally involves taking T cells from the patient and increasing their number by expansion,
This is done by administering them to the patient. However, it is difficult to replicate T cells to the required number in vitro.
【0004】 発明者らはT細胞が(抗原にナイーブなT細胞さえも)刺激され、著しく大き
い程度にまで増殖することを例証した。この現象は、本明細書中で「超増殖(s
uper−proliferation)」と呼ばれる。そのようなT細胞の応
答を生じる物質を同定する方法(以下に説明する)が開発された。この方法によ
り同定された一定の製品のインビトロでのT細胞に対する効果が調べられた。[0004] The inventors have demonstrated that T cells (even T cells that are naive to antigen) are stimulated and proliferate to a significantly greater extent. This phenomenon is referred to herein as "superproliferation (s
upper-proliferation). Methods have been developed to identify substances that produce such T cell responses (described below). The effects of certain products identified by this method on T cells in vitro were examined.
【0005】 T細胞の超増殖を生じる製品はワクチンアジュバントとして、又はインビトロ
においてT細胞を大きな数まで複製するために用いることができる。当該製品は
、製品自体に対して特性を有する免疫応答を作るため、又は当該製品自体に対す
るものか若しくはそうではないT細胞の応答の検出において用いることもできる
。[0005] Products that produce T cell hyperproliferation can be used as vaccine adjuvants or to replicate large numbers of T cells in vitro. The product can also be used to generate an immune response with properties against the product itself, or in detecting the response of a T cell to or from the product itself.
【0006】 したがって、本発明は、人間又は動物の体の療法による治療方法において使用
するため、又は人間又は動物の体の診断方法において使用するための、T細胞の
超増殖を引き起こす、製品を提供する。Accordingly, the present invention provides a product that causes T cell hyperproliferation for use in a method of treatment of a human or animal body by therapy or for use in a method of diagnosing the human or animal body. I do.
【0007】 本発明はまた、インビトロで細胞を処置するための当該製品の使用を提供する
。本発明は、当該製品により処置したエックスビボの細胞を提供する。本発明は
加えて、抗原性成分及びアジュバントとして本発明の製品を含有するワクチンを
提供する。[0007] The invention also provides the use of the product for treating cells in vitro. The present invention provides ex vivo cells treated with the product. The present invention additionally provides a vaccine containing the product of the present invention as an antigenic component and an adjuvant.
【0008】 一の態様において、製品は癌細胞の表面上に存在する抗原を含有し、又は製品
は癌細胞に対して特異的なT細胞を刺激することができる。したがって、本発明
はまた、癌の予防又は治療のための医薬の製造における製品の使用を提供する。 本発明は添付の図面により説明される。[0008] In one embodiment, the product contains an antigen present on the surface of the cancer cells, or the product can stimulate T cells specific for the cancer cells. Accordingly, the present invention also provides the use of the product in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of cancer. The present invention is illustrated by the accompanying drawings.
【0009】 本発明の製品は一般的には一個の化合物であるが、しかし、それぞれが超増殖
を引き起こすのに貢献する、一又はそれ以上の活性化合物を含有する組成物であ
ってもよい。製品は典型的には少なくとも5つの水酸基を有し、例えば少なくと
も10、20若しくは30個の水酸基を有する。製品は典型的には、以下に議論
するペプチド上に一又はそれ以上の修飾を有する。The product of the invention is generally a single compound, but may also be a composition containing one or more active compounds, each of which contributes to causing hyperproliferation. The product typically has at least 5 hydroxyl groups, for example, at least 10, 20 or 30 hydroxyl groups. The product typically has one or more modifications on the peptides discussed below.
【0010】 本発明の一定の製品は、一又はそれ以上の異なるMHCクラスI又はクラスI
I分子に結合する。一の態様において製品は抗原提示細胞又はT細胞上の受容体
、例えば糖ペプチドに結合できる受容体、に結合し得る。マクロファージのC型
レクチンがそのような受容体の一例である(例えば文献1に記載されている)。
受容体に結合した後、製品は典型的に抗原提示細胞に取り込まれ、MHCクラス
I又はクラスII分子に結合した細胞表面に提示される。[0010] Certain products of the present invention may comprise one or more different MHC Class I or Class I
Binds to the I molecule. In one embodiment, the product can bind to a receptor on the antigen presenting cell or T cell, for example, a receptor capable of binding a glycopeptide. Macrophage C-type lectin is an example of such a receptor (eg, as described in reference 1).
After binding to the receptor, the product is typically taken up by antigen presenting cells and displayed on the cell surface bound to MHC class I or class II molecules.
【0011】 本発明の一定の製品は、ペプチドであるか、又はペプチドを含有する。当該ペ
プチドは天然に生じるタンパク質、例えば人間、動物又は病原由来のもの、由来
の配列を有していてもよく、したがって、そのようなタンパク質の断片であって
もよい。当該タンパク質は典型的には、現実にグリコシル化されているものであ
る。一の態様において、当該タンパク質は腫瘍細胞において異なる形態で生じる
ものであり、例えば、腫瘍細胞においてグリコシル化の異なるパターンを有する
ものである。当該タンパク質は典型的には、細胞表面に発現されるものである。Certain products of the present invention are or contain a peptide. The peptide may have a sequence derived from a naturally occurring protein, for example from humans, animals or pathogens, and may therefore be a fragment of such a protein. The protein is typically one that is actually glycosylated. In one embodiment, the protein occurs in a different form in the tumor cell, eg, has a different pattern of glycosylation in the tumor cell. The protein is typically one that is expressed on the cell surface.
【0012】 一の態様において、タンパク質はMUC1である。従って、タンパク質はMU
C1の反復配列からのアミノ酸配列を有していてもよく、例えば、配列N−Al
a−His−Gly−Val−Thr−Ser−Ala−Pro−Asp−Th
r−Arg−Pro−Ala−Pro−Gly−Ser−Thr−Ala−Pr
o−Pro−Ala−His−Gly−Val−Thr−Ser−Ala−Pr
o−Asp−Thr−Arg−Pro−Ala−Pro−Gly−Ser−Th
r−Ala−Pro−Pro−Ala−C(配列番号2)、又はこの配列の断片
を有していてもよい。好ましい断片は、N−Ala−His−Gly−Val−
Thr−Ser−Ala−Pro−Asp−Thr−Arg−Pro−Ala−
Pro−Gly−Ser−Thr−Ala−Pro−Pro−Ala−C(配列
番号1)である。[0012] In one embodiment, the protein is MUC1. Therefore, the protein is MU
It may have an amino acid sequence from the repetitive sequence of C1, for example, the sequence N-Al
a-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Th
r-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pr
o-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pr
o-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Th
It may have r-Ala-Pro-Pro-Ala-C (SEQ ID NO: 2), or a fragment of this sequence. A preferred fragment is N-Ala-His-Gly-Val-
Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-
It is Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-C (SEQ ID NO: 1).
【0013】 当該ペプチドの配列は、上記のペプチドのいずれかと、例えば少なくとも70
%の相同性(ホモロジー)等の、相同性を有しており、好ましくは、少なくとも
80、90、95、97又は99%の相同性を、例えば少なくとも20個、好ま
しくは、少なくとも30個、例えば40、60、又は100個又はそれ以上の連
続するアミノ酸の領域に渡って有する。タンパク質の相同性を測る方法は、当該
技術分野において周知であり、当業者よって相同性はアミノ酸同一性(アイデン
ティティー)に基づいて計算される(時々「ハードホモロジー」と呼ばれる)も
のと理解される。[0013] The sequence of the peptide may be any of the above peptides, eg, at least 70
% Homology, preferably at least 80, 90, 95, 97 or 99% homology, for example at least 20, preferably at least 30, for example It has over a region of 40, 60, or 100 or more contiguous amino acids. Methods for measuring protein homology are well-known in the art, and it is understood by those skilled in the art that homology is calculated based on amino acid identity (sometimes referred to as "hard homology"). .
【0014】 例えば、UWGCGパッケージ(2)は相同性を計算する(例えばデフォルト
の設定上で使用される)ために使用することができるBESTFITプログラム
を提供する。例えば、アルツクル(Altschul)S.F.(1993)J
Mol Evol,36:290−300;アルツクル,S.F.ら(199
0)J Mol Biol 215:403−10に記載のように、相同性又は
ラインアップ(line up)配列を計算するためPILEUP及びBLAS
Tアルゴリズムを使用することができる(典型的にはデフォルトの設定上で)。For example, the UWGCG package (2) provides a BESTFIT program that can be used to calculate homology (eg, used on default settings). For example, Altschul S. et al. F. (1993) J
Mol Evol, 36: 290-300; F. (199
0) PILEUP and BLAS to calculate homology or line up sequences as described in J Mol Biol 215: 403-10.
The T algorithm can be used (typically on the default settings).
【0015】 BLAST分析を実行するためのソフトウェアはナショナル・センター・フォ
ー・バイオテクノロジー・インフォメーション(http://www.ncb
i.nlm.nih.gov/)を通じて公衆に入手可能である。このアルゴリ
ズムは第一に、問題の配列中の長さWの短い単語であって、データベースの配列
中の同じ長さの単語と並べた時に、一定の正の値を付した閾値スコアTに合致す
るか、又は満足する上記単語を同定することにより、ハイスコアペア(HSPs
)を同定することを含む。Tは、近隣単語スコア閾値(neighbourho
od word score threshold)として言及される(アルツ
クルら、上)。これらの初期の近隣単語のヒットは、それらを含むHSPsを見
つけるためのサーチを開始する種(シーズ)として働く。単語のヒットは、累積
的な並びのスコアが増える限り、各配列の両方の方向へと伸長される。単語ヒッ
トの各方向への伸長は、累積的な並びのスコアがその達成された最大値からXの
量だけ落ちた時;一又はそれ以上の負のスコアを与える残基の並びによって、累
積的なスコアがゼロ又はそれ以下になった時;又はいずれかの配列の末端に到達
した時、に終了する。BLASTアルゴリズムのパラメーターW、T及びXによ
り整列の感度及び速度が決まる。BLASTプログラムは、デフォルトとして、
単語長(W)11、BLOSUM62スコア付けマトリックス(ヘニコッフ(H
enikoff)とヘニコッフ(1992)、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA89:10915−10919を参照されたい)の整列(B)5
0、予測数量(expectation)(E)10、M=5、N=4及び両ス
トランドの比較を使用する。[0015] Software for performing BLAST analysis is available at the National Center for Biotechnology Information (http: //www.ncb).
i. nlm. nih. It is available to the public through gov /). The algorithm firstly finds a short word of length W in the sequence in question that, when aligned with words of the same length in the sequence of the database, matches a threshold score T with a constant positive value. Or by identifying the words that are satisfactory, the high score pair (HSPs
). T is the neighborhood word score threshold (neighbourho
Odd word score threshold (Artzl et al., supra). These initial neighborhood word hits serve as seeds that initiate a search to find HSPs containing them. Word hits are extended in both directions of each sequence as long as the cumulative alignment score increases. Expansion of a word hit in each direction is cumulative when the score of the cumulative sequence falls below its achieved maximum by an amount of X; by the sequence of residues giving one or more negative scores. Ends when the score is zero or less; or when the end of any sequence is reached. The parameters W, T and X of the BLAST algorithm determine the sensitivity and speed of the alignment. The BLAST program, by default,
Word length (W) 11, BLOSUM62 scoring matrix (Henikov (H
Enikoff) and Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 10915-10919) (B) 5
Use 0, expected (E) 10, M = 5, N = 4 and a comparison of both strands.
【0016】 BLASTアルゴリズムは、二つの配列の類似性(similarity)の
統計的分析を実行する;例えば、カーリン(Karlin)とアルツクル(Al
tschul)(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
90:5873−5787を参照されたい。BLASTアルゴリズムにより提供
される類似性の一つの測定は、最小合計確率(the smallest su
m probability、P(N))であり、それは二つのヌクレオチド又
はアミノ酸配列の間の合致が生じ得る確率の指標を提供する。例えば、配列は第
一の配列と第二の配列との比較において、最小合計確率が約1より小さい場合、
好ましくは約0.1より小さい場合、より好ましくは約0.01より小さい場合
、そして最も好ましくは約0.001より小さい場合に類似すると考えられる。The BLAST algorithm performs a statistical analysis of the similarity of two sequences; for example, Karlin and Alzul
tschul) (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90: 5873-5787. One measure of similarity provided by the BLAST algorithm is the minimum sum su
m probability, P (N)), which provides an indication of the probability that a match between two nucleotide or amino acid sequences can occur. For example, if a sequence has a minimum sum probability of less than about 1 in a comparison between a first sequence and a second sequence,
Preferably it is similar to less than about 0.1, more preferably less than about 0.01, and most preferably less than about 0.001.
【0017】 相同なペプチドは典型的には、置換、挿入又は欠失により元の配列と異なり、
例えば、1、2、3、4、5から8個又はそれ以上の置換、欠失又は挿入である
。置換は好ましくは「保存的」である。これらは、下記表に従って定義される。
第2列の同じブロック中のアミノ酸、及び好ましくは第3の欄の同じ列中のアミ
ノ酸は互いに置換され得る。 Homologous peptides typically differ from the original sequence by substitutions, insertions or deletions,
For example, 1, 2, 3, 4, 5 to 8 or more substitutions, deletions or insertions. Substitutions are preferably "conservative." These are defined according to the table below.
Amino acids in the same block in the second row, and preferably in the same row in the third column, can be substituted for each other.
【0018】 相同なペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列は、典型的には元のペプ
チドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズする。それは、バックグラ
ウンドよりも顕著に上のレベルでハイブリダイズする。その相互作用により発生
するシグナルのレベルは典型的に、「バックグラウンド」のハイブリダイゼーシ
ョンの少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍の強さである。相互作
用の強さは、例えば、プローブを放射線標識する(例えば32Pによる)ことによ
り計測される。選択的なハイブリダイゼーションは典型的には、高いストリンジ
ェンシーにした媒体の条件(例えば、約50℃から約60℃において、0.03
M塩化ナトリウム及び0.003Mクエン酸ナトリウム)を使用することにより
達成される。[0018] The sequence of the polynucleotide encoding the homologous peptide typically hybridizes to the polynucleotide encoding the original peptide. It hybridizes at a level significantly above background. The level of signal generated by the interaction is typically at least 10 times, preferably at least 100 times as strong as "background" hybridization. The strength of the interaction is measured, for example, by radiolabeling the probe (eg with 32 P). Selective hybridization is typically carried out under conditions of high stringency media (eg, at about 50 ° C. to about 60 ° C., at 0.03 ° C.).
M sodium chloride and 0.003 M sodium citrate).
【0019】 当該ペプチド(又は上記で言及した断片)は一般的に、少なくとも15個のア
ミノ酸、例えば、少なくとも20、21、22、25、30、40、60、又は
80のアミノ酸、の長さを有する。当該ペプチドは典型的に、例えば天然に生じ
るか又は天然に生じない修飾等による、修飾されている。当該修飾は、例えば、
1、2、3、4又はそれ以上の炭水化物部分のペプチドへの(例えば、当該ペプ
チドの異なるアミノ酸への)付加等による、グリコシル化でもよい。当該炭水化
物部分は典型的に、単糖、二糖、三糖又は多糖の形態にある、天然の及び/又は
非天然の糖を含む。当該部分中に存在する糖はアルドース及び/又はケトースで
ある。当該炭水化物部分は一般的に、テトロース、ペントース、ヘキソース、又
はヘプトースである糖を有する。当該糖は典型的に、Glu、Gal又はGal
Nacである。好ましい部分は、Gal−GalNac(Galβ1−3Gal
Nacα)である。もし、当該ペプチドが天然産生のタンパク質由来のアミノ酸
配列を有するならば、当該配列中に、当該タンパク質の天然産生する形態中に存
在する一又はそれ以上の修飾(例えばグリコシル化のパターン)もまた含む。当
該ペプチドは典型的に、天然産生のタンパク質中の相当する配列中に存在するよ
り少ないグルコシル化(例えば天然産生配列中に存在する糖の80%、50%又
は30%より少ない)を有する。当該ペプチド中に存在する修飾(複数でもよい
)は典型的に、当該タンパク質が非腫瘍細胞又は腫瘍細胞に存在している場合と
同じである。The peptide (or fragment referred to above) generally has a length of at least 15 amino acids, for example, at least 20, 21, 22, 25, 30, 40, 60 or 80 amino acids. Have. The peptide is typically modified, for example, by a naturally occurring or non-naturally occurring modification. The modification is, for example,
Glycosylation, such as by the addition of one, two, three, four or more carbohydrate moieties to the peptide (eg, to different amino acids of the peptide) may be used. Such carbohydrate moieties typically include natural and / or non-natural sugars, in the form of mono-, di-, tri- or polysaccharides. The sugar present in the moiety is aldose and / or ketose. The carbohydrate moiety generally has a sugar that is tetroses, pentoses, hexoses, or heptose. The sugar is typically Glu, Gal or Gal.
Nac. A preferred moiety is Gal-GalNac (Galβ1-3Gal
Nacα). If the peptide has an amino acid sequence derived from a naturally-occurring protein, the sequence also includes one or more modifications (eg, a pattern of glycosylation) present in the naturally-occurring form of the protein. . Such peptides typically have less glucosylation than is present in the corresponding sequence in naturally occurring proteins (eg, less than 80%, 50% or 30% of the sugars present in the naturally occurring sequence). The modification (s) present in the peptide is typically the same as when the protein is present in a non-tumor or tumor cell.
【0020】 炭水化物部分は一般的に、ペプチド中のセリン、トレオニン、又はアスパラギ
ン残基に結合し、典型的には当該ペプチドにO−結合又はN−結合する。当該部
分は一般的に、α又はβ結合によりペプチドに結合する。[0020] The carbohydrate moiety generally binds to a serine, threonine, or asparagine residue in the peptide, and is typically O- or N-linked to the peptide. Such moieties are typically linked to the peptide by an α or β bond.
【0021】 ペプチドが配列番号1の配列、又は相同の配列を有する時、修飾は典型的に、
10位及び/又は17位上にある(つまり、ペプチドのN末端からそれぞれ10
番目及び17番目の残基)か、又は相同性のペプチドの相当する位置にある。好
ましい製品は、Gal−GalNac(Galβ1−3GalNacα)又はG
alNac(N−アセチルガラクトースアミンα)部分を10位のThr又は1
7位のThr上に有する、配列番号1のアミノ酸配列を有する糖ペプチドを含有
する。この糖ペプチドは、本明細書中で、「10,17糖ペプチド」として言及
される。従って一の好ましい態様において、製品は、表2中に示されるペプチド
A2、A2GalNac又はA3である。When the peptide has the sequence of SEQ ID NO: 1, or a homologous sequence, the modification is typically
On positions 10 and / or 17 (ie, 10
Residues 17 and 17) or the corresponding position of the homologous peptide. Preferred products are Gal-GalNac (Galβ1-3GalNacα) or G-GalNac.
alNac (N-acetylgalactosamine α) moiety is replaced with Thr or 1 at position 10.
It contains a glycopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 on Thr at position 7. This glycopeptide is referred to herein as "10,17 glycopeptide". Thus, in one preferred embodiment, the product is peptide A2, A2GalNac or A3 shown in Table 2.
【0022】 一定の製品は、10、17糖ペプチドの特定の結合剤に結合することができる
。そのような特定の結合剤は、以下に記述するアッセイにおいて超増殖を生じさ
せるために10、17糖ペプチドが結合する、T細胞上の受容体であってもよい
。特定の結合剤は10、17糖ペプチドに対して特異的な抗体であってもよい。
そのような抗体は常習的な方法、例えば以下に記述する方法により作製し得る。
特定の結合剤は一般的に、以下に記述するアッセイにおいて10,17糖ペプチ
ドにより生じる超増殖を阻害することができる。10,17糖ペプチドの特定の
結合剤に結合することができる製品は一般的に、特定の結合剤又はT細胞への結
合において、10,17糖ペプチドと競合し、したがって、10,17糖ペプチ
ドの特定の結合剤又はT細胞への結合を阻害する。Certain products can be conjugated to a specific binding agent of the 10,17 glycopeptide. Such a specific binding agent may be a receptor on a T cell to which the 10,17 glycopeptide binds to cause hyperproliferation in the assays described below. Particular binding agents may be antibodies specific for the 10,17 glycopeptide.
Such antibodies can be produced by conventional methods, for example, the methods described below.
Certain binding agents are generally capable of inhibiting the hyperproliferation caused by the 10,17 glycopeptide in the assays described below. Products that can bind 10,17 glycopeptides to a particular binder generally compete with the 10,17 glycopeptide for binding to a particular binder or T cell, and thus Inhibit binding to certain binding agents or T cells.
【0023】 本発明の製品は、(i)Gly−Val−Thr−Ser−Alaモチーフの
Thr、又は(ii)Gly−Ser−Thr−Ala−ProモチーフのSe
r及び/又はThrに結合しているGalNac又はGalNac−シアル酸を
有する、MUC1のタンデム反復由来の配列(例えば、配列番号1若しくは配列
番号2又はそれらの断片)を有するペプチドを含んでいても、含んでいなくても
よい。The product of the present invention can be obtained by (i) Thr of the Gly-Val-Thr-Ser-Ala motif, or (ii) Se of the Gly-Ser-Thr-Ala-Pro motif.
or a peptide having a sequence from a tandem repeat of MUC1 (e.g., SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof) having GalNac or GalNac-sialic acid bound to r and / or Thr, It may not be included.
【0024】 T細胞の超増幅を引き起こす本発明の製品は、以下に記載するアッセイにおい
て使用した場合に、少なくとも10又はそれ以上の刺激指標(stimulat
ion index)を与えるものである。当該製品はしたがって、このアッセ
イにおいて少なくとも15、20、30、50、80、100、200又はそれ
以上の刺激指標を与える。The product of the invention that causes T cell hyperexpansion, when used in the assays described below, has a stimulant index of at least 10 or more.
ion index). The product thus provides at least 15, 20, 30, 50, 80, 100, 200 or more stimulation indicators in this assay.
【0025】超増殖アッセイ 健康な人間のドナー由来の血液20mlから末梢血液リンパ球(PBL)を調
製する。PBLを含有するバッフィコート(軟膜)を、フィコール(Ficol
l)勾配を用いた遠心分離により他の血液成分から分離する。この方法で分離し
たPBLは抗原提示細胞を含有する。2×105のPBLを200μlのAIM
V培地及び50μg/mlの候補の物質(使用されたAIM V培地は典型的
には、ギブコBRL(GIBCO BRL)のCat.No.12030−01
1である)96ウェルのプレートのウェルに加える。対照ウェルは同じ方法によ
り作るが、候補の物質を含有しない。ウェルを37℃で96時間インキュベート
する。次に、3Hチミジンの1μCiをウェルに加え、37℃で18時間の更な
るインキュベーションを行う。当該細胞を回収し、チミジンの取り込みを測定す
る。刺激指標は、候補の物質について得られた平均カウントを、対照ウェル中の
細胞について得られた平均カウントで割ることにより計算される。Hyperproliferation Assay Peripheral blood lymphocytes (PBL) are prepared from 20 ml of blood from a healthy human donor. Buffy coat (buffy coat) containing PBL was applied to Ficoll (Ficol).
l) Separate from other blood components by centrifugation using a gradient. PBLs isolated in this manner contain antigen presenting cells. 2 × 10 5 PBLs into 200 μl AIM
V medium and 50 μg / ml of the candidate substance (AIM V medium used is typically GIBCO BRL Cat. No. 12030-01).
Add 1) to the wells of a 96-well plate. Control wells are made by the same method but do not contain the candidate substance. Incubate the wells at 37 ° C. for 96 hours. Next, 1 μCi of 3 H thymidine is added to the wells and a further incubation at 37 ° C. for 18 hours is performed. The cells are collected and thymidine incorporation is measured. The stimulation index is calculated by dividing the average count obtained for the candidate substance by the average count obtained for cells in control wells.
【0026】 一定の製品の場合、超増殖は、MHCクラスI分子に結合する抗体及び/又は
MHCクラスII分子に結合する抗体、例えばクラスI分子に結合するW632
抗体又はクラスII分子に結合するTal 3c3、により阻害される。For certain products, hyperproliferation is achieved by binding antibodies to MHC class I molecules and / or antibodies to MHC class II molecules, such as W632 binding to class I molecules.
Inhibited by Tal 3c3, which binds to antibodies or class II molecules.
【0027】 製品は典型的には、製品により処理され得る(例えば50μg/mlの濃度で
)、以下に記載するT細胞のいずれの超増殖をも引き起こす。The product will typically cause any hyperproliferation of the T cells described below, which can be treated with the product (eg, at a concentration of 50 μg / ml).
【0028】 本発明の製品は上記のアッセイにおいて超増殖を引き起こす。それらはインビ
ボでのT細胞の超増殖又はアッセイにおいて使用されるT細胞とは異なるT細胞
の超増殖を引き起こすか、又は引き起こさない。しかしながら、一般的に本発明
の製品は、他のT細胞の超増殖又はアッセイにおける条件以外の条件におけるT
細胞の超増殖をも生じる。The product of the present invention causes hyperproliferation in the above assay. They cause or do not cause T cell hyperproliferation in vivo or T cell hyperproliferation different from the T cells used in the assay. However, in general, the products of the present invention may be useful for T cell hyperproliferation or T conditions in conditions other than those in assays.
It also results in cell hyperproliferation.
【0029】 発明者等は、げっ歯動物細胞(例えばマウス又はラット細胞)が一定の本発明
の製品により処置された場合、これらの細胞が超増殖を起こさないことを示した
。したがって、製品はげっ歯動物のT細胞の超増殖を引き起こすかもしれないし
引き起こさないかもしれない。したがって、もし上記のアッセイにおいて、げっ
歯動物のT細胞の超増殖を引き起こさない製品が(げっ歯動物のT細胞に)用い
られた場合、一般的に刺激指標は10以下、例えば8、6、4、2又は1になる
。The inventors have shown that when rodent cells (eg, mouse or rat cells) are treated with certain products of the invention, they do not undergo hyperproliferation. Thus, the product may or may not cause rodent T cell hyperproliferation. Thus, if a product that does not cause rodent T cell hyperproliferation is used (for rodent T cells) in the above assay, the stimulation index will generally be less than 10, for example 8, 6, 4, 2 or 1.
【0030】 本発明の製品は、当該技術分野の熟練者に周知の従来の方法により製造され得
る。ペプチドは新規に合成されても、又は従来の方法により適当な発現系におけ
る転写及びDNAの翻訳若しくはRNAの翻訳により製造されてもよい。新規な
化合物である製品は、合成有機化学の公知技術により製造される。糖ペプチドを
作製する方法は当該技術分野において公知である(3)。製品が糖ペプチドであ
るか、又は糖ペプチドを含む場合、炭水化物側鎖は典型的には、適当なグリコシ
ルトランスフェラーゼ(複数でもよい)を用いて糖ペプチドに付加される。典型
的に炭水化物側鎖は、糖類単位の段階的な付加によりペプチド上に構築される。
例えば、もしペプチドに直接付加された糖類単位がGalNacならば、これは
UDP−GalNac及びペプチドをポリペプチド−GalNac−トランスフ
ェラーゼに提供することにより、ペプチド中のトレオニン又はセリンに付加され
る。The products of the present invention can be manufactured by conventional methods well known to those skilled in the art. Peptides may be synthesized de novo or produced by conventional methods by transcription and translation of DNA or RNA in a suitable expression system. Products which are novel compounds are manufactured by known techniques of synthetic organic chemistry. Methods for making glycopeptides are known in the art (3). If the product is, or comprises, a glycopeptide, the carbohydrate side chains are typically added to the glycopeptide using a suitable glycosyltransferase (s). Typically, carbohydrate side chains are built on peptides by the stepwise addition of saccharide units.
For example, if the saccharide unit directly added to the peptide is GalNac, it is added to threonine or serine in the peptide by providing UDP-GalNac and the peptide to the polypeptide-GalNac-transferase.
【0031】 本明細書において、「刺激(stimulation)」なる語は、T細胞表
面上の受容体が製品と接触した後、T細胞の活性化を起こすことをいう。活性化
は、T細胞の分化及び/又は増殖を包含し得る。活性化は、T細胞の分泌又はそ
のサイトカインの分泌を開始させる。活性化は抗原特異的でも、非特異的でもよ
い。非特異的であるとき、異なる抗原に対して特異的なT細胞受容体を有する異
なるT細胞が刺激され、増殖する。したがって、刺激されたT細胞はモノクロー
ナルか、又はポリクローナルである。As used herein, the term “stimulation” refers to the activation of a T cell after the receptor on the surface of the T cell contacts the product. Activation may include T cell differentiation and / or proliferation. Activation initiates the secretion of T cells or their cytokines. Activation may be antigen-specific or non-specific. When non-specific, different T cells with T cell receptors specific for different antigens are stimulated and proliferate. Thus, the stimulated T cells are monoclonal or polyclonal.
【0032】 一定の製品はMHCクラスI又はII分子上でT細胞に提示される。刺激は、
T細胞に製品を提示するMHCクラスI又はII分子に関して、特異的でも、非
特異的でもよい。刺激により生じる増殖は、超増殖であってもよい。[0032] Certain products are presented to T cells on MHC class I or II molecules. The stimulus is
It may be specific or non-specific with respect to the MHC class I or II molecule presenting the product to T cells. Proliferation caused by the stimulus may be superproliferation.
【0033】 刺激は一次T細胞(抗原についてナイーブ)又は二次T細胞(抗原について経
験済み)であってもよい。一般的に一次T細胞は、それらが持つT細胞受容体に
より認識される抗原に、未だ暴露されていない。二次T細胞は、T細胞受容体に
より認識される抗原に対する暴露に応答した、一次T細胞の増殖により、一次T
細胞から形成される。T細胞はCD4又はCD8陽性である。一の態様において
、T細胞はMHCクラスII又はクラスI制限の方法で製品を認識する。CD4
T細胞はTh1又はTh2型の細胞であり、Th1が好ましい。T細胞は細胞毒
性T細胞であってもよい。The stimulus may be primary T cells (naive for antigen) or secondary T cells (experienced for antigen). In general, primary T cells have not yet been exposed to antigens recognized by their T cell receptors. Secondary T cells undergo primary T cell proliferation in response to exposure to antigens recognized by T cell receptors, resulting in primary T cells.
Formed from cells. T cells are CD4 or CD8 positive. In one embodiment, the T cells recognize the product in an MHC class II or class I restricted manner. CD4
T cells are Th1 or Th2 type cells, with Th1 being preferred. The T cells may be cytotoxic T cells.
【0034】 T細胞は、リンホカイン−活性化キラー(LAK)細胞であってもよい。LA
K細胞の製造は当該技術分野において公知である(8)。これらの細胞は一般的
に末梢血液リンパ球をIL−2で処理することにより製造される。T細胞は腫瘍
浸透リンパ球(TIL)であってもよい。TILは、IL−2中において分離し
た腫瘍を培養し、次に製造された分化したリンパ芽球を分離することにより製造
される。TILを製造する一つの方法は以下に記載される。T細胞は腫瘍を流出
させるリンパ節由来であってもよい。[0034] The T cells may be lymphokine-activated killer (LAK) cells. LA
Production of K cells is known in the art (8). These cells are generally produced by treating peripheral blood lymphocytes with IL-2. The T cells may be tumor penetrating lymphocytes (TIL). TILs are produced by culturing dissociated tumors in IL-2 and then isolating the produced differentiated lymphoblasts. One method for producing TIL is described below. T cells may be derived from lymph nodes that drain the tumor.
【0035】 T細胞は、ウイルス、細菌又は菌類などの、病原からの抗原に対し特異的なT
細胞受容体を有していてもよい。T細胞受容体は癌抗原、例えば以下で言及する
癌のいずれかの細胞により製造されるもの、に対して特異的であってもよい。T cells are specific for antigens from pathogens, such as viruses, bacteria or fungi.
It may have a cell receptor. The T cell receptor may be specific for a cancer antigen, such as those produced by cells of any of the cancers mentioned below.
【0036】 本発明はインビトロで細胞を処置するための製品の使用を提供する。当該細胞
は、細胞を製品と接触させることを含む方法で処置される。当該方法において典
型的には、製品は少なくとも0.1μg/mlの濃度、例えば、(少なくとも若
しくは約)1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml,100μg/ml
、1000μg/ml又はそれ以上である。細胞は典型的には、細胞が一般的に
その天然の機能に従って製品と相互作用し得るように、例えば細胞が製品により
刺激され得るように、又は細胞がその表面に製品を提示し得るように、細胞が生
存し続けるような条件下で(及び典型的には細胞が機能的に活性であり続けられ
るような条件下で)少なくとも0.5時間、例えば(少なくとも若しくは約)2
、10、24、48、96時間又はそれ以上、製品に接触させる。処置される細
胞は一般的に上記の通りのT細胞又は抗原提示細胞である。The present invention provides the use of the product for treating cells in vitro. The cells are treated in a manner that includes contacting the cells with a product. Typically in the method, the product is at a concentration of at least 0.1 μg / ml, for example (at least or about) 1 μg / ml, 10 μg / ml, 50 μg / ml, 100 μg / ml
, 1000 μg / ml or more. The cell is typically such that the cell can interact with the product according to its natural function, e.g., the cell can be stimulated by the product, or the cell can present the product on its surface. For at least 0.5 hour, such as (at least or about) 2 hours, under conditions such that the cells remain viable (and typically under conditions such that the cells remain functionally active).
Contact product for 10, 24, 48, 96 hours or more. The cells to be treated are generally T cells or antigen presenting cells as described above.
【0037】 製品は、T細胞及び抗原提示細胞を含む細胞の集団(例えば、本発明の組成物
について以下に記載する量である)を処置するために用いることができる。処置
されるべき細胞は一般的に人間又は動物から誘導される。細胞は健康な個体由来
でも、病気のリスクがない、又はある個体由来でもよい。個体は病気を持ってい
てもよい。個体が腫瘍を有している場合、細胞は血液由来若しくは腫瘍の付近由
来であるか、又は腫瘍を浸透した細胞であってもよい。細胞は、リンパ節等のリ
ンパ系由来でもよい。リンパ節は腫瘍からリンパ液を受け取るものでもよい。The product can be used to treat a population of cells, including T cells and antigen presenting cells, eg, in the amounts described below for the compositions of the invention. The cells to be treated are generally derived from humans or animals. The cells can be from a healthy individual, at no risk of disease, or from an individual. The individual may have a disease. If the individual has a tumor, the cells may be blood-derived or near the tumor, or may be cells that have penetrated the tumor. The cells may be from the lymphatic system, such as a lymph node. The lymph nodes may receive lymph from the tumor.
【0038】 T細胞の場合、一般的に製品はT細胞の刺激を引き起こす。上記の通り、刺激
は超増殖を引き起こすことができ、従って本発明は製品をT細胞に接触させるこ
とを含むT細胞の超増殖を引き起こす方法を提供する。一般的にT細胞の刺激の
間、抗原提示細胞もまた存在し、そしてこれらは、例えばMHCクラスI又はI
I分子に結合した、製品をT細胞に提示し得る。一定の製品は抗原提示細胞の不
在の下でT細胞を刺激することができる。In the case of T cells, the product generally causes stimulation of the T cells. As noted above, the stimulus can cause hyperproliferation, and thus the present invention provides a method of causing hyperproliferation of T cells, comprising contacting the product with T cells. Generally during antigen stimulation of T cells, antigen presenting cells are also present and these are, for example, MHC class I or I
The product linked to the I molecule may be presented to T cells. Certain products can stimulate T cells in the absence of antigen presenting cells.
【0039】 本発明の方法において、T細胞は他の薬剤で付加的に処理されてもよい。これ
らの他の薬剤は製品により引き起こされる刺激を促進し得るか、又は特定のT細
胞にのみ刺激を生じさせ得る。そのような薬剤には、例えばIL−2又はIL−
7等のサイトカイン;鍵穴笠貝(keyhole limpet)シアニン又は
本明細書中で言及する他のアジュバント等のアジュバント;或いは、T細胞によ
り認識される抗原が包含される。上記の通り一般的に、T細胞刺激の間、抗原提
示細胞が存在する。しかしながら、薬剤はまた、例えばCD8T細胞が刺激され
る場合のCD4T細胞のように、他の細胞も包含しうる。In the method of the present invention, T cells may be additionally treated with other drugs. These other agents may enhance the irritation caused by the product, or may cause irritation only to certain T cells. Such agents include, for example, IL-2 or IL-
Adjuvants such as keyhole limpet cyanine or other adjuvants referred to herein; or antigens recognized by T cells. As described above, generally during T cell stimulation, antigen presenting cells are present. However, the agent may also include other cells, for example, CD4 T cells when CD8 T cells are stimulated.
【0040】 本方法において、T細胞の刺激は、刺激に応答してT細胞が増殖する条件下で
ある。したがって、当該方法は個体から採取されたT細胞を「成長」(つまり数
を増やす)させるために用いることができる。In the method, the stimulation of the T cells is under conditions under which the T cells proliferate in response to the stimulation. Thus, the method can be used to “grow” (ie, increase the number) of T cells collected from an individual.
【0041】 上記の通り、刺激されるT細胞は一次T細胞であってもよく、したがって、本
発明の方法はインビトロで一次T細胞応答を作り出す、つまり一次T細胞の増殖
を、増殖又は細胞毒アッセイにおいて検出可能な程度まで起こさせるために用い
られる。文献9は、例えばそのようなアッセイがどのように行われるか示す。As mentioned above, the stimulated T cells may be primary T cells, and thus the methods of the invention produce a primary T cell response in vitro, ie, increase the proliferation of primary T cells, Used to raise to a detectable extent in the assay. Reference 9 shows for example how such an assay is performed.
【0042】 本発明の方法においてT細胞の刺激は一般的にT細胞の増殖を引き起こすので
、当該方法は特定のT細胞、例えば特定の抗原に対して特異的なT細胞、を検出
するために使用することができる。一般的に特定の抗原に対して特異的なT細胞
の検出においては、抗原に応答する、T細胞の増殖、T細胞からの物質の分泌、
又はT細胞による標的細胞の殺害、が検出アッセイの規準として用いられる。し
かし、そのようなアッセイは、T細胞の検出感度において限界があり、低い濃度
で存在するT細胞の検出は不可能である。従って、本発明の製品はそのようなア
ッセイにおいて、それらT細胞の検出を助けるためのそのようなT細胞の増殖を
引き起こさせるのに使用することができる。T細胞が認識する抗原は製品そのも
のでもよい。Since the stimulation of T cells in the method of the present invention generally causes the proliferation of T cells, the method may be used to detect specific T cells, eg, T cells specific for a particular antigen. Can be used. In general, detection of T cells specific for a specific antigen involves proliferation of T cells, secretion of substances from T cells,
Alternatively, killing of target cells by T cells is used as a basis for a detection assay. However, such assays have limited sensitivity in detecting T cells, and cannot detect T cells present at low concentrations. Thus, the products of the present invention can be used in such assays to cause the proliferation of such T cells to aid in their detection. The antigen recognized by the T cell may be the product itself.
【0043】 従って、本発明の方法は製品に特異的なT細胞を検出するために用いることが
できる。当該方法はまた、製品に特異的でないT細胞検出するために用いること
ができる。そのような方法において、T細胞が特異的な抗原はT細胞にもまた提
供される。もし製品に特異的なT細胞応答が特定の病気の関に製造されるなら、
本発明の方法はこのT細胞の応答を検出するために使用することができ、したが
って、当該病気の診断においても使用することができる。特にそのような病気は
免疫抑制を引き起こす病気であり得る。当該病気は、例えば以下に議論する癌の
いずれかのような、病原又は腫瘍により引き起こされるものであってもよい。 一般的に病気を有する個体から採取されるT細胞であって、本方法において刺
激されるものは二次T細胞である。これらのT細胞は病気を起こす実体により製
造される抗原に特異的なものである。そのような実体は一般的に、病原又は腫瘍
である。Thus, the method of the present invention can be used to detect product specific T cells. The method can also be used to detect T cells that are not product specific. In such a method, a T cell specific antigen is also provided to the T cell. If a product-specific T cell response is produced for a particular disease,
The method of the present invention can be used to detect this T cell response, and thus can also be used in the diagnosis of the disease. In particular, such a disease can be a disease that causes immunosuppression. The disease may be caused by a pathogen or a tumor, for example, any of the cancers discussed below. Generally, T cells taken from a diseased individual and stimulated in the present method are secondary T cells. These T cells are specific for the antigen produced by the disease causing entity. Such an entity is generally a pathogen or a tumor.
【0044】 本発明の方法において処置される抗原提示細胞は、もともと専ら抗原提示細胞
として働く細胞、又はT細胞に製品を提示することができる、非天然の抗原提示
細胞であってもよい。抗原提示細胞は典型的には、樹状細胞、単球、マクロファ
ージ又はB細胞である。抗原提示細胞は、抗原を提示することができるWO93
/17095に記載されたショウジョウバエ細胞、CHO細胞、バキュロウイル
スに感染した昆虫細胞、細菌、イースト、又はワクシニアに感染した細胞であっ
てもよい。抗原提示系は(10)に基づく。一の態様において、樹状細胞はCD
34+幹細胞又はCD14+末梢血単球から、例えば、GM−CSF、IL−4
及びTNF−αを用いて、エックスビボで培養された。抗原提示細胞は、適当な
関係で、例えばMHCクラスI又はクラスII分子への結合して、T細胞に提示
されるために製品により処置される。したがって、抗原提示細胞の処置は一般的
に、抗原提示細胞が抗原を認識できるT細胞を刺激することができるようにする
。The antigen presenting cells to be treated in the method of the present invention may be cells that originally serve exclusively as antigen presenting cells, or non-naturally occurring antigen presenting cells capable of presenting a product to T cells. Antigen presenting cells are typically dendritic cells, monocytes, macrophages or B cells. Antigen presenting cells are capable of presenting antigens in WO93
Drosophila cells, CHO cells, baculovirus-infected insect cells, bacteria, yeast, or vaccinia-infected cells as described in US Pat. The antigen presentation system is based on (10). In one embodiment, the dendritic cells are CD
From 34+ stem cells or CD14 + peripheral blood monocytes, for example, GM-CSF, IL-4
And ex vivo using TNF-α. The antigen presenting cells are treated with the product to be presented to T cells in an appropriate relationship, eg, binding to an MHC class I or class II molecule. Thus, treatment of antigen presenting cells generally allows them to stimulate T cells that can recognize the antigen.
【0045】 処置される細胞は、空のMHCクラスI又はII分子をその表面に提示する細
胞であってもよい。そのような細胞はMHC提示において不完全であり得る。処
置されるT細胞はT2細胞でもよい。The cell to be treated may be a cell that presents empty MHC class I or II molecules on its surface. Such cells may be defective in MHC presentation. The T cells to be treated may be T2 cells.
【0046】 本発明のエックスビボ細胞は一般的に、製品により刺激されたT細胞か、又は
製品を提供された抗原提示細胞である。そのような細胞は本発明の方法により作
られ得る。T細胞の刺激は、抗原特異的であってもなくてもよく、したがって、
T細胞は製品を認識するT細胞受容体を有していても、いなくてもよい。T細胞
はT細胞のポリクローン性又はモノクローン性の集団中に存在していてもよい。
本発明のT細胞は上記T細胞の特徴のいずれかを有していてもよい。The ex vivo cells of the invention are generally T cells stimulated by the product or antigen presenting cells provided with the product. Such cells can be made by the method of the present invention. The stimulation of T cells may or may not be antigen-specific,
T cells may or may not have a T cell receptor that recognizes the product. The T cells may be in a polyclonal or monoclonal population of T cells.
The T cells of the present invention may have any of the above T cell characteristics.
【0047】 一般に本発明の抗原提示細胞は、その表面に、MHCクラスI又はクラスII
分子と連結して製品を保持する。一の態様において、抗原提示細胞は製品が載せ
られた少なくとも200の、例えば少なくとも若しくは約500又は1000の
、クラスI又はクラスII分子をその表面に有する。Generally, the antigen-presenting cell of the present invention has an MHC class I or class II on its surface.
Holds the product in conjunction with the molecule. In one embodiment, the antigen presenting cell has at least 200, such as at least or about 500 or 1000, class I or class II molecules on the surface on which the product is loaded.
【0048】 本発明の細胞は標識されていてもよく、又は標識チミジン又は放射性クロミウ
ムなど、標識を保持していてもよい。The cells of the invention may be labeled, or may carry a label, such as labeled thymidine or radioactive chromium.
【0049】 本発明はまた、T細胞、抗原提示細胞及び本発明の製品を含む組成物を提供す
る。T細胞又は抗原提示細胞は、上記の細胞のいずれかでもよい。T細胞:抗原
提示細胞の割合は典型的には500:1から1:500である。典型的には、組
成物1ミリリットルあたり、少なくとも103個の、例えば少なくとも若しくは
約105、106、107、108、109個の細胞が存在する。組成物はまた典型
的に、T細胞又は抗原提示細胞を支持することができる培地、例えばRPMI培
地を含む。培地はまた、IL−2、IL−4、IL−7又はTNF−α等のサイ
トカインを含有してもよい。T細胞及び抗原提示細胞は同じ個体由来でもよい。
組成物は単核細胞画分、例えば末梢血から分離されたもの、を含んでいてもよい
。The invention also provides a composition comprising a T cell, an antigen presenting cell and a product of the invention. T cells or antigen presenting cells may be any of the cells described above. The ratio of T cells to antigen presenting cells is typically from 500: 1 to 1: 500. Typically, there are at least 10 3 , for example at least or about 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 , 10 9 cells per milliliter of the composition. The composition also typically includes a medium that can support T cells or antigen presenting cells, such as RPMI medium. The medium may also contain cytokines such as IL-2, IL-4, IL-7 or TNF-α. T cells and antigen presenting cells may be from the same individual.
The composition may include a mononuclear cell fraction, for example, separated from peripheral blood.
【0050】 本発明のワクチンにおいて製品は抗原及び/又はアジュバントとして働く。も
しワクチンが製品に特異的な受容体を保持するT細胞の刺激に繋がる場合、一般
的に製品は抗原として働く。もしワクチンが製品に特異的なT細胞受容体を有し
ないT細胞の刺激に繋がる場合、製品はアジュバントとして働く。製品は、ワク
チンが投与される個体のMHCクラスI又はII型に依存するか又は依存しない
方法により抗原又はアジュバントとして働く。In the vaccine of the present invention, the product acts as an antigen and / or adjuvant. If the vaccine leads to the stimulation of T cells that retain the product-specific receptor, the product generally serves as an antigen. If the vaccine leads to the stimulation of T cells that do not have a product-specific T cell receptor, the product acts as an adjuvant. The product acts as an antigen or adjuvant in a manner that depends or does not depend on the MHC class I or II type of the individual to whom the vaccine is administered.
【0051】 製品がアジュバントとして使用されるワクチンでは抗原性成分は病原又は癌、
例えば本明細書中で議論された病原又は癌、由来であり得る。In vaccines where the product is used as an adjuvant, the antigenic component may be pathogen or cancer,
For example, it may be from a pathogen or cancer, as discussed herein.
【0052】 製品が抗原として使用されるワクチンでは、アジュバント成分は、抗体応答よ
りも、例えば上記T細胞のいずれかのT細胞応答等のT細胞応答(例えばCD4
又はCD8T細胞応答)の進行を好むものである。したがって、アジュバント成
分はIL−2又はIL−7等のサイトカイン、鍵穴笠貝ヘモシアニン(keyh
ole limpet hemocyanin)、破傷風毒素又はLAMPI(
例えば(12)に記載されたもの)を包含する。アジュバントは油滴エマルジョ
ン、スクアレン、または例えばミコバクテリウム・フレイ(例えば細胞壁骨格)
又はサルモネラ・ミネソタ(例えば、メノホスホリル脂質A)等の細菌の成分を
含む。アジュバントはデトックス(DetoxTM)であってもよい。In vaccines where the product is used as an antigen, the adjuvant component is more likely to be a T cell response (eg, CD4 response) than an antibody response, eg, a T cell response of any of the above T cells.
Or CD8 T cell response). Thus, the adjuvant component is a cytokine such as IL-2 or IL-7, keyhole limpet hemocyanin (keyh
ole limpet hemocyanin), tetanus toxin or LAMPI (
For example, those described in (12)) are included. The adjuvant may be an oil droplet emulsion, squalene, or, for example, Mycobacterium frei (eg, a cell wall skeleton).
Or bacterial components such as Salmonella minnesota (eg, menophosphoryl lipid A). The adjuvant may be Detox ™ .
【0053】 一の態様において、例えば(11)のように、アジュバントはリポソームであ
る。製品は、例えば(13)のように、製品をMHCクラスI又はII経路へと
向かわせる物質、例えばtatペプチド、に結合していてもよい。In one embodiment, as in (11), the adjuvant is a liposome. The product may be conjugated to a substance that directs the product to the MHC class I or II pathway, such as (13), for example, a tat peptide.
【0054】 ワクチンが人間又は動物に投与された時、抗体応答は起こるか又は起こらない
。抗体は製品に特異的であり得る。ワクチンが製品ではない抗原性成分を含有す
る時、抗体はそのような成分に特異的であり得る。When the vaccine is administered to a human or animal, an antibody response may or may not occur. Antibodies can be product specific. When the vaccine contains an antigenic component that is not a product, the antibody may be specific for such component.
【0055】 本発明の細胞は人間又は動物の体の療法による治療方法において使用され得る
。細胞は患者に投与され得る。投与される細胞は同原細胞であるか、又はMHC
クラスIHLA−A又はHLA−Bについて、若しくはMHCクラスIIの型に
ついて患者と部分的に又は完全に適合した細胞である。細胞は上記議論された本
発明の組成物中に存在するか、又はそこから誘導され得る。細胞は、患者に投与
されるべき細胞又は組成物中に存在する取り除く必要がある他の細胞に結合する
、特定の結合剤を用いて組成物から分離される。典型的には、特定の結合剤は抗
体である。The cells of the present invention can be used in a method of treatment by therapy of the human or animal body. The cells can be administered to a patient. Administered cells may be progenitor cells or MHC
Cells that are partially or fully compatible with the patient for class I HLA-A or HLA-B, or for MHC class II types. Cells may be present in or derived from the compositions of the invention discussed above. The cells are separated from the composition using a specific binding agent that binds to cells to be administered to the patient or other cells present in the composition that need to be removed. Typically, the particular binding agent is an antibody.
【0056】 本発明はまた、T細胞に化合物又は組成物を接触させること、及びT細胞が超
増殖を受けるか否か決定することを含む、T細胞の超増殖を起こす製品を同定す
るためのアッセイを提供する。当該アッセイは典型的には上記のアッセイである
。当該アッセイはしたがって、候補の物質をスクリーニングするのに用いること
ができる。そのような候補物質は人間又は動物細胞からの抽出物、例えば腫瘍細
胞からの抽出物、中に存在する。候補となる物質は例えばファージディスプレー
ライブラリー等のコンビナトリアルライブラリー又は、天然産出物のライブラリ
ー中に存在する。アッセイはまた、本発明の製品をデザインするために用いるこ
ともできる。The present invention also provides for identifying a product that causes T cell hyperproliferation, comprising contacting the T cell with a compound or composition and determining whether the T cell undergoes hyperproliferation. Provide the assay. The assay is typically the assay described above. The assay can therefore be used to screen candidate substances. Such candidate substances are present in extracts from human or animal cells, such as extracts from tumor cells. Candidate substances are present, for example, in combinatorial libraries such as phage display libraries or libraries of natural products. Assays can also be used to design products of the invention.
【0057】 本発明は、T細胞の超増殖を引き起こす、本願の出願日にはデータベース中に
記載されていない製品を提供する。したがって、そのような製品は本願の出願日
には当該技術分野において知られていない。The present invention provides products that cause T cell hyperproliferation and are not listed in the database as of the filing date of the present application. Accordingly, such products are not known in the art at the filing date of the present application.
【0058】 本発明の製品は、T細胞の超増殖を引き起こすためのキット中に提供され得る
。そのようなキットはインビトロにおいて、(上記のとおりT細胞の超増殖を起
こす方法のため)細胞を患者に投与する前に当該細胞を複製するためのものであ
る。当該キットは、癌を診断するためのものであってもよく、その場合、例えば
T細胞の応答の検出について上記の通り、製品は癌に特異的なT細胞(例えば製
品に特異的なT細胞)の存在を検出するために用いられる。The product of the invention can be provided in a kit for causing T cell hyperproliferation. Such a kit is for replicating the cells in vitro (before the method of causing T cell hyperproliferation as described above) before administering the cells to a patient. The kit may be for diagnosing cancer, in which case the product may be a cancer-specific T cell (eg, a product-specific T cell, eg, as described above for detecting a T cell response). ) Is used to detect the presence of
【0059】 本発明の製品又は細胞は実質的に単離された形態で存在し得る。製品又は細胞
は、製品又は細胞の意図された目的を阻害しない、担体又は希釈剤と混合するこ
とができ、未だ実質的に単離されていると考えられる。製品は実質的に精製され
た形態であってもよく、そこでそれは調製物中に90%以上の、例えば95、9
8若しくは99%より多くの、少なくとも95、98若しくは99%の、又はお
よそ95、98若しくは99の%の、乾燥質量を含有するか;あるいは、もし製
品がペプチドならば、調製物中に90%以上の、例えば95、98、若しくは9
9%より多くの、少なくとも95、98若しくは99%の、又はおよそ95、9
8若しくは99%の、ペプチドを含み得る。細胞は実質的に精製された形態にあ
ってもよく、その場合一般的に調製物中90%以上の、例えば95、98若しく
は99%より多くの、少なくとも95、98若しくは99%の、又はおよそ95
、98若しくは99%の、細胞又は乾燥質量を含有する。[0059] The products or cells of the invention can be in a substantially isolated form. The product or cell can be mixed with a carrier or diluent that does not interfere with the intended purpose of the product or cell, and is still considered substantially isolated. The product may be in a substantially purified form, where it is present in the preparation in a proportion of 90% or more, for example 95, 9
Contains a dry mass of more than 8 or 99%, at least 95, 98 or 99%, or approximately 95, 98 or 99%; or, if the product is a peptide, 90% in the preparation For example, 95, 98, or 9
Greater than 9%, at least 95, 98 or 99%, or approximately 95, 9
It may contain 8 or 99% of the peptide. The cells may be in a substantially purified form, in which case typically at least 90%, eg, greater than 95, 98 or 99%, at least 95, 98 or 99%, or approximately 95
, 98 or 99% cells or dry mass.
【0060】 本発明はまた、本発明の製品又は細胞の有効で、非毒性の量をそれを必要とす
る人間又は人間でない動物に投与することによる病気の診断又は治療方法を提供
する。病気は癌でもよく、したがって、当該方法は、例えば乳ガン、肺ガン、膀
胱ガン、結腸ガン、卵巣ガン及び子宮膜内腫瘍等のガンを診断又は治療する。診
断又は治療されるほかの癌は、例えば軟組織及び骨肉腫を含む肉腫、白血病など
の血液学的悪性を含む。The present invention also provides a method of diagnosing or treating a disease by administering an effective, non-toxic amount of a product or cell of the present invention to a human or non-human animal in need thereof. The disease may be cancer, and thus the method diagnoses or treats cancer, such as, for example, breast, lung, bladder, colon, ovarian and endometrial tumors. Other cancers to be diagnosed or treated include sarcomas, including, for example, soft tissue and osteosarcoma, hematologic malignancies such as leukemia.
【0061】 本発明の製品又は細胞は、調剤上許容される担体又は希釈剤と混合することに
より、臨床的投与用に処方することができる。例えば、製品又は細胞は局所的、
非経口的、静脈内、筋肉内、皮下、経皮的投与用に処方される。それらは、調剤
上許容され、所望の投与経路に適した、例えば希釈剤又は担体など、いかなるビ
ヒクルと混合してもよい。注射用の調剤担体又は希釈剤は、例えば、注射用水又
は生理食塩水など、無菌又は等張の溶液でよい。The products or cells of the present invention can be formulated for clinical administration by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. For example, the product or cells may be topical,
It is formulated for parenteral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, transdermal administration. They may be mixed with any vehicle that is pharmaceutically acceptable and suitable for the desired route of administration, for example a diluent or carrier. The injection carrier or diluent may be a sterile or isotonic solution, for example, water for injection or saline.
【0062】 投与量は、有効で毒性のない量を送達するため、及び種々のパラメーターによ
り、特に使用される物質の性質及び有効性;治療される患者の年齢、体重及び症
状;使用する投与態様;治療される症状;および要求される臨床計画により、調
整することができる。指針として、注射により投与される本発明の製品の量は一
般的に10から1000μgまでである。例えば、100から500μgである
。指針として、投与される本発明の細胞の数は一般的に、105から1013まで
、好ましくは107から1011までである。The dosage will depend on the various parameters and the nature and effectiveness of the substance used; the age, weight and condition of the patient to be treated; the mode of administration used; It can be adjusted according to the condition to be treated; and the clinical plan required. As a guide, the amount of the product of the invention administered by injection is generally from 10 to 1000 μg. For example, 100 to 500 μg. As a guide, the number of cells of the invention to be administered is generally from 10 5 to 10 13 , preferably from 10 7 to 10 11 .
【0063】 記載された投与経路及び投与量は、当業者であればいかなる特定の患者及び症
状のために最適の投与経路及び投与量を容易に決定することができるので、指針
としてのみ意図される。The routes of administration and dosages described are intended only as a guide, as those skilled in the art can readily determine the optimal route of administration and dosage for any particular patient and condition. .
【0064】 細胞を投与する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、US−A−
4,844,893及びUS−A−4,690,915に示されている。Methods for administering cells are known in the art, for example, US-A-
Nos. 4,844,893 and US-A-4,690,915.
【0065】 典型的に細胞は、例えば少なくとも50ml、100ml、200ml又はそ
れ以上等の少なくとも20mlの容量を有する溶液中で投与される。細胞は1、
2、3、10、20又はそれ以上の別々の投与であって、それぞれの投与が例え
ば、1時間、2時間、5時間、12時間、1日、2日、4日、7日、1月、又は
それ以上間隔を空けた投与により、患者に与えられ得る。TILに対する投与計
画は(4)に記載されている。Typically, the cells are administered in a solution having a volume of at least 20 ml, for example at least 50 ml, 100 ml, 200 ml or more. 1 cell
2, 3, 10, 20 or more separate doses, each dose being for example 1 hour, 2 hours, 5 hours, 12 hours, 1 day, 2 days, 4 days, 7 days, 1 month , Or at more spaced doses. The dosing regimen for TIL is described in (4).
【0066】 抗原特異的な方法でインビトロにおいてT細胞を刺激する方法は、当該技術分
野において公知であり、例えば、(5)は抗原特異的な一次CD8T細胞応答を
作り出す方法を示す。Methods for stimulating T cells in vitro in an antigen-specific manner are known in the art, for example, (5) shows a method for generating an antigen-specific primary CD8 T cell response.
【0067】 例えば(7)に記載の通り、本明細書に記載の物質のいずれかに対する抗体を
作ることができる。当該抗体は、例えば、本発明の製品に関して上に記載した精
製のレベルのいずれかにまで、精製又は単離される。For example, as described in (7), antibodies can be made to any of the substances described herein. The antibodies are purified or isolated, for example, to any of the levels of purification described above with respect to the products of the invention.
【0068】TILの調製 TILを製造する方法は当該技術分野において公知である(例えば(6))。
TILは、コラゲナーゼ、I型DNAアーゼ、及びV型ヒアルロニダーゼ酵素混
合物中で腫瘍を消化し、得られる懸濁液を濾過し(例えばワイヤーメッシュを用
いる)、フィコール(Ficoll)勾配を用いて濾液からリンパ球を分離する
ことにより得られる。TILは、AIMV(又は10%のヒト血清を補給したR
PMI)、6000IU/mlのIL−2及び1000U/mlのIL−4中、
5×105成熟細胞/mlの密度で、37℃、5%のCO2下で培養することがで
きる。TILが3〜4×106細胞/mlの密度に到達したとき、培養物を分割
し、希釈することができる。 Preparation of TIL Methods for producing TIL are known in the art (eg (6)).
TIL digests tumors in a collagenase, type I DNAase, and type V hyaluronidase enzyme mixture, filters the resulting suspension (eg, using a wire mesh), and removes lymph from the filtrate using a Ficoll gradient. Obtained by separating the spheres. TIL was measured using AIMV (or R with 10% human serum).
PMI) in 6000 IU / ml IL-2 and 1000 U / ml IL-4
It can be cultured at a density of 5 × 10 5 mature cells / ml at 37 ° C. under 5% CO 2 . When the TIL reaches a density of 3-4 × 10 6 cells / ml, the culture can be split and diluted.
【0069】製品を提供する物質 一定の物質は、それらが個体に投与された時、又は、それらが例えば本明細書
において言及する細胞のいずれか等、哺乳類の細胞に接触した(例えば、内部へ
提供される)時に本発明の製品を与える。そのような物質は、本明細書中で使用
される語「製品」のなかに包含される。そのような物質は本明細書において議論
されるインビボ及びインビトロの方法において使用することができ、製品の投与
について記載したのと同じ方法で投与し得る。Certain substances that provide the product may be in contact with (eg, internal to) mammalian cells when they are administered to an individual or when they are administered to an individual, for example, any of the cells referred to herein. Provided) the product of the present invention. Such materials are included within the term "product" as used herein. Such substances can be used in the in vivo and in vitro methods discussed herein and can be administered in the same manner as described for the administration of the product.
【0070】 物質は典型的には、細胞により処理されて(典型的には加水分解されて)製品
を与えることができる、製品の前駆体である。糖ペプチドである製品の場合、そ
のような処理はペプチド及び/又は炭水化物成分を修飾し得る。前駆体は例えば
、本明細書中に記載の抗原提示細胞のいずれかの抗原処理経路において処理され
得る。ペプチドを含む製品の場合、前駆体は製品のN及び/又はC末端に付加的
な配列を有する製品を含んでもよい。The substance is typically a product precursor that can be processed (typically hydrolyzed) by the cells to give a product. For products that are glycopeptides, such treatment may modify the peptide and / or carbohydrate components. Precursors can be processed, for example, in any of the antigen processing pathways of the antigen presenting cells described herein. In the case of a product comprising a peptide, the precursor may include a product having additional sequences at the N- and / or C-termini of the product.
【0071】 一の態様において、物質は発現されて製品(又は上記の前駆体)を与えること
ができるポリヌクレオチドである。当該ポリヌクレオチドは典型的には、DNA
又はRNAであり、一本鎖又は二本鎖である。もし製品がペプチドを含むのなら
ば、ポリヌクレオチドは一般的に当該ペプチドをコードする配列を含む。In one embodiment, the substance is a polynucleotide that can be expressed to give a product (or a precursor as described above). The polynucleotide is typically a DNA
Or single-stranded or double-stranded RNA. If the product includes a peptide, the polynucleotide generally includes a sequence encoding the peptide.
【0072】 コード配列は典型的には、ポリヌクレオチドの発現を提供し得る調節配列に、
使用できるように結合される。したがって、典型的にはポリヌクレオチドはコー
ド鎖に対し5’及び3’に、例えば、コード鎖の転写及び/又は翻訳を助ける等
、発現を助ける配列を含む。The coding sequence typically includes regulatory sequences that can provide for expression of the polynucleotide,
Combined for use. Thus, typically, a polynucleotide will contain sequences 5 'and 3' to the coding strand that aid expression, for example, assist in the transcription and / or translation of the coding strand.
【0073】 ポリヌクレオチドは典型的には、例えば人間の細胞において等、哺乳類細胞に
おいて製品を発現することができる。ポリヌクレオチドは、以下に議論する細胞
性ベクターにおいて製品を発現することができる。The polynucleotide is typically capable of expressing the product in mammalian cells, for example, in human cells. The polynucleotide can express the product in a cellular vector discussed below.
【0074】 一の態様において、ポリヌクレオチドは、例えばCD8T細胞応答を刺激する
ことができるウイルス[例えばワクシニアウイルス(例、MVA又はNYVAC
)]等のウイルス又は細胞性ベクター中に存在する。 以下の例は本発明を例証する。In one embodiment, the polynucleotide is a virus capable of stimulating a CD8 T cell response, eg, a vaccinia virus (eg, MVA or NYVAC
)] Or other viral or cellular vectors. The following examples illustrate the invention.
【0075】例1 PBLの調製 20〜25mlの血液を血液回収チューブ(20mlのRPMI、クエン酸ナ
トリウム及びメルカプトエタノールを含む)中に回収し、フィコール上に層にす
る。チューブを400gで20分間スピンさせて、PBLsを含有するバッフィ
コートを取り出し、ハンクス(Hanks)緩衝塩溶液で3回、AIMV培地中
で1回洗浄する。抗原提示細胞が調製物中に存在する。 Example 1 Preparation of PBL 20-25 ml of blood is collected in a blood collection tube (containing 20 ml of RPMI, sodium citrate and mercaptoethanol) and layered on Ficoll. The tube is spun at 400 g for 20 minutes and the buffy coat containing the PBLs is removed and washed three times with Hanks buffered saline and once in AIMV medium. Antigen presenting cells are present in the preparation.
【0076】樹状細胞(DCs)の調製 20〜25mlの血液を20mlのRPMI、クエン酸ナトリウム及びメルカ
プトエタノールを含む血液回収チューブ中にとり、フィコール上に層にする。チ
ューブを400gで20分間スピンさせて、PBLsを含有するバフィコートを
取り出し、ハンクス緩衝塩溶液(9)で3回、AIMV培地中で1回洗浄する。Preparation of Dendritic Cells (DCs) 20-25 ml of blood is taken in a blood collection tube containing 20 ml of RPMI, sodium citrate and mercaptoethanol and layered on Ficoll. The tube is spun at 400 g for 20 minutes and the buffy coat containing the PBLs is removed and washed three times with Hanks' buffered saline solution (9) and once in AIMV medium.
【0077】 5から20×106個の細胞を33mmの培養皿上、AIMV中に植え付け、
細胞を2時間時間かけて接着させる。接着していない細胞を穏やかに取り除き、
接着細胞を500単位/mlのヒトIL−4及び800単位/mlのヒトGM−
CSFを含有するAIMV培地中で培養する。2〜3日毎に1mlの培地を取り
出し、サイトカインIL−4及びGM−CSFを含有する新鮮な培地で置換する
。第7日目に樹状細胞はAPCsとして使用する準備ができる。5 to 20 × 10 6 cells were seeded in AIMV on a 33 mm culture dish,
Allow cells to adhere for 2 hours. Gently remove non-adhered cells,
The adherent cells were treated with 500 units / ml human IL-4 and 800 units / ml human GM-
Culture in AIMV medium containing CSF. Remove 1 ml of medium every 2-3 days and replace with fresh medium containing cytokines IL-4 and GM-CSF. On day 7, the dendritic cells are ready to be used as APCs.
【0078】例2 糖ペプチドが精製された樹状細胞上に提示される、増殖アッセイ 上記のように7日間培養された樹状細胞はピペットを用いて回収され、適当な
数のチューブ(3×33mmの皿を5又はそれ以上のチューブ、15mlのファ
ルコン)に分ける。細胞をスピンさせて、1mlのAIMV培地にとり、20〜
100μg/mlの糖ペプチド又は緩衝液単独と共に37℃で2時間インキュベ
ーションする。100μlのAIMV中の2×105個の接着していないPBL
s(それらは樹状細胞の精製の間に取り除かれた)を、5〜50μgの糖ペプチ
ドの存在下、96ウェル組織培養皿のウェル中で、100μlの糖ペプチドでパ
ルスしたDCsと混合する。各試料は、4つ作られ(クアドルプリケート)、3
7℃で4日間インキュベートする。第4日目に、1μCiの3Hチミジンを各ウェ
ルに加え、皿を37℃で一晩インキュベートした。細胞を回収し、チミジンの取
り込みを測定する。 Example 2 Proliferation Assay in which Glycopeptides are Displayed on Purified Dendritic Cells Dendritic cells cultured for 7 days as described above are harvested using a pipette and the appropriate number of tubes (3 × Divide the 33 mm dish into 5 or more tubes, 15 ml Falcon). Spin cells and take up in 1 ml AIMV medium
Incubate for 2 hours at 37 ° C. with 100 μg / ml glycopeptide or buffer alone. 2 × 10 5 non-adhered PBLs in 100 μl AIMV
s (they were removed during dendritic cell purification) are mixed with 100 μl of glycopeptide-pulsed DCs in the wells of a 96-well tissue culture dish in the presence of 5-50 μg of glycopeptide. Each sample is made up of 4 (quadruplicate), 3
Incubate at 7 ° C for 4 days. On day 4, 1 μCi of 3H thymidine was added to each well and the dishes were incubated at 37 ° C. overnight. Cells are harvested and thymidine incorporation is measured.
【0079】PBLに糖ペプチドが直接添加される増殖アッセイ 2×105個のPBLを96ウェル皿の各ウェルに加える。糖ペプチド又は緩
衝液を当該ウェルに加え(各試料はクアドルプリケート(quadruplic
ate)で行う)、皿を37℃でインキュベートする。第4日目に1μCiの3
Hチミジンを各ウェルに添加し、皿を37℃で一晩インキュベートする。細胞を
回収し、チミジンの取り込みを測定する。 Proliferation assay in which glycopeptides are added directly to PBLs 2 × 10 5 PBLs are added to each well of a 96-well dish. Glycopeptide or buffer is added to the wells (each sample is quadruplicate).
ate)) and incubate the dishes at 37 ° C. On day 4, 1 μCi of 3
H-thymidine is added to each well and the dishes are incubated at 37 ° C overnight. Cells are harvested and thymidine incorporation is measured.
【0080】刺激指標の計算 刺激指標は、試験糖ペプチドについて得られた平均カウントを緩衝液単独を与
えた細胞について得られた平均カウントで割ることにより計算する。これはこの
種のデータを表す標準的な方法であり、一般的に、試料が陽性であると考えられ
るためには3又はそれ以上の刺激指標を与えなければならないと考えられる。増
殖アッセイの結果は表1に示される。試験された糖ペプチドは表2に示される(
それらはα結合によりペプチドに結合する)。A10はA9と同じであるが、A
9配列のN末端にLysを有する。表1は7種の健康的なドナー(左側の7つの
欄)由来のT細胞及び6種の乳がん患者(BrCa)由来のT細胞による結果を
示す。 Calculation of the Stimulus Index The stimulus index is calculated by dividing the average count obtained for the test glycopeptide by the average count obtained for cells given buffer alone. This is the standard way of representing this type of data and it is generally believed that three or more stimulation indicators must be provided for a sample to be considered positive. The results of the proliferation assay are shown in Table 1. The glycopeptides tested are shown in Table 2 (
They bind to the peptide via an α-link). A10 is the same as A9, but A
9 sequences have Lys at the N-terminus. Table 1 shows the results with T cells from seven healthy donors (seven columns on the left) and T cells from six breast cancer patients (BrCa).
【0081】例3 CD4T細胞を使用した増殖アッセイ 50μg/mlの糖ペプチドを1ウェルあたり2×105個のCD4T細胞(
底が平らな96ウェルのプレート中)に加えた。 Example 3 Proliferation Assay Using CD4 T Cells 50 μg / ml of glycopeptide was added to 2 × 10 5 CD4 T cells per well (
(In a 96-well plate with a flat bottom).
【0082】例4 糖ペプチドによる刺激後増殖する細胞のFACS分析 健康なドナー由来のPBLを、A2糖ペプチドの存在下、7日間自己由来DC
s(100μg/mlのA2糖ペプチドで2.5時間前もってパルスした)と共
に培養した。次にIL−2を培養物に加え、さらに7日間の培養の後、細胞を再
び自己由来DCsを用いてA2糖ペプチドで刺激した。さらなるIL−2の添加
のラウンド及び糖ペプチドによる再刺激の後、細胞をFACSにより分析した。
CD19(B細胞マーカー);CD16及びCD56(NKマーカー);CD3
(T細胞マーカー)の特定のマーカーを使用した。結果を図1に示す。 Example 4 FACS Analysis of Proliferating Cells After Glycopeptide Stimulation PBLs from healthy donors were isolated from autologous DC for 7 days in the presence of A2 glycopeptide.
s (pre-pulsed with 100 μg / ml A2 glycopeptide for 2.5 hours). IL-2 was then added to the culture and after a further 7 days of culture, the cells were again stimulated with A2 glycopeptide using autologous DCs. After an additional round of IL-2 addition and restimulation with glycopeptides, cells were analyzed by FACS.
CD19 (B cell marker); CD16 and CD56 (NK marker); CD3
A specific marker (T cell marker) was used. The results are shown in FIG.
【0083】 健康的なドナー由来のPBLを、図1について上記した通り、2ラウンドの刺
激のためA2GalNacとそれに次ぐIL−2を用いて刺激した。FACS分
析の結果を図2に示す、その中で;A、陰性の対照;B、抗CD4抗体による染
色;C、抗CD8抗体による染色;D、抗α/βT細胞受容体抗体による染色;
E、抗−γ/δT細胞受容体抗体による染色。PBLs from healthy donors were stimulated with A2GalNac followed by IL-2 for two rounds of stimulation as described above for FIG. The results of the FACS analysis are shown in FIG. 2, in which: A, a negative control; B, staining with an anti-CD4 antibody; C, staining with an anti-CD8 antibody; D, staining with an anti-α / β T cell receptor antibody;
E, Staining with anti-γ / δT cell receptor antibody.
【0084】例5 刺激後のT細胞によるサイトカイン分泌 下記の表は糖ペプチドによる刺激に応答してのPBLによるIFNα分泌を示
す。IL−4の分泌がないので、これはTH1応答を示す。 Example 5 Cytokine Secretion by T Cells After Stimulation The following table shows IFNα secretion by PBL in response to stimulation by glycopeptides. Since there is no secretion of IL-4, which shows a TH 1 response.
【0085】例6 マウスの脾臓細胞とヒトPBLを比較する増殖アッセイ マウスの脾臓細胞が増殖アッセイにおいて用いられた。結果は以下に示される
。見た通り、A8GalNacがヒトPBLの超増殖を起こしているにも関わら
ず、マウス脾臓細胞では陽性の結果を与えない。 Example 6 Proliferation assay comparing mouse spleen cells to human PBL Mouse spleen cells were used in a proliferation assay. The results are shown below. As can be seen, A8GalNac does not give a positive result in mouse spleen cells, despite the hyperproliferation of human PBL.
【0086】 [0086]
【0087】 [0087]
【0088】文献 1.スズキ(Suzuki)ら(1996)ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー(The Journal of Immunology)、156、128
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2, 11671-11675 13. Kim et al. (1997) J. Am. Immunol. 159, 1666-
1668
【図1】 A2で刺激された細胞のFACS分析を示す。Aは対照、BはCD19及びC
はCD3、CD16/56である。CD19はB細胞マーカーであり、CD16
及びCD56はNKマーカーであり、CD3はT細胞マーカーである。FIG. 1 shows FACS analysis of cells stimulated with A2. A is control, B is CD19 and C
Is CD3, CD16 / 56. CD19 is a B cell marker and CD16
And CD56 are NK markers, and CD3 is a T cell marker.
【図2】 A2GalNacで刺激した後に増殖する細胞のFACS分析を示す。Aは対
照であり、Bは抗CD−4であり、Cは抗CD−8、Dは抗α/βTCRであり
、そしてEは抗γ/δTCRである。縦軸はカウントを示す。FIG. 2 shows FACS analysis of cells growing after stimulation with A2GalNac. A is a control, B is anti-CD-4, C is anti-CD-8, D is anti-α / β TCR, and E is anti-γ / δ TCR. The vertical axis shows the count.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12Q 1/02 G01N 33/50 Z 4H045 G01N 33/15 C07K 14/47 ZNA 33/50 C12N 5/00 E // C07K 14/47 ZNA A61K 37/02 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI ,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID, IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,K Z,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA ,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ, PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,S K,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG ,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 テイラー − パパディミトリオウ、ジョ イス イギリス国 ロンドン、セント トマス ストリート、ガイズ ホスピタル、サード フロア トマス ガイ ハウス、ブリー スト バイオロジイ グループ、インペリ アル キャンサー リサーチ ファンド Fターム(参考) 2G045 AA24 AA40 BB20 CA18 DA44 DA77 FB07 GC22 4B063 QQ08 QQ20 QQ79 QR78 QS36 QX02 QX07 4B065 AA93X BA22 CA45 4C084 AA02 AA03 AA17 BA01 BA02 BA18 BA19 BA34 NA14 ZB022 ZB092 ZB262 4C085 AA03 BB12 EE06 FF14 FF17 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA53 CA40 EA31 FA71 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12Q 1/02 G01N 33/50 Z 4H045 G01N 33/15 C07K 14/47 ZNA 33/50 C12N 5/00 E // C07K 14/47 ZNA A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL , PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, A T, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM , HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU , ZA, ZW (72) Inventor Taylor-Papadimitriou, Joyce London, St. Thomas Street, Guys Hospital, Third Floor Thomas Guy House, Breast Biology Group, Imperial Cancer Reach fund F term (reference) 2G045 AA24 AA40 BB20 CA18 DA44 DA77 FB07 GC22 4B063 QQ08 QQ20 QQ79 QR78 QS36 QX02 QX07 4B065 AA93X BA22 CA45 4C084 AA02 AA03 AA17 BA01 BA02 BA18 BA19 Z34B0A12 Z02A19 AA20 AA30 BA10 BA53 CA40 EA31 FA71
Claims (15)
用するため、又は人間若しくは動物の体に行われる診断方法において使用するた
めの、T細胞の超増殖を引き起こす製品。1. A product that causes T cell hyperproliferation for use in a method of treating the human or animal body by therapy or for use in a diagnostic method performed on the human or animal body.
はThr17上に有する配列番号1のアミノ酸配列を有する糖ペプチド、あるい
は療法により人間若しくは動物の体を治療する方法において使用するため、又は
人間若しくは動物の体に行われる診断方法において使用するための、T細胞の超
増殖を引き起こすその類似体である、請求項1に記載の製品。2. A glycopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 having Gal-GalNac or a GalNac moiety on Thr10 or Thr17, or for use in a method of treating the human or animal body by therapy, or a human or animal The product of claim 1, which is an analog thereof that causes T cell hyperproliferation, for use in a diagnostic method performed on the body.
ベースに記載されていない製品。3. A product that causes T cell hyperproliferation and is not listed in the database as of the filing date of the present application.
超増殖を受けるか否か測定することを包含する、T細胞の超増殖を起こす製品の
同定のためのアッセイ。4. An assay for identifying a product that causes T cell hyperproliferation, comprising contacting a compound or composition with T cells and determining whether the T cells undergo hyperproliferation.
か一項に定義された、又は請求項4に記載のアッセイにおいて同定された、製品
の使用。5. Use of a product as defined in any one of claims 1 to 3 or identified in an assay according to claim 4, for treating cells in vitro.
記載のアッセイにおいて同定された製品で処置されたエックスビボのT細胞。6. Ex vivo T cells treated with a product as defined in any one of claims 1 to 3 or identified in an assay according to claim 4.
記載のアッセイにおいて同定された製品で処置され、かつT細胞に製品を提示す
ることができるエックスビボの細胞。7. An ex-vivo treated with a product as defined in any one of claims 1 to 3 or identified in the assay of claim 4 and capable of presenting the product to T cells. cell.
に記載のT細胞。8. The cells which have undergone hyperproliferation after being treated with the product.
2. The T cell according to 1.
記載のアッセイにおいて同定された製品をT細胞と接触させることを含む、イン
ビトロでT細胞の超増殖を引き起こす方法。9. T cell hyperproliferation in vitro, comprising contacting a T cell with a product as defined in any of claims 1 to 3 or identified in the assay of claim 4. How to cause.
定義された、又は請求項4に記載のアッセイにおいて同定された製品を含有する
組成物。10. A composition comprising T cells, antigen presenting cells and a product as defined in any one of claims 1 to 3 or identified in an assay according to claim 4.
か一項に定義された、又は請求項4に記載のアッセイにおいて同定された製品を
含有する、ワクチン組成物。11. A vaccine composition comprising an antigenic component and a product as defined in any one of claims 1 to 3 or as identified in an assay according to claim 4 as an adjuvant.
に記載のアッセイにおいて同定された製品、及び調剤上許容される担体又は希釈
剤を含有する医薬組成物。12. A method as defined in claim 1 or claim 4.
A pharmaceutical composition comprising the product identified in the assay described in 1. and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
ための、請求項6、7、若しくは8に定義された細胞、請求項9に記載の方法に
より作られた細胞、又は請求項10、11若しくは12に記載の組成物。13. A cell as defined in claim 6, 7, or 8, for use in a method of treatment of the human or animal body by therapy, a cell made by the method of claim 9, or Item 13. The composition according to Item 10, 11 or 12.
の請求項1〜4若しくは6〜12のいずれか一項において定義された、作られた
又は同定された製品、細胞若しくは組成物の使用。14. A product, cell or cell as defined in any one of claims 1-4 or 6-12 for use in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of cancer. Or use of the composition.
T細胞を刺激することによる癌の予防又は治療のための医薬の製造における、請
求項1〜3のいずれか一項において定義された製品又は請求項4のアッセイにお
いて同定された製品の使用。15. The method according to any one of claims 1 to 3, in the manufacture of a medicament for preventing or treating cancer by stimulating said T cell, which is a T cell whose T cell receptor recognizes a product. Use of a product as defined in claim 1 or a product identified in the assay of claim 4.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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