【発明の詳細な説明】
ヒトＪＴＶ１遺伝子はＰＭＳ２遺伝子と部分的に重なる
本発明の一部は、ＮＩＨ助成金ＣＡ３５４９４およびＣＡ６２９２４を用いて
援助された。即ち、米国政府は本発明について一定の権利を有する。
発明の分野
遺伝性非ポリープ性結腸癌（ＨＮＰＣＣ）は、結腸癌の早期発症（ＣＲＣ）に
よって特徴づけられる常染色体優性遺伝性疾患である（Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ
．，１９９３）。ＨＮＰＣＣ患者由来の事実上全ての腫瘍および非遺伝性ＣＲＣ
の一部は、そのゲノム上のミクロサテライト配列中に多くの変異を含む（Ｉｏｎ
ｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３
；Ａａｌｔｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．
，１９９４）。ＤＮＡ不対合の遺伝性欠損は、ＨＮＰＣＣ患者におけるミクロサ
テライトの不安定性および腫瘍感受性の両者の原因となると考えられる（Ｐａｒ
ｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３：Ｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。不
対合修復に関与する４つの遺伝子（ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１および
ｈＰＭＳ２）が現在発見され、ＨＮＰＣＣ患者の生殖系列中で変異を有すること
が示されている（Ｆｉｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｌｅａｃｈ ｅｔ
ａｌ．，１９９３；Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｂｒｏｎｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９
４；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。
不対合修復はＭｕｔＳ近縁タンパク質の不対合塩基対に対する結合によって開
始され、ＭｕｔＬ近縁タンパク質のＭｕｔＳ−ＤＮＡ複合体への結合によって引
き継がれる（総説・Ｍｏｄｒｉｃｈ，１９９５）。次に不対合を含むＤＮＡ鎖を
切除するために他の構成分子が運び込まれ、正しいヌクレオチドで不対合を置き
換える。この系路に関与するヒトｍｕｔＬ近縁タンパク質が最近均質に精製され
、不対合修復に欠損のあるヒト腫瘍細胞系列の不対合修復活性を相補することが
示
された（Ｌｉ ａｎｄ Ｍｏｄｒｉｃｈ，１９９４）。この相補活性は８５およ
び１１０ｋＤａタンパク質からなるヘテロ二量体中に存在する。８５ｋＤａタン
パク質由来の消化タンパク質の配列解析から、それがｈＭＬＨ１産物であること
が判明し、このタンパク質の分子量はｃＤＮＡ配列から予想されるものと一致し
た（Ｂｒｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４；Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓｅ
ｔ ａｌ．，１９９４）。１１０ｋＤａ構成分子から産生したペプチドの配列か
ら、それがｈＰＭＳ２ ｍｕｔＬホモログであることが示された。しかし、ｈＰ
ＭＳ２の予想される分子量は９５ｋＤａに過ぎない（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９４）。以前に単離されていたｈＰＭＳ２ ｃＤＮＡクローン
には開始メチオニンと考えられる位置の上流に読み枠内終止コドンが存在しなか
ったため、オープンリーディングフレームがさらに上流まで伸びることがあり得
る。即ち、当該分野においてはｈＰＭＳ２遺伝子およびその近傍の遺伝的構造の
知見の必要が存在する。
発明の概要
本発明の目的は、７番染色体上の新規の単離された遺伝子を提供することであ
る。
本発明の目的は、新規のヒト遺伝子産物を産生するためのベクターおよび宿主
細胞を提供することである。
本発明の別の目的は、ヒト遺伝子産物を含む物質の組成物を提供することであ
る。
これらおよび他の目的は、以下に記載される一つまたは複数の態様によって提
供される。
本発明の一つの態様においては、ｃＤＮＡ断片が提供される。このｃＤＮＡは
図２に示されるヌクレオチド配列からなる。
本発明の別の態様においては、図２に示されるヌクレオチド配列からなるｃＤ
ＮＡ断片を含むベクター、およびこのベクターを含む宿主細胞が提供される。
本発明のさらに別の態様においては、ある組成物が提供される。この組成物は
本質的に、図２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる。
本発明のさらに別の態様においては、図１に示されるようなＪＴＶ１タンパク
質の組成物が提供される。この組成物には、他のヒトタンパク質が混入していな
い。
本発明の別の態様においては、図２に示されるＪＴＶ１タンパク質のアミノ酸
配列をコードするｃＤＮＡ断片が提供される。
また本発明によって、ｃＤＮＡプローブが提供される。上記のプローブのｃＤ
ＮＡ部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列の、隣接するヌクレオチド
１５から１１７６からなる。
図面の簡単な説明
図１は、ｈＰＭＳ２の５’領域および予想されるコーディング領域の配列を示
す。矢印は、以前に開示されたｃＤＮＡクローンの５’領域を示す。開始メチオ
ニンと考えられる位置を下線で示す。
図２は、ＪＴＶ１の配列を示す。この配列はＧｅｎｂａｎｋに登録されている
（登録番号Ｕ２４１６９）。開始メチオニンと考えられる位置を下線で示す。
図３は、ＪＴＶ１のゲノム上の位置を示す。ｈＰＭＳ２およびＪＴＶ１のゲノ
ム上の位置は、ヒト７番染色体の様々な領域を含む体細胞ハイブリッドをスクリ
ーニングすることによって確認された。レーン１，ＧＭ１０７９１はチャイニー
ズハムスター卵巣（ＣＨＯ）系列中に７番染色体全部を含む；レーン２，ＮＡ１
１４４０はＣＨＯ系列中に７ｐｔｅｒ＞７ｐ２２を含む；レーン３，Ｒｕ−Ｒａ
ｇ４−１３はマウス系列中に７ｃｅｎ−７ｐｔｅｒを含む；レーン４，４ＡＦ１
／１０６／Ｋ０１５はネズミ系列中に７ｃｅｎ−７ｑｔｅｒを含む；レーン５，
ＧＭ０５１８４．１７はＣＨＯ系列中に７ｑ２１．２−ｑｔｅｒを含む；レーン
６，２０６８Ｒａｇ２２−２はマウス系列中に７ｑ２２−ｑｔｅｒを含む；レー
ン７，ヒトゲノムＤＮＡ；レーン８，マウスゲノムＤＮＡ；レーン９，ＣＨＯゲ
ノムＤＮＡ。
図４は、ｈＰＭＳ２およびＪＴＶ１の転写開始点のマッピングを示す。２つの
遺伝子の５’端を含むゲノム領域の配列が示される。配列は、ｈＰＭＳ２のコド
ン１を基準に番号付けされる。小文字活字はＪＴＶ１（ｎｔ−４７９から−８３
３）およびｈＰＭＳ２（ｎｔ＋２４から＋１０８）のイントロン配列を示す。矢
印は、ｈＰＭＳ２（センス鎖）およびＪＴＶ１（アンチセンス鎖）のｃＤＮＡク
ローンを示す。下線の付いたＡＴＧコドンは、予想されるｈＰＭＳ２（センス鎖
のｎｔ＋１）およびＪＴＶ１（アンチセンス鎖のｎｔ−３４５）の開始メチオニ
ンを示す。この配列はＧｅｎｂａｎｋに登録番号Ｕ２４１６８で登録されている
。
図５はｈＰＭＳ２およびＪＴＶ１の発現を示す。様々な組織由来のＲＮＡが逆
転写酵素（＋ＲＴ）と、または逆転写酵素のない（−ＲＴ）対照反応中で保温さ
れた。このｃＤＮＡは、ｈＰＭＳ２（Ａ）およびＪＴＶ１（Ｂ）に特異的なプラ
イマーによるＰＣＲの鋳型として用いられた。ＲＴ−ＰＣＲ産物はポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって分離された。
好ましい態様の詳細な説明
ｈＰＭＳ２由来の上流領域を研究するため、我々は複数の新たなｃＤＮＡクロ
ーンを単離し、ＰＣＲ利用法によってｈＰＭＳ２転写物の５’端を解析し、対応
するゲノム断片をクローン化した。転写物を単離した上、ｈＰＭＳ２に重なった
、以前には記載されていない遺伝子を我々は運良く発見した。この遺伝子は本明
細書においてＪＴＶ１と呼称される。ＪＴＶ１ｃＤＮＡおよびタンパク質の配列
は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２に示される。
本発明によるｃＤＮＡ断片は、逆転写酵素に基づくＲＮＡ転写物の配列を有す
る隣接する一つながりのデオキシリボヌクレオチドである。このような断片はイ
ントロンを含まない。この断片は単離された分子であり得、または他の核酸配列
に共有結合され得る。この断片は例えばプラスミド、ウィルス、またはミニ染色
体のようなベクターの一部として複製され得る。このベクターは、組み換えＤＮ
Ａ分子を形質転換された細胞のような宿主細胞中で複製され得る。この宿主細胞
はＪＴＶ１を産生するために用いられ得る。この宿主細胞はまた、例えば宿主細
胞をＪＴＶ１配列の発現に影響し得るまたはしない様々な試薬で処理することに
よって、ＪＴＶ１配列の発現制御を研究するために用いられ得る。本明細書にお
いてはＤＮＡ配列は特定のものが述べられるが、配列のいづれの位置においても
、
他の三つの核酸塩基の一つによる単数の核酸置換のような小さい変異を作成する
ことは十分に当業者の能力内である。さらに、タンパク質構造または機能に対す
る影響を研究するために、単数の塩基欠失または単数の塩基挿入を作成すること
は当業者の能力内である。
ヒト以外の組み換え宿主細胞でＪＴＶ１が産生される場合、他のヒトタンパク
質の混入しないＪＴＶ１タンパク質の組成物が産生される。ＪＴＶ１タンパク質
が天然の産生細胞またはヒト宿主細胞から単離される場合、このタンパク質は例
えばＪＴＶ１アミノ酸配列からなる免疫原に対して作成された抗体を用いて精製
され得る。それが望ましい場合、当分野において既知のいかなる他の精製手段も
用いられ得る。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に開示されるのとは異なるヌクレオチド配列を有する
が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に開示されるＪＴＶ１タンパク質をコードするＤＮ
Ａ分子が作成され得る。コドン、アミノ酸および開示されたアミノ酸配列間の既
知のコード関係を用いて、多数の他の配列が容易に設計され、産生され得る。こ
のようなＤＮＡ分子は本発明の範囲に含まれる。
ハイブリダイゼーション実験のために、ｃＤＮＡプローブが用いられ得る。こ
れらは典型的には放射性標識または蛍光分子のような検出可能なマーカーで標識
されるが、これは必ずしも必要ではない。本発明のｃＤＮＡプローブはＳＥＱＩ
Ｄ ＮＯ：１に示される配列の少なくとも１５の隣接したヌクレオチドからなる
。さらなる特異性が望まれる場合、より大きい１８、２０、２５または３０ヌク
レオチド（最大で全長配列の１１７６ヌクレオチド）が用いられ得る。
第７染色体上の欠失を検出するためのプローブとして、ＪＴＶ１ ｃＤＮＡが
用いられ得る。プロモーター領域が重なるため、ＪＴＶ１の大きな欠失はＰＭＳ
２の発現にも影響し、遺伝性非ポリープ性結腸癌（ＨＮＰＣＣ）を引き起こすと
予想される。ＪＴＶ１ ｃＤＮＡは染色体マッピングに用いられ得る。さらに、
ＰＭＳ２プロモーター領域の活性または反応性を試験するために用いられ得る。
ＪＴＶ１転写物またはＪＴＶ１タンパク質が存在する場合、ＰＭＳ２プロモータ
ーは完全であると考えられる。ＰＭＳ２プロモーターが完全であるがＰＭＳ２産
物が存在しない場合、コーデーィング領域内の構造欠損が示唆される。
ＪＴＶ１配列は、ＰＭＳ２遺伝子座における相同組み換えを行うために用いら
れ得る。例えば、ＰＭＳ２変異が存在し、野生型遺伝子による置換による治療が
望まれる場合、相同性を有する隣接領域を提供するためにＰＭＳ２配列が用いら
れ得る。同様に、ＰＭＳ２の隣接領域に他の遺伝子を導入することが望まれ得る
。ＪＴＶ１配列はそのような他の遺伝子の端に用いられ、一つまたは複数の相同
領域を提供し得る。ＪＴＶ１およびＰＭＳ２配列の間への他の遺伝子の挿入が望
まれる場合も、これらの同定された配列を相同組み換えのための相同性ユニット
として用いて達成され得る。
実施例
実施例１
ｈＰＭＳ２の５’末端の単離および配列解析
Ｐ１クローン５３から精製されたＤＮＡ（ｈＰＭＳ２遺伝子を含むことが以前
に確認されている（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ， ｅｔ ａｌ．，１９９４））は、
ＥｃｏＲＩで消化されｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）にサブクローン化された。ｈＰＭＳ２の５’端を含むクローンはエキソン１に
対するプライマーＡ（表１）でのハイブリダイゼーションによって同定された。
いくつかの陽性クローンは、制限酵素による解析によって同一物であることが判
明した。ｈＰＭＳ２のこの領域の配列は、３５Ｓα−ｄＡＴＰおよびＳｅｑｕｅ
ｎａｓｅ（ＵＳＢ）を用いて決定された。
※図１中の開始メチオニンと考えられる位置に対して。
それぞれが８．５ｋｂのＥｃｏＲＩ挿入物を含む３つのクローンが単離された
。一つのクローンｐＳＭＮの部分的な配列の解析によって、そこにｈＰＭＳ２の
コーディング配列および以前にコドン１と呼称されたものの上流配列が含まれる
ことが判明した。以前に報告された開始コドンと考えられる位置は、図１でヌク
レオチド１として示される。ｈＰＭＳ２の配列はヌクレオチド１の８３３ｂｐ上
流まで伸びていた。この配列から、開示されていた開始メチオニンの３２１ヌク
レオチド上流に読み枠内終止コドンが明らかとなり、この間にはメチオニンは存
在しなかった（図１）。
実施例２
ｈＰＭＳ２プローブを用いた、さらなるｃＤＮＡクローンの単離
Ｐ１クローン５３を鋳型として、プライマーＨおよびＩ（表１）を用いてＰＣ
Ｒによって産生されたｈＰＭＳ２のｎｔ＋２４から＋１３６を含むプローブを用
いて、二つのｃＤＮＡライブラリーがスクリーニングされた。λＧＴ１０に入っ
たヒト小腸ランダムプライマーｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およ
びλＺＡＰＩＩに入ったＨｅｌａオリゴｄＴプライマーｃＤＮＡライブラリー（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が、記載されたようにスクリーニングされた（Ｋｉｎｚ
ｌｅｒ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９８９）。ただし、ハイブリダイゼ
ーションは６８℃で行われ、フィルターは６５℃で０．５時間洗浄された。プ
ラーク精製の後、小腸ライブラリー由来のＥｃｏＲＩ挿入物はｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔベクターにサブクローン化され、一方ＨｅｌａｃＤＮＡ挿入物は使用説明
書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従ってファージミドとして回収された。
小腸ランダムプライマーｃＤＮＡライブラリーから一つのクローンが単離され
、これはｈＰＭＳ２のｎｔ−１４から＋１６６８を含んでいた。Ｈｅｌａオリゴ
ｄＴプライマーｃＤＮＡライブラリーから二つのクローンが単離された。これら
のクローンはｎｔ−５３から始まり、ｎｔ＋２７２２または＋２７４９で終わる
。ＨｅｌａｃＤＮＡライブラリーはまた、ｈＰＭＳ２の５’ゲノム領域由来のｎ
ｔ−４１４から＋１６を含む、プライマーＤ（表１）およびＯ（表２）を用いて
Ｐ１クローン５３からＰＣＲによって産生した４３０ｂｐのプローブでスクリー
ニングされた。予想された通り、同一の二つのクローンが同定された。しかし、
１２個の異なる重複クローンが発見され、異なる転写物であると考えられ、ＪＴ
Ｖ１と名づけられた（表２）。これらの１２個のｃＤＮＡは約１．２ｋｂの長さ
であり、全長をシークエンスされた。１２個全てはポリＡ部位（３’末端と考え
られる）で終わり、その上流１．２ｋｂに関して同一であった。５’末端は互い
の３８ｂｐ以内に位置していた。ｈＰＭＳ２との比較から、ＪＴＶ１は反対側の
鎖から転写されることが示唆された。
※図２中の開始メチオニンと考えられる位置に対して。
実施例３
ＪＴＶ１
ＪＴＶ１である一つのクローン（ｐＭ２３ＮＮＦＬ）の長さは１２３３ｂｐで
あり、９３６ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードしていた
（図２）。このＯＲＦ中の第一メチオニンはコドン１で示され（図２）、その６
６ｂｐ上流には読み枠内終止コドンが存在した。このメチオニンはＫｏｚａｋ翻
訳開始コンセンサス（Ｋｏｚａｋ，１９８６）に順当な一致を示した。３’末端
はヌクレオチド１０８６から始まるポリアデニル化シグナル（ＡＡＵＡＡＡ）を
含み、その後にはポリＡ尾部を伴う。転写物は分子量３４．５ｋＤａの３１２ア
ミノ酸のポリペプチドをコードすると予想された。ヌクレオチドおよびペプチド
配列データベースの検索から、これがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝
子ファミリーと限られた相同性を有する新規の遺伝子であることが判明した。
実施例４
ＪＴＶ１の染色体マッピング
ｈＰＭＳ２遺伝子座は以前にＰ１クローン５３を用いたＦＩＳＨによって染色
体７ｐ２２にマッピングされていた（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１
９９４）。複数のｈＰＭＳ２関連遺伝子は７番染色体の長腕に位置し保存された
５’領域を有するため（Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，私信）、我々はＪＴＶ１のゲ
ノム上の位置を、第７染色体の様々な領域を含むげっ歯類−ヒト体細胞ハイブリ
ッドＤＮＡ（Ｓｃｈｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９３）のＰＣＲ解析によって確認した。ｈＰＭＳ２およびＪＴＶ１の
３’非翻訳領域からＰＣＲプライマーが選択され、ゲノムＤＮＡを増幅すること
が示された。ｈＰＭＳ２プライマーＪおよびＫは１２１ｂｐ産物を産生し、ＪＴ
Ｖ１プライマーＱおよびＲは１３４ｂｐ産物を産生した。両方の遺伝子のＰＣＲ
産物は７ｐ２２領域を含むＤＮＡ；系列ＧＭ１０７９１（完全なヒト第７染色体
を含
む）、ＮＡ１１４４０（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｉｔｕｔｅ）（７ｐ２２＞７ｐ
ｔｅｒ）、およびＲｕ−Ｒａｇ４−１３（７ｃｅｎ−７ｐｔｅｒ）において形成
された（図３、レーン１、２および３）。系列４ＡＦ１／１０６／Ｋ０１５（７
ｃｅｎ−ｑｔｅｒ）、ＧＭ０５１８４．１７（７ｑ２１．２−ｑｔｅｒ）または
２０６８Ｒａｇ２２−２（７ｑ２２−ｑｔｅｒ）においてはいかなる産物も見ら
れなかった（図３、レーン４、５および６）。
実施例５
ｈＰＭＳ２およびＪＴＶ１の５’末端の解析
ｈＰＭＳ２転写物の５’末端は標準的なｃＤＮＡクローニング、ＲＡＣＥおよ
びＲＴ−ＰＣＲ解析によって研究された。ＲＮＡはイソチオシアン酸グアニジン
を用いる方法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ， １９８７）
を用いて組織および細胞から精製された。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（
ＲＴ−ＰＣＲ）がランダムプライマーｃＤＮＡライブラリーを鋳型として記載さ
れたように（Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３）行われた。ｈＰＭＳ２の５
’末端のＲＴ−ＰＣＲは、表１に記載された共通のアンチセンスプライマー（Ｉ
）およびセンスプライマー（ＡからＦ）を用いて行われた。ＪＴＶ１の５’末端
のＲＴ−ＰＣＲマッピングは、表２に記載された共通のアンチセンスプライマー
Ｐおよびセンスプライマー（ＬからＯ）を用いて行われた。ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ
末端迅速増幅法、Ｆｒｏｈｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８８）は、ｈＰＭＳ２に
対して連続アンチセンスプライマーＩおよびＧ（表１）を用いて、使用説明書（
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従って行われた。ＪＴＶ１のＲＡＣＥ解析は、アンチセン
スプライマーＰ（表２）を用いて行われた。増幅産物はＴ末端ベクター（ＩｎＶ
ｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化され、ＳＰ６およびＴ７プライマーを用いてシ
ークエンスされた。増幅は９５℃３０秒、５６℃１．５分、７０℃１．５分、３
５サイクルで行われた。反応産物は６％非変性ポリアクリルアミドゲルによる電
気泳動によって分離された。
図４は、ｈＰＭＳ２およびＪＴＶ１の両者の転写開始点を含むゲノム領域の配
列を示す（図１のようにｈＰＭＳ２に対して番号付ける）。ｈＰＭＳ２ｃＤＮＡ
クローンの５’末端は上部鎖に矢頭で示す。一つのクローンはｎｔ−１４から、
一つのクローンはｎｔ−２４から、二つのクローンはｎｔ−５３から始まる。Ｒ
ＡＣＥ産物は成人脳、白血球および胎盤ｍＲＮＡから生成された。ｎｔ＋１１６
から＋１３６に対応するアンチセンスプライマーを用いて、約１６０から１９１
ｂｐの複数のバンドと、５５０ｂｐまでの薄いバンドが観察された。クローン化
された４つのＲＡＣＥ産物の配列から、５’末端は予想されたようにｎｔ−２２
から−５５の間に位置することが示された。これらのデータは、ｈＰＭＳ２転写
物の大部分はｎｔ−１３から−５５の間で始まり、少数はさらに上流に伸びるこ
とを示す。これは、Ｈｅｌａ細胞由来のｍＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲ解析
によって確認された。ＲＴ−ＰＣＲ粗産物は、５’末端がｎｔ−１４、−１１０
、−２８３および−４１４であるセンスプライマー（プライマーＡ、Ｂ、Ｃおよ
びＤ；表１）およびｎｔ＋９０から＋１０７に対応するアンチセンスプライマー
（Ｇ）で増幅された。５’末端がｎｔ−４４８または−４８７であるセンスプラ
イマー（プライマーＥおよびＦ）を用いた場合はいかなるＰＣＲ産物も観察され
なかった。プライマーＥおよびFに欠陥がないことを確認するための、これらの
プライマーおよびｎｔ−２から＋１６に対応するアンチセンスプライマー（Ｏ）
を用いたゲノムＤＮＡの増幅は成功した。
ＪＴＶ１の５’末端はｈＰＭＳ２と同様に不均一なパターンを示した。１２個
のｃＤＮＡクローンの５’末端は図４の下部鎖に矢頭で示す。これらはＪＴＶ１
のコドン１の上流７３から１１３ｎｔに位置する。ＲＡＣＥによって、ＪＴＶ１
のｎｔ＋１５７に対応するアンチセンスプライマーを用いて産生した産物の大半
は２３０から２７０ｂｐであったというｃＤＮＡからの結果が確かめられた。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ解析は、表２に挙げたアンチセンスプライマーＰおよびいくつかのセ
ンスプライマー（ＬからＯ）を用いて行われた。５’末端が−８、−２３および
−１１１であるセンスプライマー（プライマーＬ、Ｍ、Ｎ）を用いた場合、ＰＣ
Ｒ産物が観察されたが、５’末端がＪＴＶ１の＋１に対してｎｔ−３６０である
センスプライマーＯを用いた場合は観察されなかった。後者のプライマーはゲノ
ム断片を首尾よく増幅したため、これには欠陥はなかった。
ｈＰＭＳ２転写物は不均一だが共線的な５’末端を有し、１１から４１５ｎｔ
の非翻訳配列と考えられる部位を含む。転写物の開始メチオニンと考えられる位
置の上流には読み枠内終止コドンが含まれ、元来記載されたメチオニンが最も有
力な翻訳開始点であると考えられる。ｈＰＭＳ２の他の上流コーディング領域は
存在しなかったため、ｈＰＭＳ２配列から予想される大きさと、ＬｉおよびＭｏ
ｄｒｉｃｈによって同定された１１０ｋＤａ ｈＰＭＳ２タンパク質との大きさ
の差異は、翻訳後修飾または他の内在性エキソンのためであると考えられる。
我々の結果は、ｈＰＭＳ２が、反対側の鎖から転写される新規の遺伝子ＪＴＶ
１と部分的に重なることを明らかにした（図４）。この構造はヒト第５染色体上
に発見されたｍｕｔＳ相同物ＨＵＭＤＵＧとジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）遺伝子のものと類似している（Ｆｕｊｉｉ ａｎｄ Ｓｈｉｍａｄａ，１９
８９）。ｈＰＭＳ２−ＪＴＶ１およびＨＵＭＤＵＧ−ＤＨＦＲの両者とも５’端
を互いに向けた配向(head to head arrangement)を持ち、両者とも普遍的に発現
され、両者とも複数の５’末端を有する。ＤＨＦＲおよびＨＵＭＤＵＧ由来の少
数の転写物は部分的に重なるため、これら二つの遺伝子は両方向性プロモーター
によって制御されることが仮定されてきた。しかし、ＤＨＦＲおよびＨＵＭＤＵ
Ｇの転写物の大半は重複部分を持たず、これはｈＰＭＳ２−ＪＴＶ１にも当ては
まる。他の不対合修復遺伝子群が隣接した遺伝子と５’端を互いに向けた配向を
持つかどうか、ＪＴＶ１がＤＮＡ複製または修復に関わるか決定することは興味
深いと考えられる。
実施例６
ｈＰＭＳ２およびＪＴＶ１の発現
ｈＰＭＳ２およびＪＴＶ１の発現は、ヒト組織から調製された種々のｍＲＮＡ
試料において解析された。成人脳、白血球、腎臓、大腸、結腸、唾腺、肺、精巣
および前立腺由来のｃＤＮＡ鋳型に対して、ｈＰＭＳ２にはプライマーＪおよび
Ｋ、ＪＴＶ１にはプライマーＱおよびＲ（表１および２）を用いてＲＴ−ＰＣＲ
が行われた。両方の遺伝子とも検査した全ての組織で発現していた（図５）。
参考文献
Aaltonen,L.A.,Peltomaki,P.,Leach,F.S.,Sistonen,P.,Pylkkanen,L.,Mecklin,J
.-P.,Jarvinen,H.,Powell,S.M.,Jen,J.,Hamilton,S.R.,Petersen,G.M.,Kinzler,
K.W.,Vogelstein,B.,and de la Chapelle,A.(1993)．遺伝性結腸ガンの発病学へ
の手がかり(Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer).Scie
nce 260:812-816
Chomczynski,P.,and Sacci,N.(1987).酸性イソチオシアン酸フェノールクロロホ
ルム抽出による一段階ＲＮＡ単離法(Single step method of RNA isolation bya
cidic guanidinium-isothiocyanate phenol-chloroform exttraction).Anal.Bio
chem.162:613
Bronner,C.E.,Baker,S.M.,Morrison,P.T.,Warren,G.,Smith,L.G.,Lescoe,M.K.,K
ane,M.,Earabino,C.,Lipford,J.,Lindblom,A.,Tannergard,P.,Bollag,R.J.,Godw
in,A.R.,Ward,D.C.,Nordenskjold,M.,Fiishel,R.,Kolodner,R.,and Liskay,R.M.
(1994).DNA不対合修復遺伝子相同物hMLH1 の変異は遺伝性非ポリープ性結腸ガン
に関与する(Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLH1 is a
ssociated with hereditary non -polyposis colon cancer).Nature 368:258-26
1.
Fishel,R.,Lescoe,M.,Rao,M.R.S.,Copeland,N.G.,Jenkins,N.A.,Garber,J.,Kane
,M.,and Kolodner,R.(1993).ヒトミューテーター遺伝子相同物MSH2およびその遺
伝性非ポリープ性結腸ガンとの関わり(The human mutator gene homolog MSH2 a
nd its association with hereditary nonpolyposis colon cancer).Cell75:102
7-1038.
Frohman,M.A.,Dush,M.K.,and Martin,G.R.(1988)．単一遺伝子特異的オリゴヌク
レオチドプライマーを用いた、希少な転写物増幅による全長cDNAの迅速な生成(R
apid production of full-length cDNAs from rare transcripts:amplification
using a single gene-specific oligonucleotide primer).Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 85:8998-9002.
Fujii,H.,and Shimada,T.(1989).ヒトジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子上流領域
の、種々に転写される遺伝子由来のcDNAクローンの単離および解析(Isolation a
nd characterization of cDNA clones derived from the divergently transcri
bed gene in the region upstream from the human dihydrofolate reductase g
ene).J.Biol.Chem．264:10057-10064.
Hori,A.,Han,H-.J.,Sasaki,S.,Shimada,M.,and Nakamura,Y.(1994)．付対合修復
遺伝子の一つ酵母PMS1に相同なヒト遺伝子のクローニング、解析および染色体マ
ッピング(Cloning,characterization and chromosomal assignment of the huma
ngenes homologous to yeast PMS1,a member of mismatch repair genes).Bioch
em.Biophys.Res.Comm．204:1257-1264.
Ionov,Y.,Peinado,M.A.,Malkbosyan,S.,Shibata,D.,and Perucho,M.(1993).結腸
における発ガンの新しい機構である、単純反復配列の普遍的な体細胞変異(Ubiqu
itous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechan
ism for colonic carcinogenesis).Nature 260:558-561.
Kinzler,K.W.,and Vogelstein,B.(1989)．全ゲノムPCR：遺伝子制御タンパク質
が結合した配列の同定への応用(Whole genome PCR:application to the identif
ication of sequences bound by gene regulatory proteins).Nuc.Acid.Res．17
:3645-3653.
Kozak,M.(1986)．真核生物リボソームによる翻訳を制御する、AUG 開始コドンの
周辺配列の点変異による決定(Point mutations define a sequence flanking th
e AUG initiator codon that modulates translation by eucaryotic ribosomes
).Cell 44:283-292.
Leach,F.S.,Nicolaides,N.C.,Papadopoulos,N.,Liu,B.,Jen,J.,Parsons,R.,Pelt
omaki,P.,Sistonen,P.,Analtonen,L.A.,Nystrom-Lahti,M.,Guan,X.-Y.,Zhang,J.
,Meltzer,P.S.,Yu,J.-W.,Kao,F.-T.,Chen,D.J.,Cerosaletti,K.M.,Fournier,R.E
.K.,Todd,S.,Lewis,T.,Leach,R.J.,Naylor,S.L.,Weissenbach,J.,Mecklin,J.-P.
,Jarvinen,J.A.,Petersen,G.M.,Hamilton,S.R.,Green,J.,Jass,J.,Watson,P.,Ly
nch,H.T.,Trent,J.M.,de la Chapelle,A.,Kinzler,K.W.,and Vogelstein,B.(199
3)．遺伝性非ポリープ性結腸ガンにおける、mutS相同物の変異(Mutations of am
utS homolog in hereditary nonpolyposis colorectal cancer).Cell 75:1215-
1225.
Li,G.-M.,and Modrich,P.(1994).ヒトmutL相同物のヘテロ二量体による、H6結腸
腫瘍細胞核抽出物への不対合修復能の再付与(Restoration of mismatch repairt
o nuclear extracts of H6 colorectal tumor cells by a heterodimer of huma
n mutL homologs).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1950-1954.
Lynch,H.T.,Smyrk,T.C.,Watson,P.,Lanspa,S.J.,Lynch,J.F.,Cavalieri,R.J.,an
d Boland,C.R.(1993).遺伝性非ポリープ性結腸ガンの遺伝学、観察、腫瘍スペク
トルおよび病理学：最新の総説(Genetics,natural history,tumor spectrum,and
pathology of hereditary nonpolyposis colorectal cancer:Anupdated review
).Gastroenterology 104:1535-1549.
Modrich,P.(1995)．不対合修復、遺伝的安定性およびガン(Mismatch repair,gen
e tic stability,and cancer).Science 266:1959-1960.
Nicolaides,N.C.,Papadopoulos,N.,Liu,B.,Wei,Y.-F.,Carter,K.C.,Ruben,S.M.,
Rosen,C.A.,Haseltine,W.A.,Fleischmann,R.D.,Fraser,C.M.,Adams,M.D.,Venter
,J.C.,Dunlop,M.G.,Hamiltom,S.R.,Petersen,G.M.,de la Chapelle,A.,Vogelste
in,B.,and Kinzler,K.W.(1994)．遺伝性非ポリープ性結腸ガンにおける、二つの
P
MS相同物の変異(Mutations of two PMS homologues in hereditary nonpolypos
is colon cancer).Nature 371:75-80.
Palombo,F.,Hughes,M.,Jiricny,J.,Truong,O.,and Hsuan,J.(1994).不対合修復
とガン(Mismatch repair and cancer).Nature367:417-418.
Papadopoulos,N.,Nicolaides,N.C.,Wei,Y.-Ruben,S.M.,F.,Carter,K.C.,Rosen,C
.A.,Haseltine,W.A.,Fleischmann,R.D.,Fraser,C.M.,Adams,M.D.,Venter,J.C.,H
amiltom,S.R.,Petersen,G.M.,Watson,P.,Lynch,H.T.,Peltomaki,P.,Mecklin,J.-
P.,de la Chapelle,A.,Kinzler,K.W.,and Vogelstein,B.(1994).遺伝性結腸ガン
におけるmutL相同物の変異(Mutations of a mutL homolog in hereditary colon
cancer).Science 263:1625-1629.
Parsons,R.,Li,G.-M.,Lonley,M.J.,Fang,W.-H.,Papadopoulos,N.,Jen,J.,de laC
hapelle,A.,Kinzler,K.W.,Vogelstein,B.,and Modrich,P.(1993).RER+腫瘍細胞
における高変異性および不対合修復欠損(Hypermutability and mismatch repair
deficiency in RER+ tumor cells).Cell 75:1227-1236.
Powers,P.A.,Scherer,S.W.,Tsui,L.-C.,Gregg,R.G.,Hogan,K.(1994).体細胞ハイ
ブリッドの解析から、ヒト骨格筋電圧依存性カルシウムチャンネルのα2/σサブ
ユニットをコードする遺伝子は染色体7q21-22 に位置する(Localization of the
gene encoding the α2/σ subunit (CACNL2A) of the human skeletal muscle
voltage-dependent Ca2+ channel to chromosome 7q21-22 by somatic cell hyb
rid analysis).Genomics 19:192-193.
Scherer,S.W.,Neufeld,E.J.,Lievens,P.M.-J.,Orkin,S.H.,Kim,J.,and Tsui,L.-
C.(1993)．体細胞ハイブリッドの解析から、CCAAT 除去タンパク質遺伝子（CUTL
1）は染色体上の7q22に位置する(Regional localization of the CCAAT displa
cement protein gene(CUTL1) to 7q22 by analysis of somatic cell hybrids).
Genomics 15:695-696.
Shibata,D.,Peinado,M.A.,Ionov,Y.,Malkhosyan,S.,and Perucho,M(1994)．反復
配列のゲノム不安定性は結腸腫瘍形成の初期状態であり、形質転換後も続く(Gen
omic instability in repeated sequences is an early somatic event in colo
rectal tumorigenesis that persists after transformation).Nature Genet．6
:273-281.
Thibodeau,S.N.,Bren,G.,and Schaid,D.(1993)．近位結腸のガンにおけるミクロ
サテライトの不安定性(Microsatellite instability in cancer of the proxima
l colon).Science 260:816-819.
Umar,A.,Boyer,J.C.,Thomas,D.C.,Nguyen,D.C.,Risinger,J.I.,Boyd,J.,Ionov,Y
.,Perucho,M.,and Kunkel,T.A.(1994)．ミクロサテライトの不安定性を示す結腸
および子宮内膜ガン細胞系列の抽出物の不対合修復能欠損(Defective mismatchr
epair in extracts of colorectal and endometrial cancer cell lines exhibi
ting microsatellite instability).J.Biol.Chem．269:14367-14370.
【手続補正書】特許法第１８４条の４第４項
【提出日】１９９７年３月３日
【補正内容】
請求の範囲
１．図２に示されるヌクレオチド配列からなるｃＤＮＡ断片。
２．請求項１のＤＮＡ断片を含むベクター。
３．請求項２のベクターを含む宿主細胞。
４．実質的に、図２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる組成
物。
５．他のヒトタンパク質が混入していない、図２に示されるＪＴＶ１タンパク
質の組成物。
６．図２に示されるＪＴＶ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ
断片。
７．ｃＤＮＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される１５から１１７６の連続す
るヌクレオチドからなるｃＤＮＡプローブ。
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フロントページの続き
(72)発明者 ニコレイデス，ニコラス・シー
アメリカ合衆国メリーランド州21236，ボ
ルティモア，ローズンクランズ・プレース
１，アパートメント ２ビー
【要約の続き】