JPH11511559A

JPH11511559A - セリアック病の診断法

Info

Publication number: JPH11511559A
Application number: JP9511805A
Authority: JP
Inventors: ウィアー，ドナルド・ジョージ; フェラン，クリストファー・アレグザンダー
Priority date: 1995-09-15
Filing date: 1996-09-13
Publication date: 1999-10-05
Also published as: NO981057D0; AU707114B2; NO981057L; EP0850418A1; NZ319260A; AU7143996A; WO1997010508A1; CA2231528A1

Abstract

(57)【要約】セリアック病および関連状態を有することが知られているまたは疑われる対象においてこのような状態を診断する方法であって、該状態に特有の抗体を含有する該対象からの体液と、該抗体に特異的なエピトープ部位を有する不死化細胞系からの細胞の懸濁液とを接触させた後、該細胞に対する抗体の結合の程度を測定することを含む上記方法。ヒト臍帯細胞は、該方法で用いるのに特に適していることが判明した。細胞系の使用は、抗体評価のための実質的な量の材料を、該細胞を培養し且つ将来の使用のためにそれらを貯蔵することによって極めて低費用で製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】セリアック病の診断法技術分野本発明は、セリアック病すなわちグルテン過敏性腸症および以下に定義の関連状態を診断する方法に関する。発明の背景セリアック病は、感受性対象において腸絨毛平板化および陰窩過形成をもたらす永久的グリアジン（コムギタンパク質）不耐症である。グリアジンに対する免疫反応は、該疾患の病因においてある役割を果たしていると考えられるが、その免疫学的機序は充分に解明されてない。抗グリアジン抗体（ＡＧＡ）、レチクリン抗体および筋内膜抗体（ＥｍＡ）は、セリアック病の患者からの血清試料中で見出される。しかしながら、ＡＧＡは、セリアック病に特異的ではなく、高血清ＡＧＡ力価は他の胃腸疾患に冒された個体でも見られる。ＥｍＡは、レチクリン抗体と密接に関連していて、グルテン過敏性でもある活発なセリアック病の大部分の個体および疱疹状皮膚炎の個体の大多数で見出される。本明細書中の関連状態とは、体液中の抗グリアジン、レチクリンまたは筋内膜抗体の１種類またはそれ以上の存在を特徴とする何等かの状態を意味する。これらの状態をひとまとめにして、以下、セリアック病と称する。セリアック病の診断は、小腸粘膜生検、更に具体的には、空腸生検の組織学的評価に依る。しかしながら、血清学的評価は、特に、それが該状態についてのあまり侵襲性でない検査であるので、ますます重要なスクリーニング法である。ＩｇＡＥｍＡ抗体の測定は、現在、最も重要な単一血清検査であると考えられている（フェレイラ（Ferreira），Ｍら（1992）；Gut 33 1633-1637）。ＩｇＡＥｍＡ測定の現行法は、サル食道の顕微鏡固定切片の使用を必要とする。ヒト臍帯もまた、ＥｍＡ抗体を測定するのに用いられる（が、長時間の処理を必要とする（ラディンサー（Ladinser），Ｂ．ら（1994）；Gut 35 776-778）。レチクリン抗体の検出には、ラット腎、胃または肝組織が用いられる。レチクリン抗体およびＥｍＡは、密接に関連してしていることぐらいまでは調べられている（フェレイラ，Ｍら上記）。しかしながら、どちらの抗原も、その正確な性質は知られていない。胎児肺線維芽細胞は、セリアック病の患者からの血清ＩｇＡに対して結合する非膠原性タンパク質分子を分泌することが示された。その精製分子は、セリアック病患者の血清試料からレチクリンおよび筋内膜に対する抗体を除去したが、グリアジンに対する抗体は除去しなかった（マーティネン（Marttinen），Ａ．おセリアック病の個体の血清学的スクリーニングのためのサルまたはヒト組織の要求は、倫理的および道徳的問題をもたらす。更に、抗体の検出のための組織試料の使用は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）およびフローサイトメトリなどの標準法の使用を妨げる。本発明は、患者のセリアック病の状態を示す抗体に特異的な細胞懸濁液の使用に基づくセリアック病の in vitro 診断法を提供することによってこれらの問題を克服する。発明の開示したがって、本発明は、セリアック病および関連状態を有することが知られているまたは疑われる対象においてこのような状態を診断する方法であって、該状態に特有の抗体を含有する該対象からの体液と、該抗体に特異的なエピトープ部位を有する不死化細胞系からの細胞の懸濁液とを接触させ、そして該細胞に対する抗体の結合の程度を測定することを含む上記方法を提供する。細胞懸濁液、特に、単細胞懸濁液が、既知の方法に典型的な組織切片よりも試験しやすいということは理解されるであろう。細胞系の使用は、抗体定量のための実質的な量の材料が、細胞を培養し且つ将来の使用のためにそれらを貯蔵することによって極めて低費用で製造されうることを意味する。本明細書中の不死化細胞系とは、繰返し培養することができ且つ死滅しない細胞系を意味する。好ましくは、該細胞は性質において胚性のものである。セリアック病特異的抗体の検出に関与する組織の共通の特徴は、上述の食道および胎児肺線維芽細胞の例で示されるように、粘膜表面に関連することである。セリアック病の患者で見出される抗体を結合する組織に共通すると確認されうるもう一つの特徴は、それらが性質において胚性のものであるということである。マーティネン，Ａ．およびマキ，Ｍ．（上記）は、セリアック病の患者からの血清が胎児線維芽細胞と反応することを示した。しかしながら、胎児線維芽細胞は、限られた回数しか継代されないので、本明細書中で記載の種類の日常的診断検定で用いるための試薬として必要な不死化細胞系の基準を満たしていない。本発明によって用いるのに好ましい細胞の一つの種類は、ヒト臍帯細胞である。本発明によって用いるのに特に適した細胞は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である。本発明者の研究は、ＨＵＶＥＣが、ＥｍＡと密接に相関する抗体と反応する抗原を有するということを示した。ＨＵＶＥＣは、例えば、ＥＶＣ 304細胞系92091712号などの商業的に入手可能な細胞系からの細胞でありうる。更に適当なヒト臍帯細胞は、ヒト臍動脈平滑筋細胞およびヒト臍静脈平滑筋細胞である。前者の種類の細胞の例は、テクノクローン（Thechnoclone），オーストリアからカタログ番号62019／Ｌ／１として入手可能なものであり、そして後者の種類の細胞の例は、同じ業者からカタログ番号6209／Ｌ／１として入手可能なものである。本発明によって測定される抗体は、典型的に、ＩｇＡ型であろう。ＩｇＡＥｍＡがセリアック病において優先的に存在する抗体反応である理由は、充分に理解されていない。しかしながら、それは、胃腸段階での抗原提示に関係していると仮定される。しかしながら、筋内膜の場合、それに対するＩｇＧ抗体が、若干の患者の血清中で検出された。適当には、細胞は、前記体液との接触前にまたは中に破壊される。体液は、いずれの体液でもありうるが、好ましくは、血清である。本発明による免疫検定で用いるための抗原は、細胞系懸濁液、特に、単細胞懸濁液であるので、様々な技術を用いて結合抗体を検出することができる。特に適当な技術は、フローサイトメトリおよび酵素免疫検定法である。しかしながら、用いることができる他の技術には、蛍光顕微鏡法が含まれる。本発明は、更に、不死化細胞系からの細胞の懸濁液を含有する、上に定義の方法を実施するためのキットを提供する。本発明は、次の実施例によって更に例証されるであろう。発明の実施態様実施例１蛍光顕微鏡によるＨＵＶＥＣ抗体反応の測定この実施例で用いられた血清は、ダブリンのセント・ジェームズ病院の胃腸病診療室（the Gastroenterology Clinic at St.James's Hospital）に通院する患者から入手された。２５人の患者は未処置のセリアック病を有し、１６人はグルテン不含治療食を摂取中であり、そして１６人は、非特異的症状および対照とされた正常な小腸生検を有していた。ＨＵＶＥＣＥＣＶ 304 92091712号（ヨロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャー（European Collection of Animal Cell Culture））を、１０％ウシ胎児血清およびゲンタマイシンを含有するローズマウント・パーク・メモリアル・インスティトゥート（Rosemount Park Memorial Institute）（ＲＰＭＩ）１６４０培地中において、５％ＣＯ₂を含む給湿インキュベーター中、３７℃で密集するまで増殖させた。その細胞を、トリプシンＥＤＴＡを用いて採集し、そしてＲＰＭＩ１６４０中で２回洗浄した。免疫蛍光検査実験：細胞２Ｘ１０⁶個／ｍｌのアリコート３０μｌを、ポリ− Ｌ−リシン（シグマ（Sigma））を塗布したスライドガラス上において室温（ＲＴ）で自然乾燥させた。次に、そのスライドを、０．５Ｍリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７．２中で３０分間洗浄した。患者または対照の血清のＰＢＳ中１／５希釈液３０μｌ容量をその細胞上に置き、そして室温で３０分間反応させた。そのスライドを再度ＰＢＳ中で更に３０分間洗浄した。次に、その細胞を、１／２０に希釈されたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ウサギ抗ヒトＩｇＡまたはＩｇＧ（ダコ（Dako））５０μｌ容量で３０分間染色し、そしてＰＢＳ中で３０分間洗浄した。そのスライドを、グリセロール／食塩水固定用培地中のカバースリップで覆い、そして免疫蛍光検査法によって、ライツ・オルトルクス（Leitz Orthlux）（オルトルクスは商標である）顕微鏡を用い、５０ワット水銀灯を用いて可視化した。陽性は、細胞質の染色によって示された。ＥｍＡおよびレチクリン抗体を、標準的な技法を用いて測定した。簡単にいうと、ＥｍＡ抗体は、商業的に入手可能なサル食道の組織切片（メディカ（Medica ）カリフォルニア）を用いて測定された。患者の血清をＰＢＳ中で１／５に希釈し、そしてＨＵＶＥＣの場合と同様に処理した。同様に、ラット腎、肝および胃の複合ブロックを用いてレチクリン抗体を検出した。４ミクロン厚さ切片を切断し且つスライドガラス上に固定し、血清を希釈し、そして免疫蛍光検査法をＨＵＶＥＣおよびＥｍＡ実験で記載のように行った。血清は正常対照と一緒にランダム化され、そして観察者にはそれぞれのスライドの由来が隠されていた。結果を表１で示す。略語一覧：ｗｐｏｓ＝弱陽性ＣＤ＝セリアック病ＴＣＤ＝被処置セリアック病ＵＴＣＤ＝未処置セリアック病表１において、患者と対照でのＥｍＡ、レチクリンおよびＨＵＶＥＣＩｇＡ抗体応答の比較を示す。５７人の血清を検査し、１６人は正常対照からであり、１６人は被処置セリアック病患者（ＴＣＤ）からであり、そして２５人は未処置セリアック病（ＵＴＣＤ）患者からであり、その結果は、３種類の抗体全部の存在の間に強い相関があるが、ＥｍＡおよびＨＵＶＥＣ抗体の関係が最も強いものであることを示している。３１人の血清がＩｇＡＥｍＡ抗体に関して陽性であり、これらの内、同じ３１人はまた、ＨＵＶＥＣＩｇＡ抗体に関して陽性であった。ＥｍＡおよびＨＵＶＥＣＩｇＡ抗体に関して陽性の３１血清について、これらの内２４血清はＩｇＡレチクリン抗体に関しても陽性であり且つ７血清は陰性であり、２６血清は、ＥｍＡ、ＨＵＶＥＣおよびレチクリンＩｇＡ抗体に関して陰性であった。結果の概要を表２で与えるが、これは、セリアック病患者および対照被験者からの５７種類の血清からのＩｇＡＥｍＡ、ＨＵＶＥＣおよびレチクリン抗体反応間の相関を示している。ＥｍＡ抗体に関して陽性の３１血清について、これら全部がＨＵＶＥＣＩｇＡ抗体に関して陽性であり、そしてこれらの内２４血清がレチクリン抗体に関して陽性であった。実施例２フローサイトメトリを用いるＨＵＶＥＣ表面および細胞内の抗体反応の測定セリアック病血清と反応するＨＵＶＥＣ抗原が表面（細胞外）起源であったかまたは細胞内起源であったかどうかを確認するために、非透過性細胞（表面）および透過性細胞（細胞内）に関してフローサイトメトリを用いて実験を行った。１０種類のＥｍＡ陽性血清および１０種類のＥｍＡ陰性血清を用いた。表面染色：新鮮なＨＵＶＥＣを、実施例１で記載のように培養物から採集し、そして２Ｘ１０⁶個／ｍｌに調整した。細胞のアリコート５０μｌをＰＢＳ中で１回洗浄し、そしてＰＢＳ中で１／５に希釈されたセリアック病患者血清のアリコート５０μｌと反応させた。その細胞を氷上で３０分間インキュベートし、そしてＰＢＳで１回洗浄した。次に、１／２０に希釈されたＦＩＴＣ結合ウサギ抗ヒトＩｇＡのアリコート２０μｌをその試験管に加え、そして３０分間反応させた。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、そしてファクスキャン（FacScan）フローサイトメーター（ファクスキャンは商標である）（ベンクトン・ディキンソン（Be cton Dickinson））で読取った。非胎児細胞系であるＵ９３７およびＨＬ６０細胞を対照細胞として用い且つ同様に処理した。ＨＵＶＥＣ細胞内抗原：ＨＵＶＥＣ細胞を２％パラホルムアルデヒド中で３０分間固定した。その細胞を０．０５％サポニン（Saponin）／ＰＢＳ（ＳＰＢＳ）中で２Ｘ１０⁶個／ｍｌに調整し、そしてＳＰＢＳ中での洗浄を更に２回行った。患者および対照の血清をＳＰＢＳ中で１／５に希釈し、そして細胞２Ｘ１０⁶ 個のアリコートが入っている試験管に対して容量５０μｌで加えた。その細胞を氷上で３０分間インキュベートし、そしてＳＰＢＳで１回洗浄した。次に、１／２０に希釈されたＦＩＴＣ結合ウサギ抗ヒトＩｇＡのアリコート２０μｌをその試験管に加え、そして３０分間反応させた。細胞をＳＰＢＳ中で１回洗浄し、そしてファクスキャンフローサイトメーターで読取った。結果を表３で示す。 ^*それぞれの数値は、別々の患者または対照を表す。非透過性ＨＵＶＥＣを用いた場合、ＥｍＡ陽性血清とＥｍＡ陰性血清との間には差が見られなかったことが認められるであろう。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値は、ＥｍＡ陰性群では５〜７およびＥｍＡ陽性群では５〜８であった。細胞を２％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして０．１％サポニンを用いて透過性にした場合、それら二つの群の間には顕著な差があった。ＥｍＡ陰性群のＭＦＩ値は１９〜４２であり、平均ＭＦＩ値２８．２であったが、ＥｍＡ陽性群のＭＦＩ値は４０〜１９２であり、平均ＭＦＩ値は１０９．５であった。二つの実験の計測器設定は同じであった。しかしながら、固定および透過性化（permealisation）は、細胞にある程度の自己蛍光を発しさせ、これが、二つの実験設定でのＭＦＩ値間の違いを説明する。実施例３フローサイトメトリによるグリアジン抗体反応の測定（Ａ）ラテックス粒子上へのグリアジンの吸収：８μｍポリスチレンビーズ（ポリサイエンシズ（Polysciences），ウォーリントン）１Ｘ１０⁷個／ｍｌの１ｍｌを蒸留Ｈ₂Ｏ中で洗浄し、そして０．０５Ｍ重炭酸緩衝液ｐＨ９．６中で１ｍｇ／ｍｌの濃度のグリアジン（シグマ）と一緒に４℃で一晩中インキュベートした。次に、そのビーズをＰＢＳ中で１回洗浄して非結合グリアジンを除去し、そしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ中において３７℃で３時間再度インキュベートして未占有部位を遮断した。非結合ＢＳＡは全て、０．０５％トゥイーン（Tween）含有ＰＢＳ（トゥイーン／ＰＢＳ）で洗浄することによってを除去された。グリアジン抗体の測定：ビーズ（１Ｘ１０⁷個／ｍｌ）１０μｌ容量を、ＰＢＳ／トゥイーン中で１／５に希釈された患者または対照の血清５０μｌが入っている７５ｍｍ試験管に対して加え、そして穏やかに混合しながら室温で３０分間インキュベートした。そのビーズを、２０００ＲＰＭで５分間遠心分離することによってＰＢＳ／トゥイーン中で２回洗浄して非結合血清を除去した。次に、ＦＩＴＣ結合ウサギ抗ＩｇＡの１／２０希釈のアリコート２０μｌを各試験管に加え、そして穏やかに混合しながら室温で３０分間インキュベートした。そのビーズを、再度、２ｍｌ容量のＰＢＳ／トゥイーンで１回洗浄し、そしてフローサイトメトリによる分析のために１ｍｌのＰＢＳ／トゥイーン中に再懸濁させた。（Ｂ）吸収実験ＥｍＡ、レチクリン、ＨＵＶＥＣおよびグリアジン抗体に関して陽性と検査されたセリアック病患者からの血清試料を、２％パラホルムアルデヒドで予め固定され且つＳＰＢＳを用いて透過性にされたＨＵＶＥＣ細胞２Ｘ１０⁷個に吸収させた。吸収実験は、最初に、ＨＵＶＥＣ透過性細胞２Ｘ１０⁷個を、ＳＰＢＳ中１０％ウサギ血清１０ｍｌ中において室温で１時間インキュベートして非特異的結合を遮断することによって行われた。その細胞を、１０％ウサギ血清含有ＳＰＢＳ中で１回洗浄し、そして２Ｘ１０⁷個／ｍｌの濃度で再懸濁させた。次に、セリアック病血清のＳＰＢＳの１／５希釈１ｍｌを、２Ｘ１０⁷個細胞１ｍｌと混合し、そして穏やかに混合しながら４℃で一晩中インキュベートした。翌日、その細胞を冷却遠心機中において２０００ＲＰＭで１０分間回転させ、そして吸収された血清を取出した。比較のために、患者血清の別の試料を、ＨＵＶＥＣ細胞が加えられないことを除いて全く同じに処理した。ＩｇＧおよびＩｇＡ測定値を吸収および非吸収血清から得、そしてＩｇＡ抗体の濃度を、抗体の濃度が両検体で同じであるように調整した。吸収および非吸収血清の１／５〜１／６４０の二倍希釈は、ＳＰＢＳ中で行われた。ＥｍＡ、レチクリン、ＨＵＶＥＣおよびグリアジン抗体濃度を、吸収および非吸収血清中で測定し、そして違いを調べた。（Ｃ）フローサイトメトリを用いるＨＵＶＥＣおよびポリスチレン粒子での吸収実験ＳＰＢＳ中で１／５に希釈された吸収および非吸収血清のアリコート５０μｌを、パラホルムアルデヒドで固定されたＨＵＶＥＣ細胞の２Ｘ１０⁶個／ｍｌの濃度のアリコート５０μｌに対して加えた。その細胞を室温で３０分間インキュベートし、ＳＰＢＳ中で１回洗浄し、そして４℃において２０００ＲＰＭで５分間回転させた。次に、ＳＰＢＳ中で１／２０に希釈されたＦＩＴＣ抗ＩｇＡの５０μｌを各試験管に加え、そして室温で更に３０分間反応させた。その細胞をＳＰＢＳ中で１回洗浄し、ＳＰＢＳ中に再懸濁させ、そしてファクスキャンでＭＦＩを測定した。（Ｄ）グリアジンで被覆されたポリスチレンビーズを用いて行われた実験：簡単にいうと、ＰＢＳ／トゥイーン中で１／５に希釈された吸収および非吸収血清のアリコート５０μｌを、予めグリアジンで被覆されたポリスチレンビーズ１Ｘ１０⁷個／ｍｌのアリコート５０μｌに対して加えた。そのビーズを室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／トゥイーン中で１回洗浄し、そして４℃において２０００ＲＰＭで５分間回転させた。次に、ＰＢＳ／トゥイーン中で１／２０に希釈されたＦＩＴＣ抗ＩｇＡの５０μｌを各試験管に加え、そして室温で更に３０分間反応させた。そのビーズをＰＢＳ／トゥイーン中で１回洗浄し、ＰＢＳ／トゥイーン中に再懸濁させ、そしてファクスキャンでＭＦＩを測定した。（Ｅ）グリアジンを用いる吸収実験ＥｍＡ、レチクリン、ＨＵＶＥＣおよびグリアジンに関して陽性の血清を、次のようにグリアジン被覆粒子で吸収した。血清１ｍｌを、１０％ＢＳＡ含有ＰＢＳ／トゥイーン中で１／５に希釈し、そしてグリアジン被覆ポリスチレン粒子（１Ｘ１０⁷個／ｍｌ）１ｍｌと一緒に４℃で一晩中穏やかに混合した。同じ患者からの血清の同様の量を、それらが１％ＢＳＡで被覆されたポリスチレン被覆粒子で吸収されたことを除いて全く同じに処理した。次に、吸収および非吸収血清両方を、ＥｍＡ、レチクリン、ＨＵＶＥＣおよびグリアジンに対するＩｇＡ抗体について検査し、そして違いを調べた。結果を表４および５で示す。 ^*ＭＦＩ＝蛍光強度中央値 ^*＝蛍光強度中央値（）＝変化％ＮＤ＝測定されなかった表４から、ＨＵＶＥＣ中の抗原は、グリアジンと交差反応しなかったことが認められるであろう。結果は、グリアジンでの吸収は、コムギタンパク質に対するＩｇＡ反応を、吸収前の１１２および９０のＭＦＩ値から吸収後の３８および３５のＭＦＩ値へそれぞれ顕著に低下させたが、ＨＵＶＥＣでのＩｇＡ反応は、吸収前の４４１および４７３のＭＦＩ値、および吸収後の４４３および４８０のＭＦＩ値と影響されなかったことを示している。同様に、ＨＵＶＥＣでの吸収は、ＨＵＶＥＣＩｇＡＭＦＩ値を４４１、４７３から７５および１１０のＭＦＩ値へそれぞれ低下させたが、それらは、ＩｇＡグリアジン反応を、１１２、９０の吸収前ＭＦＩ値から９０および７０の吸収後ＭＦＩ値へそれぞれ最低限に減少させただけであった。表５において、種々の患者血清を用いた吸収実験の結果を示す。これらは、５回の別々の実験において、ＨＵＶＥＣでの吸収は、ＥｍＡおよびレチクリン力価両方を実質的に減少させたが、ＩｇＡグリアジン抗体反応は、僅かに低下させただけであったことを示す。吸収前のＥｍＡ力価は、１２８０、６４０、１２８０、６４０および１６０であったが、吸収後のＨＵＶＥＣでの力価はそれぞれ、８０、８０、８０、４０および１０へ降下した。吸収前のレチクリン力価は３２０、１６０、１６０および１６０であったが、吸収後の力価はそれぞれ、２０、１０、４０および２０であった。グリアジンＩｇＡ抗体吸収前ＭＦＩ値は５２、５９、２１、６０および３５であったが、吸収後ＭＦＩ値はそれぞれ、３０、３６、１２、４０、１９であった。これらのデータは、ＥｍＡおよびレチクリン力価の低下水準が、それぞれの吸収実験において同様であり且つ４〜１６倍に変化したが、グリアジン抗体反応の最大の低下は２倍未満であったことを示している。実施例４ＥｍＡの検出のための本発明による方法で用いる各種細胞種類の適性を確認する実験を行った。結果を表６で示す。上の実施例から、血清抗体をサル食道またはＨＵＶＥＣを用いて測定した場合に、陽性および陰性の等しい相関が得られたことが認められるであろう。ＥｍＡおよびＨＵＶＥＣ抗体に関して陽性であった血清は、レチクリン陽性を必ずしも示すとは限らなかったが、これは、ＥｍＡおよびレチクリン抗体が異なるというよりもむしろ用いられた組織の感受性の欠如を反映していると思われる。ＨＵＶＥＣ抗体は、フローサイトメトリにより、細胞の表面とは反応しないが、細胞がサポニンで透過性にされた場合にのみ反応することか判明したが、これは、標的抗原が細胞内であることを示唆する。透過性ＨＵＶＥＣを用いる吸収実験は、胎児肺線維芽細胞を用いるマーティネン，Ａ．およびマキ，Ｍ．（上記）によって記載されたものと同様の知見を与えた。つまり、彼らは、これら細胞によって分泌されたタンパク質に対するＩｇＡ抗体が筋内膜およびレチクリン両方に対して結合しうることを示したが、本発明者は、ＨＵＶＥＣでの吸収が、レチクリンおよびＥｍＡを実質的に除去し且つグリアジン抗体反応を部分的にのみ低下させたことを示した。対照的に、グリアジン被覆粒子は、ＨＵＶＥＣＥｍＡ抗体反応性を排除しなかった。これらの知見は、ＨＵＶＥＣがレチクリンおよびＥｍＡ抗原両方を有することまたはこれら抗原が同一物であることを示唆する。セリアック病の病因におけるＥｍＡまたはレチクリン抗原／抗体の役割は、これら抗体を特異的に産生する機序と同様、未だ知られていない。それら抗体は、活発なセイアック病において存在し、そしてグルテン食を中止すると消失するので、それらが単純に炎症過程の結果であり、その結果、免疫系に対して新胚抗原を暴露するためであることが示唆される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１０月２１日【補正内容】３４条補正英文明細書２頁と３頁の間（日本語明細書２頁１４行と１５行の間）に２Ａ頁として下記の内容を挿入する。Ｄ’Ｃｒｕｚ，Ｄ．Ｐ．ｅｔａｌ．（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８５，２４５−２６１には、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＥＬＩＳＡアッセイにおける固相として用い、全身性紅斑性狼蒼患者の血清中の内皮細胞に対する抗体を同定し、これらの抗体が病気のパターンおよび活性化のマーカーであるかを、特に腎炎および血管炎との関連で調べることが記載されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者フェラン，クリストファー・アレグザンダーアイルランド国カウンティ・ダブリン，ブラックロック，モナロー・ドライブ５

Claims

【特許請求の範囲】１．セリアック病および関連状態を有することが知られているまたは疑われる対象においてこのような状態を診断する方法であって、該状態に特有の抗体を含有する該対象からの体液と、該抗体に特異的なエピトープ部位を有する不死化細胞系からの細胞の懸濁液とを接触させ、そして該細胞に対する抗体の結合の程度を測定することを含む上記方法。２．細胞が性質において胚性のものである請求項１に記載の方法。３．細胞がヒト臍帯細胞である請求項１に記載の方法。４．細胞がヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である請求項３に記載の方法。５．ＨＵＶＥＣが、ＥＶＣ 304細胞系92091712号の細胞である請求項４に記載の方法。６．細胞が、ヒト臍動脈平滑筋細胞またはヒト臍静脈平滑筋細胞である請求項３に記載の方法。７．抗体がＩｇＡ型である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．細胞を、前記体液との接触前にまたは中に破壊する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。９．体液が血清である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。１０．結合抗体をフローサイトメトリによって算定する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。１１．結合抗体を酵素免疫検定法によって算定する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。１２．不死化細胞系からの細胞の懸濁液を含有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。１３．セリアック病および関連状態を有することが知られているまたは疑われる対象においてこのような状態を診断する方法であって、実質的に、本明細書中に記載され且つ例示された通りである上記方法。