JPH11510155A

JPH11510155A - 治療方法

Info

Publication number: JPH11510155A
Application number: JP9507372A
Authority: JP
Inventors: ロバーツ，クレイグ，ウィリアム; ブレウェア，ジェームス，マクドナルド; アレクサンダー，ジェイムズ
Original assignee: プロチュースモレキュラーデザインリミテッド
Priority date: 1995-08-02
Filing date: 1996-08-01
Publication date: 1999-09-07
Also published as: MX9800919A; GB9515868D0; AU6626296A; EP0861074A1; CA2228298A1; AU705662B2; ZA966603B; WO1997004768A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、サイトカインの上昇したレベルに関連する炎症状態および他の状態を処置または予防する方法を提供する。このような状態としては、リウマチ様関節炎および喘息が挙げられる。この方法は、非イオン性界面活性剤ベシクルを被検体に投与することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】治療方法本発明は、サイトカイン、特に、前炎症性サイトカインおよび上昇すると有害な効果を誘発する他のサイトカインの望ましくなく上昇したレベルに関連する炎症性および他の状態を治療または予防する方法に関する。サイトカインは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージを含む、免疫性の炎症性応答に関わる様々な細胞により生成される誘発性の可溶性タンパクである。インターロイキン、コロニー刺激因子、ケモカイン、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子のファミリーを含む、多数の異なるサイトカインが存在する。これらは、損傷、感染、炎症および腫瘍の状態を含む広範囲の刺激に応答して生成され、免疫制御因子、成長因子および分化因子としての機能を含む様々な機能を果たす。免疫系は、サイトカインと宿主細胞、他のサイトカインおよび制御分子との間の多くの相互作用を有する極めて複雑なネットワークからなっている。免疫系の各細胞タイプは、その細胞タイプに典型的なサイトカインの明確なレパートリーを生み出すが、たいていのサイトカインが二つ以上の細胞タイプにより生成されるため、様々な細胞タイプ間での生成において幾分オーバーラップしている。サイトカインは、多面発現的に作用し、すなわち、イトカインは、それらの効果が高アフィニティー膜受容体により発揮される宿主中の種々な標的細胞に作用して、その特定の標的細胞に依存した効果を生み出す。従って、このネットワークは、単一のサイトカインが二つ以上の細胞タイプと相互作用すること、個々のサイトカインが多数の生物学的活性を有すること、幾つかのサイトカインが共通の効果を（しばしば、見たところ相乗作用的な方法で）媒介する因子として作用できること、およびサイトカインの効果が（サイトカイン受容体が多くの細胞上に存在するので）多様で広範囲に及びうることを保証している。サイトカインは極めて迅速に誘発され、通常のレベルで誘発されると、チャレンジ、例えば感染、損傷および炎症に応答して、このようなチャレンジに対する身体の防御および治癒の過程に必須である代謝的および生化学的変化を媒介することにより、宿主に利益をもたらす。しかしながら、望ましくなく上昇したレベルのサイトカイン生成は、敗血病、カヘキシー、リウマチ様関節炎および喘息を含む、人類に知られた最も致命的かつ広範囲の慢性的な衰弱性疾患の幾つかを媒介しうる。この点において特に関連するものは、炎症の発生および維持に本来的に関連しているサイトカイン、いわゆる前炎症性サイトカインの群であり、これらとしては、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン１アルファおよびベータ(IL-1αおよびIL-1β)、インターロイキン６(IL-6)、インターロイキン８(IL- 8)、およびインターロイキン１２(IL-12)、並びにアレルギー性炎症のプロモーターとして作用する他のサイトカイン、例えばインターロイキン４（IL-4）およびインターロイキン５（IL-5）が挙げられる。これらのどのサイトカインの過剰生成も、急性および慢性炎症の病理学に関連する。これらの前炎症性サイトカインおよびアレルギー性炎症のサイトカインプロモーターの病理生理学的効果は、過剰生成により予期されるような、それらが通常引き出す応答の誇張によりしばしば特徴付けられる。これは、過剰の血管拡張を引き起こす内皮性因子の超生成、白血球遊送、内皮の低応答性、平滑筋の収縮、漏出性出血、および可溶性因子のさらなる放出、またはさらなる炎症性応答が可能な細胞、例えばマクロファージおよびマスト細胞の刺激を導くことがある。様々な疾患状態は、望ましくなく上昇したサイトカインレベルに関連しており、これらはしばしば、病理生理学的効果の多様性を導く様々なサイトカイン間での相乗作用により悪化する。このような疾患の例としては、以下のものが挙げられる： - 敗血症性ショック、これは入院患者が遭遇する特定の問題であり、しばしば生命を脅かす疾患であり、細胞壁成分である内毒素LPSがその疾患の開始を招くバクテリア感染により引き起こされると信じられている。感染に関連する破壊的な炎症性応答は、TNF-αおよび他の前炎症性サイトカインがLPSにより刺激された結果である。TNF-αは、敗血症の第一の原因物質であることが示されている（Glauser et al.，Clinical Infectious Diseases 18，s 205-216(1994)）。TNF-αの急性および慢性の過剰生成は、様々な系に対して広範囲の影響を及ぼす;それは、散在した血管内凝集、血管付着分子の増加、それ故に細胞の流出、および血管緊張および血小板凝集を行い得るプロスタグランディンおよびロイコトリエンの増加に帰着し得る。TNF-α は、バクテリア感染から、外傷（トラウマ，trauma）などの他の攻撃から生じうる全身性炎症性応答症候群（SIRS:敗血症としても知られる）に至り、重い敗血症（SIRSプラス体温上昇、頻拍、乳酸性アシドーシス、潅流異常および乏尿）を経て、敗血症性ショック（重い敗血症プラス低血圧）までの進行を媒介する。この過多の効果は、他の累積過程において共同して作用する前炎症性サイトカイン、例えばIL-1、IL-6およびIL-8などとともにTNF-αをかなめとして有するカスケード系の形態をとる。特に、IL-1およびIL-6はSIRSを媒介するに際し、臨界的な役割を果たす(Glauser et al.，(1994);Dinarelli，Eur．Cytokine Netw.，5(6) ，517-531（1994）；Borden & Chin，J．Lab．Clin．Med.，126(6)，824-829(19 94))。 - 急性期応答(APR)。これは、感染、トラウマ、新生物またはホメオスタシスにストレスを与える他の障害から生じる予定され、良く調和して編成された局所的および全身的な反応からなる(Borden & Chin，J．Lab．Clin．Med 123，824-9 (1994))。損傷の部位での局所的な反応としては、血小板の凝集および凝塊形成、血管の拡張および漏出、特にIL-1、TNF-αおよびIL-6を含む多くのサイトカインを放出する顆粒球および単球/マクロファージの蓄積および活性化などが挙げられる。全身的な反応としては、発熱、白血球増加、補体および凝血生成のカスケードの活性化、および肝臓で生成される”急性期”血漿タンパクの濃度変化などが挙げられる。望ましくなく上昇した IL-6のレベルは、SIRS、火傷損傷、トラウマの患者、および臓器移植後の患者において注目されており、後者の症例においては臓器拒絶の初期徴候を与える。 - 関節炎疾患、変形性関節症（OA）およびリウマチ様関節炎(RA)、これらは、前炎症性サイトカイン IL-1、TNF-αおよびIL-6が主として重要である複雑なサイトカインネットワークにより制御される(Sipe et al.，Mediators of Inflamm ation，3，243-256(1994))。これら三種のサイトカイン全ては、RA患者からの滑液、滑膜および軟骨において、望ましくなく上昇したレベルで検出されている一方で、IL-1およびIL-6がOA患者からの後者の組織において見出されている。RAにおいては IL-8も重要である。IL-15もまた、RAと関連している。実に、TNF-αまたは IL-1レベルを低下させる特定の治療は、リウマチ様関節炎における腫れた関節および全体的な痛みに対して積極的な利益を有することが示されている。 - アレルギー性炎症。多くのアレルギーは、Th2-タイプのTヘルパー細胞によるIL-4およびIL-5の過剰生成に関連しており、これらはヒトにおけるアレルギー性炎症の病理学に関与し（Kumar & Busse，1995）;Romagnami，Current Opin．Immunology，6(6)，838 -846(1994))、また、これらは体液の免疫性に関連している。アレルギー性および非アレルギー性喘息の両方は、望ましくなく上昇した IL- 4およびIL-5レベルに関連している(Kumar & Busse，Scientific American:Scien ce & Medicine，March/April，38-47(1995))。IL-6およびTNF-αもまた、喘息の病因に関与する。 ”アレルギー性”炎症性プロモーターであるIL-4およびIL-5、およびヒスタミンなどの迅速な媒介物質の過剰生成に根本的に結びついた他の一般的なアレルギーとしては、限定はされないが、花粉アレルギー( 枯草熱)、非特異的アレルギー性鼻炎、家屋の塵ダニアレルギーおよび動物の鱗屑アレルギーなどが挙げられる。 - カヘキシー、慢性的な侵入性疾患、例えば癌および寄生体性疾患、並びにHI V感染に関連した厳しい体重損失および組織消耗の状態、栄養要求および食物摂取のバランスから外れた、TNF-α、IL-1およびIL-6が全て体液媒介物質として巻き込まれる、継続した脂肪およびタンパクの異化作用により特徴付けられる。 - IL-6の上昇したレベルに関連することが示されている特定タイプの癌、例えば多発性骨髄腫のようなB細胞新生(Akira et al.，Adv．Immunology，54 1-63， (1993))。他の炎症性疾患としては、潰瘍性大腸炎、IL-12が関連する炎症性腸疾患、およびアテローム性動脈硬化などが挙げられる。これらの疾患にかかっている患者により示される極めて多様な範囲の症状として理解されるものであるにもかかわらず、それらは全て、これらのサイトカインの根本的な関与により特徴付けられる。現在の治療上の戦略は、例えば、サイトカインとその受容体との相互作用を、一方または他方の成分に対する結合パートナー、例えば受容体またはサイトカインに対する抗体を用いて遮断または干渉しようと試みることにより、個々のサイトカイン（または第二のメッセンジャー）の効果を標的ねらいすることに基づいている。このような戦略は、単一媒介物質のみに対して集中させる際に著しい制限があり、しばしば短命である。さらに、サイトカイン間の相互作用経路の複雑なネットワークにおいて只一つの物質を除去または不活性化することは、単に経路間の切換として作用し、炎症性応答を媒介する異なるサイトカインに帰着するであろう。加えて、ヒトへの抗体の投与に依存する体系的処置方法には問題がないわけではなく、また、しばしばこのような処置の望ましくない副作用は、利益よりもまさっている。したがって、多数のサイトカインを多面発現的に作用させることができる新規な治療方法に対する要求がある。本発明は、このような方法を提供する。したがって、一つの観点から見ると、本発明は、被検体に有効量の非イオン性界面活性剤ベシクル（NISV）を投与することからなる、上昇すると有害な効果を誘発する一つ以上のサイトカインの望ましくなく上昇したレベルに関連する状態と戦う方法を提供する。関連する見地において、本発明は、上昇すると有害な効果を誘発する一つ以上のサイトカインの望ましくなく上昇したレベルに関連する状態と戦うのに使用するための剤の製造におけるNISVの用途を提供する。このような状態としては、敗血症性ショックおよび重い敗血症、カヘキシー、並びに炎症状態、例えばリウマチ様関節炎、喘息および局所的アレルギー状態、例えば湿疹および乾せん、バクテリア性内毒素血症、SIRS、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、アテローム性動脈硬化、骨粗鬆症、糖尿病、白血病、多発性骨髄腫、嚢胞性線維症、肺線維症、急性髄膜炎菌感染、アルコール性肝炎、様々なアレルギー、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症が挙げられ、これら疾患の治療は本発明の特別な観点を構成する。ここで用いられるように、”戦う（combating）”という語は、予防および治療の両方を包含する。我々は、NISVが、前炎症性サイトカインであるTNF-α、IL-1、IL-6およびIL-8 、並びにアレルギー性炎症のサイトカイン媒介物質であるIL-4およびIL-5のレベルを独立して低下させることができることを見出した。細胞レベルでのこの治療活性は、これらのサイトカインの上昇したレベルに関連する疾患の処理に関して、生理学的レベルでの注目すべき利益に変換する。この文脈で、望ましくなく上昇したサイトカインレベルは、炎症の徴候またはその特徴的な応答を示さない” 正常な”被検体において観察されるよりも大きなレベルを指す。我々は、ヒトおよび動物の細胞の両方において、インビボおよびエクスビボで、これらのサイトカインのレベルの低下を実証した。我々はまた、カヘキシーの動物モデルにおいて、明確な治療効果をも実証した。一つの観点において、本発明は、炎症性応答において細胞により生成されるTN F-αのレベルを低下させるためのNISVの用途に関する。これは、敗血症およびカヘキシーの治療および予防において特に重要である。本発明はまた、炎症および免疫過程に関与する細胞により生成されるIL-1、IL-6、IL-8、IL-12および/またはIL-4および／または IL-5の一つ以上のレベルを低下させるためのNISVの用途にも関する。 NISVは、例えば薬物などのキャリアとして、また化粧品の成分としても知られている。抗原が閉じ込められている場合には、このようなベシクル（小胞）は、国際特許出願番号WO93/19781およびWO95/09651に記載されているように、効力のある免疫学上のアジュバントとしても知られている。しかしながら、我々は、ベシクル自身の治療上の可能性が、特に抗原不在で免疫調節剤として、これまでに認識されたことについて知っていない。したがって、本発明は、NISVをキャリアとしてではなく、唯一つの治療活性剤として使用できる点で、NISVを必要とする先行技術の治療から区別することができる。NISVは、閉じ込められたか、またはそれらに会合した他の如何なる生物学上の活性物質がなくても、活性を有する。言い換えれば、それらを”空”で用いることができる。本発明に従って用いられるベシクルは、非イオン性界面活性剤の単独からなっていてもよく、所望により他の成分、例えば脂肪、脂肪酸および脂質を粘膜を通して輸送する能力またはその輸送を促進する能力を有する分子、例えばWO95/096 51に記載されたような胆汁酸塩を含んでいてもよい。事実、これらの輸送能力を備えたこのような分子からなるベシクルに基づいた組成物は新規である。このようなベシクルの例は、上記のWO95/09651に記載されており、これは製造方法をも記載している。本発明は、全てのタイプのNISV小胞構造、例えば単層ラメラベシクル（一つの二層膜からなる）、多層ラメラベシクル（二つ以上の二層膜からなる）、および単層ラメラおよび/または多層ラメラベシクルからなっていてよい多小胞状ベシクルに適用できる。 NISVの製造方法は、この技術においてよく知られており、例えばWO93/19781およびWO95/09651を含む文献に記載されている。 NISVを形成するために用いられる非イオン界面活性剤は、適当な界面活性の性質を有する薬理学上許容される全ての物質であってよい。このような物質の好ましい例は、グリセロールエステルである。このようなグリセロールエステルは、一つまたは二つの高級脂肪族アシル基、例えば各アシル部分中に少なくとも10個の炭素原子を含有する基を含んでいてもよい。グリセロールモノエステル、特にＣ₁₂-Ｃ₂₀アルカノイルまたはアルケノイル部分、例えばカプロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、オレイルまたはステアロイルを含有するものが好ましい。特に好ましい界面活性剤は、１-モノパルミトイルグリセロールである。エーテル結合した界面活性剤も、本発明のNISVを構成する非イオン性界面活性剤として使用できる。このような物質の好ましい例は、グリセロールまたはグリコール、好ましくは４炭素原子以下の低級脂肪族グリコール、最も好ましくはエチレングリコールに基づいたエーテル結合界面活性剤である。このようなグリコールに基づいた界面活性剤は、二つ以上のグリコールユニット、好ましくは五つ以下、より好ましくは二つまたは三つのグリコールユニットを含有していてもよく、例えばジグリコールセチルエーテルまたはポリオキシエチレン-3-ラウリルエーテルである。グリコールまたはグリセロールモノエーテルが好ましく、特にＣ₁₂-Ｃ₂₀アルキルまたはアルケニル部分、例えばカプリル、ラウリル、ミリスチル、セチル、オレイルまたはステアリルを含有するものが好ましい。本発明で用いることのできるエチレンオキシド縮合生成物としては、WO88/068 82に記載されたもの、すなわちポリオキシエチレンの高級脂肪族エーテルおよびアミン界面活性剤が挙げられる。特に好ましいエーテル結合界面活性剤は、1-モノセチルグリセロールエーテルおよびジグリコールセチルエーテルである。しかしながら、本発明の用途にとっては、薬理学上許容される物質、好ましくは哺乳類系において容易に生物分解可能なものを選択することが必要である。こういうわけで、以下の投与法で投与されるベシクルを製造するためには、上記のグリセロールエステルが好ましい。皮下、筋内、皮内、腹腔内または関節内のいずれかの注射による投与、あるいは粘膜経路、例えば口、鼻、気管支、尿生殖器、直腸、肺内または眼への投与、経口投与は、特に胆汁酸塩または等価の化合物を含有するベシクルの場合において、特に好ましい。一つの観点において、本発明は、上昇すると有害な効果を誘発するサイトカインの望ましくなく上昇したレベルに関連する状態と戦うための、NISVを製薬上許容されるキャリアまたは賦形剤と一緒に含有する、肺内または筋内投与に好適な形態の製薬組成物を提供する。脂肪、脂肪酸および脂質を、膜を通して輸送するかまたはその輸送を促進することができる能力を有する分子（以下、”輸送促進剤”という）をさらに含有する上述のベシクルの場合において、このような様々の分子、例えばWO95/09561に記載されたものなどを用いることができる。側鎖のC²³炭素原子がカルボン酸およびその誘導体を有するコレステロール誘導体が、特に好ましい。このような誘導体の内、”胆汁酸”は、コール酸およびケノデオキシコール酸、これらとグリシンまたはタウリンとの接合生成物、例えばグリコール酸およびタウロコール酸、および例えばデオキシコール酸およびウルソデオキシコール酸などの誘導体、およびこれら各々の酸の塩である。また、”輸送促進剤”として好ましいものは、アシルオキシ化アミノ酸、好ましくはアシルカルニチンおよびその塩、特にC_6-20アルカノイルまたはアルケノイル部分を含有するもの、例えばパルミトイルカルニチンである。ここで用いられるように、アシルオキシ化アミノ酸という語は、一級、二級および三級アミノ酸、並びにα、βおよびγアミノ酸を包含することが意図される。アシルカルニチンは、アシルオキシ化γアミノ酸の例である。これらのベシクルは、当然ながら、非イオン性界面活性剤に加えて、二つ以上のタイプの”輸送促進剤”、例えば一つ（またはそれ以上）の異なる胆汁酸塩および一つ（またはそれ以上）のアシルカルニチンからなっていてもよい。有効にベシクルを形成するために、非イオン性界面活性剤は、二層膜を形成することができる高分子量の好適な疎水性物質、特にステロイド、例えばコレストロールなどのステロールと混合することが必要な場合がある。コレステロールなどの物質の存在は、ベシクルの物理的特性が依存する二層膜形成を補助する。 NISVは、電荷を生じさせる両親媒性物質を取り込んで、NISVに電荷を持たせることもできる。酸性物質、例えば高級アルカン酸およびアルケン酸（例えば、パルミチン酸、オレイン酸）；または酸性基を含有する他の化合物、ホスフェート、例えばジアルキル、好ましくはジ(高級アルキル)ホスフェート、例えばジセチルホスフェート、またはホスファチジン酸、あるいはスルフェートモノエステル、例えば高級アルキルスルフェート、例えば高級アルキルスルフェート、例えばセチルスルフェートは全て、この目的のために用いることができる。ステロイドは、例えば非イオン性界面活性剤の20〜120重量パーセント、好ましくは 60〜100重量パーセントを占めることができる。電荷を生じさせる両親媒性物質は、例えば非イオン性界面活性剤の1〜30重量パーセントを占めることができる。電荷を生じさせる両親媒性物質は、ベシクルの構造を安定化し、効果的な分散を提供する。非イオン性界面活性剤および膜形成性の疏水性物質は、剪断力の存在下で水和させることによりNISVに変換することができる。このような剪断力を適用するための装置は公知であり、好適な装置は例えばWO88/06882に記載されている。音波処理および超音波処理もまた、NISVの形成、またはそれらの粒子サイズの変更に対して効果的な手段である。本質的には、ベシクルを形成するための試薬を、好都合には80〜150℃の範囲の温度で、好都合には好適な媒体、例えば緩衝剤または水性溶液の存在下で接触させて、界面活性剤を”溶融”し、均一な懸濁を保証するために攪拌する。このような混合は標準的な公知の技術、例えばボルテックスまたは均一化装置、例えば製薬産業において普通の装置の使用によるものであってよい。 NISVの製造のために有効な方法は、Collins et al.，J．Pharm．Pharmocol．4 2 53（1990）により開示されたものである。これは、NIS、ステロイドおよび（用いられるならば）両親媒性物質の混合物を溶解すること、および水性緩衝剤の存在下で激しく混合しながら水和させることを含んでいる。次いで懸濁物は、NI SV-形成混合物を溶融状態に維持するのに十分な高められた温度で、微孔性ポリカーボネート膜を通して数回押し出される。有機溶媒、例えば炭化水素または塩素化炭化水素溶媒、例えばクロロホルムから、ロータリーフィルム蒸発によりNISVを形成することも可能である。得られた薄膜は、次いで所望によりリン酸緩衝塩水中で、取り込まれるべき物質および所望により別の界面活性剤の存在下で水和することができる(Russell and Alexand er，J．Immunol．140，1274(1988))。特定サイズのベシクルが要求される場合、これらは、Nayar et al．（Biochem ．Biophys．Acta 986 200-206(1989)）により記載されたように、ポリカーボネートフィルターを通して逐次押し出すことにより、あるいはこの技術で知られた他の方法、例えば試薬を特定の条件下で、例えば異なる回数および異なる速さ（これらは、各系および所望するサイズごとに適当に決定できる）で混合して均一化することにより、製造することができる。理論に束縛されることは望まないが、本発明の治療剤は、関連するサイトカイン生成の原因となる細胞、典型的にはマクロファージおよび単球、並びに他の免疫細胞レベルで作用すると信じられる。特に、本発明によれば、単一の剤を用いて二つ以上のサイトカインをダウンレギュレーションすることができるため、このレベルでのサイトカイン生成のダウンレギュレーションは、個々のサイトカインの活性を遮断しようと試みる現行の治療と比べて、相当な前進を意味する。もう一つの観点から見ると、本発明は、カヘキシーにかかったか、またはかかりやすい被検体に、有効量のNISVを投与することを含む、カヘキシーと戦う方法を提供する。関連する観点において、本発明は、カヘキシーの処置または予防に使用するための剤の製造におけるNISVの用途を提供する。更なる観点において、本発明は、敗血症性ショックにかかっているか、またはかかりやすい被検体に、有効量のNISVを投与することを含む、敗血症性ショックと戦う方法を提供する。関連する観点において、本発明は、敗血症性ショックの処置または予防に使用するための剤の製造におけるNISVの用途を提供する。もう一つの観点から見ると、本発明は、関節炎にかかっているか、またはかかりやすい被検体に、有効量のNISV 投与することを含む、関節炎と戦う方法を提供する。関連する観点において、本発明は、関節炎の処置または予防に使用するための剤の製造におけるNISVの用途を提供する。もう一つの観点から見ると、本発明は、喘息にかかっているか、またはかかりやすい被検体に、有効量のNISVを投与することを含む、喘息と戦う方法を提供する。関連する観点において、本発明は、喘息の処置または予防に使用するための剤の製造におけるNISVの用途を提供する。ここで用いられる、”処置”または”処置する”は、前炎症性サイトカインレベルが危機的に上昇してしまう前に時宜にかなったNISVの投与による、存在する病的状態の緩和、およびその予防的阻止の両方を指す。このような状態の発症は、しばしば予知することができるが、従来は利用可能な有効な予防方法は無かった。本発明に係る治療剤は、全ての従来方法、例えば非経口的に（例えば、腹腔内、皮下、筋内、皮内または静脈内）、局所的に(例えば、皮膚へのクリームとして)、関節内に、粘膜的に(例えば、口、鼻、膣、直腸および眼内経路を介して) 、あるいは、例えば肺および気管支系中に直接に剤を送達するように設計されたデバイス、例えば吸入デバイスおよび噴霧器を用いた肺内送達により投与することができ、また、従来の薬学的方法に従って、所望により一つ以上の製薬上許容されるキャリアまたは賦形剤、例えばRemingtons Pharmaceutical Science，ed ．Gennaro，Mack Publishing Company，Pennsylvania，USA（1990）に記載されたようなものとともに処方することができる。このような組成物は、好都合には、例えば粘膜、非経口または経口投与のための単位投与量形態として処方される。 NISVは、それ自体知られているが、このような調製物を単位投与量に分割することが提唱されたことがなかった。したがって、更なる観点において、本発明は、空のNISVを製薬上許容されるキャリアまたは賦形剤とともに、好都合には単位投与量形態で含有する、製薬組成物を提供する。この文脈において、”空のNISV”は、取り込まれたか、またはそれらと会合した活性物質を有しないNISVである。実際の体系的処置方法または体系的予防方法、処方および投与量は、広い範囲で、個々の患者に依存し、個々の状況に基づいて医療従事者により工夫することができる。処方のタイプは、投与経路に好適なものであろう。例えば、皮下または筋内注射によるNISVの非経口投与は、注射用のPBSまたは水中のNISVの滅菌水性懸濁液を用いて行われ、アンプル、バイアル中に、または予め充填したシリンジ中の計量された投与として、または投与前に注射用のPBSまたは水で再構成するための凍結乾燥物の形態で提供される。皮下注射のためのNISVの投与量としては、例えばPBSまたは水中の上記のように処方されたベシクル2.5〜50mg、例えば2.5〜25mgが挙げられる。皮下経路のための体系的投与方法は、特定の臨床状況での作用期間により決定することができる。投与の頻度は、毎日の注射から毎週または二週間ごとの注射の範囲であってよい。典型的な体系的投与方法は、例えば14日の間隔で二回の投与、14日の間隔で三回の投与、０、28および84日の間隔で三回の投与、または７日の間隔で三回の投与からなることができる。粘膜投与は、例えばこれらの体系的方法に従うことができる。経口投与の投与量は、ベシクル2.5〜50mg、またはこれより相当高くてもよい。好適な経口用処方としては、シロップの矯味矯臭液状懸濁剤、液体／粉末充填カプセルなどが挙げられる。呼吸器への投与（鼻からまたは口から）のためには、NISVの水性懸濁液の計量スプレー吸入器または噴霧器を用いることができる。本発明は、第一にヒトに適用できるが、獣医学において、例えばコンパニオン動物、例えばネコおよびイヌ、および家畜、例えば食用飼鳥類を処置するために用いることもできる。一般的に、ベシクルのサイズは決定的ではなく、本発明方法は、上述の経路による投与に適する広いサイズ範囲のベシクルに適用可能である。広範囲のNISVサイズは、例えば約100nmから数マイクロメーターのオーダーにわたって文献に記載されており、用いることができる。しかしながら、我々は、前炎症性サイトカインおよび炎症のサイトカイン媒介物質のレベルが本発明のベシクルにより影響を受ける一方で、サイトカインレベルの調節の程度がベシクルのサイズにより影響を受けること、および特に、特定のベシクルサイズが、観察できるサイトカインレベルの低下を向上させることができることを見出した。すなわち、我々は、前炎症性サイトカイン生成のダウンレギュレーションが、我々の実験により150 〜215nmの範囲内であることが示された閾値より上で特に際立っていることを見出した。この効果は、用いる系、すなわちベシクルの性質、処置される状態および関係する動物種にも依存して変化することがある。この向上した有益な効果を達成するのに好適なベシクルサイズは、適当な試験により決定することができる。インビトロでは、ネズミおよびヒトの細胞は、NISVの有益な効果の向上について、同様のサイズ閾値を示すように見える。すなわち、例えばネズミおよびヒトの場合において、我々の実験は、有益な向上した効果が約200nmより大きいベシクルで得ることができることを示した。特に、より大きなベシクル、典型的には平均直径が約200または215nm より大きく、数マイクロメーター以下（例えば750-3000nm）のベシクルは、より小さなベシクル、例えば平均直径が約160nmのものと比べて、より大きなIL-5およびIL-1ダウンレギュレーションを引き起こすことが示された。インビボ実験は、数マイクロメーター以下のベシクルが有効であることを実証した。したがって、本発明の好ましい観点は、ベシクルが200nmより大きい、好ましくは215nmより大きい、より好ましくは250nmより大きい平均直径を有する、本発明の全ての方法、用途および組成物を包含する。 NISVサイズの役割のこの発見は、前炎症性サイトカインおよび炎症性のサイトカイン媒介物質の上昇したレベルに関連したアレルギー性疾患および炎症性疾患の全てにおいて重要である。所望ならば、調製物のベシクルのサイズ分布を調節して、例えば可変性を低減させ、特定のサイズ範囲のベシクルを排除するか、または均一な調製物を得ることができる。これは、Nayar et al，Biochem．Biophys．Acta，986，200-209（1 989）に記載されているように、既知の直径の細孔を有するポリカーボネート膜を通して押し出すことにより達成することができる。この押し出し法により製造されたベシクルの実際のサイズは、用いた膜の定格細孔直径とは異なることがあるのは勿論理解されることであり、したがって、一旦形成されたベシクルのサイズを、当業者に知られた他の方法、例えば光子相関分光法（PCS）および電子顕微鏡検査法（EM）により更に特徴付けることが望ましい。比較的均一なサイズのベシクルを製造する他の方法としては、フレンチプレス、Lasic，Liposomes： from physics to applications，Elservier，Amsterdam（1993）に記載されたような、マイクロ流動化/均質化および音波処理の使用が挙げられる。このような調製物のサイズは、上記の技術により確認することができる。他の製造方法を用いたならば、所望のサイズのベシクルは、より不均一なサイズ個体群から、例えばサイズ排除クロマトグラフィー法、遠心分離法などを含む当業者に公知の様々な技術により分別することができる。サイトカイン経路および相互作用の上記の考察は、この高度に複雑な、かつ急速に発展している分野に関する現存の知識の概要にすぎない。我々の発明が、どの特定のサイトカイン活性の理論にも拘束されるものではなく、断固として実験による観測に基づいたものであることは、明らかに理解されるべきである。特定のサイトカインの活性が、細胞タイプに応じて変化すること、およびサイトカインが状態およびその発生の段階に応じて異なる特性を有する場合があることは理解されるであろう。本発明の方法は、単独の治療剤としてNISVからなる治療剤の製造に、および関係する疾患または状態の処置において有用な一つ以上の他の剤、例えば抗炎症剤、例えばコルチコステロイド、抗ヒスタミン剤および抗サイトカイン抗体、治療用サイトカイン、例えばIL-2、IL-12およびIFN-γ、また、敗血症性ショックの場合には抗バクテリア剤とともに組合せることに適用可能である。このような追加の剤は、界面活性剤ベシクル、好ましくはNISVと同時にまたは連続的に投与することができ、同時投与の場合には、これらの剤はベシクルと混合して提供することができ、および／またはその中に取り込まれていてもよい。したがって、更なる観点から見ると、本発明は、NISVおよび少なくとも一つの他の製薬上活性な剤を、治療において同時に、別個に、または連続的に使用するための組合せ調製物として含有する生成物を提供する。製薬上に活性な剤は、治療に応じて選択され、その例はここに挙げられている。 NISVは、ある剤（一つ以上）と組み合わせて投与して、その剤の治療効果を除くことなく、その剤の望まれない副作用を中和することもできる。例えば、癌の処置において、組合せ治療でのNISVの投与を用いて、化学治療剤の望まれない副作用、例えばカヘキシーを減少させることができる。さらに、このような組合せ治療において、NISVの有益な治療効果を提供することに加え、NISV中に剤（一つ以上）を取り込ませることを用いて、例えば持続放出ビヒクルをその剤に提供することにより、またはその剤が分解または系から迅速に除去されるのを防止することにより、その剤の薬物動態学的プロファイルを向上させることができる。他の剤を予備形成されたNISV中に取り込ませることができる方法としては、フラッシュ凍結に続いて凍結乾燥することにより、水相に存在する剤を予備形成ベシクル中に取り込ませる脱水-再水和法（Kirby & Gregoriadis，Biotechnology ，2，979-984（1984）、および凍結−融解技術（Pick，Arch．Biochem．Biophys ．212，195-203(1981)）が挙げられる。後者の技術においては、ベシクルを関連する剤と混合し、液体窒素中で繰り返しフラッシュ凍結し、例えばおよそ60℃の温度（すなわち対応する界面活性剤の転移温度よりも上）まで加温する。NISVが均質化により製造される場合、剤を均質化過程中に取り込ませることができる。このような方法において、均質化前に剤を水相に溶解する。本発明を、以下の非限定的な実施例を用いて、以下の図面を参照しながら説明する：図１: マウスにおけるT.Gondii-誘発カヘキシーに関連する体重損失を減少させるNISVの能力。図１a: PBS、NISV、可溶性タキゾイト抗原(STAg)、NISV中に取り込まれたSTAg （NISV/STAg）またはNISVと混合したSTAg(NISV＋STAg)で免疫した後に、T.Gondi i に感染させたマウスの脳内のT.Gondii嚢胞の数を示す棒グラフ。図１b: PBS、NISV、STAgまたはNISV/STAgで能動免疫された実験マウスにおけるT.Gondii感染後の体重損失のレベルを示すグラフ。図２: マウスにおけるFK-565誘発カヘキシーに関連する体重損失を減少させる NISVの能力。図２a: PBS、NISV、PBS中のアシルトリペプチドFK-565またはNISV中に取り込まれたFK-565を腹腔内注射した後のマウスにおける体重損失を示すグラフ。図２bおよび２c: 図２aのように処置されたマウスから単離されたConA刺激された脾臓細胞中で生成したIL-2（図２b）およびIL-12（図２c）のレベルを示す棒グラフ。図３: 刺激されたネズミ細胞により生成されたサイトカインレベルのNISVによる減少。図３a: ネズミのマクロファージ細胞ラインJ774の、LPS+IFN-γ、IFN-γ、LPS 、NISV+IFN-γ+LPS、NISV+IFN-γ、NISV+LPSまたはNISVを用いた刺激によるTNF- α生成を示す棒グラフ。図３b: ネズミの腹膜マクロファージの、PBS、LPS、LPS+NISV、LPS+IFN-γまたは LPS+NISV+IFN-γを用いた刺激によるTNF-α生成を示す棒グラフ。図３c: ネズミの腹膜マクロファージの、LPS+NISVまたはLPS+PBSを用いた刺激によるIL-6生成を、無刺激の細胞により生成されるIL-6と比較して示す棒グラフ。図４: 刺激されたヒト細胞により生成されるサイトカインレベルのNISVによる減少。図４aおよび４b: PBS、LPSまたはLPS+NISVを用いて処置したヒト末梢血液白血球におけるIL-6（図４a）およびTNF-α（図４b）のレベルを示すグラフ。図５: 刺激されたヒト細胞により生成されるサイトカインレベルのNISVによる減少。図５aおよび５b: PBS、LPSまたはLPS+NISVを用いて処置したヒト末梢血液白血球におけるIL-6（図５a）およびTNF-α（図５b）のレベルを示すグラフ。図５cおよび５d: PBS、LPS、NISVまたはLPS＋NISVを用いて処置したヒト末梢血液白血球における IL-1α（図５c）およびIL-1β（図５d）のレベルを示すグラフ。図６: NISVの免疫調節効果に対するNISVサイズの影響。図６aおよび６b: 孔サイズ800nm、400nm、200nmおよび100nmの膜を通して押し出すことにより製造されたNISV中に取り込まれた卵タンパク、またはPBS中の卵タンパクを用いて処理したマウスから回収した、con-A刺激リンパ節細胞により生成されたIL-2およびIL-5（図６a）およびIL-5およびIFNγ(図６b)。図７aおよび７b: PBS、LPS、200nmの孔サイズ膜を通した押し出しにより製造されたNISVまたは押し出しによらず製造されたNISVで処置した、ヒトの白血球前マクロファージ細胞ラインU937からの細胞中の、および健康な有志からのPBLS中のIL-1α（図７a）およびIL-1β（図７b）レベルを示す棒グラフ。図８、９および１０: ウスにおけるLPS誘発サイトカイン生成のNISVによる抑制。図８は、NISVの皮下注射後、１、４または１４日目に投与したLPSに応答した、マウスにおける血清IL-6生成を示す棒グラフである。図８は、LPS抗原投与の３時間後（図８a）またはLPS抗原投与の６時間後（図８b）の、17mg／kgのNISV 投与量からの結果を示す。図９は、LPS抗原投与の３時間後（図９a）またはLPS抗原投与の６時間後（図９b）の、80mg／kgのNISV投与量からの結果を示す。（＊:ｐ≦0.05ｖコントロール;**:ｐ≦0.025ｖコントロール;***:p≦0.0005ｖコントロール）図１０は、NISV投与後15、18または28目に第二のLPS 抗原投与後の80mg/kgのN ISV投与量からの結果を示す。（＊:ｐ≦0.05ｖコントロール）図１１および１２: LPS-刺激ヒトPBLおけるTNF-αおよびIL-6のレベルのNISV による減少。図１１aおよび１１bは、NISVの投与前（点線）および後（実線）のヒトの有志から抽出した、LPS-刺激PBL（１１b）または非刺激PBL（１１a）中のTNF-αレベルを示すグラフである。図１２aおよび１１bは、NISVの投与前（点線）および後（実線）のヒトの有志から抽出した、LPS-刺激PBL（１２b）または非刺激PBL（１２a）中のIL-6レベルを示すグラフである。実施例実施例１カヘキシーの調節カヘキシーは、幾つかの基本的な状態（例えば、ビールスおよび寄生虫などの微生物による慢性感染、腫瘍、充血性心不全症など）によって引き起こされるが、前炎症性サイトカイン、特にTNF-αおよびIL-6によって媒介される顕著な体重損失を特徴とする深刻な病状である。この体重損失の誘発は、十分に給飼できたとしても、動物の栄養状態とは無関係であり、身体体積の損失によって特徴付けられる。NISVを、カヘキシー性体重損失の防止に関して、二つのモデル、即ち一方はカヘキシーが寄生虫感染によって誘発された場合、他方はカヘキシーがペプチド薬によって誘発された場合において調査した。Ａ．NISV で処置されたマウスでのトキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii )-誘発カヘキシーに伴う体重損失レベルにおける減少量材料および方法小胞の調製：小胞は、BrewerおよびAlexander（Immunology，75，570-575(199 2)）によって先に説明された方法によって調製した。1-モノパルミトイルグリセロール(MPG)、コレステロール（CHOL）および燐酸ジセチル（DCP）（全てSigma 社製、Poole、Dorset、U.K.）を、15mlパイレックス試験官中、モル比5:4:1(MPG :CHOL:DCP)で合計150mlになるように混合し、融解するまでドライブロック（Gra nt）中で130℃に加熱した。５mlの水性バッファ（PBS、ｐH7.4）を加え、得られた懸濁液を１分間激しく渦巻き攪拌し、かつ懸濁液を60℃で２時間振盪した時に空の小胞が形成された。これで小胞は、貯蔵またはインビトロアッセイのための準備が整っていた。前の研究では、この方法で調製された小胞が、ほぼ直径２μ mの小胞を産出したことを示した。抗原捕獲：予備形成された小胞への抗原捕獲は、KirbyおよびGregoriadis（Bi otechnology，2，979-984(1984)）によって説明された脱水-再水和技術によって達成された。簡単に説明すると、５ml（150μmol）の小胞溶液を、ポリプロピレン遠心チューブ (Elkay Products Inc．製、Shrewsbury，MA，U.S.A)中で、PBS中の抗原（5mg／m l）２mlと混合し、液体窒素中で回転させることによって薄い殻として瞬時に凍らせた。次いで、調製物を、0.5mlの蒸留水で再水和する前に、凍結乾燥機中、一夜0.1torrで凍結乾燥した。動物および接種： BALB／Kマウスを屋内で育成し、8〜10週令で接種した。５匹のグループのマウスを、100μl FCAでエマルジョン化したPBS中の50μｇの可溶性タキゾイト（tachyzoite）抗原(STAg)(Roberts & Alexanderによって調製されたもの、Parasitology，104，19-23(1992))、NISV内に捕獲された50μgのSTAg、または空のNISVと混合した50μgのSTAgの何れかで皮下免疫した。コントロールグループを、同体積のPBSまたは空のNISVの何れかで、腹腔内に免疫した。接種を、２週間後に繰り返した。第二回免疫感作の２週間後、マウスを20個の育成可能なT.ゴンディのシストに感染させた。４週間後、シスト感染数（burdens）を脳懸濁液から手動で計数した。感染後32日間、マウスの平均体重を測定した。結果 STAg単独、NISV中に捕獲されたSTAg（即ち、NISV／STAg）またはNISVと混合したSTAg（即ち、NISV & STAg）での能動免疫化によって、マウス脳内でシスト化した寄生虫の数が有意に減少するという結果が得られた（図１ａ）。PBSまたはNISV単独で処置されたコントロールグループでの脳毎のシスト数では、減少がなくかつ有意な差がなかった。NISVは、単独では各マウスに感染可能なシスト数にほとんど効果がなく、即ち、NISVは、寄生虫に対する直接的な防護をもたらさず、かつ寄生虫自身に直接的な影響を与えなかった。図１ｂは、T．ゴンディのシストで感染させた後の体重損失のレベルを示している。体重損失（カヘキシー）は、PBSを接種されたコントロールグループで深刻であった。このグループのマウスは、感染後20日以内に、体重のほぼ12%を失った。これに対して、他のコントロールグループでのNISV投与は、感染マウスの寄生虫感染程度を変化させることはなく、感染マウスにおける如何なる有意な代謝的体重損失も防止した。NISV単独で処置されたマウスの体重は、STAg、NISV／ STAgまたはNISV-STAgで接種後の能動、防護免疫性を示すものと同様であった。 NISV単独の投与は、トキソプラズマ・ゴンディ寄生虫による感染を防止しないか、あるいは脳内のシスト数で示されるように、寄生虫の生存可能性に影響を与えなかった。しかしながら、NISV投与は、この病状に伴うかなりの体重損失（カヘキシー）を防止した。これに対して、PBSコントロールグループにおけるマウスは、高レベルの寄生虫感染とともに、20日間にわたる体重の激しい損失を示した。Ｂ．NISV で処置されたマウスでのFK-565-誘発カヘキシーに伴う体重損失レベルにおける減少量 FK-565は、強力な抗腫瘍および抗バクテリア効果を有することが知られている、実験用の酸性アシルトリペプチドである。これは、腫瘍生長を阻害することによって、抗腫瘍宿主防御活性を増大させる。繰り返しFK-565を腹腔内注射をすることで、腫瘍に対するネズミ腹膜マクロファージおよびナチュラルキラー（NK）細胞の細胞毒性を有意に活性化し、それらの殺傷能力も増加させる。FK-565は更に、TNF-α（強力な抗腫瘍サイトカイン）の放出を増加させることによって、抗腫瘍活性を示す。しかしながら、FK-565によって増加させられたTNF-αおよび他の前炎症性サイトカインの産生は、優位な程度の薬剤-誘導カヘキシーを伴う。材料および方法 NISVを、BrewerおよびAlexander（上記）に説明されるように製造した。薬剤捕獲：FK-565を、凍結-解凍法（Pick，Arch．Biochemistry，Biophysics 21 2 ，195-203(1981)）を用いて予備形成されたNISV内に捕獲した。抗原小胞混合物を液体窒素中で凍結し、次いで解凍させて60℃とした。これを５回繰り返した。懸濁液を60℃でさらに２時間振盪した。FK-565の捕獲レベルは、標準ニンヒドリンアッセイを用いて調査した。動物および接種：雌BALB／cマウスを屋内で育成し、8〜10週令で接種した。５匹のグループのマウスを、100μl のPBS、空のNISV(100μl; ５mg)、PBS中のFK- 565(200μl; 全部で20μg)、またはNISV内に捕獲されたFK-565（200μl; 10mgの小胞中全部で６μg）の何れかで腹腔内に免疫した。マウスの体重をz注射前、および上記剤の注射から１、２および３日後に記録した。サイトカインアッセイ：注射から３日後、マウスから脾臓を採取し、２mM L-グルタミン、100単位／mlペニシリン、100μg／mlストレプトマイシン、0.05mM β -メルカプトエタノールおよび10%（v/v）ウシ胎児血清（FCS）（全てGibco社製，Paisley，U.K.）を追加したRPMI 1640培地中にプールした。脾臓をピンセッで緩やかに細かく裂いてばらばらにし、懸濁液を10分間200×ｇで遠心し、次いで0 .5mlの培地で再懸濁して、脾臓細胞懸濁液を製造した。生存可能な細胞をトリパンブルー排除試験によって計数し、細胞懸濁液を５×10⁶細胞／mlに調節した。細胞懸濁液の100μl／ウェルのアリコート（5×10⁵細胞を含む）を、96-ウェル平底組織培養プレート（Costar社製，Cambridge，M.A.，USA）に加え、次いでCo n A（5 μg/ml）の100μl／ウェルのアリコートを加えて、これを３組作成した。次いで、培養物を5%CO₂雰囲気中、37℃で60 時間インキュベートした後、細胞培養上澄み液の150μlのアリコートを分離し、サイトカインアッセイのために-70℃で貯蔵した。サイトカイン（IL-2およびIL-12）を単一特異性ELISAで検出した。平底ポリスチレンプレート（Dynatech社製，Alexandria，VA，USA）を、最適濃度（何れの場合にも２μｇ／mlに決定した）の、50μl／ウェルの抗-マウスサイトカインモノクローナル抗体により、４℃で一夜被覆した。（IL-2試薬はPharmingen、San Diego，CA，USAから、IL-12試薬はWister Institute，USAから得た）。プレートを、PBS／Tween（PBST）(pH7.4，0.05% Tween20)で３回洗浄し、200μl／ウェルの、PBS中の10%（v/v）FCSで、37℃にて60分間ブロックした。プレートをPBST中で３回洗浄し、上澄みおよび標準品（IL-2，0-62.5 単位／ml；IL-12，0-500pg /ml）の100μlサンプルを、２組でウェルに追加し、37℃にて２時間インキュベートした。PBSTで４回洗浄した後、100μl／ウェルのビオチニル化抗-マウスサイトカインモノクローナル抗体（全て１μg／ml）を加え、プレートを37℃にて4 5分間インキュベートした。PBSTで６回洗浄した後、100μl／ウェルのアルカリホスホターゼ-ストレプトアビジン複合物（Pharmingen社製）（PBS中の10%(v/v) FCS中で1／2000に希釈）を加え、プレートを37℃にて30分間インキュベートした。プレートを、PBSTで８回洗浄し、100μl／ウェルのパラ-ニトロフェニルホスフェート（pNPP）基質（Sigma社製）（グリセリンバッファー（0.1M;pH10.4）中で調製）を加えた。プレートを暗所で、37℃にて30分間インキュベートし、得られた吸光度は、Titertek Multiskan plate reader（Flow Laboratori es社製，Irvine，Ayrshire，U.K.）で、405nmにて測定した。細胞培養物のサイトカイン濃度は、標準曲線（回帰係数ｒ=0.990またはより良好）から決定した。グループ間の比較はスチューデントのTテストを用いて行なった。結果図２ａ FK-565腹腔内投与後の体重損失のレベルを示している。PBSまたはNIS を接種したコントロールグループは、始めから終わりまで、標準的な、変化のない体重を示した。PBS中のFK-565で処置したマウスは、薬剤の投与後３日間で、1 6%の体重を失った。NISV内に捕獲されたFK-565を接種したマウスは、体重損失が有意に減少し、平均体重が注射後１日で安定し、３日後では上昇した。このマウスは、薬剤の投与後３日間で、約５%の体重を失った。様々な処置の後にマウスから単離され、Con A刺激された脾臓細胞におけるIL- 2およびIL-12産生を比較した（各々図２ｂおよび図２ｃ）。NISV内捕獲FK-565の投与は、IL-2およびIL-12の有意な産生によって証明されるように、顕著なTh1- 型免疫反応を引き出した。これらサイトカインは、Th2反応および炎症を伴うサイトカインを産生する傾向にあるPBS中のFK-565投与後のコントロールより、有意に高いレベルでは産生されなかった。 NISV中に捕獲されたFK-565の投与は、FK-565に起因するカヘキシー性体重損失を完全には防止しなかったが、かなりな程度減少させた（３日にわたって16%から5％）。NISVは、以下に示されるデータから明らかなように、カヘキシーを、T NF-α、IL-6およびIL-1（αおよびβ）を含む主要前炎症性サイトカインの産生における直接的なタウンレギュレーションによって防止した。実施例２ NISV で処置されたインビトロネズミマクロファージモデルにおけるLPS-誘導TNF- αおよびIL-6レベルの減少量実施例１の結果は、NISVが前炎症性サイトカインによって引き起こされる全身代謝性体重損失を減少させる有意な治療上の能力を有することを示す。TNF-αは、カヘキシー性体重損失に伴う第一前炎症性サイトカインである。実験は、この減少がNISVおよびNISVのTNF-αレベルを減少させる能力によって媒介されることを確かめるために、計画された。材料および方法 NISVを、実施例１で説明された方法で調製した。Ａ．ネズミマクロファージセルラインJ774を用いたインビトロでの研究 BALB/c/NIHマウスから収穫されたネズミマクロファージセルライン（J774）は、Professor H．Harris／Dr．R．Sutherland(Sir William Dunn School of Path ology，Oxford，U.K.)から贈与された。細胞は、10%（v/v）FCS、２mM L-グルタミン、100単位／mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン（全てGibco 社製）を追加したRPMI 1640培地内で、5%CO₂雰囲気中37℃にて維持した。細胞を 1000×ｇで遠心することによって徹底的に洗浄し、３M D-グルコースおよび10%F CSを追加したダルベッコ改質イーグル培地中、様々な薬剤で活性化した。濃度ほぼ１×10⁶細胞／mlの、100μl／ウェルのアリコートを、96-ウェル平底細胞培養プレート（Costar社製）内に安定化させた。幾つかのグループ（5〜6の複製／グループ）の細胞を10μlの以下の調製物で処置し、5%CO₂雰囲気中37℃にて培養した。グループ１： LPS（40ng/ml）＋IFNγ（10単位／ml）グループ２： IFNγ（10単位／ml）グループ３： LPS（40ng/ml）グループ４： NISV（0.2mg）＋IFNγ（10単位／ml）＋LPS（40ng/ml）グループ５： NISV（0.2mg）＋IFNγ（10単位／ml）グループ６： NISV（0.2mg）＋LPS（40ng/ml）グループ７： NISV（0.2mg）サイトカインアッセイ：刺激の48時間後、テスト培養ウェルから上澄み液を分離し、単一特異性ELISA（Parmingen社製）を用いて TNF-α産生を試験した。平底ポリスチレンプレート（Dynatech社製）を、50μl／ウェルのラット抗-マウス TNF-αモノクローナル抗体により、5%CO₂雰囲気中37℃にて一夜被覆した。プレートをPBST中で３回洗浄し、200μl／ウェルの、PBS中の10%（v/v）FCSで、37℃ にて60分間ブロックした。プレートをPBST中で３回洗浄し、これに100μLの上澄みサンプルおよび標準品（20ng／ml TNF-α）（PBS中の10%（v/v）FCSで希釈）を加え、37℃にて２時間インキュベートした。PBSTで4回洗浄した後、100μl／ウェルのビオチニル化ラット抗-マウス TNF-αモノクローナル抗体（PBSの10%（ v/v）FCS中0.5mg/ml）を加え、37℃にて45分間インキュベートした。アルカリホスホターゼ-ストレプトアビジン複合体およびpNPP基質を用いた TNF-αレベルの検出は、実施例１のサイトカインアッセイで説明したのと全く同様に行なった。Ｂ．ネズミ腹膜マクロファージを用いたインビトロでの研究上記研究は、安定化したネズミ細胞培養物（J774）で行なった。マウスから新鮮な状態で分離された細胞において、同様の免疫調節効果が見られること（このことは、恐らく間違いなく真のインビボ系のより正確なモデルを提供するに違いない）を調査するために、浸出したネズミ腹膜マクロファージを用いた平行実験を行なった。腹膜マクロファージは、標準体積のRPMI培地の導入および次の微細-ゲージ針を介した分離によって、BALB/cマウスから分離した。細胞は、3M D-グルコースおよび10%FCSを追加されたRPMI培地中で、（A）で説明したように洗浄した。細胞の100μl／ウェルのアリコート（約2.5×10⁶細胞／mlの濃度）を、96-ウェル平底細胞培養プレート（Coster社製）内で、5%CO₂雰囲気中37℃にて４時間インキュベートした。非接着細胞は、FCSを追加された、２倍体積のRPME培地を用いてウェル吸引することで分離した。８グループ（３組／グループ）の細胞を以下の調製物で処置し、5%CO₂雰囲気中37℃にてインキュベートした。グループ１：コントロール（PBS，pH7.4）グループ２： LPS（200ng/ウェル）グループ３： LPS（200ng/ウェル）＋NISV（0.2mg）グループ４： LPS（200ng/ウェル）＋IFNγ（10単位／ウェル）グループ５： LPS（200ng/ウェル）＋NISV（0.2mg）＋ IFNγ（10単位／ウェル）グループ６： LPS（200ng/ウェル）＋NISV（0.2mg）グループ７： LPS（200ng/ウェル）＋コントロール（PBS，pH7.4）グループ８：刺激しない（バックグラウンド）サイトカインアッセイ：刺激の24時間後、100μl の上澄み液を、各々のテスト培養ウェルから分離し、以下を目的とするテストをした。ｉ）上記（A）に記載されたものと全く同一の単一特異性ELISA（Pharmingen社製）を用いたTNF-α産生（グループ１〜５）。 ii）上記（A）に記載されたものと全く同一の単一特異性ELISA（Pharmingen社製）を用いたIL-6産生（グループ６〜８）。結果図３ａは、J-774細胞刺激後のTNF-α放出のレベルを示す。J-774ネズミマクロファージのNISVでの処置は、極めて重要な前炎症性サイトカイン、TNF-αのLPS- 誘導産生をダウンレギュレートした。ネズミマクロファージのLPS処置では、他の薬剤でのJ774細胞の処置の後に導き出された結果より有意に高いTNF-αレベルが結果として得られた。J774細胞へのNISVおよびLPSの併用投与は、LPS単独の投与と比較して、TNF-αの産生を有意に減少（P<0.025）させた。J774マクロファージでのTNF-α放出における同様の減少が、NISVおよびIFN-γの併用投与後に観察された。図３ｂは、ネズミ腹膜マクロファージのLPS刺激後でのTNF-α放出レベルを示す（グループ１〜５）。ネズミマクロファージへのLPS単独の投与は、細胞からのTNF-αの放出をかなり誘導した。LPSおよびIFN-γの併用投与は、TNF-α産生においてLPS単独より大きな増加（有意ではない）を示した。NISVおよびLPSの併用投与は、TNF-α放出レベルを実質的に（約50%の割合で）減少させた。同様に、腹膜マクロファージからのTNF-α放出の減少は、NISVおよびIFN-γの併用投与後になお一層大きかった（約75%）。図３ｃは、ネズミ腹膜マクロファージのLPS刺激後でのIL-6放出レベルを示す（グループ６〜８）。LPSとのNISV併用投与によって、ネズミ腹膜マクロファージにより産生されたIL-6レベルは、PBS中のLPS投与と比較して有意に減少した。刺激しなかった腹膜マクロファージは、IL-6を産生しなかった。この研究は、NISVが、炎症の場合を模倣した、LPS刺激後の培養ネズミマクロファージにおけるTNF-αレベルを、有意に減少させ得ることを示す。腹膜マクロファージから得たこの結果は、この効果が安定化されたネズミ細胞培養物に特異的なものではないことを示すとともに、マウスから新鮮な状態で分離されかつ 2 4時間維持された細胞における炎症型刺激の後に、二つの極めて重要な前炎症性サイトカイン、TNF-αおよびIL-6のレベルを減少させるNISVの免疫調節機能を示す。このデータは、炎症性体重損失（カヘキシー）の防止という結果となる細胞の事項と、実施例１で観察された全身効果との間に重要な関連を与える。これは、 NISVの炎症調節効果は、TNF-αおよびIL-6の両方を有意に減少させるよう作用することを示す。細胞レベルでの前炎症性サイトカインのこの減少は、身体レベルでの炎症媒介症状において利益をもたらす結果となる。インビボでは、TNF-αおよびIL-6両方への効果が協力して起こり、何れかが単独で作用するより大きな程度まで、炎症性反応をダウンレギュレートするよう作用するであろう。実施例３ NISV で処置されたインビトロヒト末梢血白血球モデルでの、LPS誘導TFN-αおよびIL-6のレベルにおける減少この研究は、前炎症性サイトカイン産生をダウンレギュレートするNISVの能力が、ネズミの系だけに限られるものではなく、細胞が同等かつ容易にNISVの抗炎症性効果に反応したことを示すために行なわれた。材料および方法 NISVは、実施例１で説明された方法で調製した。末梢血単核白血球（PBLs）が、健康な大人のボランティアから得たヘパリン化／クエン酸添加静脈血から調製された。ほぼ10mlの全ヒト静脈血をヘパリン化シリンジに抜き出し、10mlフィコール／パーク（Ficoll/Paque）上に注意深く層化し、この流動体間の界面での乱れが最小限となるように、滅菌遠心チューブ内で室温-平衡化させた。血液／フィコール勾配を20℃で30分間、1000× gにて遠心した。P BLsは、ペレット化した赤血球および多形核白血球の上、かつ麦藁色のプールの血漿および血小板の下に層化した細胞のタイトなバンドとして表れた。血漿および血小板を注意深く取り除いて廃棄し、白血球上の薄い血漿のフィルムを残した。これらを、PBS中の10%（v/v）FCSを追加されたRPMI 1960培地10mlを含む20ml ナンク（Nunc）チューブに吸引し、４℃で貯蔵した。この細胞プラス培地を、使用前に25℃にて20分間再遠心し、前記のようにFCSを追加された10mlのRPMI 1640 中に再懸濁した。細胞を、FCSが追加された10mlのRPMI 1640で再度洗浄し、FCS および適切な抗菌剤（1%w/v テトラサイクリン；1%w/v ストレプトマイシン）が追加された 10mlのDMEN中に再懸濁した。これで、細胞のインビトロアッセイのための準備が整っていた。ヒトPBLsの２ml／ウェルのアリコート（約２×10⁶細胞／mlの濃度）を、24-ウェル平底組織培養プレート（Coster社製）内で安定化させた。３グループ（３組／グループ）の細胞を以下の調製物で処置し、5%CO₂雰囲気中37℃にてインキュベートした。グループ１：コントロール（PBS，pH7.4）グループ２： LPS（40ng/ウェル）グループ３： LPS（40ng/ウェル）＋NISV（1mg）細胞を、刺激後4、24、48および72時間で分離された細胞培養上澄み液のアリコートとともに72時間維持し、次のサイトカインアッセイのために-70℃で貯蔵した。細胞培養物からの上澄みを、製造者の指示に従って、IL-6のため(Genzyme社製 )およびTNF-αのため（Parmingen社製）の単一特異性ヒトELISAでアッセイした。ELISAプレートを、適切な比色溶液で現像し、Titertek Multiskan plate read er（Flow Labolatories社製）で405nmにて測定した。細胞培養上澄み液のサイトカイン濃度は、標準曲線（回帰係数ｒ＝0.990またはより良好）から決定した。予備的な統計的分析を行なった。このテキストで言及されたいずれの有意性も、標準偏差測定値（不図示）に関連する。結果この研究は、LPSによるインビロト刺激に対するヒトPBLsの反応（炎症反応を模倣する）を説明する。図４ａ及び４ｂは、各々、細胞へのLPSの導入が、サイトカインIL-6およびTNF-αの産生という結果をもたらすことを示す。図４ａは、IL-6の放出を示す。LPSでの刺激の後、IL-6のレベルは急激に増加し、投与後24時間にて2.5ng／PBS、LPS、200nmの細孔サイズ膜を介した押し出しにより製造されたNISVまたは押し出しによらず製造されたNISVで処置したmlでピークとなった。PBSでのPBLsの刺激では、IL-6放出は無視できるレベルであるという結果となった。NISVのLPSとの共投与は、IL-6放出を完全に防止した。NISV 処理後でのIL-6の測定可能なレベルは、PBSのコントロール投与後に達成されたものと有意な差がなかった。図４ｂは、TNF-αの放出を示す。LPSでの刺激の後、TNF-αはヒトPBLから非常に急激に放出され、刺激後たった４時間で高レベルで存在するようになった。NI SVのLPSとの共投与は、LPSを単独で投与されたグループと比較して、刺激後４時間でのTNF-α放出を、5.5ng／mlから３ng／mlまで減少させた。これら結果は、LPSで刺激後、インビトロにてヒトPBLsにより放出された重要な前炎症性サイトカインIL-6およびTNF-αのレベルを減少させるというNISVのかなりの能力を説明する。IL-6およびTNF-αの両方は、SIRSなどの急性症状だけでなく、慢性疾患、例えばリュマチ性関節炎などの処置等における調節のための可能性のある治療上のターゲットである。この研究では、NISVが、刺激されたPBL からのIL-6放出を殆んど完全に防止し、LPSとの共投与後４時間という迅速さで、TNF-αのレベルを大幅に減少させることが観察された。実施例４ヒトPBLsでのLPS-誘導TNF-α、IL-6およびIL-のレベルのNISVによる減少材料および方法 NISVを、実施例１で説明する方法で調製した。 PBLsを、健康な大人のボランティアからのヘパリン化／クエン酸添加静脈血から、またScottish Blood Transfusion Serviceから得た。PBLsは、実施例３で説明されるようなフィコール／パーク勾配培地を用いて密度依存遠心法によって調製した。ヒトPBLsの２ml／ウェルのアリコート（約２×10⁶細胞／mlの濃度）を、24-ウェル平底組織培養プレート（Coster社製）内で安定化させた。４グループ（３組み／グループ）の細胞を以下の調製物で処置し、5%CO₂雰囲気中37℃にてインキュベートした。グループ１：コントロール（PBS，pH7.4）グループ２： LPS（40ng/ml）グループ３： NISV（1mg）グループ４： LPS（40ng/ml）＋NISV（1mg）細胞を、刺激後1.5、4、24および48時間で分離された細胞培養上澄み液のアリコートとともに48時間維持し、次のサイトカインアッセイのために-70℃で貯蔵した。細胞培養物からの上澄みを、製造者の指示に従って、IL-1（αおよびβ）のため（Dynatech社製）（全ての処置グループ）、IL-6 のため（Genzyme社製）およびTNF-αのため（Parmingen社製）（処置グループ１、２＆４）の単一特異性ヒトELISAでアッセイした。ELISAプレートを、適切な比色溶液で現像し、Titertek Multiskan plate reader（Flow Labolatories 社製）で490nmにて測定した。細胞培養上澄み液のサイトカイン濃度は、標準曲線（回帰係数ｒ＝0.990またはより良好）から決定した。予備的な統計的分析を行なった。このテキストで言及されたいずれの有意性も、標準偏差測定値（不図示）に関連する。結果この研究は、インビトロにおいて、刺激されたヒトPBLからの前炎症性サイトカインのレベルを減少させるというNISVの能力を示す。図５ａ及び５ｂは、各々、細胞へのLPSの導入が、サイトカインIL-6およびTNF-αの産生という結果をもたらすことを示す。特筆すべきことは、この特定の研究におけるコントロールPB Lsは、進行中の炎症反応を有する個体からたまたま誘導されたものであることである。そのようなわけで、コントロールPBLsは、検出可能なレベルの前炎症性サイトカインIL-6およびTNF-αを一様に産生していた。図５ａは、IL-6の放出を示す。LPS刺激PBLsは、培養の24時間後にてピークレベルのIL-6を産生した。これらレベルは、図４ａで観察されたものと同様であった。コントロールPBLsも、測定可能なレベルのIL-6を産生した。NISVのLPSとの共投与は、IL-6のレベルをコントロールレベル未満に減少させた。図５ｂは、TNF-αの放出を示す。LPSでの刺激の後、TNF-αのレベルは、急速に増加し、刺激後たった４時間でピークとなった。NISVのLPSとの共投与は、LPS をほぼ50%の割合で減少させた。コントロールPBLsも、この系において、測定可能なレベルのTNF-αを産生した。図５ｃは、IL-1αの放出を示す。NISVは、刺激性シグナル（LPS）なしでは、有意なレベルのIL-1αを誘導することができなかった。LPSの投与は、IL-1αのかなりの産生を起こすという結果となった。NISVのLPSとの共投与は、48時間にわたって、IL-1αの放出を減少させた。図５ｄは、IL-1βの放出を示す。NISVは、刺激性シグナル（LPS）なしでは、有意なレベルのIL-1βを誘導することができなかった。LPSの投与は、IL-1βのかなりの産生を起こすという結果となった。NISVのLPSとの共投与は、48時間にわたって、IL-1βの放出を減少させた。この研究は、繰り返し調査を示し、この調査において、重要な前炎症性サイトカインを減少させるというNISVのかなりの能力を示す実施例３の結果が確認された。興味深いことに、この研究で用いられた濃度での小胞調製物は、これら前炎症性サイトカインの放出の動力学（放出の完全な防止の点は除く）には実質的に影響を持たなかったことである。この実験からのコントロールPBLsは、進行中の炎症性反応に悩まされている個体で遭遇するであろう細胞集団と同様の細胞集団を代表している。そのようなわけで、主な前炎症性サイトカインの一つ、IL-6の「ベースライン」を減少させるというNISVの能力は、有利かつ有意であると見なし得るだけである。この結果は、NISVが、ヒトPBLsのLPS刺激後に引き出されたIL-1の全体的レベルを減少させる能力を有することを示している。NISVは、この系において産生されるIL-1αのレベルを有意に減少させ、加えて引き出されたIL-1βの量を有意に減少させ、これらは炎症反応において重要である。実施例５ NISV の炎症調節効果におけるサイズの効果この研究は、小胞のサイズがNISVで達成される治療的炎症調節のレベルに影響を与えるかどうかを調査するように計画された。Ａ．NISVのサイズのIL-5レベルへの効果小胞のサイズがNISVの治療的能力に影響を与えるかどうかが、抗原として捕獲されたオボアルブミン（OVA）を用いた免疫原性研究から決定された。IL-5（喘息の開始において関連するサイトカイン）が測定された。材料および方法 NISVを、実施例１で説明される方法で調製した。抗原捕獲： OVA（グレードV、Sigma社製）を、凍結-解凍法（Pick， 1981）を用いて形成されたNISV内に捕獲した。抗原／小胞混合物を液体窒素中で凍結し、次いで解凍させて60℃とした。これを５回繰り返した。懸濁液を60℃でさらに２時間振盪し、サーモバレル押出機（Lipex Biomembranes Inc．製，Vancouver，C anada）中で、60℃にて、ポリカーボネートフィルター（Costar社製）の孔サイズを減少させて、順次押出すことにより、異なるサイズの小胞調製物を製造した。遊離抗原を、４℃にて40分間1000000×ｇで洗浄して除去した。タンパク質濃度は、窒素アッセイ（Brewer et al.，vaccine 13(5)，1441-1444(1995)）によって測定した。電子顕微鏡：小胞を、以下のように、電子顕微鏡で試験した。小胞懸濁液の小サンプル（約10μl）を清浄な銅板（Balzers High Vaccum，Milton，Keynes，U.K. ）間に挟み、190℃の液体プロパン中に浸して急速凍結した。次いで、サンプルを、ほぼ４×10^-6torrで操作される拡散ポンプ真空システム中の-100℃でのコールドステージに移した。支持板を割ってばらばらにし、露出した表面をすぐに蒸発白金／炭素で45℃にて増影し、次いで露出した割れ面に、炭素の二次強化コートを90℃で被覆した。小胞調製物を、純粋アセトンから減少する幾つかのアセトン濃度のアセトン／蒸留水溶液中で洗浄することで型から除去した。最後に、蒸留水中での数回の洗浄後、型を銅グリッド上に収集し、嵌装し、透過型電子顕微鏡で試験した。動物および接種：雌BALB／ｃマウスを屋内で育成し、8〜10週令で接種した。５匹のグループのマウスの足に、10μlの以下の調製物を接種した。グループ１： 800nm孔サイズ膜から押出したNISVに捕獲された10μgのOVA グループ２： 400nm孔サイズ膜から押出したNISVに捕獲された10μgのOVA グループ３： 200nm孔サイズ膜から押出したNISVに捕獲された10μgのOVA グループ４： 100nm孔サイズ膜から押出した NISVに捕獲された10μgのOVA グループ５： PBS中の10μｇのOVA（コントロール）処置後10〜14日のマウスから、ドレン鼠径および膝窩リンパ節を収集した。鼠径および膝窩リンパ節を無菌的に分離し、細胞懸濁液を、実施例１に説明されるように、調製して計数した。５×10⁵個の細胞を含む、100μl／ウェルの細胞懸濁液のアリコートを、96-ウェル平底細胞培養プレート（Costar 社製）内に加え、次いでCon A（5μg/ml）またはOVA（2000μg/ml）の100μl／ウェルのアリコートを加えて、これを３組作成した。次いで、培養物を5%CO₂雰囲気中、37℃で60時間インキュベートした後、細胞培養上澄み液の150μlのアリコートを分離し、サイトカインアッセイのために-70℃で貯蔵した。サイトカイン（IL-2，IL-5およびINF-γ）を単一特異性ELISAで検出した。平底ポリスチレンプレート（Dynatech社製）を、最適濃度（何れの場合にも２μg/ ｌに決定した）の、50μl／ウェルの抗-マウスサイトカインモノクローナル抗体（Pharmingen社製）により、４℃で一夜被覆した。プレートを、PBSTで３回洗浄し、200μl／ウェルの、PBS中の10%（v/v）FCSで、37℃にて60分間ブロックした。プレートをPBST中で３回洗浄し、上澄み液サンプル100μlおよび標準品（IL-2 ，0-62.5 単位／ml；IL-5，0-1.6ng/ml；IFN-γ，0-70 単位／ml）を、２組でウェルに追加し、37℃にて２時間インキュベートした。アルカリホスホターゼ- ストレプトアビジン複合物およびpNPP基質を用いたサイトカインレベルの検出は、実施例１のサイトカインアッセイで説明されたのと全く同じに行なった。結果光子相関分光器（photon correlation spectroscopy）を用いた他の実験（データ不図示）では、孔直径200nmのポリカーボネートフィルタを介して押し出された小胞の実際のサイズが、152〜157nmの範囲であり、孔直径400nmの膜を介して押し出された小胞が、200〜242nmであることが確かめられた。図６ａは、Con A刺激リンパ節細胞におけるIL-2およびIL-5産生のレベルを示す。図６ｂは、各々、Con AおよびOVA刺激におけるIL-5およびIFN-γ産生のレベルを示す。400nm膜を通して押出されたNISVが、最大量のIL-2およびIFN-γを引き出した一方、IL-5のレベルを、コントロールOVAグループで達成されるものより下（有意ではないものの）に減少させた。800nmを通して押出されたNISVは、O VA単独で達成されたものと同様のレベルのIL-5を産生した。100&200nm膜を通して押出されたNISVは、400&800膜を介して押出されたNISVまたはOVAコントロールの投与後に引き出されたものよりも有意に大きなレベルのIL-5を産生した。治療用途で用いられるNISVのサイズは、免疫調節因子として作用するための能力がこのパラメータに影響されるようであるため、重要であろう。この実施例で説明されるシステムにおいて、200nmよりも大きな平均直径のNISVは、IL-5のダウンレギュレーションに対して、また、関連IL-4（その産生がIL-5の産生にリンクする）によっても、良好な治療効果を生み出すのに特に良く適していた。Ｂ．NISVのサイズのIL-1レベルへの効果小胞のサイズがヒト細胞ラインにおいて研究され、より大きな（即ち＞200nm ）小胞がヒト細胞における治療用指標にとってもより適していることが確認された。平行した研究が、培養ヒトマクロファージ細胞ラインにおいて、およびボランティアから得た新鮮なヒトPBLSにおいて行なわれた。材料および方法 NISVは実施例１で説明される方法で調製され、かつ、上述したように、ポリカーボネートフィルター（Costar社製）を通して押し出された。ヒトU937細胞ライン：ヒト白血球プロマクロファージ細胞ラインU937からの細胞を、10%（v/v）FCS、２mMのL-グルタミン、100単位／mlのペニシリンおよび100 μg／mlのストレプトマイシン（全てGibco社製）を追加されたRPMI 1640培地中で、5%CO₂雰囲気中37℃にて維持した。細胞を1000×ｇで遠心して徹底的に洗浄した後、10%FCSを追加れたDMEM中、様々な薬で活性化した。ヒトPBLs：ヒトPBLsは、実施例３で説明されるように、健康なボランティアから調製した。 U937またはヒトPBLs細胞の２ml／ウェルのアリコート（約２×10⁶細胞／ml濃度）を、24-ウェル平底組織培養プレート（Coster社製）内で安定化させた。４グループ（３組み／グループ）の各タイプの細胞を以下の調製物で処置し、5%CO₂ 雰囲気中37℃にてインキュベートした。グループ１：コントロール（PBS，pH7.4）グループ２： LPS（40ng/ml）グループ３： 200nm孔サイズ膜から押出したNISV（1mg）（「小」）グループ４：非押出しNISV（直径約1.6μm）（1mg）（「普通」）細胞を、刺激後24および48時間（PBLs）および72時間（U937細胞）で分離された細胞培養上澄み液のアリコートとともに72時間維持し、次のサイトカインアッセイのために-70℃で貯蔵した。 U937およびPBL細胞培養物の両方からの上澄みを、製造者の指示に従って、IL- 1αおよびIL-1βのため（Parmingen社製）の単一特異性ヒトELISAでアッセイした。ELISAプレートを、適切な比色溶液で現像し、Titertek Multiskan plate re ader（Flow Labolatories社製）で490nmにて測定した。細胞培養上澄み液のサイトカイン濃度は、標準曲線（回帰係数ｒ=0.990またはより良好）から決定した。結果図７ａおよび７ｂは、各々IL-1αおよびIL-1βのレベルを示す。予想されるように、LPSは、IL-1αのU937-放出がLPS刺激に対して無反応のようである以外は、24および72時間の間で両方のタイプの細胞からのIL-1放出を刺激した。小さい、約160nmのNISVは、U937細胞およびヒトPBLsからの低レベルのIL-1α放出を引き出した。しかしながら、より大きい、約1.6μmの小胞は、如何なる検出可能な程度のL-1α放出も刺激しなかった。小さい、約160μmのNISVは、U937およびヒトPBL細胞の両方において有意なレベルのIL-1βを引き出した。小さいNISVで引き出されたこのサイトカインのレベルは、LPSでこれら細胞を刺激した後に生み出されたものと同様であった。より大きな、約1.6μmのNISVは、コントロールPBSグループにおいて観察されたものと同様のIL-1βのレベルを引き出した。小および大NISVを用いたヒトU937プロマクロファージおよびヒトPBLsの刺激後に示された結果は、ネズミインビボシステムで説明された結果と相関関係がある。平均直径約200nmより大きなNISVは、ヒト細胞における免疫調節のための良好な治療プロフィールを有する。実施例６マウスに皮下注射で投与されたNISVによる、LPS誘導サイトカイン産生の抑制この研究は、インビトロでのLPS-誘導サイトカイン産生をダウンレギュレートするというNISVの能力が、匹敵するインビボ試験系でも維持されることを示すために行なわれた。材料および方法 NISVを、重量比4:5:1のコレステロール、1-モノパルミトイルグリセロールおよび燐酸ジセチルから調製した。これら成分を135℃で一緒に溶融させ、実施例１のようにPBSで希釈して、温度65℃で最終体積750mlおよび濃度25mg/mlとし、次いで8000rpmで30分間ホモジネートした後、オートクレーブで滅菌した。NISV を、二つの投与量レベルの一つ、2.5mg（約83mg／kg体重と等価）または0.5mg（約17mg／kg体重と等価）で皮下注射によって、BALB／cマウスのグループ（各グループ匹）に投与した。３グループのマウスが各投与量で投与され、更に２グループが未処置のままとされた。 LPSは、NISV注射後の異なる時点で、腹腔内注射（200μl中４μg）により投与した。 2.5mg NISVに分配された動物は、14日間隔で２回のLPS抗原投与を受けたが、一方0.5mg NISVに分配されたものは、１回のLPS抗原投与を受けた。各々のコントロールグループは、同様に抗原投与された。血液サンプルを、各LPS抗原投与後、３および６時間で、IL-6レベル測定のために採取した。サンプルは、製造者の指示に従って、“Quantikine”ELISAキット（R+D Systems社製、Abingdon，Oxon）を用いて分析した。結果結果を、図８，９および１０に示した。予想されるように、コントロールグループは、LPS抗原投与後、血清IL-6レベルの増加を示し、最高レベルは、投与後３時間の時点で起こった。NISVの両方の投与量レベルが、IL-6レベルの増加を部分的に阻害した。図８は、17mg／kg体重でのNISVの効果を示す。抑制効果はNISV後１日で最も大きく、少なくとも４日間持続した（NISV後14日でのIL-6レベルは、コントロールレベルと同等であった）。図９は、83mg／kg体重でのNISVの効果を示す。このより高い投与量では、効果の開始がより遅く、かつLPS抗原投与前14日でNISVを投与されたグループにおいて最も高かった。図１０は、高投与量NISVグループにおける第二LPS抗原投与に対する反応を示す。LPS に反応したIL-6の阻害は、NISV投与後15日で抗原投与されたグループで最大であるようであるが、部分的に28日間持続する。これらの結果は、NISVの皮下注射が有害な刺激（LPS）に対するサイトカイン反応をインビボで阻害すること、および作用の持続期間が投与量に依存することを実証しており、これは、この経路で投与した場合の「デポー」効果を示唆する。実施例７ LPS 刺激されたヒトPBLsにおけるTNF-αおよびIL-6レベルの減少ボランティア研究において、エクスビボでのサイトカイン産生の予備評価を、 LPSで刺激されたPBLsを用いて行なった。材料および方法投与前および後（＋24時間）の静脈血サンプルを、１mlのリン酸緩衝塩水中に懸濁された25mgのNISV（実施例６で調製）の皮下注射を受けたボランティアから得た。末梢血単核白血球を、フィコール／パーク勾配を用いた密度依存遠心法によってヘパリン化サンプルから分離し、白血球層を実施例３で説明するようにさらに処理して、Dulbeccoの最低基本培地中の細胞懸濁液を製造した。この懸濁液（約２×10⁶細胞／mlを含む）からのアリコートを、24-ウェル平底組織培養プレート内で安定化させた。２セット（３組み／セット）の各サンプルからの細胞を以下のように処置し、37℃で48時間インキュベートした。セット１：非刺激細胞培養物セット２： LPS(40ng/ml)激細胞培養物細胞を、培養0，1.5，4，24および48時間で分離し、IL-6およびTNF-αについて“Quantikine”キット（R＋D Systems社製、Abingdon，Oxon）を用いて分析するまで、-70℃で貯蔵した。サイトカイン濃度は、アッセイ標準品からの結果に基づく標準曲線から決定した。結果結果を図１１および１２に示した。TNF-αおよびIL-6レベルの両方における増加が、NISV投与前のサンプルでのLPS刺激とは無関係に起こった。しかしながら、ボランティアにおいて、NISV投与前後で得られたPBLsを比較することで証明し得る差異が観察された。TNF-αレベルの抑制が、NISV投与後４時間よび24時間の両方で抽出したPBLsにおいて見られ（図１１参照）、IL-6レベルの抑制が、NISV 投与後24時間で抽出したPBLsにおいて見られた（図１２参照）。これら予備データは、NISVの皮下注射がヒトPBLsのLPS抗原投与に対する反応性を抑制することを示唆している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/00 ６０９Ａ６１Ｋ 31/00 ６０９Ｆ６１７６１７６１７Ｅ６１９６１９Ｅ６２９６２９６２９Ａ６３１６３１Ｃ６３７６３７Ｅ６４３６４３ 31/22 31/22 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ブレウェア，ジェームス，マクドナルド英国グラスゴウジー12 ９ティージェー，ハイランド，ポルワースストリート 46，フラット 31 (72)発明者アレクサンダー，ジェイムズ英国グラスゴウジー61 １ディーエイチ，ベアースデン，バーモラルドライブ 17

Claims

【特許請求の範囲】１．上昇すると有害な効果を誘発する一つ以上のサイトカインの望ましくなく上昇したレベルに関連する状態と戦うのに使用するための剤の製造における非イオン性界面活性剤ベシクル（NISV）の用途。２．被検体にNISVの有効量を投与することからなる、上昇すると有害な効果を誘発する一つ以上のサイトカインの望ましくなく上昇したレベルに関連する状態と戦う方法。３．上昇すると有害な効果を誘発する一つ以上のサイトカインの望ましくなく上昇したレベルに関連する状態が、炎症状態、関節炎疾患、カヘキシーおよびアレルギー反応から選択される請求項１または２記載の用途または方法。４．上記の状態が、敗血症性ショックおよび重い敗血症、カヘキシー、炎症状態（リウマチ様関節炎、喘息および局所的アレルギー状態、例えば湿疹および乾せん、バクテリア性内毒素血症、SIRS、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、アテローム性動脈硬化、骨粗鬆症、糖尿病、白血病、多発性骨髄腫、嚢胞性線維症、肺線維症、急性髄膜炎菌性感染、アルコール性肝炎、様々なアレルギー、全身性紅斑性狼瘡および多発性硬化症を含む）から選択される請求項３記載の用途または方法。５．上記の状態が、リウマチ様関節炎およびその関連状態である請求項３記載の用途または方法。６．上記の状態が、慢性的な炎症状態である請求項３記載の用途または方法。７．上記の状態が、喘息である請求項３記載の用途または方法。８．上記のサイトカインが、前炎症性サイトカインである請求項１〜７のいずれかに記載の用途または方法。９．上記の前炎症性サイトカインが、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8およびIL-12から選択される請求項８記載の用途または方法。 10．上記のサイトカインが、アレルギー性炎症のサイトカイン媒介物質である請求項１〜７のいずれかに記載の用途または方法。 11．上記のサイトカインが、IL-4およびIL-5から選択される請求項10記載の用途または方法。 12．上記の非イオン性界面活性剤が、グリセロールエステルである先行する請求項のいずれかに記載の用途または方法。 13．上記のグリセロールエステルが、C_12-20アルカノイルまたはアルケノイル部分を含むグリセロールモノエステルである請求項12記載の用途または方法。 14．上記のグリセロールモノエステルが、1-モノパルミトイルグリセロールである請求項13記載の用途または方法。 15．上記の非イオン性界面活性剤が、グリセロールまたは低級脂肪族グリコールに基づいたエーテルを含む請求項1〜11のいずれかに記載の用途または方法。 16．NISVおよび少なくとも一つの他の製薬学的に活性な剤を、治療において同時に、別個にまたは連続的に使用のための組合せ調製物として含有する生成物。 17．NISVを、抗炎症剤および／または抗バクテリア剤とともに含む製薬組成物。 18．上記のNISVが、請求項12〜15のいずれかで定義されたものである請求項16または請求項17記載の組成物または生成物。 19．カヘキシーにかかっているか、またはかかりやすい被検体に、有効量のNISV を投与することを含む、カヘキシーと戦う方法。 20．カヘキシーの処置または予防に使用するための剤の製造におけるNISVの用途。