JPH11507812A - Human G-protein binding receptor (HETGQ23) - Google Patents

Human G-protein binding receptor (HETGQ23)

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JPH11507812A
JPH11507812A JP9500363A JP50036396A JPH11507812A JP H11507812 A JPH11507812 A JP H11507812A JP 9500363 A JP9500363 A JP 9500363A JP 50036396 A JP50036396 A JP 50036396A JP H11507812 A JPH11507812 A JP H11507812A
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Abstract

(57)【要約】 ヒトＧ−タンパク質結合性受容体ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)、およびそのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法を開示する。そのようなポリペプチドを、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定するために利用する方法、ならびに該アンタゴニストおよびアゴニストを治療的に使用して、Ｇ−タンパク質結合性受容体の発現不足および過剰発現にそれぞれに関連のある症状を治療する方法もまた開示する。Ｇ−タンパク質結合性受容体の核酸配列における変異および該受容体の可溶性体のレベルの変化を検出するための診断方法もまた開示する。   (57) [Summary] Disclosed are human G-protein coupled receptor polypeptides, and DNA (RNA) encoding such polypeptides, and methods for producing such polypeptides by recombinant techniques. Methods of utilizing such polypeptides to identify antagonists and agonists for such polypeptides, and the therapeutic and therapeutic use of such antagonists and agonists to under- and over-express G-protein coupled receptors Also disclosed are methods of treating conditions each associated with an expression. Also disclosed are diagnostic methods for detecting mutations in the nucleic acid sequence of a G-protein coupled receptor and altered levels of the soluble form of the receptor.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＧ−タンパク質結合性受容体(ＨＥＴＧＱ２３) 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチド によりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプ チドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの 製造に関する。とくに、本発明のポリペプチドは、ヒト７−膜貫通受容体である 。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。 多くの医学的に重要な生物学的プロセスが、Ｇ−タンパク質および／または第 二メッセンジャー、例えば、cＡＭＰを含む信号伝達経路に関与するタンパク質 により媒介されることは十分確立されている(Ｌefkowitz、Ｎature、３５１：３ ５３−３５４(１９９１))。本明細書中では、これらのタンパク質を、Ｇ−タン パク質またはＰＰＧタンパク質を伴う経路に関与するタンパク質と呼ぶ。これら のタンパク質の幾つかの例には、アドレナリン作動薬およびドーパミンに対する 受容体のようなＧＰＣ受容体(Ｋobilka，Ｂ.Ｋ.ら、ＰＮＡＳ、８４：４６−５ ０(１９８７);Ｋobilka，Ｂ.Ｋ.ら、Ｓcience、２３８：６５０−６５６(１９８ ７)；Ｂunzow,Ｊ.Ｒ.ら、Ｎature、３３６：７８３−７８７(１９８８))、Ｇ− タンパク質自体、エフェクタータンパク質、例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニ ルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ、並びにアクチュエーター(actuato r)タンパク質、例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼ Ｃ(Ｓ imon,Ｍ.Ｉ.ら、Ｓcience、２５２：８０２−８（１９９１）が含まれる。 例えば、信号伝達の１つの型では、ホルモン結合の効果は、細胞内部での、酵 素、アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素活性化はヌクレ オチドＧＴＰの存在に依存して、ＧＴＰはまたホルモン結合に影響を及ぼす。Ｇ −タンパク質は、ホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼと連結する。Ｇ−タン パク質は、ホルモン受容体により活性化された場合、ＧＴＰを結合ＧＤＰと交換 することが示された。次いで、そのＧＴＰ担持型は、活性化アデニル酸シクラ ーゼに結合する。Ｇ−タンパク質自体により触媒される、ＧＴＰのＧＤＰへの加 水分解は、Ｇ−タンパク質をその基本の不活性型へと戻す。従って、Ｇ−タンパ ク質は、受容体からエフェクターへと信号を中継ぎする中間体として、および信 号の持続時間を制御する時計として、二重の役割を果たす。 Ｇ−タンパク質結合性受容体の膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、７ つの推定される膜貫通ドメインを有するものとして特徴付けられている。該ドメ インは、細胞外または細胞質ループにより連結された膜貫通α−ヘリックスを示 すと考えられている。Ｇ−タンパク質結合性受容体には、ホルモン、ウイルス、 成長因子、および神経受容体といったような、広範囲にわたる生物学的に活性な 受容体が含まれる。 Ｇ−タンパク質結合性受容体は、少なくとも８つの分散した親水性ループを連 結する、約２０〜３０個のアミノ酸からなる、これらの７つの保存された疎水的 な広がりを含むものとして特徴付けられている。結合性受容体のＧ−タンパク質 ファミリーには、精神病性および神経学的障害を治療するために使用される神経 弛緩薬に結合するドーパミン受容体が含まれる。このファミリーのメンバーの他 の例には、カルシトニン、アドレナリン、エンドセリン(endothelin)、cＡＭＰ 、アデノシン、ムスカリン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロン ビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１受容体、ロド プシン、におい物質、サイトメガロウイルス受容体等が含まれる。 大部分のＧ−タンパク質結合性受容体は、機能的タンパク質の構造を安定化す ると考えられているジスルフィド結合を形成する、最初の２つの細胞外ループの 各々に、１つの保存されたシステイン残基を有する。７つの膜貫通領域を、ＴＭ １、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と名付ける。ＴＭ ３もまた、信号伝達に関与する。 システイン残基のリン酸化および脂質化(パルミチル化またはファルネシル化) は、幾つかのＧ−タンパク質結合性受容体の信号伝達に影響を及ぼし得る。大部 分のＧ−タンパク質結合性受容体は、３番目の細胞質ループおよび／またはカル ボキシ末端内に可能性のあるリン酸化部位を含む。β−アドレナリン作動性受容 体のような、幾つかのＧ−タンパク質結合性受容体に関して、プロテインキナー ゼ Ａおよび／または特異的受容体キナーゼによるリン酸化は、受容体の脱感受 性を媒介する。 幾つかの受容体については、Ｇ−タンパク質結合性受容体のリガンド結合部位 は、数個のＧ−タンパク質結合性受容体膜貫通ドメインにより形成された親水性 ソケットを含んでなると考えられており、このソケットは、Ｇ−タンパク質結合 性受容体の疎水性残基により囲まれている。各々のＧ−タンパク質結合性受容体 膜貫通ヘリックスの親水性側は、内側を向いて、極性リガンド結合部位を形成す ると仮定されている。ＴＭ３は、ＴＭ３ アスパラギン酸残基が含まれるような 、リガンド結合部位を有するものとして、幾つかのＧ−タンパク質結合性受容体 に関係がある。加えて、ＴＭ５ セリン、ＴＭ６ アスパラギン、およびＴＭ６ま たはＴＭ７ フェニルアラニンまたはチロシンもまたリガンド結合に関係がある 。 Ｇ−タンパク質結合性受容体は、ヘテロトリマーのＧ−タンパク質により、様 々な細胞内酵素、イオンチャンネル、および輸送体に細胞内で結合することがで きる(Ｊohnsonら、Ｅndoc.、改訂版、１０：３１７−３３１（１９８９）を参照 )。様々なＧ−タンパク質のα−サブユニットは、特定のエフェクターを優先的 に刺激して、細胞における様々な生物学的機能を変化させる。Ｇ−タンパク質結 合性受容体の細胞質残基のリン酸化は、幾つかのＧ−タンパク質結合性受容体の Ｇ−タンパク質結合の調節に関する重要な機構として同定されている。Ｇ−タン パク質結合性受容体は、哺乳動物の宿主内の多くの部位において見い出される。 本発明の一態様により、新規ポリペプチドならびに生物学的に活性であって、 診断上または治療上有用な、そのフラグメントおよび誘導体を提供する。本発明 のポリペプチドは、ヒト起源である。 本発明の別の態様により、mＲＮＡ、ＤＮＡ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、 本発明のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子、さらにはまた、その アンチセンスアナログ、並びに生物学的に活性であって、診断上または治療上有 用な、そのフラグメントを提供する。 本発明のさらなる態様により、そのようなポリペプチドを組換え技術により製 造する方法であって、当該タンパク質の発現、およびその後の当該タンパク質の 回収を促進する条件下において、ヒトＧ−タンパク質結合性受容体の核酸配列を 含む組換え原核および／または真核宿主細胞を培養することを含んでなる方法を 提供する。 本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提 供する。 本発明の別の態様により、本発明の受容体ポリペプチドに結合して、該ポリペ プチド活性化するかまたは活性化を阻害する化合物に関してスクリーニングする 方法を提供する。 本発明のさらに別の態様により、Ｇ−タンパク質結合性受容体の発現不足に関 係がある病態の治療に対して本発明の受容体ポリペプチドを刺激するために、そ のような活性化化合物を使用する方法を提供する。 本発明の別の態様により、Ｇ−タンパク質結合性受容体の過剰発現と関連のあ る病態を治療することに対して本発明のポリペプチドの作用を阻害するために、 そのような阻害化合物を使用する方法を提供する。 本発明のまた別の態様により、本発明のＧ−タンパク質結合性受容体の少なく とも１つの膜貫通ドメインの、同型的なアミノ酸置換を有するフラグメント、コ ンセンサスフラグメントおよび／または配列である、天然には存在しない、合成 の、単離された、および／または組換えＧ−タンパク質結合性受容体ポリペプチ ドを提供することから、該受容体は、Ｇ−タンパク質結合性受容体リガンドを結 合することができ、またはこれは、Ｇ−タンパク質結合性受容体リガンド結合を 量的に、または質的に変化させることもできる。 本発明のさらに別の態様により、それらの期待される生物学的特性によって、 リガンドに結合することにより、またはリガンド結合を変化させることにより、 Ｇ−タンパク質結合性受容体機能の可能性のあるモジュレーターとして有用であ り得る、Ｇ−タンパク質結合性受容体合成または組換えＧ−タンパク質結合性受 容体ポリペプチド、その同型的な置換誘導体、抗体、抗イディオタイプ抗体、組 成物、および方法を提供し、これらは、診断、治療および／または研究での応用 に使用することができる。 本発明の別の目的により、様々なＧ−タンパク質結合性受容体またはそのフラ グメントを阻害する、または模倣することを意図する、合成の、単離された、ま たは組換えポリペプチドを、受容体タイプおよびサブタイプとして提供する。 本発明のさらに別の態様により、本発明の核酸配列に対して特異的にハイブリ ダイズするのに充分な長さの核酸分子を含んでなる診断プローブも提供する。 本発明のまた別の目的により、変異したＧ−タンパク質結合性受容体核酸配列 に関係がある疾患、または疾患に対する感受率を検出するための診断アッセイを 提供する。 本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明ら かであろう。 以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含 される本発明の範囲を限定しようとするものではない。 第１図は、本発明のＧ−タンパク質結合性受容体のcＤＮＡ配列および対応す る推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関する標準的な１文字略字を使用する。 配列決定は、３７３自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂiosystems，Ｉnc. )を使用して行った。 第２図は、本発明のポリペプチド(上段)とヒト内皮分化タンパク質（ｅｄｇ− １）遺伝子のmＲＮＡ（下段）との間のアミノ酸ホモロジーである。 第３図は、Ｇ−タンパク質結合性受容体の二次構造的特徴である。最初の７段 は、αヘリックス、βシート、ターン領域またはコイル領域といったようなアミ ノ酸配列の領域を示す。ボックスエリアが、上記の領域に対応するエリアである 。図中、２番目のセットは、細胞内、細胞質に接触しているかまたは膜を貫通し ているエリアのアミノ酸配列のエリアを示す。親水性を示すパートでは、膜の脂 質２層内に存在し、したがって疎水性であるタンパク質配列のエリア、ならびに 親水性であり、脂質２層膜外にあるタンパク質配列のエリアを示す。抗原エリア とは、脂質２層膜外であって、抗原に結合可能なエリアであるために、抗原イン デックスは、親水性プロットに対応する。さらに表面確率プロットが抗原インデ ック スおよび親水性プロットに対応する。両親媒性プロットは、極性および非極性で ある１３配列の領域を示す。フレキシブル領域は、フレキシブル領域が膜外領域 であり、インフレキシブル領域が膜貫通領域であるという意味において、２番目 のセットに対応する。 本発明の一態様により、第１図（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有する成 熟ポリペプチド、または１９９５年４月２８日にＡＴＣＣ寄託番号第９７１３０ 号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドを コードする、単離された核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト内皮腫瘍組織由 来のcＤＮＡから単離された。それは、構造上、Ｇ−タンパク質結合性受容体フ ァミリーに関係がある。それは、３６４個のアミノ酸残基のタンパク質をコード するオープンリーディングフレームを含む。そのタンパク質は、ヒトＥＤＧ−１ タンパク質に対し、３６４アミノ酸長さにわたり、３６％の同一性と６１％の類 似性をもって、最も高い程度の相同性を示す。本発明の受容体ポリヌクレオチド に対する潜在的リガンドは、アナンダミン、セロトニン、アドレナリンおよびノ ルアドレナリン、血小板活性化因子、トロンビン、Ｃ５ａおよびブラジキニン、 ケモカインならびに血小板活性化因子などが挙げられるが、これらに限定される ものではない。 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、こ のＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮ Ａは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コード鎖または非 コード(アンチ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配 列は、第１図（配列番号１）に示すコード配列または寄託されたクローンのコー ド配列と同じであってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として 、第１図（配列番号１）のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプ チドをコードする異なったコード配列であってもよい。 第１図（配列番号２）の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコ ードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが 含まれ得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配 列(および場合により付加的コード配列)、および成熟ポリペプチドのコード配列 のイントロンまたは非コード配列５'および／または３'といったような非コード 配列。 従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペ プチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的コ ードおよび／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。 本発明は、さらに、第１図（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペ プチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの フラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの 変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在 するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得 る。 従って、本発明には、第１図（配列番号２）に示すのと同じ成熟ポリペプチド または寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチド をコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの 変異体が含まれ、これらの変異体は、第１図（配列番号２）のポリペプチドまた は寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン ト、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、 欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。 先に示したように、該ポリヌクレオチドは、第１図（配列番号１）に示すコー ド配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配列の 天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られてい るように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失ま たは付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされ るポリペプチドの機能を実質的には変えない。 ポリヌクレオチドはまた、本発明の全長ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび 細胞内ドメインから切断された、本発明ポリペプチドの細胞外部分である、本発 明の受容体ポリペプチドの可溶性体をコードする。 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とする マーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そ のマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するため の、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であって よく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合 には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは 、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する( Ｗilson,Ｉ．ら、Ｃell、３７：７６７(１９８４))。 「遺伝子」なる語はポリペプチド鎖の製造に関与するＤＮＡセグメントを意図 している；コーディング領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー） 、ならびに個々のコーディングセグメント（エクソン）の間の配列（イントロン ）も含む。 全長の本発明のポリヌクレオチド配列のフラググメントをcＤＮＡライブラリ ーのハイブリダイゼーションプローブとして使用して他の遺伝子を単離し、これ らの遺伝子は本発明のポリヌクレオチド配列と高い配列類似性または同様の生物 学的活性を有する。このタイプのプローブは少なくとも２０または３０塩基を有 するのが好ましいが、５０塩基あるいはそれ以上を有してもよい。該プローブは また、全長の転写物に対応するcＤＮＡクローン、および制御領域およびプロモ ーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全な本発明の遺伝子を含む単一 または複数のゲノムクローンを同定するのに使用してよい。スクリーニングの例 にはオリゴヌクレオチドプローブを合成するため公知のＤＮＡ配列を使用するこ とによる遺伝子のコーディング領域の単離を含む。本発明の遺伝子の配列と相補 的な配列を有している標識したオリゴヌクレオチドは、ライブラリーのどのメン バーに該プローブがハイブリダイズするかを決定するため、ヒトcＤＮＡ、ゲノ ムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするのに使用する。 本発明はさらに、配列間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、 さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブ リダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件 下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。 本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に 少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ 、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では 、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図( 配列番号１)のcＤＮＡもしくは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリ ペプチドと実質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチドをコ ードする。 言い方を替えると、本発明ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、上記の同一 性があり、活性を保持するかまたはしない該ポリヌクレオチドは、少なくとも２ ０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、さらに好ましくは少なくとも５０塩基 を有する。たとえば、このようなポリヌクレオチドは、たとえば配列番号１のポ リヌクレオチドの回収用の該ポリヌクレオチドに対するプローブとして、または 診断用プローブとして、あるいはＰＣＲプライマーとして使用できる。 したがって、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオ チドに対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好まし くは少なくとも９５％の同一性があるポリヌクレオチド、ならびに少なくとも２ ０または３０塩基、好ましくは少なくとも５０塩基を有する、そのフラグメント 、および、このようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関 する。 本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダ ペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への 便宜として与えられるものであって、寄託が３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求 されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオ チドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配 列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載の矛盾す る際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売す るには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与され ない。 本発明はさらに、第１図（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有する、または 寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＧ−タンパク質結 合性受容体ポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメン ト、アナログおよび誘導体に関する。 第１図（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコード されるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」と いう用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能もしくは活性 を保持するポリペプチド、すなわち、Ｇ−タンパク質結合性受容体として機能す るか、または、たとえポリペプチドがＧ−タンパク質結合性受容体として機能し なくとも(例えば、可溶性型の受容体)、リガンドまたは受容体を結合する能力を 保持するポリペプチドを意味する。アナログには、プロプロテイン部分を切断す ることにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロ プロテインが含まれる。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成 ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドであってよい。 第１図（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコード されるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、(ｉ)１つまたは それ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型ア ミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コード によりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよ いもの、(ii)１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、また は(iii)成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例え ば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、また は(iv)リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される 配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペ プチドに融合しているもの、または(ｖ)該ポリペプチドのフラグメントが可溶 性、すなわち膜に結合せず、依然として膜結合受容体に対するリガンドに結合し ているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本 明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供される のが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。 「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存在 するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きてい る動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されて いないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じ ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレ オチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチド またはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組 成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。 本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド ）、ならびに、配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の類似性（ 好ましくは少なくとも７０％の同一性）、さらに好ましくは少なくとも９０％の 類似性（さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性）、さらにより好ましくは 少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは９５％の同一性）をもつポリ ペプチド、および一般的に少なくとも３０アミノ酸、さらに好ましくは少なくと も５０アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を含む。 当業界で知られているように、２つのポリペプチド間の「類似性」とは、ひと つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポ リペプチドのアミノ酸配列と比較することによって測定される。 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成によって対 応する全長ポリペプチドを生産するのに用いることができる；したがって、該フ ラグメントは、全長ポリペプチドの製造用中間体として用いることができる。本 発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリペプチドの 合成に用いることができる。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベク ターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術 による製造にも関する。 宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本 発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランス フォームされ、またはトランスフェクトされる)。該ベクターは、例えば、プラ スミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プ ロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＧ−タンパク質 結合性受容体遺伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培養 することができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択され た宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。 本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用 することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発 現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。その ようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４ ０の誘導体;細菌プラスミド;ファージＤＮＡ;バキュロウイルス;酵母プラスミド ;プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター;ワクシニア、ア デノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含ま れる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生 存可能である限り、使用することができる。 適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般 には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部 位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思わ れる。 発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能 に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、 以下のものが挙げられる:ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli lacまた はtrP、ファージラムダＰLプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそ れらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモータ ー。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結 区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。 さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダク ターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラサイ クリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細 胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能な マーカー遺伝子を含むのが好ましい。 上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制 御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、 その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。 適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる:Ｅ.coli、Ｓtreptomyce s 、Ｓalmonella typhimuriumといったような細菌細胞;酵母のような真菌細胞;Ｄ rosophila Ｓ２およびＳpodoptera Ｓf９といったような昆虫細胞;ＣＨＯ、ＣＯ ＳまたはＢowesメラノーマといったような動物細胞；アデノウイルス;植物細胞 等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われ る。 とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含ん でなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向 で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクター を含んでなる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、 該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当 なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている 。以下のベクターを例として挙げる。細菌用:pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９ (Ｑiagen)、pbs、pＤ１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、p bluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ( Ｓtratagene);ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、p ＲＩＴ５(Pharmacia)。真核生物用:pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、p ＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Pharmac ia)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複 製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。 プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝 子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およ びＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、 Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰR、ＰLおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには 、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後 期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン− Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレ ベルの範囲内である。 さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿 主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞 であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物 の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ キストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行う ことができる。(Ｄavis，Ｌ.、Ｄibner,Ｍ.、Ｂattey.Ｌ.、Ｂasic Ｍethods i n Molecular Ｂiology(１９８６))。 宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる 遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、 従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。 成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌 、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発 明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系も また使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ ングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular Ｃloning: Ａ Laborator y Ｍanual,第２版、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク、(１９８９)により 記 載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エン ハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロ モーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡ のシス作用性要素である。例には、bp１００〜２７０の、複製開始点の後期側に あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサ ー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス エンハンサーが含まれる。 通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォ ーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピシリ ン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転 写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キ ナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱シ ョックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構 造配列は、翻訳開始および終結配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場 合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生 成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合 タンパク質をコードすることができる。 細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構 造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結信号と共に、機能的なプロモーター を有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベク ターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内で の増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよ び複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿 主には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimurium、並びにＰse udomonas属、Ｓtreptomyces属、およびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が 含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。 代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは 、周知のクローニングベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝要素を 含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複 製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２ ２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、スウェーデン)およびＧＥ Ｍ１(Ｐromege Ｂiotec、Ｍadison、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３ ２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わ せる。 適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度 まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフト または化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。 細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により 破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保持する。 タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理 、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊 でき、そのような方法は、当業者に周知である。 組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用 することができる。哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１７５( １９８１)により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、およ び適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７ 、３Ｔ３、ＣＨＯＨＳ２９３、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物 発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またい ずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーお よびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた 含んでなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およ びポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることが できる。 本発明のＧ−タンパク質結合性受容体ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまた はエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、 ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、ア フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー 、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物 から回収して精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、 成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性 能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。 本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物 であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵 母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造するこ とができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、 グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチ ドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。 本発明のＧ−タンパク質結合性受容体は、該受容体ポリペプチドを活性化する 化合物(アゴニスト)および／または活性化を阻害する化合物(アンタゴニスト)に 関してスクリーニングする方法において使用することができる。 一般に、そのようなスクリーニング方法は、その表面上に本発明受容体ポリペ プチドを発現する適当な細胞を与えることを必要とする。このような細胞には、 哺乳類、酵母、drosophilaまたはE.Coliが含まれる。特に、本発明の受容体をコ ードするポリヌクレオチドを使用して、細胞をトランスフェトし、そのことによ って、Ｇ−タンパク質結合性受容体を発現させる。次いで、発現した受容体を試 験化合物に接触させて、結合、機能的応答の刺激または阻害を観察する。 そのようなスクリーニング方法の１つは、本発明のＧ−タンパク質結合性受容 体を発現するためにトランスフェクトされる、メラノフォアの使用を必要とする 。そのような技術は、１９９２年２月６日に公開されたＰＣＴ ＷＯ ９２／０１ ８１０に記載されている。 従って、例えば、そのようなアッセイは、Ｇ−タンパク質結合性受容体をコー ドするメラノフォア細胞を、その受容体リガンドおよびスクリーニングすべき化 合物の両方と接触させることにより、本発明受容体ポリペプチドの活性化を阻害 する化合物に関してスクリーニングするために利用することができる。該リガン ドにより発生される信号の阻害は、化合物が該受容体に対して可能性のあるアン タゴニストであること、すなわち、該受容体の活性化を阻害することを示す。 該スクリーニングは、そのような細胞をスクリーニングすべき化合物と接触さ せることにより、該受容体を活性化する化合物を決定するために、またそのよう な化合物が信号を発生するかどうか、すなわち、該受容体を活性化するかどうか を測定するために利用することができる。 他のスクリーニング技術には、例えば、Ｓcience、第２４６巻、１８１−２９ ６頁(１９８９年１０月)に記載されているような、受容体の活性化により引き起 こされる細胞外のpＨ変化を測定するシステムにおいての、Ｇ−タンパク質結合 性受容体を発現する細胞(例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞)の使用が 含まれる。例えば、該化合物を、本発明の受容体ポリペプチドを発現する細胞と 接触させて、第二メッセンジャー応答、例えば、信号伝達またはpＨ変化を測定 して、該受容体を活性化または阻害する可能性のある化合物が有効であるかどう かを決定することができる。 別のそのようなスクリーニング技術は、Ｇ−タンパク質結合性受容体をコード するＲＮＡを、アフリカツメガエル卵母細胞中に導入して該受容体を一時的に発 現させることを必要とする。受容体を阻害すると考えられる化合物をスクリーニ ングする場合、次いで、その受容体卵母細胞を、その受容体リガンドおよびスク リーニングすべき化合物と接触させ、続いて、カルシウム信号の阻害または活性 化を検出することができる。 別のスクリーニング技術は、Ｇ−タンパク質結合性受容体を発現させることを 必要とし、ここでは、該受容体をホスホリパーゼ ＣまたはＤに結合させる。そ のような細胞の代表例として、内皮細胞、平滑筋細胞、胚腎臓細胞等を挙げるこ とができる。スクリーニングは、該受容体の活性化または該受容体の活性化の阻 害をホスホリパーゼ第二信号から検出することにより、上記のように成し遂げる ことができる。 別の方法は、標識化リガンドの、その表面上に該受容体を有する細胞への結合 の阻害を測定することにより、本発明受容体ポリペプチドの活性化を阻害する化 合物に関してスクリーニングすることを必要とする。そのような方法は、真核細 胞を、Ｇ−タンパク質結合性受容体をコードするＤＮＡと共にトランスフェクト することから、該細胞がその表面上に該受容体を発現して、標識化型の既知のリ ガンドの存在下、該細胞を可能性のあるアンタゴニストと接触させることを必要 とする。該リガンドは、例えば、放射能により標識化することができる。該受容 体に結合した標識化リガンドの量は、例えば、該受容体の放射能により測定する 。該受容体に結合する標識化リガンドの減少により測定されるように、もし該化 合物が該受容体に結合するならば、標識化リガンドの該受容体への結合が阻害さ れる。 Ｇ−タンパク質結合性受容体は、哺乳動物の宿主に偏在して、多くの病状を含 め、多くの生物学的機能を担う。従って、一方では、Ｇ−タンパク質結合性受容 体を刺激し、また他方では、Ｇ−タンパク質結合性受容体を阻害するすることが できる化合物および薬物を見い出すことが望まれる。 たとえば、Ｇ−タンパク質結合性受容体を活性化する化合物は、喘息、パーキ ンソン病、急性心不全、低血圧症、尿うっ滞、および骨粗鬆症の治療といったよ うな、治療目的にも有用である。 一般に、スクリーニング方法により決定される、Ｇ−タンパク質結合性受容体 の活性化を阻害する化合物は、様々な治療目的に使用することができ、例えば、 高血圧症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、なら びに精神分裂病、繰病性興奮、うつ病、せん妄、痴呆、重度精神遅滞、ハンティ ングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群などの運動障害などの神経およ び精神疾患の治療に用いられる。Ｇ−タンパク質結合性受容体を阻害する化合物 は、内因性食欲不振の軽減および過食症のコントロールにも用いられる。 抗体、または幾つかの場合には、オリゴヌクレオチドは、Ｇ−タンパク質結合 性受容体に結合するが、第二メッセンジャー応答を引き出さないことから、該Ｇ −タンパク質結合性受容体をアンタゴナイズする。抗体には、通例、抗体の抗原 結合部位と関連がある独自の決定基を認識する抗イディオタイプ抗体が含まれる 。可能性のあるアンタゴニスト化合物にはまた、Ｇ−タンパク質結合性受容体の リガンドと密接に関係のあるタンパク質、すなわち、生物学的機能を失ってしま っており、またＧ−タンパク質結合性受容体に結合しても、応答を全く引き出さ ないリガンドのフラグメントも含まれる。 アンチセンス技術を利用して調製されたアンチセンス構築物は、三重らせん形 成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御すること ができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合 に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド 配列の５'コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮ Ａオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与す る遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−Ｌeeら、Ｎucl.Ａc ids Ｒes.、６：３０７３(１９７９)；Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：４５６( １９８８);およびＤervanら、Ｓciece、２５１：１３６０(１９９１)を参照）、 そのことによって、転写およびＧ−タンパク質結合性受容体の産生を妨げる。ア ンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmＲＮＡにハイブリ ダイズして、mＲＮＡ分子のＧ−タンパク質結合性受容体への翻訳をブロックす る(アンチセンス−Ｏkano、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０(１９９１);Ｏligode oxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression、ＣＲＣ Ｐ ress、Ｂoca Ｒaton、ＦＬ(１９８８))。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細 胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発 現させて、Ｇ−タンパク質結合性受容体の産生を阻害することができる。 小さなペプチドまたはペプチド様分子などの、Ｇ−タンパク質結合性受容体に 結合し、リガンドに近づき難くすることから、正常な生物学的活性を妨げる小さ な分子も、本発明の受容体ポリペプチドの活性化を阻害するのに用いることがで きる。 受容体のフラグメントなどの可溶性型のＧ−タンパク質結合性受容体も、リガ ンドに結合して、そのリガンドが、膜に結合したＧ−タンパク質結合性受容体と 相互作用できないようにすることにより、該受容体の活性化を阻害するのに用い ることができる。 本発明はさらに、医薬的に許容しうる担体とともに有効量の上記阻害化合物を 患者に投与して、リガンドがＧ−タンパク質結合性受容体へ結合することを遮断 することにより、または第２シグナルを妨げることにより、Ｇ−タンパク質結合 性受容体の活性化を阻害し、それによって異常な状態を軽減することを特徴とす る、Ｇ−タンパク質結合性受容体活性の過剰に関連した異常な状態の治療方法を 提供する。 本発明は、また、医薬的に許容しうる担体とともに有効量の上記活性化化合物 を患者に投与し、それによって異常な状態を軽減することを特徴とする、Ｇ−タ ンパク質結合性受容体活性の発現不足に関連した異常な状態の治療方法を提供す る。 可溶性体のＧ−タンパク質結合性受容体、およびこのような受容体を活性化ま たは阻害する化合物は、適当な薬学的担体と組み合わせて使用することができる 。そのような組成物は、治療上有効な量の該ポリペプチドまたは化合物、および 薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これ に限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース 、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その 製剤は、投与方法に適合すべきである。 本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１ つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そ のような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を 規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト への投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに 、該医薬組成物は、他の治療化合物と共に使用することができる。 該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経 路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、具体 的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、該 医薬組成物は、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場 合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。 最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０ μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。 該Ｇ−タンパク質結合性受容体ポリペプチド、および活性化または阻害化合物 は、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのインビボに おける発現により、本発明に従って使用することができる。 従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいてポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該 ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。 例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の 使用によって、当業界で既知の方法により、細胞を操作することができる。 同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのインビボにおけ る発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で知ら れているように、細胞をインビボにおいて操作して、ポリペプチドをインビボに おいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレト ロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。その ような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他 の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作する ための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒク ルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用することがで きるアデノウイルスであってもよい。 レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス肉腫ウイルス、モロニ ーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ロウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉 腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウ イルス、アデノウイルス、骨髄増殖肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどのレ トロウイルスから誘導することができるが、これらに限定されるものではない。 ひとつの具体例において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウ ス白血病ウイルスから誘導される。 ベクターには、１種または２種以上のプロモーターが含まれる。適当なプロモ ーターとしては、ミラー（Miller）らのＢiotechniques，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．９ ，９８０〜９９０（１９８９）に記載されているレトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４ ０プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、も しくはその他のプロモーター（たとえば、ヒストン、ｐｏｌＩＩＩおよびβ−ア クチンプロモーターなどの真核細胞性プロモーターといったような細胞性プロモ ーター；ただし、これらに限定されるものではない）が挙げられるが、これらに 限定されるものではない。適当なプロモーターの選択は、本発明の教示から当業 者に明らかであろう。 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適当なプロモーターによって 調節される。適当なプロモーターとしては、アデノウイルスメジャーレイトプロ モーターなどのアデノウイルスプロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ） プロモーターなどのヘテロロガスプロモーター；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモ ーター；ＭＴＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの誘発プロモ ーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモ ーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ プロモーターといったようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター、レトロウ イルスＬＴＲ（前述の修飾レトロウイルスＬＴＲも含む）；β−アクチンプロモ ーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターなどが挙げられるが、これらに限 定されるものではない。該プロモーターは、該ポリペプチドをコードする遺伝子 を調節する活性（native）プロモーターである。 レトロウイルスプラスミドベクターを用いてパッケージング細胞系に形質導入 を行い、プロデューサー細胞系を形成する。トランスフェクトされうるパッケー ジング細胞としては、ミラーのHuman Gene Therapy、Vol.１、５〜１４（１９９ ０）に記載された、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ １９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８ ６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞系が挙げられるが、これらに限定さ れるものではない。ベクターによるパッケージング細胞への形質導入は、当業者 には既知の方法で行うことができる。このような手段としては、電気穿孔、リポ ソームの使用およびＣａＰＯ4沈降が挙げられるが、これらに限定されるもので はない。別法として、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソーム中に封入 するか、または、脂質に結合させて宿主に投与してもよい。 プロデューサー細胞系は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む 感染性レトロウイルスベクター粒子を生産する。次いで、このようなレトロウイ ルスベクター粒子を用いて、インビトロまたはインビボのいずれかにて真核細胞 に形質導入することができる。形質導入された真核細胞は、本発明のポリペプチ ドをコードする核酸配列を発現するであろう。形質導入されうる真核細胞として は、胚幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細胞および気管 支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 本発明は、リガンドがＧ−タンパク質結合性受容体に結合しうるような条件下 で、Ｇ−タンパク質結合性受容体を発現する哺乳動物細胞をリガンドに接触させ 、該受容体に結合するリガンドの存在を検出し、それによって該リガンドがＧ− タンパク質結合性受容体に結合するかどうかを決定することを特徴とする、本発 明のＧ−タンパク質結合性受容体に結合する能力が分かっていないリガンドが、 このような受容体に結合しうるかどうかを決定する方法を提供する。 本発明はさらに、細胞の表面上でヒトＧ−タンパク質結合性受容体と特異的に 相互作用して、これに結合する薬物を同定するために、薬物をスクリーニングす る方法であって、Ｇ−タンパク質結合性受容体をコードする、単離されたＤＮＡ 分子を含んでなる哺乳動物の細胞を、複数の薬物と接触させ、その哺乳動物の細 胞に結合するそれらの薬物を決定し、またそのことによって、本発明のヒトＧ− タンパク質結合性受容体と特異的に相互作用して、これに結合する薬物を同定す ることを含んでなる方法を提供する。次いで、このような薬物を治療的に用いて 、本発明の受容体を活性化するかまたは活性化を阻害する。 本発明はまた、Ｇ−タンパク質結合性受容体をコードするmＲＮＡの存在を検 出することにより、細胞の表面上でのＧ−タンパク質結合性受容体の発現を検出 する方法であって、細胞から全体のmＲＮＡを得て、ハイブリダイズする条件下 、そのようにして得られたmＲＮＡを、ヒトＧ−タンパク質結合性受容体をコー ドする核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブリダイズすることが可 能である、本発明の核酸プローブと接触させて、そのプローブにハイブリダイズ したmＲＮＡの存在を検出し、またそのことによって、Ｇ−タンパク質結合性受 容体の発現を該細胞により検出することを含んでなる方法も提供する。 本発明はまた、本発明の受容体ポリペプチドをコードする核酸配列における変 異の存在に関係がある疾患、または疾患に体する感受率を検出するための診断ア ッセイの一部としての、Ｇ−タンパク質結合性受容体遺伝子の使用にも関する。 そのような疾患、例えば、腫瘍および癌は、細胞のトランスフォーメーションに 関係がある。 ヒトＧ−タンパク質結合性受容体遺伝子において変異が起こっている個体は、 様々な技術により、ＤＮＡレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患 者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得ること ができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用することができ、または分析 前にＰＣＲ(Ｓaikiら、Ｎature、３２４：１６３−１６６(１９８６))を利用す ることにより、酵素的に増幅することができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、 同じ目的に使用することができる。例としては、Ｇ−タンパク質結合性受容体タ ンパク質をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、Ｇ−タンパ ク質結合性受容体変異を同定して分析することができる。例えば、欠失および挿 入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにおける変化により検出す ることができる。点変異は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化Ｇ−タンパク質 結合性受容体のＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化Ｇ−タンパク質結合性受容 体のアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることにより同定することがで きる。完全に対合している配列は、ＲＮアーゼＡ消化により、または融解温度の 相違により、対合していない複式物(duplexes)と区別することができる。 参照遺伝子と「変異体」の間の配列の相違は直接のＤＮＡシークエンシニグ方 法によって明らかになる。さらに、クローニングしたＤＮＡセグメントは特異的 なＤＮＡセグメントを検出するプローブとして使用する。この方法の感度はＰＣ Ｒと組み合わされる場合に非常に増強される。例えば、二本鎖ＰＣＲ産物または 一本鎖鋳型分子とともに使用したシークエンシング法は修飾したＰＣＲ産物によ って産生される。配列決定は放射線標識したヌクレオチドを使用する従来の方法 によって、または蛍光標識タグを有する自動シークエンシング方法によって行わ れる。 ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲル でのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂げる ことができる。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視 覚化することができる。ＤＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジング ラジエントゲルを変性することで区別することができ、ここでは、様々なＤＮＡ フラグメントの移動度が、それらの特異的な融解または部分的な融解温度により 、ゲルにおける様々な位置で遅延される(例えば、Ｍyersら、Ｓcience、２３０ ：１２４２(１９８５)を参照)。 特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護といったようなヌ クレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法により示すことができる(例えば、 Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１(１９８５))。 従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーショ ン、ＲＮアーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用( 例えば、制限酵素断片長多型(ＲＦＬＰ))、およびサザンブロッティングといっ たような方法により成し遂げることができる。 さらに従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、in situ分析により検出することもできる。 本発明はさらに、宿主由来のサンプルにおいてレベルが上昇することがある疾 患の指標であるところの本発明の受容体ポリペプチドの可溶性体のレベルが変化 していることを検出する診断アッセイに関する。可溶性受容体ポリペプチドの検 出に利用することができるアッセイは当業者によく知られており、例えば、ラジ オイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析および好ましく はＥＬＩＳＡアッセイが使用される。 ＥＬＩＳＡアッセイは最初に本発明のポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好 ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらにリポーター抗体をモ ノクローナル抗体に対して調製する。該リポーター抗体に放射能、蛍光または本 実施例においては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素といったような検出可能な薬 剤を結合させる。サンプルを直ちに宿主から取り除いて、サンプル中のタンパク 質と結合する固相支持体、例えばポリスチレンの皿の上でインキュベートする。 ついでウシ血清アルブミンのような非特異的なタンパク質と共にインキュベート することにより、その皿の空いているタンパク質結合部位を全て覆う。つぎに、 モノクローナル抗体を皿においてインキュベートするが、その間に、そのモノク ローナル抗体はポリスチレン皿に結合したの本発明のタンパク質に結合する。結 合しなかったモノクローナル抗体を全てバッファーで洗い流す。西洋ワサビペル オキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に直ちに置くと、リポーター抗体の 、本発明のポリペプチドに結合した任意のモノクローナル抗体への結合が起こる 。ついで結合しなかったリポーター抗体を洗い流す。ついでペルオキシダーゼ基 質を皿に加え、一定時間の発色量を標準曲線に対して比較する場合、患者のサン プルの一定体積中に存在する本発明のタンパク質の量の測定値である。 本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色 体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることがで きる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配 列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置を マークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッ ピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階で ある。 簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp) を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。３'の翻訳さ れていない領域のコンピューター分析を利用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上の エキソンをスパン(span)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程 を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む 体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応する ヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与 えるであろう。 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰 属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて の本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きい ゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成 することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他 のマーキング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソー ティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特 異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ セレクションが含まれる。 cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼ ーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができ る。この技術は、５０または６０塩基という短いcＤＮＡで利用することができ る。この技術の復習には、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：ａ Ｍanual of Ｂa sic Ｔechniques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク(１９８８)を参照。 ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的 位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例え ば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniv ersity Ｗelch Ｍedical Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を 結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する 。 次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノ ム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全 ておいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その 変異は疾患の原因となるものであるらしい。 現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する 染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺 伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析およ び２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。 ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらの アナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに対す る抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまた はモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト 化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成 物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメン トの製造に使用することができる。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチ ドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒ トでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして 得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポ リペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプ チドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような 抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離する ことができる。 モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗 体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Ｋo hlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５６：４９５−４９７)、トリオ ーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmm unology Ｔoday４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥ ＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃoleら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy、Ａlan Ｒ．Ｌiss，Ｉnc.、７７−９６頁において)が含まれ る。 単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４，９４６，７７８ 号) は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し 得る。また、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性ポリペプ チド産物に対するヒト化抗体を発現させることもできる。 本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかし、本発明は、そのよ うな実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にこ とわらない限り、重量単位である。 以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および ／または用語を記載する。 「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／ または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限定 されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可 能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミ ドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。 ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列により作用する制限酵素でＤＮＡを触媒 切断することを示す、本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、 それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように 使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミド またはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築の ためにＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、 ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適 当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間の インキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えること ができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、 所望のフラグメントを単離する。 切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇoeddel，Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒ es.、８：４０５７(１９８０)により記載されている８％ポリアクリルアミドゲ ルを用いて行う。 「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる。一本鎖ポリデオキ シヌクレオチド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す、そのような合 成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存在 下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにラ イゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない フラグメントにライゲートするであろう。 「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル 結合を形成する過程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にことわら ない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ 等モル量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既 知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。 特にことわらない限り、トランスフォーメーションは、Ｇraham，Ｆ.およびＶ an der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、５２：４５６−４５７(１９７３)の方法に記載さ れているようにして行った。 実施例１ Ｇ−タンパク質結合性受容体（ＧＰＲＣ）ポリペプチドの細菌発現および精製 最初に、ＧＰＲＣをコードするＤＮＡ配列(ＡＴＣＣ受託番号第９７１３０号) を、プロセシングしたＧＰＲＣ核酸配列（シグナルペプチド配列を含む）の５' および３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅 する。ＧＰＲＣ核酸配列に対応するさらなるヌクレオチドをそれぞれ５'および ３'末端配列に追加する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列： を有し、ＢamＨＴ制限酵素部位を、続いて、切断されたタンパク質の推定第２ア ミノ酸から始まるＧＰＲＣコーディング配列の１７ヌクレオチドを含む。３'配 列： は、ＡＳＰ７１８部位に対する相補的配列、および続くＧＰＲＣコーディング配 列の１９ヌクレオチドを含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクターpＱＥ− ３１（キアゲン、インク）、チャタワース（Ｃhatsworth）、カリフォルニア)上 の制限酵素部位に一致する。pＱＥ−３１は、抗生物質耐性(Ａmpr)、細菌の複製 開始点（ori）、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーター／オペレーター(Ｐ／Ｏ)、 リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位部位をコードす る。ついでpＱＥ−３１をＢamＨＴおよびＡＳＰ７１８で消化する。増幅した配 列をpＱＥ−３１にライゲーションし、ついでヒスチジンタグおよびＲＢＳをコ ードする配列と共にイン・フレームで挿入する。次いで、そのライゲーション混 合物を使用して、Ｍ１５／rep４（キアゲン、インク）である大腸菌株をサンブ ルックら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コー ルド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８９）に記載された方法によ ってトランスフォームした。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピー を含み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋanr) も与える。トランスフォーマントを、それらが、ＬＢプレートで増殖する能力に より同定しついでアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。所望の 構築物を含むクローンを、Ａmp(１００μg／ml)およびＫan(２５μg／ml)の両方 を補った、ＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養 物を使用して、大きな培養物に１：１００〜１：２５０の割合で播種する。細胞 が、０.４〜０.６の間の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.600)まで増殖させる。次いで、 ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を、最終濃度が １mＭとなるまで加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏ をクリアリングし、遺伝子発現を増加させることにより誘導する。細胞をさらに ３−４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレット をカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl中で可溶化した。清澄後、 この溶液から、６−ヒスチジンタグを含むタンパク質による強固な結合を可能に する条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化 したＧＰＲＣを精製する(ホチュリ（Ｈochuli,Ｅ.）ら、Ｊ．Ｃhromatography ４１１：１７７−１８４（１９８４）)。６モルのグアニジンＨＣl（ｐＨ５.０ ）中、 ＧＰＲＣ（純度９０％）をカラムから溶出し、また再生を目的として３モルのグ アニジンＨＣｌに合わせ、１００mＭのリン酸ナトリウム、１０モルのグルタチ オン（還元された）および２ミリモルのグルタチオン（酸化された）で調節する 。この溶液中で１２時間インキュベートした後、該タンパク質を１０ミリモルの リン酸ナトリウムにて合わせる。 実施例２ ＣＯＳ細胞における組換えＧＰＲＣの発現 プラスミド、ＧＰＲＣ ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０複製開始点、２）アンピ リシン耐性遺伝子、３）大腸菌複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イ ントロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーターを含む、ベクター pcＤＮＡ３／Ａmp(インビトロゲン(Ｉnvitrogen))から得られる。完全なＧＰＲ Ｃの前駆体およびその３'末端にイン・フレームで融合したＨＡタグをコードす るＤＮＡ断片を、そのベクターのポリリンカー領域にクローニングすることから 、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは 、前記のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープ に対応する(ウィルソン（Ｉ.Ｗilson）、ニマン（Ｈ.Ｎiman）、ハイテン（Ｒ. Ｈeighten）、チェレンソン（Ａ.Ｃherenson）、コノリー（Ｍ.Ｃonnolly）、お よびラーナー（Ｒ.Lerner）、１９８４、Ｃell ３７、７６７)。ＨＡタグを我々 の標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタンパク質を、ＨＡエピトー プを認識する抗体で容易に検出することが可能となる。 プラスミド構築方法を以下に記載する： ＧＰＲＣをコードするＡＴＣＣ受託番号第９７１３０号のＤＮＡ配列を、２つ のプライマーを用いてのＰＣＲにより構築する： ５'プライマー配列： はＢamＨＩ部位（太字）、続いて開始コドンから出発するＧＰＲＣのコーディン グ配列の２７ヌクレオチドを含む； ３'配列： は、ＸhoＩ部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、ＨＡタグ、およびＧＰＲ Ｃコーディング配列の最後の２４ヌクレオチド(終止コドンは含まれていない)を 含む。従って、ＰＣＲ産物は、ＨindＩＩＩ部位、ＧＰＲＣコーディング配列、 続いて、イン・フレームで融合したＨＡタグ、そのＨＡタグの隣の翻訳終結コド ン、およびＸhoＩ部位を含む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片およびベクタ ー、pcＤＮＡ３／Ａmpを、ＨindＩＩＩおよびＸhoＩ制限酵素で消化して、ライ ゲーションする。そのライゲーション混合物を大腸菌株ＤＨ５αにトランスフォ ームし、そのトランスフォームされた培養物をアンピシリン培地プレート上に置 いて、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡをトランスフォーマントから 単離して、正しい断片の存在に関してＰＣＲおよび制限分析により試験する。組 換えＧＰＲＣの発現のために、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法により、ＣＯＳ細胞 を発現ベクターでトランスフェクションする。（サンブルック、フリッチ（Ｅ. Ｆritsch）、マニアチス（Ｔ.Ｍaniatis）、モレキュラー・クローニング：ア・ ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、( １９８９)）。ＧＰＲＣＨＡタンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法 により検出する(ハーロゥ（Ｅ.Ｈarlow）、レーン（Ｄ.Ｌane）、アンチボディ ーズ（Ａntibodies）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍanua l）、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、(１９８８))。トランスフ ェクションから２日後、タンパク質を35Ｓ−システインで８時間標識化する。次 いで、細胞培地を集めて、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡバッファー(１５０mＭ Ｎ aＣl、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０.５％ ＤＯＣ 、５０mＭ トリス、pＨ７.５))で溶菌する(ウィルソンら、同上３７：７６７（ １９８４）)。細胞ライゼートおよび培養培地の両方を、ＨＡに特異的なモノク ローナル抗体で沈降させる。沈降したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ ル上で分析する。 実施例２ バキュロウイルス発現システムを用いてのＧＰＲＣのクローニングおよび発現 全長のＧＰＲＣタンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第９７１３０号 を、遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー を利用して増幅する。 その５'プライマーは、配列： を有し、またＢam ＨＩ制限酵素部位(太字)、続いて、真核細胞における翻訳の 開始に有効な信号に似ている１１ヌクレオチド(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１９８７、１９ ６ 、９４７−９５０、Ｋozak,Ｍ.)を含み、またこの直ぐ後は、ＧＰＲ遺伝子の 最初の１８ヌクレオチド(翻訳開始コドン「ＡＴＧ」に下線を引く)である。 その３'プライマーは、配列： を有し、また制限エンドヌクレアーゼＢam ＨＩの切断部位、およびＧＰＲＣ遺 伝子の３'の翻訳されていない配列に対して相補的な１０ヌクレオチドを含む。 増幅された配列を、市販のキット(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、ＬaＪo lla、Ｃa.)を使用して、１％アガロースゲルから単離した。次いで、そのフラグ メントをエンドヌクレアーゼＢam ＨＩで消化し、次いで１％アガロースゲル上 で再度精製した。このフラグメントをＦ２と名付ける。 ベクターpＡ２(pＶＬ９４１ベクターの修飾、以下に論ずる)を、バキュロウイ ルス発現システムを用いてのＧＰＲＣタンパク質の発現に使用する(レビューに は、サマーズ(Ｓummers)，Ｍ.Ｄ.およびスミス(Ｓmith)，Ｇ.Ｅ．１９８７、Ａ manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture proced ures、Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎｏ.１５５ ５を参照)。この発現ベクターは、オートグラファ(Ａutographa)カリフォルニア ポリヘドロシスウイルス(ＡcＭＮＰＶ)の強力なポリヘドリンプロモーター、 続いて、制限エンドヌクレアーゼＢam ＨＩの認識部位を含む。シミアンウイル ス(ＳＶ)４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。組換 えウイルスを容易に選択するため、Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子 を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化信号が続くポリヘドリンプロモーター と同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした(cotransfected)野生型ウイ ルスＤＮＡの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス配列をポリヘ ドリン配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターを、例え ば、pＡc３７３、pＶＬ９４１、ＰＧＲ１およびpＡcＩＭ１を、pＡ２の代わりに 使用することができるであろう(ラッコー(Ｌuckow)，Ｖ.Ａ.およびサマーズ(Ｓu mmers)，Ｍ.Ｄ.、Ｖirology、１７０:３１−３９)。 プラスミドを制限酵素ＡＳＰ７１８およびＢam ＨＩで消化した後、当業界で 既知の方法により、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、 市販のキット（“Ｇeneclean”、ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、La Jolla、ＣＡ）を用 いてＤＮＡを１％アガロースゲルから単離した。このベクターＤＮＡをＶ２と名 付ける。 フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼで ライゲートさせた。次いで、Ｅ.coli ＤＨ５α細胞をトランスフォームして、Ｇ ＰＲＣ遺伝子を有するプラスミド(pＢacＧＰＲＣ)を含む細菌を、酵素Ｂhm ＨＩ を使用して同定した。クローン化されたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定 により確認した。 リポフェクション法(フェルグナー（Ｆelgner）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７(１９８７))を利用して、プラスミドpＢacＧ ＰＲＣ５μgを市販の線形化バキュロウイルス(「ＢaculoＧoldTMバキュロウイル スＤＮＡ」、Ｐharmingen、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共に同時トランスフェ クトした。 ＢaculoＧoldTMウイルスＤＮＡ１μgおよびプラスミドpＢacＧＰＲＣ５μgを 、無血清グレイス(Ｇrace's)培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg 、ＭＤ)５０μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。そ の 後、リポフェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合 して、室温で１５分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合 物を、無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳ f９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴加した。そのプレートを前後に揺 り動かして、新たに加えた溶液を混合した。次いで、そのプレートを２７℃で５ 時間インキュベートした。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレート から除去して、１０％ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加えた。そ のプレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続けた。 ４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳmith(上記)により記載されたように して、プラークアッセイを行った。変法として、「Ｂlue Gaｌ」(Ｌife Ｔechnolo gies Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲルを使用したが、このことによ り、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。(「プラーク アッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者のガイド、および Ｌife Technologies Ｉnc.、Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイルス 学、９−１０頁にも見い出すことができる)。 ４日後、ウイルスの連続希釈物を細胞に加えて、青色に染色されたプラークを エッペンドルフピペットの先端で採取した。次いで、組換えウイルスを含む寒天 を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ管内で再び懸濁させた。その 寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を 、３5mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用した。４日後、これらの 培養皿の上清を収集した後、４℃で保存した。 Ｓf９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳを補ったグレイス培地で増殖させた。 その細胞に、感染多重度(ＭＯＩ)２で組換えバキュロウイルスＶ−ＧＰＲＣを感 染させた。６時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを含ま ないＳＦ９００II培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)に替えた。 ４２時間後、５μＣiの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣiの35Ｓシステイン５μＣ i(Ａmersham)を加えた。その細胞をさらに７２時間インキュベートした後、低張 リン酸緩衝液中で細胞溶解により収穫し、細胞膜を遠心分離により収集して、標 識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚 化した。 実施例４ 遺伝子治療における発現 皮膚生検により被験者から線維芽細胞を得る。得られる組織を組織培養培地に 置き、小片に分ける。組織小片を組織培養フラスコの湿った表面に置く（約１０ 個の小片をそれぞれ別のフラスコ内に置く）。フラスコを逆さまにし、きつく閉 じて室温にて一夜放置する。室温にて２４時間後、フラスコを逆に戻し、組織小 片をフラスコの底に置いたまま新鮮な培養培地（たとえば、Ｈａｍ'ｓＦ１２培 地に１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたもの）を加え る。次いで、これを３７℃にて約１週間インキュベートする。この時点で、新鮮 な培地を加え、続いて数日毎に培地を取り換える。さらなる２週間の培養後、単 層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、より大きなフラスコに塗 り付ける。 モロニーマウス肉腫ウイルスのＬＴＲにてフランキングされているｐＭＶ−７ （カーシュマイヤー（Ｋirschmeier），Ｐ．Ｔ．らのＤＮＡ、７：２１９〜２５ （１９８８））をＥcoＲＩおよびＨindＩＩＩで切断し、続いてウシ腸ホスファ ターゼで処理する。線形ベクターをアガロースゲル上で分画し、ガラスビーズを 用いて精製する。 それぞれ５'および３'末端配列に対応するＰＣＲプライマーを用いて本発明ポ リペプチドのcＤＮＡを増幅する。５'プライマーはＥcoＲＩ部位を含み、３'プ ライマーはＨindＩＩＩ部位を含む。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下に、等量のモ ロニーマウス肉腫ウイルスの線形バックボーンおよび増幅したＥcoＲＩ断片なら びにＨindＩＩＩ断片を一緒に加える。得られる混合物を２つの断片のライゲー ションに適当な条件下に維持する。ライゲーション混合物を用いて細菌ＨＢ１０ １を形質転換し、次いで、正しく挿入されているＧＰＲＣ遺伝子をベクターが含 んでいることを確認するためにカナマイシン含有寒天上に置く。 １０％ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたダル ベッコの調整イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、両栄養性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａ ｍ１２パッケージング細胞を組織培養物中で増殖させて集密的密度にする。次い で、該遺伝子を含むＭＳＶベクターを該培地に加え、パッケージング細胞にベク ターで形質導入する。パッケージング細胞はただちにＧＰＲＣ遺伝子を含む感染 性ウイルス粒子を産生する（パッケージング細胞は今後プロデューサー細胞と称 する）。 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮な培地を加え、続いて、集密的プロ デューサー細胞の１０ｃｍプレートから培地を収穫する。感染性ウイルス粒子を 含む消費された培地をミリポアフィルターで濾過して脱離したプロデューサー細 胞を除去し、次いで、この培地を用いて線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞の 亜集密的プレートから培地を除去し、プロデューサー細胞から得た培地と素早く 交換する。この培地を除去し、新鮮な培地と交換する。もし、ウイルスの力価が 高ければ、すべての線維芽細胞が実質的に感染していることになり、選択の必要 はない。もし、力価が非常に低ければ、neoまたはhisなどの選択可能なマーカー を有するレトロウイルスベクターの使用が必要である。 次いで、それ単独で、あるいはサイトデックス３マイクロキャリアービーズ上 で集密的になるまで増殖させた後に、遺伝的に操作された線維芽細胞を宿主に注 入する。線維芽細胞はただちに該タンパク質産物を産生する。 先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、後 記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法により本発明を行うことができ る。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION               Human G-protein coupled receptor (HETGQ23)   The present invention relates to newly identified polynucleotides, such polynucleotides Polypeptides, such polynucleotides and polypeptides The use of tides, and also the use of such polynucleotides and polypeptides Related to manufacturing. In particular, the polypeptide of the invention is a human 7-transmembrane receptor . The invention also relates to inhibiting the action of such polypeptides.   Many medically important biological processes involve G-proteins and / or Proteins involved in signal transduction pathways, including two messengers, eg, cAMP Is well established (Lefkowitz, Nature, 351: 3). 53-354 (1991)). In the present specification, these proteins are referred to as G-tan. Called proteins involved in pathways involving protein or PPG proteins. these Some examples of proteins for adrenergic and dopamine GPC receptors such as the receptor (Kobilka, BK et al., PNAS, 84: 46-5). 0 (1987); Kobilka, BK, et al., Science, 238: 650-656 (198). 7); Bunzow, JR et al., Nature, 336: 783-787 (1988)), G- The protein itself, an effector protein such as phospholipase C, adeni Cyclase, phosphodiesterase, and actuator (actuato r) Proteins such as protein kinase A and protein kinase C (S imon, MI et al., Science, 252: 802-8 (1991).   For example, in one type of signal transduction, the effect of hormone binding is Activation of adenylate cyclase. Enzyme activation by hormones Depending on the presence of otide GTP, GTP also affects hormone binding. G The protein links the hormone receptor with adenylate cyclase; G-tan Protein exchanges GTP for bound GDP when activated by hormone receptors It was shown to be. The GTP-carrying form is then activated cyclized adenylate. Binds to lyse. Addition of GTP to GDP catalyzed by G-protein itself Hydrolysis returns the G-protein to its basic, inactive form. Therefore, G-tamper Proteins are intermediates that relay the signal from the receptor to the effector, and It plays a dual role as a clock that controls the duration of the signal.   The membrane protein gene superfamily of G-protein coupled receptors comprises 7 It has been characterized as having two putative transmembrane domains. The Dome Indicates transmembrane α-helix connected by extracellular or cytoplasmic loops It is believed that G-protein coupled receptors include hormones, viruses, A wide range of biologically active substances such as growth factors and neuroreceptors Receptors.   G-protein coupled receptors link at least eight dispersed hydrophilic loops. These seven conserved hydrophobic, consisting of about 20-30 amino acids It is characterized as having a wide spread. G-protein of binding receptor The family includes nerves used to treat psychotic and neurological disorders. Includes dopamine receptors that bind to relaxants. Other members of this family Examples of calcitonin, adrenaline, endothelin, cAMP , Adenosine, muscarinic, acetylcholine, serotonin, histamine, thoron Bottle, kinin, follicle stimulating hormone, opsin, endothelial differentiation gene-1 receptor, rhodo Psin, odorants, cytomegalovirus receptors and the like.   Most G-protein coupled receptors stabilize the structure of functional proteins Of the first two extracellular loops that form a disulfide bond Each has one conserved cysteine residue. 7 transmembrane regions 1, name TM2, TM3, TM4, TM5, TM6, and TM7. TM 3 are also involved in signaling.   Phosphorylation and lipidation of cysteine residues (palmitylation or farnesylation) Can affect the signaling of some G-protein coupled receptors. most G-protein coupled receptor may be located in the third cytoplasmic loop and / or Contains a potential phosphorylation site within the boxy end. β-adrenergic receptor For some G-protein coupled receptors, such as the body Phosphorylation by ZeA and / or specific receptor kinases can lead to receptor desensitization. Mediates sex.   For some receptors, the ligand binding site of a G-protein coupled receptor Is the hydrophilicity formed by several G-protein coupled receptor transmembrane domains Is believed to comprise a G-protein coupled Surrounded by the hydrophobic residues of the sex receptor. Each G-protein binding receptor The hydrophilic side of the transmembrane helix points inward to form a polar ligand binding site It is assumed that TM3 has a TM3 aspartic acid residue. , Some G-protein binding receptors as having a ligand binding site Has to do with. In addition, TM5 serine, TM6 asparagine, and TM6 Or TM7 phenylalanine or tyrosine is also involved in ligand binding .   G-protein-coupled receptors can be modified by heterotrimeric G-proteins. It can bind intracellularly to various intracellular enzymes, ion channels, and transporters. (See Johnson et al., Endoc., Revised, 10: 317-331 (1989)). ). Α-subunits of various G-proteins preferential effectors Stimulate various biological functions in cells. G-protein binding Phosphorylation of cytoplasmic residues of the avid receptor is associated with several G-protein coupled receptors. It has been identified as an important mechanism for the regulation of G-protein binding. G-tan Protein binding receptors are found at many sites within a mammalian host.   According to one aspect of the present invention, there is provided a novel polypeptide as well as a biologically active, Fragments and derivatives thereof are provided that are diagnostically or therapeutically useful. The present invention Are of human origin.   According to another aspect of the present invention, including mRNA, DNA, cDNA, genomic DNA, An isolated nucleic acid molecule encoding a polypeptide of the present invention, or even an isolated nucleic acid molecule thereof. Antisense analogs, as well as biologically active, diagnostically or therapeutically To provide the fragment.   According to a further aspect of the invention, such polypeptides are produced by recombinant technology. The expression of the protein, and the subsequent Under conditions that promote recovery, the nucleic acid sequence of the human G-protein A method comprising culturing a recombinant prokaryotic and / or eukaryotic host cell comprising provide.   In accordance with yet a further aspect of the present invention, there are provided antibodies against such polypeptides. Offer.   According to another aspect of the invention, the polypeptide binds to a receptor polypeptide of the invention and is Screen for compounds that activate or inhibit peptide activation Provide a way.   According to yet another aspect of the present invention, there is provided a method for inhibiting the expression of a G-protein coupled receptor. To stimulate the receptor polypeptides of the invention for the treatment of related conditions, There is provided a method of using an activating compound such as   According to another aspect of the present invention, there is provided a method which is associated with overexpression of a G-protein coupled receptor. To inhibit the effects of the polypeptides of the present invention for treating Methods for using such inhibitory compounds are provided.   According to yet another aspect of the present invention, the G-protein coupled receptor of the present invention comprises Fragments having homologous amino acid substitutions of both transmembrane domains, Non-naturally occurring, synthetic that is a consensus fragment and / or sequence Isolated and / or recombinant G-protein coupled receptor polypeptides Provide a G-protein coupled receptor ligand. Or it can bind G-protein coupled receptor ligand binding It can also be varied quantitatively or qualitatively.   According to yet another aspect of the present invention, depending on their expected biological properties, By binding to a ligand or altering ligand binding, Useful as potential modulators of G-protein coupled receptor function G-protein coupled receptor synthesis or recombinant G-protein coupled receptor Receptor polypeptides, homologous substituted derivatives thereof, antibodies, anti-idiotypic antibodies, groups The present invention provides compositions and methods, which have diagnostic, therapeutic and / or research applications. Can be used for   According to another object of the present invention, various G-protein coupled receptors or their Synthetic, isolated or intended to inhibit or mimic Alternatively, the recombinant polypeptide is provided as a receptor type and subtype.   According to yet another aspect of the present invention, a nucleic acid sequence of the present invention is specifically hybridized. Also provided is a diagnostic probe comprising a nucleic acid molecule of sufficient length to soy.   According to yet another object of the present invention, a mutated G-protein binding receptor nucleic acid sequence Diagnostic assays to detect susceptibility to, or disease associated with, provide.   These and other aspects of the invention will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein. Or maybe.   The following drawings illustrate aspects of the invention and are encompassed by the following claims. It is not intended to limit the scope of the invention.   FIG. 1 shows the cDNA sequence of the G-protein coupled receptor of the present invention and the corresponding cDNA sequence. 1 shows the predicted amino acid sequence. Use standard single letter abbreviations for amino acids. Sequencing was performed using a 373 automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc. ).   FIG. 2 shows the polypeptide of the present invention (upper panel) and human endothelial differentiation protein (edg- 1) Amino acid homology with gene mRNA (lower).   FIG. 3 shows the secondary structural features of the G-protein coupled receptor. First seven steps Ami, such as α-helix, β-sheet, turn region or coil region 2 shows the region of the no acid sequence. The box area is an area corresponding to the above area . In the figure, the second set is intracellular, in contact with the cytoplasm or through the membrane. Shows the area of the amino acid sequence of the area where In the part showing hydrophilicity, the grease of the membrane Areas of the protein sequence that are present in the quality 2 layer and are therefore hydrophobic, and Areas of protein sequences that are hydrophilic and are outside the lipid bilayer membrane. Antigen area Is an area outside the lipid bilayer membrane and capable of binding to the antigen. The dex corresponds to the hydrophilicity plot. In addition, surface probability plots Check And hydrophilicity plots. Amphipathic plots are polar and non-polar 13 shows a region of 13 sequences. In the flexible area, the flexible area is the extra-membrane area In the sense that the inflexible region is a transmembrane region. Corresponding to the set.   According to one aspect of the present invention, a composition having the deduced amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Mature polypeptide, or ATCC Deposit No. 97130 on April 28, 1995 The mature polypeptide encoded by the cDNA of the clone deposited as An encoded, isolated nucleic acid (polynucleotide) is provided.   The polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention may be derived from human endothelial tumor tissue. Isolated from the original cDNA. It is structurally a G-protein coupled receptor family. Related to the family. It encodes a protein of 364 amino acid residues Open reading frame. The protein is human EDG-1 36% identity and 61% similarity over 364 amino acids length to protein Similarity indicates the highest degree of homology. Receptor polynucleotide of the present invention Potential ligands for are anandamine, serotonin, adrenaline and Luadrenaline, platelet activating factor, thrombin, C5a and bradykinin, Including but not limited to chemokines and platelet activating factors Not something.   The polynucleotide of the invention may be in the form of RNA or in the form of DNA. DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. The DN A can be double-stranded or single-stranded, and if single-stranded, can be the coding strand or non-stranded. It can be the coding (anti-sense) strand. Coding sequence encoding the mature polypeptide The columns are the coding sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or the code of the deposited clone. Sequence, or as a result of duplication or degeneracy of the genetic code The same mature polypeptide as the DNA of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or the deposited cDNA It may be a different coding sequence encoding the tide.   The mature polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or the deposited cDNA Polynucleotides encoding mature polypeptides to be loaded include: May be included: coding sequence for mature polypeptide only; coding sequence for mature polypeptide Sequence (and optionally additional coding sequences), and the coding sequence of the mature polypeptide Non-coding, such as introns or non-coding sequences 5 'and / or 3' Array.   Thus, the term "polynucleotide encoding a polypeptide" Polynucleotides containing only the coding sequence for the peptide, and also additional And / or polynucleotides containing non-coding sequences.   The present invention further relates to a polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Of the polypeptide encoded by the peptide or the cDNA of the deposited clone Of the above polynucleotides encoding fragments, analogs and derivatives For mutants. Polynucleotide variants are naturally occurring variants of a polynucleotide. Allelic variants or non-naturally occurring variants of the polynucleotide You.   Therefore, the present invention provides the same mature polypeptide as shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Or the same mature polypeptide encoded by the cDNA of the deposited clone Polynucleotides, and also the polynucleotides of such polynucleotides. Variants are included, these variants being the polypeptides of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or Is a fragment of the polypeptide encoded by the cDNA of the deposited clone. , Derivatives or analogs. Such nucleotide variants include: It includes deletion mutants, substitution mutants, and addition and insertion mutants.   As indicated above, the polynucleotide was coded as shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). Naturally occurring allelic variant of the coding sequence or the coding sequence of the deposited clone. It may have a coding sequence that is a naturally occurring allelic variant. Known in the industry As such, allelic variants can have one or more nucleotide substitutions, deletions, or deletions. Or another form of polynucleotide sequence, which may have an addition, Does not substantially alter the function of the polypeptide.   Polynucleotides also include the transmembrane domain of a full-length polypeptide of the invention. The present invention, which is an extracellular portion of a polypeptide of the present invention cleaved from an intracellular domain, Encodes a soluble form of the light receptor polypeptide.   The polynucleotide of the present invention also allows for purification of the polypeptide of the present invention. It may also have the coding sequence fused in frame to the marker sequence. In the case of a bacterial host, Marker sequence to provide for purification of the mature polypeptide fused to the marker The hexa-histidine tag provided by the pQE-9 vector Well, or when using, for example, a mammalian host, eg, COS-7 cells Alternatively, the marker sequence may be a hemagglutinin (HA) tag. HA tag Corresponding to an epitope obtained from the influenza hemagglutinin protein ( Wilson, I .; Et al., Cell, 37: 767 (1984)).   The term "gene" is intended for DNA segments involved in the production of polypeptide chains Areas before and after the coding area (leaders and trailers) , As well as sequences between individual coding segments (exons) (introns ) Is also included.   Fragments of full length polynucleotide sequences of the invention can be cloned into cDNA libraries The other gene was used as a hybridization probe for These genes have high sequence similarity or similar organisms to the polynucleotide sequences of the present invention. Has biological activity. This type of probe has at least 20 or 30 bases. Preferably, it may have 50 bases or more. The probe is In addition, cDNA clones corresponding to full-length transcripts, as well as regulatory regions and promoters Containing the complete gene of the invention, including the promoter region, exons and introns Alternatively, it may be used to identify multiple genomic clones. Screening example Use known DNA sequences to synthesize oligonucleotide probes. And isolating the coding region of the gene. Complementary to the sequence of the gene of the present invention Labeled oligonucleotides with unique sequences are available at any member of the library. To determine whether the probe hybridizes to the bar, a human cDNA, It is used to screen libraries of DNA or mRNA.   The present invention further provides that at least 70%, preferably at least 90%, More preferably, if there is at least 95% identity, a hybrid It relates to a polynucleotide to be rediscovered. The invention is particularly applicable to stringent conditions. The following relates to a polynucleotide that hybridizes to the above-mentioned polynucleotide. As used herein, the term "stringent conditions" refers to the Only if there is at least 95% and preferably at least 97% identity , Meaning that hybridization will occur. In a preferred embodiment The polynucleotide that hybridizes to the above-described polynucleotide is shown in FIG. Mature polyprotein encoded by the cDNA of SEQ ID NO: 1) or the deposited cDNA A polypeptide that retains substantially the same biological function or activity as the peptide To load.   In other words, it hybridizes to the polynucleotide of the present invention, and Said polynucleotide, which may or may not retain activity, has at least 2 0 bases, preferably at least 30 bases, more preferably at least 50 bases Having. For example, such a polynucleotide may be, for example, a polynucleotide of SEQ ID NO: 1. As a probe to the polynucleotide for recovery of the oligonucleotide, or It can be used as a diagnostic probe or as a PCR primer.   Accordingly, the present invention relates to a polynucleotide encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2. At least 70%, preferably at least 90%, more preferably Or at least 95% identity, and at least 2 A fragment thereof having 0 or 30 bases, preferably at least 50 bases And polypeptides encoded by such polynucleotides. I do.   The deposit referred to herein relates to the international recognition of the deposit of microorganisms in patent proceedings. Will be kept under the terms of the Plague Treaty. These deposits are simply It is provided as a convenience and is deposited with 35 USC. Required under §112 Does not acknowledge that Polynucleotides contained in the deposited material The sequence of the peptide, and also the amino acid sequence of the polypeptide encoded thereby. The columns form part of the present specification and are inconsistent with the description of any of the sequences herein. Whenever we check, we check. Manufacture, use, or sell the deposited material License may be required, and such a license is granted here. Absent.   The invention further has the deduced amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), or G-protein having an amino acid sequence encoded by the deposited cDNA Binding receptor polypeptides, and also fragments of such polypeptides. , Analogs and derivatives.   Encoded by the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or the deposited cDNA Are referred to as "fragments," "derivatives," and "analogs." The term refers to a biological function or activity that is substantially the same as such a polypeptide. That function as a G-protein coupled receptor Or even if the polypeptide functions as a G-protein coupled receptor At least (e.g., soluble form of the receptor), the ability to bind a ligand or receptor A polypeptide that is retained. For analogs, cleave the protein portion Can be activated to produce an active mature polypeptide. Contains protein.   The polypeptide of the present invention may be a recombinant polypeptide, a natural polypeptide or a synthetic polypeptide. It may be a polypeptide, preferably a recombinant polypeptide.   Encoded by the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or the deposited cDNA The fragment, derivative or analog of the polypeptide to be produced comprises (i) one or More amino acid residues are homologous or non-homologous amino acid residues (preferably, Amino acid residue), and such a substituted amino acid residue May or may not be coded by (Ii) one or more amino acid residues having a substituent, (Iii) compounds wherein the mature polypeptide increases the half-life of the polypeptide (e.g., Such as polyethylene glycol) fused with other compounds, or Is used for (iv) leader or secretory sequence, or purification of the mature polypeptide Additional amino acids, such as sequences or protein sequences, Those fused to the peptide or (v) soluble fragments of the polypeptide That is, it does not bind to the membrane and still binds to the ligand for the membrane-bound receptor Can be Such fragments, derivatives and analogs are It is believed to be within the purview of those skilled in the art from the teachings herein.   The polypeptides and polynucleotides of the invention are provided in an isolated form Preferably, it is purified to homogeneity.   The term `` isolated '' refers to the substance that is in its original environment (e.g., If it does, it means that it has been removed from its natural environment. For example, alive A naturally occurring polynucleotide or polypeptide in an animal is isolated Not the same but isolated from some or all of the coexisting substances in the natural system The polynucleotide or polypeptide has been isolated. Such a polynucleus Otides can be part of a vector and / or such polynucleotides Alternatively, the polypeptide can be part of the composition and such a vector or The product is still isolated in that it is not part of its natural environment.   The polypeptide of the present invention is a polypeptide of SEQ ID NO: 2 (particularly a mature polypeptide). ) And at least 70% similarity to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 ( Preferably at least 70% identity), more preferably at least 90% Similarity (even more preferably at least 90% identity), even more preferably Poly with at least 95% similarity (even more preferably 95% identity) Peptides, and generally at least 30 amino acids, more preferably at least Also include portions of such polypeptides that include 50 amino acids.   As is known in the art, the "similarity" between two polypeptides is the human The amino acid sequences of the two polypeptides and their conserved amino acid substitutions are It is determined by comparing with the amino acid sequence of the polypeptide.   Fragments or portions of the polypeptides of the present invention can be bound by peptide synthesis. Can be used to produce the corresponding full-length polypeptide; Fragments can be used as intermediates for the production of full-length polypeptides. Book A fragment or portion of a polypeptide of the invention is a fragment of the full length polypeptide of the invention. Can be used for synthesis.   The present invention also relates to a vector containing the polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention. Genetically engineered host cells and recombinant techniques for polypeptides of the invention It also relates to manufacturing by.   The host cell may be, for example, a cloning vector or an expression vector. Genetically engineered (transduced or transduced) with the vectors of the invention Formed or transfected). The vector is, for example, a plasmid. It can be in the form of a sumid, virus particle, phage, and the like. The engineered host cells Activating a promoter, selecting a transformant, or a G-protein Cultured in a conventional nutrient medium modified to amplify the binding receptor gene can do. Culture conditions such as temperature, pH, etc. are selected for expression. The culture conditions previously used with the host cells used will be apparent to those skilled in the art.   The polynucleotides of the present invention can be used to produce peptides by recombinant techniques. can do. Thus, for example, the polynucleotide can be expressed as a polypeptide. The expression vector can be included in any one of a variety of expression vectors. That Such vectors include chromosomal, non-chromosomal and synthetic DNA sequences, eg, SV4 0 derivative; bacterial plasmid; phage DNA; baculovirus; yeast plasmid A vector obtained from a combination of plasmid and phage DNA; vaccinia, a Contains viral DNA such as denovirus, fowlpox virus, and pseudorabies It is. However, any other vector must be capable of replicating in the host and It can be used as long as it is viable.   The appropriate DNA sequence can be inserted into the vector by various methods. General The DNA sequence may be converted to a suitable restriction endonuclease moiety by methods known in the art. Insert in place. Such and other methods are deemed to be within the purview of those skilled in the art. It is.   The DNA sequence of the expression vector can be operated with an appropriate expression control sequence (promoter) To cause mRNA synthesis. As a representative example of such a promoter, These include: LTR or SV40 promoter,E.coli lacAlso IstrP, Phage lambda PLPromoters and prokaryotic or eukaryotic cells or Other promoters known to control gene expression in these viruses - Expression vectors also provide a ribosome binding site for translation initiation and transcription termination. We include ward. The vector may also include appropriate sequences for amplifying expression.   In addition, the expression vector may be a dihydrofolate reductor for eukaryotic cell culture. Such as resistance to tase or neomycin, orE.coliThen Tetra Rhino Transformed host cells, such as culin or ampicillin resistance One or more selectable to provide a phenotypic trait for cell selection It preferably contains a marker gene.   Suitable DNA sequences as described above, and also suitable promoters or Using the vector containing the control sequence to transform a suitable host, It can allow the host to express the protein.   Representative examples of suitable hosts include the following:E.coli,Streptomyce s ,Salmonella typhimuriumBacterial cells such as; fungal cells such as yeast;D rosophila  S2andSpodoptera Sf9Insect cells such as; CHO, CO Animal cells such as S or Bowes melanoma; adenovirus; plant cells etc. Selection of an appropriate host is deemed to be within the skill of the art in light of the teachings herein. You.   In particular, the present invention also includes one or more of the sequences broadly described above. Also included are recombinant constructs consisting of The construct may have the sequence of the invention forward or reverse. A vector, such as a plasmid or viral vector, inserted at Comprising. In a preferred aspect of this embodiment, the construct further comprises, for example, It comprises control sequences, including a promoter operably linked to the sequence. suitable Many different vectors and promoters are known to those of skill in the art and are commercially available . The following vectors are given as examples. For bacteria: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, p bluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A ( Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, p RIT5 (Pharmacia). For eukaryotes: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, p XT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmac ia). However, any other plasmid or vector will not It can be used as long as it is manufacturable and viable.   The promoter region is a CAT (chloramphenicol transferase) vector. Using any vector with a vector or a selection marker, You can choose from children. Two suitable vectors are PKK232-8 and And PCM7. Individually named bacterial promoters include lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PLAnd trp. Eukaryotic promoters , CMV immediate early, HSV thymidine kinase, early and later SV40, LTR from retrovirus, and mouse metallothionein- I. Selection of appropriate vectors and promoters is well within the skill of the artisan. Within the range of the bell.   In a further aspect, the present invention relates to a host cell comprising the above-described construct. The inn Primary cells are higher eukaryotic cells such as mammalian cells, lower eukaryotic cells such as yeast cells Or the host cell can be a prokaryotic cell, such as a bacterial cell. Building Transfection of host cells with calcium phosphate transfection, DEAE-de By kisstran-mediated transfection or electroporation be able to. (Davis, L., Dibner, M., Battey. L., Basic Methods i. n Molecular Biology (1986)).   Encoded by the recombinant sequence using the construct in the host cell in the usual manner Gene products can be produced. Alternatively, the polypeptide of the invention may be It can be produced synthetically by a conventional peptide synthesizer.   Mature proteins can be obtained from mammalian cells, yeast, or bacteria under the control of appropriate promoters. , Or in other cells. Such proteins A cell-free translation system is also required for production using RNA obtained from the light DNA construct. Also can be used. Cloni suitable for use in prokaryotic and eukaryotic hosts And expression vectors are described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborator. y Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, New York, (1989) Record And this disclosure forms a part of the present specification.   Transcription of a DNA encoding a polypeptide of the present invention by higher eukaryotes may be It is increased by inserting a Hanser sequence into the vector. Enhancers are professional DNA, usually about 10 to 300 bp, that acts on the motor to increase its transcription Is a cis-acting element. For example, bp 100 to 270 on the late side of the replication origin Certain SV40 enhancers, cytomegalovirus early promoter enhancers , A polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus Enhancer included.   Typically, recombinant expression vectors contain an origin of replication, and a host cell Selectable markers that allow for animation, such asE.coliThe Ampicily Resistance gene andS. cerevisiae Inversion of TRP1 gene and downstream structural sequence Includes promoters derived from highly expressed genes to drive transcription Will be. Such promoters are, inter alia, 3-phosphoglycerate Glycolytic enzymes such as PGK, α-factor, acid phosphatase, It can be obtained from an operon that encodes a protein. Heterologous structure The construction sequence, together with the translation initiation and termination sequences, is assembled in an appropriate phase. Place Optionally, the heterologous sequence has a desired property, such as an expressed recombinant protein. Fusions involving N-terminally identified peptides that provide product stabilization or simplified purification Can encode a protein.   Expression vectors useful for use in bacteria include those encoding the desired protein. The functional DNA sequence is combined with the appropriate translation initiation and termination signals, along with a functional promoter. Constructed by insertion into an operable leading phase having That baek To maintain the vector and, if desired, within the host. One or more phenotypic selectable markers and And an origin of replication. Nuclear inn suitable for transformation Primarily,E.coli,Bacillus subtilis,Salmonella typhimurium, And Pse Various species within the genus udomonas, Streptomyces, and Staphylococcus Although included, others can also be used as selection agents.   As a representative, but non-limiting example, vectors useful for use in bacteria are Genetic elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC37017) Selectable markers and bacterial clones derived from commercially available plasmids A manufacturing start point. Such commercially available vectors include, for example, pKK2 23-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and GE M1 (Promege Biotec, Madison, Wis., USA). These pBR3 Combining 22 "bone nuclei" with an appropriate promoter and the structural sequence to be expressed Let   Transform an appropriate host strain and set the host strain at the appropriate cell density. After growth, the selected promoter is replaced by an appropriate method (e.g., temperature shift). Or chemical induction) and the cells are cultured for an additional period.   Cells are generally harvested by centrifugation and by physical or chemical methods Break down and retain the resulting crude extract for further purification.   Microbial cells used for protein expression may be subjected to freeze-thaw cycles, sonication Destroyed by any conventional method, including mechanical disruption or use of cell lysing agents Yes, such methods are well known to those skilled in the art.   Various mammalian cell culture systems are also used to express recombinant proteins can do. Examples of mammalian expression systems include Gluzman, Cell, 23: 175 ( 1981), the COS-7 line of monkey kidney fibroblasts, and And other cell lines capable of expressing compatible vectors, such as C127 , 3T3, CHOHS293, HeLa and BHK cell lines. Mammal Expression vectors contain an origin of replication, a suitable promoter and enhancer, or Required ribosome binding sites, polyadenylation sites, splice donors And the acceptor site, transcription termination sequence, and the 5 'non-transcribed sequence Would comprise. DNA sequences obtained from SV40 splicing, and And polyadenylation sites to provide the required non-transcribed genetic elements it can.   The G-protein coupled receptor polypeptide of the present invention may comprise ammonium sulfate or Is ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, Phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, Affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography , And recombinant cell culture by methods including lectin chromatography And can be purified. If necessary, the protein regeneration step It can be used to complete the configuration of the mature protein. Finally, high sex Active liquid chromatography (HPLC) can be used for the final purification step.   The polypeptide of the present invention may be a naturally purified product or a product of a chemical synthesis method. Or from prokaryotic or eukaryotic hosts (e.g., bacteria, (By mother, higher plant, insect and mammalian cells) Can be. Depending on the host used in the recombinant production method, the polypeptide of the present invention, Can be glycosylated or not glycosylated. Polypeptide of the invention Can also include the first methionine amino acid residue.   The G-protein coupled receptor of the present invention activates the receptor polypeptide Compounds (agonists) and / or compounds that inhibit activation (antagonists) Can be used in methods of screening for   Generally, such screening methods involve the use of a receptor polypeptide of the invention on their surface. It requires providing appropriate cells that express the peptide. In such cells, Includes mammals, yeast, drosophila or E. Coli. In particular, the receptor of the present invention The cells using the polynucleotide to be transferred, thereby Thus, a G-protein-coupled receptor is expressed. Next, the expressed receptor was tested. Upon contact with the test compound, binding, stimulation or inhibition of a functional response is observed.   One such screening method is the G-protein coupled receptor of the present invention. Requires the use of a melanophore, which is transfected to express the body . Such a technique is described in PCT WO 92/01 published February 6, 1992. 810.   Thus, for example, such an assay would encode a G-protein coupled receptor. Melanophore cells to be screened for their receptor ligands and screening Contact with both compounds inhibits activation of the receptor polypeptide of the present invention Can be used to screen for compounds that do. The ligans Inhibition of the signal generated by the compound indicates that the compound has a potential effect on the receptor. It indicates that it is a agonist, that is, it inhibits activation of the receptor.   The screening involves contacting such cells with the compound to be screened. To determine a compound that activates the receptor, and Whether a compound generates a signal, that is, activates the receptor Can be used to measure the   Other screening techniques include, for example, Science, 246, 181-29. Triggered by receptor activation, as described on page 6 (October 1989). G-protein binding in a system for measuring extracellular pH changes Use of cells that express the sex receptor (eg, transfected CHO cells) included. For example, combining the compound with a cell expressing the receptor polypeptide of the present invention. Upon contact, measure second messenger response, eg, signal transmission or pH change To determine whether a compound capable of activating or inhibiting the receptor is effective. Can be determined.   Another such screening technique encodes a G-protein coupled receptor. Transducing RNA into Xenopus oocytes to transiently trigger the receptor. Need to be manifested. Screening for compounds that may inhibit the receptor If so, the receptor oocyte is then replaced with its receptor ligand and screen. Contact with the compound to be cleaned, followed by inhibition or activity of the calcium signal Can be detected.   Another screening technique involves expressing a G-protein coupled receptor. Required, where the receptor is bound to phospholipase C or D. So Representative examples of such cells include endothelial cells, smooth muscle cells, embryonic kidney cells and the like. Can be. Screening involves activating the receptor or inhibiting activation of the receptor. Achieved as described above by detecting harm from the phospholipase second signal be able to.   Another method involves binding of the labeled ligand to cells having the receptor on its surface. By measuring the inhibition of the activity, the activation of the receptor polypeptide of the present invention is inhibited. Need to screen for compounds. Such methods are eukaryotic Vesicles are transfected with DNA encoding a G-protein coupled receptor As a result, the cell expresses the receptor on its surface, and a known form of Requires contacting the cells with a potential antagonist in the presence of gand And The ligand can be labeled, for example, by radioactivity. The acceptance The amount of labeled ligand bound to the body is measured, for example, by the radioactivity of the receptor . If the labeling is to occur as measured by a decrease in labeled ligand binding to the receptor, If the compound binds to the receptor, the binding of the labeled ligand to the receptor is inhibited. It is.   G-protein coupled receptors are ubiquitous in mammalian hosts and contain many pathologies. Responsible for many biological functions. Thus, on the one hand, G-protein coupled receptors Stimulates the body and, on the other hand, inhibits G-protein coupled receptors It is desirable to find compounds and drugs that can.   For example, compounds that activate G-protein coupled receptors include asthma, parkin Nsonson's disease, acute heart failure, hypotension, urinary stasis, and treatment of osteoporosis. It is also useful for therapeutic purposes.   G-protein coupled receptors, generally determined by screening methods Compounds that inhibit the activation of can be used for various therapeutic purposes, for example, Hypertension, angina, myocardial infarction, ulcer, asthma, allergy, benign prostatic hyperplasia, Schizophrenia, paralytic excitement, depression, delirium, dementia, severe mental retardation, Khanty Nervous and neurological disorders such as motor disorders such as Ngton's disease or Jill de la Tourette syndrome It is used for the treatment of psychiatric disorders. Compounds that inhibit G-protein coupled receptors Is also used to reduce endogenous anorexia and control bulimia.   The antibody, or in some cases, the oligonucleotide, is a G-protein linked Binds to the sexual receptor but does not elicit a second messenger response. -Antagonize the protein binding receptor. Antibodies typically include the antigen of the antibody. Includes anti-idiotypic antibodies that recognize unique determinants associated with the binding site . Potential antagonist compounds also include G-protein coupled receptors. Proteins that are closely related to the ligand, i.e. And elicits no response when bound to a G-protein coupled receptor. Fragments of the missing ligand are also included.   Antisense constructs prepared using antisense technology have a triple helical form. Controlling gene expression by antisense or antisense DNA or RNA Both methods can be used to bind polynucleotides to DNA or RNA. based on. For example, a polynucleotide encoding a mature polypeptide of the invention. Using the 5 'coding portion of the sequence, an antisense RN of about 10-40 base pairs in length Design the A oligonucleotide. DNA oligonucleotides involved in transcription Designed to be complementary to the gene region (triple helix-Lee et al., Nucl. Ac ids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 ( 1988); and Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)). That prevents transcription and production of G-protein coupled receptors. A Antisense RNA oligonucleotides hybridize to mRNA in vivo. Soy blocks the translation of mRNA molecules into G-protein coupled receptors (Antisense-Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligode oxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRCP ress, Boca Raton, FL (1988)). The oligonucleotides described above are also Delivery of antisense RNA or DNA in vivo. In effect, production of G-protein coupled receptors can be inhibited.   G-protein coupled receptors, such as small peptides or peptide-like molecules It binds and renders it inaccessible to ligands, so small Any molecule can be used to inhibit the activation of the receptor polypeptide of the present invention. Wear.   Soluble forms of G-protein-coupled receptors, such as receptor fragments, are also available from Riga. And binds its ligand to a membrane-bound G-protein coupled receptor. Used to inhibit the activation of the receptor by preventing interaction Can be   The present invention further provides an effective amount of the above inhibitory compound together with a pharmaceutically acceptable carrier. Administers to patients to block ligand binding to G-protein coupled receptors G-protein binding by preventing or blocking the second signal Inhibits the activation of sexual receptors, thereby reducing abnormal conditions A method of treating an abnormal condition associated with an excess of G-protein coupled receptor activity. provide.   The present invention also provides an effective amount of the activating compound described above together with a pharmaceutically acceptable carrier. Administering to a patient, thereby reducing the abnormal condition. Provided is a method for treating an abnormal condition associated with insufficient expression of protein binding receptor activity. You.   Soluble forms of G-protein coupled receptors, and those that activate or activate such receptors Or a compound that inhibits can be used in combination with a suitable pharmaceutical carrier . Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the polypeptide or compound, and And a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Such carriers include But not limited to, saline, buffered saline, dextrose , Water, glycerol, ethanol, and combinations thereof. That The formulation should suit the mode of administration.   The present invention also relates to one or more of the components of the pharmaceutical composition of the present invention, Pharmaceutical packs or kits comprising one or more containers are also provided. So Manufacture, use or sale of pharmaceutical or biological products in connection with containers such as Notifications may be given in the form prescribed by the regulatory authorities, which may Represents the approval of the appropriate department for manufacture, use or sale for administration to a healthcare professional. further The pharmaceutical composition can be used with other therapeutic compounds.   The pharmaceutical composition may be topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal or intradermal. Administration can be by any convenient means, such as by road. The pharmaceutical composition may be Is administered in an amount effective to treat and / or prevent a specific symptom. Generally, The pharmaceutical composition is administered in an amount of at least about 10 μg / kg (body weight), If so, they will be administered in an amount not to exceed about 8 mg / kg (body weight) per day. In most cases, the dosage is about 10 times daily, taking into account the route of administration and the symptoms. It is from μg / kg to about 1 mg / kg (body weight).   G-protein coupled receptor polypeptides and activating or inhibiting compounds In vivo of such polypeptides, often referred to as "gene therapy" Can be used in accordance with the present invention.   Thus, for example, a patient-derived cell can be used to encode a polypeptide ex vivo. After the manipulation with the polynucleotide (DNA or RNA) to be Give to the patient to be treated with the peptide. Such methods are well-known in the art. For example, a retroviral particle containing RNA encoding the polypeptide of the present invention. Through use, cells can be manipulated by methods known in the art.   Similarly, polypeptides can be used in vivo, for example, by methods known in the art. The cells can be manipulated in vivo for different expression. Known in the industry As has been described, cells can be manipulated in vivo to convert polypeptides in vivo. Containing RNA encoding the polypeptide of the present invention for expression in Producer cells for producing rovirus particles can be administered to a patient. That These and other methods for administering the polypeptides of the invention by such methods and others Will be apparent to those skilled in the art from the teachings of the present invention. For example, manipulate cells Expression vehicles for use include those other than retroviruses, for example, a suitable delivery vehicle. Once combined with the cells, they can be used to manipulate cells in vivo. Adenovirus that can be used.   The retroviral plasmid vector is Moloney mouse sarcoma virus, Moroni. -Mouse leukemia virus, spleen necrosis virus, rous sarcoma virus, Harvey meat Tumor virus, avian leukemia virus, gibbon ape leukemia virus, human immunodeficiency virus Such as virus, adenovirus, myeloproliferative sarcoma virus, and breast cancer virus It can be derived from, but is not limited to, a Torovirus. In one embodiment, the retroviral plasmid vector comprises a Moloney mouse. Derived from the leukemia virus.   Vectors include one or more promoters. Suitable Promo For example, Miller et al., Biotechniques, Vol. 7, No. 9 , 980-990 (1989); 0 promoter; and the human cytomegalovirus (CMV) promoter, Or other promoters (eg, histone, polIII and β- Cellular promoters such as eukaryotic promoters such as the Kuching promoter Data, but are not limited thereto). It is not limited. Selection of an appropriate promoter is well within the skill of the art in the teachings of the present invention. Will be obvious to those.   The nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention may be Adjusted. Suitable promoters include adenovirus major late pro Adenovirus promoters such as motors; cytomegalovirus (CMV) Heterologous promoters such as promoters; RS virus (RSV) promoters Promoters such as MTT promoter, metallothionein promoter, etc. Heater promoter; Albumin promoter; ApoAI promoter Promoter; human globulin promoter; herpes simplex virus thymidine kinase Promoters such as viral thymidine kinase promoter, retrovirus Ils LTR (including the aforementioned modified retrovirus LTR); β-actin promoter And the human growth hormone promoter, but are not limited thereto. It is not specified. The promoter is a gene encoding the polypeptide Is a native promoter that regulates   Transduce packaging cell lines with retroviral plasmid vectors To form a producer cell line. A package that can be transfected As zing cells, Miller's Human Gene Therapy, Vol. 1, 5-14 (199) 0), PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T 19-14X, VT-19-17-H2, $ CRE, $ CRIP, GP + E-8 6, including, but not limited to, GP + envAm12 and DAN cell lines. It is not something to be done. Transduction of packaging cells with vectors can be performed by those skilled in the art. Can be performed by a known method. Such means include electroporation, Use ofsomes and CaPOFourBut not limited to sedimentation There is no. Alternatively, retroviral plasmid vector encapsulated in liposomes Alternatively, it may be administered to a host linked to a lipid.   The producer cell line contains a nucleic acid sequence encoding a polypeptide of the invention. Produce infectious retroviral vector particles. Then, such a retro ui Eukaryotic cells either in vitro or in vivo using Lus vector particles Can be transduced. The transduced eukaryotic cells are the polypeptides of the invention. Will express the nucleic acid sequence encoding the code. As eukaryotic cells that can be transduced Includes embryonic stem cells, hepatocytes, fibroblasts, myoblasts, keratinocytes, endothelial cells and trachea Include, but are not limited to, epithelial cells.   The present invention is directed to conditions under which a ligand can bind to a G-protein coupled receptor. Contacting a mammalian cell expressing a G-protein coupled receptor with a ligand Detecting the presence of a ligand that binds to the receptor, thereby allowing the ligand to bind to G- Determining whether to bind to a protein-binding receptor Ligands of unknown ability to bind to light G-protein coupled receptors are A method is provided for determining whether it can bind to such a receptor.   The present invention further provides for specifically binding human G-protein-coupled receptors on the surface of cells. Screen drugs to identify those that interact and bind to it DNA encoding a G-protein coupled receptor A mammalian cell comprising the molecule is contacted with a plurality of drugs and the mammalian cells are contacted. Those drugs that bind to the vesicles, and thereby determine the human G- Identify drugs that specifically interact with and bind to protein-binding receptors Providing a method comprising: Then use such drugs therapeutically Activates or inhibits the receptor of the present invention.   The present invention also detects the presence of mRNA encoding a G-protein coupled receptor. Detect the expression of G-protein coupled receptors on the surface of cells Under conditions in which total mRNA is obtained from cells and hybridized. The thus obtained mRNA is coded for human G-protein binding receptor. Specifically hybridizes with sequences contained within the sequence of the nucleic acid molecule to be Contact with the nucleic acid probe of the present invention, and hybridize to the probe. The presence of the mRNA, and thereby detect G-protein binding Also provided is a method comprising detecting expression of a container by said cell.   The invention also provides for alterations in the nucleic acid sequence encoding the receptor polypeptide of the invention. Diagnostics to detect a disease or susceptibility to a disease It also relates to the use of G-protein coupled receptor genes as part of an assay. Such diseases, for example, tumors and cancers, Have a relationship.   Individuals mutated in the human G-protein coupled receptor gene are: Various techniques can be used to detect at the DNA level. Diagnostic nucleic acids are From human cells, for example, from blood, urine, saliva, tissue biopsy, and autopsy material Can be. Genomic DNA can be used directly for detection or analysis Before using PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986)). By doing so, amplification can be performed enzymatically. RNA or cDNA also Can be used for the same purpose. Examples include G-protein coupled receptor receptors. The G-protein is synthesized using PCR primers complementary to the nucleic acid encoding the protein. The cytosolic binding receptor mutation can be identified and analyzed. For example, deletions and insertions Input is detected by a change in the size of the amplified product relative to the normal genotype. Can be The point mutation is that the amplified DNA is radioactively labeled G-protein. Binding receptor RNA or, alternatively, radiolabeled G-protein binding receptor Can be identified by hybridizing to the body's antisense DNA sequence. Wear. Perfectly matched sequences are obtained by RNase A digestion or by melting temperatures. The differences can be distinguished from unpaired duplexes.   Sequence differences between the reference gene and the “mutant” are directly related to DNA sequencing. Revealed by law. Furthermore, the cloned DNA segment is specific Used as a probe to detect a DNA segment. The sensitivity of this method is PC It is greatly enhanced when combined with R. For example, a double-stranded PCR product or The sequencing method used with the single-stranded template molecule depends on the modified PCR product. Is produced. Sequencing is a conventional method using radiolabeled nucleotides Or by automated sequencing methods with fluorescently labeled tags It is.   Genetic testing based on DNA sequence differences can be performed on gels with or without denaturing agents. Achieved by detecting changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments at room temperature be able to. Small sequence deletions and insertions can be visualized by high-resolution gel electrophoresis. Wake up. The various sequences of the DNA fragment are It can be distinguished by denaturing the radiant gel. The mobility of the fragments depends on their specific or partial melting temperature Are delayed at various positions in the gel (see, eg, Myers et al., Science, 230 : 1242 (1985)).   Sequence changes at specific positions may also affect nucleic acids such as RNase and S1 protection. It can be demonstrated by a creatase protection assay, or a chemical cleavage method (e.g., Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397-4401 (1985)).   Therefore, the detection of a specific DNA sequence is based on the hybridization of genomic DNA. RNase protection, chemical cleavage, direct DNA sequencing, or the use of restriction enzymes ( For example, restriction fragment length polymorphism (RFLP)) and Southern blotting. Such a method can be achieved.   In addition to more traditional gel electrophoresis and DNA sequencing, the mutations also It can also be detected by in situ analysis.   The invention further relates to diseases that may have elevated levels in a sample derived from the host. Altered levels of soluble forms of the receptor polypeptides of the invention, which are indicative of disease Diagnostic assays that detect Detection of soluble receptor polypeptides Assays that can be used for extraction are well known to those of skill in the art and include, for example, Immunoassay, competitive binding assay, western blot analysis and preferably Uses an ELISA assay.   The ELISA assay initially comprises an antibody specific for the antigen of the polypeptide of the invention, preferably an antibody. Preferably, including preparing a monoclonal antibody. Further reporter antibodies Prepare against noclonal antibodies. Radioactivity, fluorescence or book In embodiments, detectable drugs such as horseradish peroxidase enzyme Combine the agents. Immediately remove the sample from the host and remove any proteins in the sample. Incubate on a plate of solid support, eg, polystyrene, that binds to the substance. Then incubate with non-specific proteins such as bovine serum albumin Cover all vacant protein binding sites on the dish. Next, Incubate the monoclonal antibody in the dish while the monoclonal antibody is Lonal antibodies bind to a protein of the invention bound to a polystyrene dish. Conclusion Wash off any unbound monoclonal antibody with buffer. Horseradish pelvis If the reporter antibody bound to oxidase is immediately placed on the dish, the reporter antibody Binding to any monoclonal antibody bound to the polypeptide of the invention occurs . The unbound reporter antibody is then washed away. Then the peroxidase group If the quality is added to the dish and the color development over time is compared against a standard curve, the patient's sample It is a measure of the amount of the protein of the invention present in a certain volume of the pull.   The sequences of the present invention are also valuable for chromosome identification. Individual sequencing of the sequence Specifically targeted to specific locations on the body and allowed to hybridize. Wear. Moreover, there is currently a need to identify specific sites on the chromosome. Actual distribution Chromosome marking reagents based on column data (repeated polymorphisms) currently Hardly available to mark. The mapping of DNA to chromosomes according to the invention Ping is an important first step in relating those sequences to genes associated with the disease. is there.   Briefly, PCR primers derived from cDNA (preferably 15-25 bp) Can be mapped to a chromosome. 3 'translated Using computer analysis of unrecognized regions, one or more of the genomic DNA The rapid selection of primers that do not span the exon Is complicated. These primers then contain the individual human chromosomes Used for PCR screening of somatic cell hybrids. Corresponding to the primer Only those hybrids, including human genes, give amplified fragments I will get it.   PCR mapping of somatic cell hybrids returns specific DNA to specific chromosomes. A quick way to belong. Using the same oligonucleotide primer Utilizing the present invention, sublocalization can be performed on specific chromosomes or large Achieved in a similar manner using a panel of fragments from a pool of genomic clones can do. Others that can be similarly used to map to that chromosome Marking methods include in situ hybridization, labeled flow Pre-screening using chromosomes (flow-sorted) Hybridization to construct a heterologous cDNA library Includes selection.   Fluorescence of cDNA clones to metaphase chromosomal spreads in situ hybridization Chromosome location (FISH) can provide accurate chromosome locations in one step You. This technique can be used with cDNAs as short as 50 or 60 bases. You. For a review of this technique, see Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Ba. See sic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).   Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical Locations can be associated with genetic map data. Such data, for example, For example, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins Univ (available online via ersity Welch Medical Library) It is. Next, the relationship between a gene mapped to the same chromosomal region and a disease is determined. Confirmed by binding analysis (coinheritance of physically adjacent genes) .   Next, the cDNA or genotype between affected and unaffected individuals is determined. It is necessary to determine the differences in the sequence. The mutation is in some or all of the affected individuals If not found in any normal individual, The mutation appears to be the cause of the disease.   Currently, analysis of physical and genetic mapping suggests that CDNAs localized correctly in chromosomal regions represent 50-500 possible causative sources. It could be one of the genes. (This is a 1-megabase mapping analysis and And one gene per 20 kb).   Polypeptides, their fragments or other derivatives, or their Use analogs, or cells expressing them, as immunogens to Antibodies can be produced. These antibodies are, for example, polyclonal or Can be a monoclonal antibody. The invention also includes chimeric, single chain, and human Of Activated Antibodies, and also Fab Fragments, or Fab Expression Libraries Things are also included. Various methods known in the art may be used to identify such antibodies and fragments. Can be used in the manufacture of   Antibodies raised against polypeptides corresponding to the sequences of the present invention are polypeptides The polypeptide directly into the animal, or the polypeptide into the animal, preferably a human. It can be obtained by administering to non-animal animals. Then, like that The resulting antibody will bind to the polypeptide itself. In this way, Even sequences that encode only fragments of the polypeptides can be completely native polypeptides. It can be used to produce antibodies that bind tide. Then such Using antibodies to isolate a polypeptide from a tissue that expresses the polypeptide be able to.   Monoclonal antibodies are prepared using anti-cells produced by continuous cell line culture. All body giving techniques can be used. Examples include hybridoma technology (Ko hler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), trio Trioma technology, human B cell hybridoma technology (Kozbor et al., 1983, Immm unology Today 4:72), and E for producing human monoclonal antibodies. BV-Hybridoma technology (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). You.   Techniques described for the production of single chain antibodies (U.S. Pat. No. 4,946,778) issue) Is suitable for producing single chain antibodies against the immunogenic polypeptide products of the invention. obtain. In addition, using the transgenic mouse, the immunogenic polypep Humanized antibodies to the tide product can also be expressed.   The present invention will be further described with reference to the following examples; It should be understood that the present invention is not limited to such an embodiment. All parts or quantities, especially Unless otherwise indicated, units are by weight.   To facilitate understanding of the following examples, some frequently occurring methods and And / or describe terms.   “Plasmids” are in lower case p preceded and / or followed by capital letters and / or Or it is indicated by a number. The starting plasmids herein are commercially available, limited Publicly available on an unmanaged basis or by publicly available means Can be constructed from functional plasmids. In addition, a plasmid equivalent to the plasmid described The codes are known in the art and will be apparent to those skilled in the art.   "Digestion" of DNA catalyzes DNA with a restriction enzyme that acts on some sequence in the DNA. Various restriction enzymes used herein to indicate cleavage are commercially available, Their reaction conditions, cofactors and other requirements are as known to those skilled in the art. used. For analytical purposes, generally 1 μg of plasmid in about 20 μl of buffer solution Alternatively, a DNA fragment is used with about 2 units of enzyme. Plasmid construction For the purpose of isolating DNA fragments, generally in larger volumes, 5-50 μg of DNA is digested with 20-250 units of enzyme. Suitable for certain restriction enzymes The appropriate buffer and base weight are specified by the manufacturer. About 1 hour at 37 ° C Incubation times are usually used but may vary according to the supplier's instructions Can be. After digestion, the reaction was electrophoresed directly on a polyacrylamide gel, Isolate the desired fragment.   Size separation of the cleaved fragments is described by Goeddel, D et al., Nucleic Acids R. es., 8: 4057 (1980). This is performed using a tool.   "Oligonucleotides" can be chemically synthesized. Single-chain polydeoxy Such a combination, representing a polynucleotide, or two complementary polynucleotide chains. Since the synthetic oligonucleotide does not have a 5 'phosphate, the presence of kinase Below, without adding a phosphate with ATP, it is possible to Will not be igated. Synthetic oligonucleotide is not dephosphorylated Will ligate to the fragment.   "Ligation" refers to the phosphodiester between two double-stranded nucleic acid fragments. It refers to the process of forming a bond (Maniatis, T. et al., Ibid., P. 146). Especially Unless otherwise, ligation is performed on approximately the DNA fragment to be ligated. With 10 units of T4 DNA ligase ("ligase") per 0.5 μg of equimolar amount, This can be accomplished using known buffers and conditions.   Unless otherwise stated, transformations were performed by Graham, F. and V. an der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1973). I went as it was.                                  Example 1 Bacterial expression and purification of G-protein coupled receptor (GPRC) polypeptides   First, a DNA sequence encoding GPRC (ATCC Accession No. 97130) Is the 5 'of the processed GPRC nucleic acid sequence (including the signal peptide sequence). And amplification using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 3 'end I do. Additional nucleotides corresponding to the GPRC nucleic acid sequence were 5 ′ and Add to 3 'end sequence. The 5 'oligonucleotide primer has the sequence: And a BamHT restriction enzyme site followed by a putative secondary Includes 17 nucleotides of GPRC coding sequence starting with amino acid. 3 'arrangement Columns: Is the sequence complementary to the ASP718 site, followed by the GPRC coding sequence. Contains 19 nucleotides in a row. The restriction enzyme site is located in the bacterial expression vector pQE- 31 (Qiagen, Inc.), Chattersworth, CA Of the restriction enzyme site. pQE-31 is resistant to antibiotics (Ampr), Bacterial replication Starting point (ori), IPTG-regulatable promoter / operator (P / O), Encodes ribosome binding site (RBS), 6-His tag and restriction enzyme site You. The pQE-31 is then digested with BamHT and ASP718. Amplified distribution The sequence was ligated to pQE-31 and the histidine tag and RBS were Insert in-frame with the sequence to be loaded. Then, the ligation mix M15 / rep4 (Qiagen, Inc.) using the compoundE. coliSambu shares Look et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Co. Ludo Spring Laboratory Press, (1989) I transformed. M15 / rep4 is a multiple copy of plasmid pREP4 Which express the lacI repressor and also have kanamycin resistance (Kanr) Also give. Transformants to their ability to grow on LB plates More identification and selection of ampicillin / kanamycin resistant colonies. Desired Clones containing the construct were cloned into both Amp (100 μg / ml) and Kan (25 μg / ml). Grown overnight in liquid culture in LB medium supplemented with (O / N). O / N culture The seeds are used to inoculate a large culture at a ratio of 1: 100 to 1: 250. cell Has an optical density of 600 (OD) between 0.4 and 0.6.600). Then IPTG ("isopropyl-BD-thiogalactopyranoside") was added to a final concentration of It was added until it became 1 mM. IPTG inactivates the lacI repressor and reduces P / O Is induced by increasing gene expression. More cells Grow for 3-4 hours. The cells were then collected by centrifugation. Cell pellet Was solubilized in the chaotropic agent 6 mol of guanidine HCl. After refining, This solution allows for strong binding by proteins containing a 6-histidine tag Chromatography on a nickel-chelate column Purified GPRC (Hochuli, E., et al., J. Chromatography) 411: 177-184 (1984)). 6 moles of guanidine HCl (pH 5.0 )During, GPRC (purity 90%) was eluted from the column and 3 moles of GPRC were used for regeneration. 100 mM sodium phosphate, 10 mol glutachi Regulate with on (reduced) and 2 mmol glutathione (oxidized) . After incubation for 12 hours in this solution, the protein was Combine with sodium phosphate.                                 Example 2                   Expression of recombinant GPRC in COS cells   The expression of the plasmid, GPRC HA, is based on 1) the SV40 origin of replication, 2) Lysine resistance gene, 3) E. coli origin of replication, 4) polylinker region, SV40 A vector comprising a CMV promoter followed by an intron and a polyadenylation site Obtained from pcDNA3 / Amp (Invitrogen). Complete GPR Encodes a precursor of C and an HA tag fused in-frame to its 3 'end Cloning the DNA fragment into the polylinker region of the vector , Recombinant protein expression is directed under the CMV promoter. HA tag Epitope obtained from influenza hemagglutinin protein as described above (I. Wilson, H. Niman, Hyten (R. Heighten), Chernson (A. Cherenson), Connolly (M. Connolly) And R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). HA tag for us By fusing the recombinant protein to the HA Can be easily detected with an antibody that recognizes the loop.   The plasmid construction method is described below:   Two of the DNA sequences of ATCC Accession No. 97130 encoding GPRC Constructed by PCR using the following primers: 5 'primer sequence: Is the BamHI site (bold) followed by GPRC coding starting from the start codon The nucleotide sequence of 27 nucleotides; 3 'sequence: Is the sequence complementary to the XhoI site, the translation stop codon, the HA tag, and the GPR Add the last 24 nucleotides of the C coding sequence (not including the stop codon) Including. Thus, the PCR product has a HindIII site, a GPRC coding sequence, Next, the HA tag fused in-frame and the translation termination code next to the HA tag And an XhoI site. DNA fragment and vector amplified by PCR -, PcDNA3 / Amp is digested with HindIII and XhoI restriction enzymes and Gating. The ligation mixture was transformed into E. coli strain DH5α. And place the transformed culture on an ampicillin medium plate. And select resistant colonies. Plasmid DNA from transformants Isolate and test for the presence of the correct fragment by PCR and restriction analysis. set For expression of recombinant GPRC, COS cells were obtained by the DEAE-DEXTRAN method. Is transfected with the expression vector. (Sunbrook, Flitch (E. Fritsch), Maniatis (T. Maniatis), molecular cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, ( 1989)). GPRCHA protein expression by radiolabeling and immunoprecipitation (E. Harlow), Lane (D. Lane), Antibody (Antibodies): A Laboratory Manual (A Laboratory Manua) l), Cold Spring Laboratory Press, (1988)). Troff 2 days after injection35Label with S-cysteine for 8 hours. Next Next, the cell culture medium was collected and the cells were washed with a detergent (RIPA buffer (150 mM N aCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC , 50 mM Tris, pH 7.5)) (Wilson et al., Supra, 37: 767). 1984)). Both cell lysate and culture medium are Precipitate with lonal antibody. The precipitated protein was subjected to 15% SDS-PAGE analysis. Analyze on file.                                 Example 2 Cloning and expression of GPRC using baculovirus expression system   DNA sequence encoding full-length GPRC protein, ATCC No. 97130 With PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of the gene Amplify using.   The 5 'primer has the sequence: And a Bam HI restriction enzyme site (bold), followed by a translational site in eukaryotic cells. 11 nucleotides resembling the signal available for initiation (J. Mol. Biol. 1987,19 6 947-950, Kozak, M.), and immediately after this, the GPR gene First 18 nucleotides (translation initiation codon "ATG" is underlined).   The 3 'primer has the sequence: And a cleavage site for the restriction endonuclease Bam HI, and a GPRC site. Contains 10 nucleotides complementary to the 3 'untranslated sequence of the gene. The amplified sequence was converted to a commercially available kit (“Geneclean”, BIO 101 Inc., LaJo). lla, Ca.) using a 1% agarose gel. Then the flag Is digested with the endonuclease Bam HI and then on a 1% agarose gel. Again. This fragment is named F2.   The vector pA2 (a modification of the pVL941 vector, discussed below) was Used for expression of GPRC proteins using the Lus expression system (for review) Are described in Summers, MD and Smith, GE. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture proced ures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.155 5). This expression vector was obtained from Autographa California. A strong polyhedrin promoter of the polyhedosis virus (AcMNPV), Subsequently, it contains a recognition site for the restriction endonuclease BamHI. Simian Will The (SV) 40 polyadenylation site is used for efficient polyadenylation. Recombination To easily select a virus, a β-galactosidase gene derived from E. coli was used. The polyhedrin promoter followed by the polyhedrin gene polyadenylation signal Insert in the same direction as. Cotransfected wild-type The viral sequence for cell-mediated homologous recombination of the ruth DNA Adjacent to both sides of the drin sequence. Many other baculovirus vectors, for example For example, pAc373, pVL941, PGR1 and pAcIM1 may be substituted for pA2. Could be used (Luckow, VA and Summers (Su). mmers), MD, Virology, 170: 31-39).   After digestion of the plasmid with the restriction enzymes ASP718 and Bam HI, Dephosphorylation using calf intestinal phosphatase by known methods. Then Use a commercially available kit ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, CA) DNA was isolated from a 1% agarose gel. This vector DNA is called V2. wear.   Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 were digested with T4 DNA ligase. Ligated. The E. coli DH5α cells were then transformed and Bacteria containing a plasmid containing the PRC gene (pBacGPRC) were isolated from the enzyme BhmHI. Was used for identification. DNA sequencing of the cloned fragment sequence Confirmed by   Lipofection method (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)). 5 μg of PRC was added to a commercially available linearized baculovirus (“BaculoGold”).TMBaculoyl DNA ", Pharmingen, San Diego, Calif.) Cut.   BaculoGoldTM1 μg of viral DNA and 5 μg of plasmid pBacGPRC , Grace's serum-free medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg) , MD) in a sterile well of a microtiter plate containing 50 μl. So of Thereafter, 10 μl of Lipofectin and 90 μl of Grace's medium were added and mixed. And incubated for 15 minutes at room temperature. Then transfection mixing Were plated on 35 mm tissue culture plates containing 1 ml of serum-free Grace's medium. f9 insect cells (ATCC CRL 1711) were added dropwise. Rock the plate back and forth To mix the newly added solution. The plate is then placed at 27 ° C. for 5 Incubated for hours. After 5 hours, plate the transfection solution And 1 ml of Grace's insect medium supplemented with 10% fetal calf serum was added. So Was returned to the incubator and culturing was continued at 27 ° C. for 4 days.   Four days later, the supernatants were collected and as described by Summers and Smith (supra). Then, a plaque assay was performed. As a variant, "Blue Gal" (Life Technolo gies Inc., Gaithersburg). As a result, plaques stained blue can be easily isolated. ("Plaque A detailed description of Assays also provides a user's guide to insect cell culture, and Baculovirus distributed by Life Technologies Inc., Gaithersburg Science, pages 9-10).   Four days later, serial dilutions of virus were added to the cells and blue-stained plaques were removed. Collected with the tip of an Eppendorf pipette. Then, the agar containing the recombinant virus Was resuspended in an Eppendorf tube containing 200 μl of Grace's medium. That The agar is removed by brief centrifugation and the supernatant containing the recombinant baculovirus is removed. Used to infect Sf9 cells seeded on 35 mm dishes. Four days later, these After collecting the culture dish supernatant, it was stored at 4 ° C.   Sf9 cells were grown in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. The cells were sensitized with recombinant baculovirus V-GPRC at a multiplicity of infection (MOI) of 2. Dyed. Six hours later, the medium is removed and contains methionine and cysteine. The medium was replaced with SF900II medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 hours later, 5 μCi35S-methionine and 5 μCi35S cysteine 5μC i (Amersham) was added. After incubating the cells for an additional 72 hours, Harvest by cell lysis in phosphate buffer, collect cell membrane by centrifugation, The visualized protein is visualized by SDS-PAGE and autoradiography. It has become.                                  Example 4                           Expression in gene therapy   Fibroblasts are obtained from the subject by skin biopsy. Transfer the resulting tissue to a tissue culture medium Place and divide into small pieces. Place a small piece of tissue on the wet surface of a tissue culture flask (approximately 10 Pieces into separate flasks). Turn the flask upside down and close tightly And left overnight at room temperature. After 24 hours at room temperature, the flask was turned back and the tissue Keep the strips at the bottom of the flask and add fresh culture medium (eg, Ham's F12 medium). With 10% FBS, penicillin and streptomycin) You. It is then incubated at 37 ° C. for about one week. At this point, fresh New medium is added, followed by a change of medium every few days. After another two weeks of culture, A layer of fibroblasts appears. Trypsinize monolayer and apply to larger flask Attach.   PMV-7 flanked by Moloney mouse sarcoma virus LTR (Kirschmeier, PT, et al., DNA, 7: 219-25. (1988)) with EcoRI and HindIII followed by bovine intestinal phospha Treat with Tase. Fractionate the linear vector on an agarose gel and remove the glass beads. To purify.   Using the PCR primers corresponding to the 5 'and 3' Amplify the cDNA of the repeptide. The 5 'primer contains an EcoRI site and the 3' primer The primer contains a HindIII site. In the presence of T4 DNA ligase, an equal amount of For the linear backbone of the Ronnie mouse sarcoma virus and the amplified EcoRI fragment And the HindIII fragment is added together. The resulting mixture is ligated with two fragments. Maintain conditions appropriate for the application. Bacterial HB10 using ligation mixture 1 and then the vector contains the correctly inserted GPRC gene. Place on agar containing kanamycin to make sure that   Dal with 10% bovine serum (CS), penicillin and streptomycin Amphoteric pA317 or GP + a in Becco's conditioned Eagle's medium (DMEM) The m12 packaging cells are grown in tissue culture to confluency. Next Then, an MSV vector containing the gene is added to the medium, and the packaging cells are vectored. Transducer. Packaging cells immediately infected with GPRC gene Produces viral particles (packaging cells will be referred to as producer cells in the future) Do).   Fresh media is added to the transduced producer cells, followed by confluent production. Harvest medium from 10 cm plate of Ducer cells. Infectious virus particles Producer cells that were removed by filtering the spent medium containing The vesicles are removed and the medium is then used to infect fibroblasts. Fibroblast Remove the medium from the subconfluent plate and quickly add the medium from the producer cells. Exchange. The medium is removed and replaced with fresh medium. If the virus titer If higher, all fibroblasts are substantially infected and need to be selected There is no. If the titer is very low, selectable markers such as neo or his It is necessary to use a retroviral vector having   Then, alone or on Cytodex 3 microcarrier beads After growing to confluence in the cell, the genetically engineered fibroblasts are injected into the host. Enter. Fibroblasts immediately produce the protein product.   Since many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, Within the scope of the appended claims, the invention may be practiced otherwise than as specifically described. You.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＣＶ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＳ 39/395 ＡＢＮ Ｃ０７Ｋ 14/705 ＡＣＦ 16/28 48/00 ＡＤＳ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 16/28 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｎ 1/21 33/50 Ｔ 5/10 Ｐ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ 33/50 ＡＢＦ ＡＣＶ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リ，イ アメリカ合衆国20878メリーランド州 ゲ イザーズバーグ、ハワード・ランディン グ・ドライブ16125番 (72)発明者 ローゼン，クレイグ・エイ アメリカ合衆国20882メリーランド州 レ イトンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番 (72)発明者 ルーベン，スティーブン・エム アメリカ合衆国20832メリーランド州 オ ルネー、ヘリティッジ・ヒルズ・ドライブ 18528番──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI A61K 38/00 ACV A61K 48/00 ADS 39/395 ABN C07K 14/705 ACF 16/28 48/00 ADS C12N 1/21 C07K 14 / 705 C12P 21/02 C 16/28 G01N 33/15 Z C12N 1/21 33/50 T 5/10 P C12P 21/02 C12N 5/00 B G01N 33/15 A61K 37/02 AAB 33/50 ABF ACV // (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT , LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, M , SD, SZ, UG), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, GE, HU, JP, KE, KG , KP, KR, KZ, LK, LT, LU, LV, MD, MG, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK, TJ, TT, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Li, I 16125 Howard Landing Drive, Gaithersburg, MD, United States 20878 (72) Inventor Rosen, Craig A. Rolling, Raytonsville, MD 20882 United States of America Hill Road 22400 (72) Inventor Leuven, Stephen M. United States 20832 Heritage Hills Drive, Aurnay, Maryland 18528

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第９７１３０号に含まれるＤＮＡによって発現するポ リペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可 能であって、少なくとも７０％が該ポリヌクレオチドと同一であるポリヌクレオ チド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフ ラグメント； よりなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。 ２．配列番号：２の１番アミノ酸から３６４番アミノ酸までの配列を有するポ リペプチドをコードする請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。 ４．請求項３に記載のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞。 ５．該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを請求項４に記載の宿主細胞か ら発現させることを含む、ポリペプチドの製造方法。 ６．細胞を請求項３に記載のベクターで遺伝的に操作することを含む、ポリペ プチドを発現させることが可能な細胞の製造方法。 ７．（ｉ）配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、および該 ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体；および （ii）ＡＴＣＣ受託番号第９７１３０号のcＤＮＡによりコードされるポリペ プチド、および該ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体； よりなる群から選択されるポリペプチド。 ８．該ポリペプチドが配列番号：２の推定アミノ酸配列を有する請求項７に記 載のポリペプチド。 ９．請求項７に記載のポリペプチドに対する抗体。 １０．請求項７に記載のポリペプチドを活性化する化合物。 １１．請求項７に記載のポリペプチドの活性化を阻害する化合物。 １２．受容体を活性化する必要がある患者の治療方法であって、請求項１０に 記載の化合物の治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。 １３．受容体を阻害する必要がある患者の治療方法であって、請求項１１に記 載の化合物の治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。 １４．該化合物がポリペプチドであって、該アゴニストをコードするＤＮＡを 該患者に与えて、該アゴニストをイン・ビボで発現させることによって、該化合 物の治療上有効な量を投与する、請求項１２に記載の方法。 １５．該化合物がポリペプチドであって、該アンタゴニストをコードするＤＮ Ａを該患者に与えて、該アンタゴニストをイン・ビボで発現させることによって 、該化合物の治療上有効な量を投与する、請求項１３に記載の方法。 １６．請求項７に記載のポリペプチドに結合して活性化する化合物の同定方法 であって、 請求項７に記載のポリペプチドに化合物を結合させるに十分な条件下で、細胞 表面上に該ポリペプチドを発現している細胞に該化合物を接触させ、該ポリペプ チドに化合物が結合することに応答する、検出可能なシグナルを提供しうる第２ 成分と混合し；次いで 該第２成分によって生成されるシグナルを検出することにより、該ポリペプチ ドに結合しうる化合物を同定することを特徴とする方法。 １７．請求項７に記載のポリペプチドに結合して活性化を阻害する化合物の同 定方法であって、 請求項７に記載のポリペプチドに結合させるに十分な条件下で、該受容体ポリ ペプチドに結合することがわかっている分析的に検出可能なリガンドを、細胞表 面上に該ポリペプチドを発現している宿主細胞と接触させ、該ポリペプチドに化 合物が結合することに応答する、検出可能なシグナルを提供しうる第２成分と混 合し；次いで 該リガンドと該ポリペプチドの相互作用によって生成するシグナルの不在を検 出することにより、該リガンドが該ポリペプチドに結合するかどうかを決定する ことを特徴とする方法。 １８．請求項７に記載のポリペプチドの発現不足に関連のある疾患または該疾 患の罹患し易さを患者において診断する方法であって、 患者由来のサンプル中の該ポリペプチドをコードする核酸配列中の変異を決定 することを特徴とする方法。 １９．宿主由来のサンプル中の請求項７に記載の存在を分析することを特徴と する診断方法。[Claims]   1. (A) a polynucleotide encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2;   (B) a vector expressed by the DNA contained in ATCC Accession No. 97130 A polynucleotide encoding a polypeptide;   (C) hybridizable to the polynucleotide of (a) or (b) A polynucleotide that is at least 70% identical to the polynucleotide Tide; and   (D) a polynucleotide sequence of the polynucleotide of (a), (b) or (c); Ragment; An isolated polynucleotide selected from the group consisting of:   2. A polypeptide having a sequence from amino acid 1 to amino acid 364 of SEQ ID NO: 2; The polynucleotide according to claim 1, which encodes a repeptide.   3. A vector comprising the polynucleotide of claim 1.   4. A host cell genetically engineered with the vector of claim 3.   5. The polypeptide encoded by the DNA may be a host cell according to claim 4. And producing the polypeptide.   6. A polypeptide comprising genetically engineering a cell with the vector of claim 3. A method for producing a cell capable of expressing a peptide.   7. (I) a polypeptide having the deduced amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and Fragments, analogs and derivatives of the polypeptide; and   (Ii) A polypeptide encoded by the cDNA of ATCC Accession No. 97130 Peptides, and fragments, analogs and derivatives of the polypeptides; A polypeptide selected from the group consisting of:   8. The polypeptide of claim 7, wherein said polypeptide has the deduced amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The polypeptide mentioned.   9. An antibody against the polypeptide of claim 7.   10. A compound that activates the polypeptide of claim 7.   11. A compound that inhibits activation of the polypeptide of claim 7.   12. A method for treating a patient in need of activating a receptor, comprising the steps of: Administering to the patient a therapeutically effective amount of the described compound.   13. 12. A method for treating a patient in need of inhibiting a receptor, as claimed in claim 11. Administering to the patient a therapeutically effective amount of the listed compound.   14． The compound is a polypeptide, and the DNA encoding the agonist is The compound may be given to the patient to express the agonist in vivo. 13. The method of claim 12, wherein a therapeutically effective amount of the substance is administered.   15. The compound is a polypeptide, and the DN encoding the antagonist A to the patient and expressing the antagonist in vivo 14. The method of claim 13, wherein a therapeutically effective amount of said compound is administered.   16. A method for identifying a compound that binds to and activates the polypeptide according to claim 7. And   A cell under conditions sufficient to bind a compound to the polypeptide of claim 7. Contacting the compound with cells expressing the polypeptide on the surface thereof; A second that can provide a detectable signal in response to binding of the compound to the tide. Mix with the ingredients; then   By detecting a signal generated by the second component, the polypeptide is detected. A compound capable of binding to the compound.   17． 9. A compound which binds to the polypeptide according to claim 7 and inhibits activation. Fixed method,   The receptor polypeptide under conditions sufficient to bind to the polypeptide of claim 7. Analytically detectable ligands known to bind to the peptide Contacting a host cell expressing the polypeptide on the surface to convert the polypeptide into the polypeptide Mixed with a second component that can provide a detectable signal in response to binding of the compound. Merge; then   Detecting the absence of a signal generated by the interaction of the ligand with the polypeptide. Determine whether the ligand binds to the polypeptide A method comprising:   18. A disease or a disease associated with insufficient expression of the polypeptide according to claim 7. A method of diagnosing susceptibility of a patient to a disease,   Determining a mutation in a nucleic acid sequence encoding the polypeptide in a sample from the patient A method comprising:   19. Analyzing the presence according to claim 7 in a sample derived from a host. How to diagnose.
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