JPH11507910A - Ｈｄｌコレステロールレベルを増大する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、CETPの機能を阻害する免疫応答を刺激することによって、哺乳動物におけるHDLコレステロールを増加させる方法を提供する。このような免疫応答は、このような応答を刺激し得るエピトープを含有するCETPまたはCETPのフラグメント（まとめて「CETPペプチド」と呼ぶ）で免疫することにより誘導され得る。ペプチドは、免疫原性を増大するために、KLHまたはオボアルブミンのようなキャリアに結合体化され得る。アジュバントがまた投与され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 HDLコレステロールレベルを増大する方法 本発明は、一般に、免疫治療分野に関し、より詳細には、コレステロールエス テル転移タンパク質（CETP）に対する免疫応答を刺激する方法に関する。 発明の背景 血液コレステロールレベルは、アテローム性動脈硬化心臓疾患の危険性に直接 に関連し、心臓発作を導くと長く考えられてきた。より最近に、血液コレステロ ールが、実際に、２つの一次的な形態から構成されることが認められた：高密度 リポタンパク質（HDL）および低密度リポタンパク質（LDL）。疾患の危険性に関 連するのではなく、高いHDLレベルは明かに逆の徴候である。実際、今日の研究 は、HDLがアテローム性動脈硬化症に対する防御において直接の作用を有し、ア テローム性動脈硬化症斑の症状の緩解さえも促進し得ることが示された。 多数の因子が、身体でのコレステロールレベル調節に関与する。コレステロー ルエステル転移タンパク質（CETP）は、HDLから非常に低い密度のリポタンパク 質（VLDL）およびLDLへのコレステロールエステル（CE）の運搬に応答し得る酵 素である。VLDLは最終的にLDLに変換される。CETPは、プロ-と抗-アテローム原 性（anti-atherogenic）リポタンパク質画分との間で脂質成分の変換を特異的に 加速する。特に、血漿中のCETPレベルとHDLコレステロールレベルとの間で強い 逆の相関関係（inverse correlation）が存在する。CETP活性レベルは、食事性 または遺伝性高コレステロール血症を罹患した個体において上昇される。CETP活 性の増大したレベルは、HDLのより低いレベルをもたらす。逆に、CETP遺伝子中 の変異に起因するCETP活性の不全を伴う個体は、著しく上昇されたHDLレベルを 有する。 より高等な生物の免疫系は、ウイルス、細菌、および寄生虫のような有害な外 来物質による侵襲に対して、個体を防御する手段として開発された。免疫系の細 胞は、個体自身の身体から（「自己」物質と呼ばれる）と、外来物質または抗原 とを区別し得る。外来物質が身体に侵入すると、免疫系は応答を増す。外来物質 を特異的に認識して結合する抗体が産生される（抗体または体液性応答）。さら に、T細胞は、外来物質に抵抗するために動員される（T細胞または細胞性応答） 。自己として認識される物質は、特定病理学的条件下（原発性自己免疫疾患）以 外は、通常はこのような応答を刺激しない。内因性タンパク質の存在が、それ自 身有害であるときでさえ、免疫系は、その物質が自己として認識されれば、リギ ュレーターとして作用し得ない。 アテローム性動脈硬化症の予防におけるHDLの潜在的に有用な効果のために、 血清中のそのレベルを増大するために使用され得る方法の必要性が存在する。こ のような方法は、理想的に特異的かつ確実であり、そして可能な限り身体の侵襲 がないべきである。本発明は、この必要性を満たし、かつ関連する利点をも提供 する。 発明の要旨 本発明は、CETPの機能を阻害する免疫応答を刺激することによって、哺乳動物 でHDLコレステロールを増加する方法を提供する。このような免疫応答は、この ような応答を刺激し得るエピトープを有する、CETPまたはCETPのフラグメント（ まとめて、「CETPペプチド」と呼ぶ）で免疫することによって誘導され得る。ペ プチドは、免疫原性を増大させるために、キーホールリンペットヘモシアニン（ KLH）またはオボアルブミンのようなキャリアに結合体化（conjugated）され得 る。アジュバントもまた投与され得る。 １つの実施態様では、抗体応答を惹起するために使用されるCEPTのフラグメン トは、約10から20アミノ酸の長さであり、そしてウサギまたはヒトCETPの配列と 相同な配列を有する。 図面の簡単な説明 図１は、トキソイド結合体化ペプチド（実線）、遊離ペプチド（破線）、また は生理食塩水（点線）のいずれかで免疫された動物についての、免疫期間中の抗 CETPペプチド力価を示す。エラーバーは標準偏差を示す。 図２は、トキソイド結合体化ペプチド（実線）、遊離ペプチド（破線）、また は生理食塩水（点線）のいずれかで免疫された動物についての、免疫期間中のCE TP活性を示す。エラーバーは標準偏差を示す。 図３は、免疫した動物にコレステロール食を与えた後の時間の関数として、CE TP活性を示す。動物を、トキソイド結合体化ペプチド（実線）あるいは遊離ペプ チド（破線）のいずれかで免疫した。エラーバーは標準偏差を示す。 図４は、免疫した動物にコレステロール食を与えた後の時間の関数として、HD L-コレステロールレベルを示す。動物を、トキソイド結合体化ペプチド（実線） あるいは遊離ペプチド（破線）のいずれかで免疫した。エラーバーは標準偏差を 示す。 図５は、免疫した動物にコレステロール食を与えた後の時間の関数として、LD L-コレステロールレベルを示す。動物を、トキソイド結合体化ペプチド（実線） あるいは遊離ペプチド（破線）のいずれかで免疫した。エラーバーは標準偏差を 示す。 図６は、免疫した動物にコレステロール食を与えた後の時間の関数として、LD L/HDL-コレステロール比を示す。動物を、トキソイド結合体化ペプチド（実線） あるいは遊離ペプチド（破線）のいずれかで免疫した。エラーバーは標準偏差を 示す。 発明の詳細な説明 本発明は、CETPレベルを低下させるために身体自身の免疫系を利用する方法を 提供し、それにより、有用なHDLコレステロールレベルを増大させる。本発明は 、血液中、より詳細には血清中のHDLを上昇させる有効な方法を提供する。HDLレ ベルを増大するために身体自身の免疫系を利用することによって、本発明は、望 ましくない副作用を有する、薬剤の繰り返し投与に関連する問題を回避する。 本発明に従って、CETPペプチドを、抗CETP免疫応答を誘発するような様式で、 適切な個体に投与する。CETPペプチドは、抗体または体液性応答を刺激し得るエ ピトープを有するように選択され得る。あるいは、CETPペプチドは、細胞性応答 、またはその他の免疫応答を刺激し得る。CETPペプチドは、B細胞エピトープを 有 するように選択され得、その配列はそのエピトープを特異的に認識して結合する 抗体の産生を刺激し得る。あるいは、T細胞またはより一般的な免疫応答を刺激 する、CETPペプチドが選択され得る。 HDLコレステロールの低い血清レベルを示すか、または示す危険性のある個体 は、このような治療に特に適切である。血清HDLレベルは、当該分野で周知の方 法を用いて測定され得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、Warnic k，G．R．J．Lipid．Res.，19:65(1978)を参照のこと。）。約30-35 mg/dlより 少ない血清HDLは、低いと考えられる。このレベルを下回る血清HDLレベルを示す 被検体は、本発明の処置に特に適している。 投与されるべきタンパク質またはペプチドは、そのタンパク質またはペプチド がB細胞および／またはT細胞エピトープを有する限り、CETPタンパク質の全体ま たは部分であり得る。本明細書中で使用されるように、「CETPペプチド」は、全 長のCETPアミノ酸配列およびそのフラグメントの両方を包含することが意図され る。ペプチドは、哺乳類CETP配列に対応するか、または相同である配列を有し得 る。ペプチドは、CETP活性を阻害する抗体を誘導し得る限り、ある程度天然配列 と異なり得る。 CETPは、そのアミノ酸配列に基づく55 kDのタンパク質であるが、翻訳後の修 飾によって、66-74 kDの見かけの分子量を有する。ヒトCETP mRNA配列は、Genba nk（寄託番号 M30185）で入手可能である。ウサギCETP mRNA配列は、Genbank（ 寄託番号 M27486）で入手可能である。Genbank配列は、ヒトおよびウサギCETPの 完全なアミノ酸配列を得るために、MacVectorソフトウエアプログラム（I.B.M． New Haven，Connecticut）を用いて翻訳された。 CETPおよびそのペプチド誘導体は、「自己」抗原として認識され得るので、キ ャリアが、それらの免疫原性を増大するために使用され得る。このようなキャリ アは、当該分野で周知であり、例えば、このような化合物は、キーホールリンペ ットヘモシアニン（KLH）、オボアルブミン、ジフテリアトキソイド（Wako BioP roducts）、および破傷風トキソイド（Connaught）を包含する。CETPペプチドは 、当該分野で周知の方法によって、このようなキャリアと結合体化され得る。Cu rrent Protocols in Molecular Biology、Ausebell，Brent，Kingston，Moore， Se idman，Smith および Strull編（1987）、または、製造者の使用説明書を参照の こと。これは、本明細書中に参考として援用される。ペプチドの免疫原性もまた 、アジュバントの投与によって増大され得る。種々のアジュバントが周知であり 、入手可能である。Antibodies:A Laboratiry Manual、HarlowおよびLane編（19 88）を参照のこと。これは本明細書中に参考として援用される。 CETPペプチドの投与によって誘導される抗CETP応答の程度は、種々のアッセイ を用いてモニターされ得る。例えば、競合形式（competitive format）のイムノ アッセイが、抗CETP抗体または抗CETP抗血清を使用して実施され得る。あるいは 、被検体個体のCETPの活性レベルは、例えば、³H-コレステロールオレイン酸エ ステル転移アッセイを用いてモニターされ得る。Lausuncion，M.A.ら、Biochem J.，270:441-449(1990)。CETP活性の減少は、抗CETP応答の直接の指標である。 以下の実施例は、本発明を例示し、限定することを意図しない。 実施例１ CETPペプチド免疫原の投与 ヒト、ウサギ、およびウサギ／ヒトCETPの部分に対応するペプチドを、標準的 なペプチド合成プロトコールに従って調製した。以下のペプチド配列を調製した ： H-Cys-Asp-Ser-Gly-Arg-Val-Arg-Thr-Asp-Ala-Pro-Asp-OH （配列番号1） H-Cys-Asp-Ala-Gly-Ser-Val-Arg-Thr-Asn-Ala-Pro-Asp-OH （配列番号2） H-His-Leu-Leu-Val-Asp-Phe-Leu-Gln-Ser-Leu-Ser-OH （配列番号3）。 第１のペプチド（配列番号1）は、本明細書中に参考として援用されるSmithお よびBarakat，Med．Sci．Res.，21:911-912(1993)からのヒトCETPペプチド配列 （シグナルペプチドを含まない131-142残基）から得る。第２のペプチド（配列 番号2）は、対応するウサギ配列であり、そしてヒトとは３アミノ酸のみ異なる 。 第３のペプチド（配列番号3）は、ヒトおよびウサギの両方に共通し、そして 中和性である抗CETPモノクローナル抗体によって認識されるエピトープである。 Tall，A.R.，J．Lipids Res.，34:1255-1257(1993)。 ペプチドは、前出のCurrent Protocols in Molecular Bioligyの方法によって 、オボアルブミンに結合体化した。四匹のニュージーランドシロウサギ（約四ヶ 月齢）のうち二匹に、PBS中の100マイクログラムオボアルブミン結合体化ヒトペ プチド（配列番号1）およびCFAを筋肉内注射し、そして二匹に、等量のヒト／ウ サギペプチド（配列番号3）を注射した。これらの動物に、一ヶ月間隔で２回、 フロイントの不完全アジュバント（IFA）中の同じペプチドで追加免疫した。 実施例２ トキソイド結合体化CETPでの免疫 メスのニュージーランドウサギの３つの群（群あたり３匹）を、トキソイド結 合体化ペプチド、遊離ペプチド、または生理食塩水のいずれかで免疫した。免疫 は、免疫期間中合計４回の免疫について、７週間毎に一度投与した。各免疫は、 各動物の背中に10カ所、皮内注射によって投与した。各免疫原をIFAに乳化し、 各動物の各々の部位に、免疫ごとに、動物あたり100μgのエマルジョンまたは1m lを与えた。 トキソイド結合体化ペプチドおよび遊離ペプチドに使用されるペプチドは同じ であった：H-His-Leu-Leu-Val-Asp-Phe-Leu-Gln-Ser-Leu-Ser-OH（配列番号3） 。トキソイド結合体化ペプチドのペプチドを、ジフテリアトキソイドまたは破傷 風トキソイドのいずれかと結合体化した。両方のトキソイド結合体化ペプチドを 、トキソイド結合体化ペプチド群の動物に投与した。ジフテリアトキソイド結合 体化ペプチドおよび破傷風トキソイド結合体化ペプチドを、キャリア誘導免疫抑 制を避けるために代替免疫で投与した（例えば、本明細書中に参考として援用さ れるGaur，A.，Int．Immunol.，2:151(1990)を参照のこと）。 免疫期間の前、期間中、および８週間後に、全動物に通常の食餌を与えた。最 後の免疫の８週間後に、トキソイド結合体化ペプチドおよび遊離ペプチド群の動 物を、1%コレステロールを含有する食餌に切り替え、そし思い出させた（remine d on）。全ての動物を、血液サンプリングの前の14時間以外は、実験中、食物お よび水を自由に摂取させた。 抗CETPペプチド力価を、ELISAアッセイによって測定した。簡単には、KLHに結 合体化されたペプチドを、マイクロタイタープレートに被覆し、そのプレートを 希釈した血清とともにインキュベートし、そして結合した抗体をヤギ-α-ウサギ ーHRP抗体で検出した。抗CETPペプチド力価を、最大応答の50%を与える希釈物の 相対物（reciprocal）として示した。 有意な抗CETPペプチド力価（10³を超える）が、免疫期間中のトキソイド結合 体化ペプチド群において生産された。逆に、遊離ペプチド群および生理食塩水群 の動物は、有意な抗CETPペプチド力価を生産しなかった。免疫期間中の得られた CETPペプチド力価は、図１に要約する。 CETP活性を、最初の免疫の前（採血前期間）および実験を終了するまで測定し た。CETP活性は、公知の方法を用いてヒト血清由来のHDLおよび標識した³H-コレ ステロールオレイン酸エステルを単離することにより測定した（例えば、本明細 書中に参考として援用される、Lasuncion，M.A.，Biochem．J.，270:441(1990) を参照のこと）。³H-HDL（3000 cpm）を、VLDLおよび50 mM Tris、150 mM NaCl 、2 mM EDTA（pH 7.4）の総容量50μl中の2.5μl試料血清とともに、37℃で１時 間インキュベートした。反応を、450μlのヒト血清を用いて停止し、そしてリン タングステン酸およびMgCl₂によって沈澱させた。上清および再懸濁した沈澱を シンチレーションカウンターで計数し、そして結果を、生理食塩水群の平均パー セント転移に対して標準化した、転移された³H-コレステロールエステルのパー セントである、CETP活性の比として示した。 CETP活性の有意な減少が、トキソイド結合体化群の動物について見出された。 免疫期間中のCETP活性を、図２に要約する。 トキソイド結合体化ペプチド群の動物由来の精製抗体は、CETP活性を42%まで 阻害した。比較すると、生理食塩水群の動物由来の精製抗体は、CETP活性を2%未 満しか阻害しなかった。CETPと反応することが知られているモノクローナル抗体 TP-2は、CETP活性を52%まで阻害した（例えば、Whitlock，M.E.，J．Clin．Inve st.，84:129(1989)を参照のこと）。従って、トキソイド結合体化ペプチド群の 動物によって産生されたCETPに対する抗体は、その群において生じるCETP活性の 減少をもたらす。抗体は、周知のHPLC高容量プロテインAカラムクロマトグラフ ィー法を用いて血清から精製された。 総コレステロール、HDL-コレステロール、LDL-コレステロール、およびトリグ リセリドレベルを、採血前期間、免疫期間、および免疫後を通じて測定した。LD Lコレステロールを、Friedwald，Ley and Fredrickson方程式に従って、評価し た（本明細書中に参考として援用される、Friedwald，W.T.，Clin Chem.,18:499 (1972)を参照のこと）。 採血前期間の間および動物に通常の食餌を与えた間は、群中のコレステロール またはトリグリセリドレベルにおいて有意な差は検出されなかった。これらの期 間中の総コレステロール、HDL-コレステロール、LDL-コレステロール、およびト リグルセリドレベルを、表１に要約する。 ＊各値は、６回の採血（採血前期間）または後続期間についての７回の採血に対 する平均値±標準偏差を示す。 動物を、1%コレステロール食に切り換えたときに、総コレステロール、LDL-コ レステロール、およびCETP活性は、普通食の動物に比較して、トキソイド結合体 化ペプチド群および遊離ペプチド群の動物の両方において有意に増加した。コレ ステロール食の前および後の、総コレステロール、HDL-コレステロール、LDL-コ レステロール、総トリグリセリド、HDL-トリグリセリド、CETP活性、および抗CE TPペプチド力価を、表２に要約する。 コレステロール食の動物についてのCETP活性は、遊離ペプチド群の動物に比較 して、トキソイド結合体化ペプチド群について有意に低かった。このような動物 のCETP活性を、コレステロール食の時間の関数として、図３に要約する。 コレステロール食の動物についてのHDL-コレステロールレベルは、遊離ペプチ ド群に比較して、トキソイド結合体化ペプチド群について有意に高かった。この ような動物のHDL-コレステロールレベルを、コレステロール食の時間の関数とし て、図４に要約する。 コレステロール食の動物についてのLDL-コレステロールレベルは、遊離ペプチ ド群に比較して、トキソイド結合体化ペプチド群について有意差がなかった。こ のような動物のLDL-コレステロールレベルを、コレステロール食の時間の関数と して、図５に要約する。 コレステロール食の動物についてのLDL/HDL-コレステロールレベル比は、トキ ソイド結合体化ペプチド群に比較して、遊離ペプチド群について有意に高かった 。このような動物のLDL/HDL-コレステロールレベル比をコレステロール食の時間 の関数として、図５に要約する。 この結果は、トキソイド結合体化ペプチドで免疫した動物は、コレステロール 食を摂取した動物において、HDL-コレステロールレベルを上昇することを示す。 低HDL-コレステロールレベルは、LDL-コレステロールレベルに関係なく、アテロ ーム性動脈硬化症の危険性の増大に関連する。従って、CETPに対する免疫は、HD L-コレステロールレベルを上昇することによって、アテローム性動脈硬化症の危 険性を減少し得る。 本発明は、本明細書中で好ましい実施態様を参考にして記載されてきたが、種 々の改変が、本発明の精神から逸脱することなく実施され得ることが理解される べきである。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ブロストフ，スティーブン ダブリュー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92009, カールスバッド，ブラック スワン プレ イス 7323 (72)発明者 カルロ，デニス ジェイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92067, ランチョサンタフェ，ピー．オー． ボッ クス 1176

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．低いレベルの血清HDLを示すヒトにおいて、高密度リポタンパク質（HDL）コ レステロールを増加させる方法であって、該ヒトに、コレステロールエステル転 移タンパク質（CETP）の免疫原性エピトープおよびキャリアを含有する組成物を 投与する工程を包含する、方法。 ２．前記免疫原性エピトープが実質的に精製されたCETPである、請求項１に記載 の方法。 ３．前記免疫原性エピトープがペプチドである、請求項１に記載の方法。 ４．前記免疫原性エピトープがB細胞エピトープを含有する、請求項１に記載の 方法。 ５．前記ペプチドが、 H-Cys-Asp-Ala-Gly-Ser-Val-Arg-Thr-Asn-Ala-Pro-Asp-OH （配列番号2）； H-Cys-Asp-Ser-Gly-Arg-Val-Arg-Thr-Asp-Ala-Pro-Asp-OH （配列番号1）；および H-His-Leu-Leu-Val-Asp-Phe-Leu-Gln-Ser-Leu-Ser-OH （配列番号3） からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。 ６．前記キャリアが、KLH、オボアルブミン、ジフテリアトキソイド、および破 傷風トキソイドからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。 ７．前記組成物がアジュバントとともに投与される、請求項１に記載の方法。 ８．前記投与が繰り返される、請求項１に記載の方法。 ９．低いレベルの血清高密度リポタンパク質（HDL）を示すヒトにおいて、アテ ローム性動脈硬化症の危険性を減少する方法であって、該ヒトに、コレステロー ルエステル転移タンパク質（CETP）の免疫原性エピトープおよびキャリアを含有 する組成物を投与する工程を包含する、方法。 １０．前記免疫原性エピトープが実質的に精製されたCETPである、請求項９に記 載の方法。 １１．前記免疫原性エピトープがペプチドである、請求項９に記載の方法。 １２．前記免疫原性エピトープがB細胞エピトープを含有する、請求項９に記載 の方法。 １３．前記ペプチドが、 H-Cys-Asp-Ala-Gly-Ser-Val-Arg-Thr-Asn-Ala-Pro-Asp-OH （配列番号2）； H-Cys-Asp-Ser-Gly-Arg-Val-Arg-Thr-Asp-Ala-Pro-Asp-OH （配列番号1）；および H-His-Leu-Leu-Val-Asp-Phe-Leu-Gln-Ser-Leu-Ser-OH （配列番号3） からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。 １４．前記キャリアが、KLH、オボアルブミン、ジフテリアトキソイド、および 破傷風トキソイドからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。 １５．前記組成物がアジュバントとともに投与される、請求項９に記載の方法。 １６．前記投与が繰り返される、請求項９に記載の方法。 １７．前記アテローム性動脈硬化症がアテローム性動脈硬化心臓疾患である、請 求項９に記載の方法。