JP2000505644A - Human G protein-coupled receptor - Google Patents

Human G protein-coupled receptor

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Abstract

(57)【要約】 ヒトATPレセプターポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするDNA（RNA）ならびにそのようなポリペプチドを組換え技術によって産生する手順が開示される。さらに、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定するためのそのようなポリペプチドを利用するための方法、ならびにATPレセプターポリペプチドの過小発現および過剰発現に関連する症状を治療的に処置するためにそのアゴニストおよびアンタゴニストを使用する方法が提供される。さらに、ATPレセプター核酸配列中の変異を検出するため、および宿主由来の試料中のレセプターの可溶性形態のレベルを検出するための診断方法が開示される。   (57) [Summary] Disclosed are human ATP receptor polypeptides and DNA (RNA) encoding such polypeptides, as well as procedures for producing such polypeptides by recombinant techniques. Further, methods for utilizing such polypeptides to identify antagonists and agonists for such polypeptides, and for therapeutically treating conditions associated with underexpression and overexpression of ATP receptor polypeptides And methods of using the agonists and antagonists. In addition, diagnostic methods are disclosed for detecting mutations in the ATP receptor nucleic acid sequence and for detecting levels of the soluble form of the receptor in a sample derived from the host.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＧタンパク質結合レセプター 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド によりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプ チドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に 関する。本発明のポリペプチドは、ヒト７-膜貫通Ｇタンパク質結合レセプター である。より詳細には、７-膜貫通結合レセプターは、ヒトATPレセプターとして 推測的に同定されている。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害 することに関する。 多数の医学的に重要な生物学的プロセスが、Ｇタンパク質および/またはセカ ンドメッセンジャー（例えば、cAMP）を含むシグナル伝達経路に関与するタンパ ク質により媒介されることは、十分に確立されている（Lefkowitz，Nature，351 :353-354(1991)）。本明細書中では、これらのタンパク質を、Ｇタンパク質とと もに経路に関与するタンパク質またはPPGタンパク質という。これらのタンパク 質のいくつかの例としては、Ｇタンパク質結合（GPC）レセプター（例えば、ア ドレナリン作用性薬剤およびドーパミンに対するGPCレセプター（Kobilka，B.K. ら，PNAS，84:46-50(1987);Kobilka,B.K.ら，Science，238:650-656（1987);Bun zow，J.R.ら，Nature，336:783-787(1988)））、Ｇタンパク質それ自体、エフェ クタータンパク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホ スホジエステラーゼ）、ならびにアクチュエータ−タンパク質（actuator prote in）（例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ）（Simon，M .I.ら，Science，252:802-8(1991))が挙げられる。 例えば、シグナル伝達の１つの形態では、ホルモン結合の効果は、細胞内にお ける酵素アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性化は 、ヌクレオチドGTPの存在に依存し、そしてGTPはまた、ホルモン結合に影響を与 える。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結させ る。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活性化されると、GTPをGDP結合 型に 変換することが示された。次いで、GTPを有する形態は、活性化されたアデニル 酸シクラーゼに結合する。GTPのGDPへの加水分解は、Ｇタンパク質それ自体によ り触媒され、Ｇタンパク質をその基底の不活性な形態に戻す。従って、Ｇタンパ ク質は、シグナルをレセプターからエフェクターに中継する中間物として、およ びシグナルの持続時間を制御する時計としての２つの役割を果たす。 ATPのような細胞外ヌクレオチドは、血小板凝集、血管収縮、細胞分割、心筋 および骨格筋収縮、ならびに末梢および中枢神経伝達を含む多数の生物学的機能 に影響し得る。Gordon，J.L.、Biochem．J．233:309-319(1986)。これらのATPの 細胞外作用は、Burnstock G（(1978)Cell Membrane receptors fo rDrugs and H ormones:A multidisciplinary approach（Straub，R.W．およびBolis L.編）107 〜118頁、Raven Press，New York)）によってP2レセプターとして分類されたプ リン性レセプターを通じて媒介される。P2レセプターは、平滑筋張力を増大させ るATPアナログの能力の順序に基づいて、P2XおよびP2yに下位分類される（Burns tock G.およびKennedy，C.，Gen．Pharmacol．16:433-440(1985)）。より最近で は、プリン性レセプターサブタイプの数がさらに拡張され（Burnstock G.，Cell Membrane receptors for Drugs and Hormones: A multidisciplinary approach （Straub，R.W．およびBolis L.編）107〜118頁、Raven Press，New York(978) ）、ATPによりアンタゴナイズされたことによりADPによって刺激されるP2tレセ プターサブタイプ、UTPならびにATPを認識するP2uレセプターサブタイプ（Murri n、R.J.A.およびBoparder，M.R. Mol．Pharmacol．41:561-568(1992)）、および ATP4-を認識し、そして細胞膜の透過を生じるP2zレセプターサブタイプが追加さ れた。 多数の神経性特徴を有し、そして神経モデルとして使用されているPC12細胞に おいて、細胞外ATPは、迅速なかつ一過性の細胞内カルシウムレベルの増大およ び神経伝達物質の放出を生じた（Fasolato，C．Pizzo，P.およびPozzan，T.，J ．Blol．Chem．265:20351-20355(1990);Sela，D.，Ram，E.およびAtlas，D．J． Biol．Chem．266:17990-17994(1991);Majid，M.A.，Okajima，F.およびKondo，Y .，Biochem．Biophy．Acta 1136:283-289(1992)）。PC12細胞上のプリン性P2レ セプターは、この相互作用を可能にする。新規のP2レセプターは、ATP刺激に よる[Ca2+]の増大およびα-35S-ATP結合の特性（Kim，W.K.およびRabin，R.A.， J．Blo．Chem.，269(9):6471-6477(1994)）の測定に基づいて発見された。 代謝におけるヌクレオチドの役割は、よく確立されているが、細胞外トランス ミッター、レギュレーター、またはモジュレーターとしてのそれらの潜在的な重 要性は最近認識された。細胞外ATPは、多くの細胞型および調製物でのイノシト ールリン脂質反転の刺激および膜伝導性の活性化のような種々の応答を誘導する ことが示されている(Burnstock，G.，Nucleosides Nucleotides 10:917-930（19 91);Bean，B.P.，Trends Pharmacol Sci．13:87-90(1992);Edwards F.A.，Gibb ，A.J.およびColquhoun，D.，Nature(London)359:144-147(1992);Kastritsis，C .H.C.，Salm，A.K.およびMcCarthy，K.，J．Neurochem．58:1277-1284(1992))。 これらの応答が、P2プリノセプター（purinoceptor）と称されるATPレセプター のファミリーで媒介されることは公知である。（Burnstock，G.およびKennedy,C .，Gen．Pharmacol．16:433-440(1985);Gordon J.L.，Biochem．J．233:309-319 (1986);Dubyak，G.R.，Am．J．Respir．Cell Mol．Biol．4;295-300(1991)）、 そのうちいくつかは、クローニングされている（Lustig，K.D.，Shiau，A.K.，B rake，A.J.およびJulius，D.，Proc．Natl．Acad．Sci，USA 90:5113-5117(1993 );Webb，T.E.，Simon，J.，Krishek，B.J.，Bateson，A.N.，Smart，T.G.，King ，B.F.，Burnstock，G.，およびBarnard，E.A.，FEBS Lett 324:219-225(1993); Brake，A.J.，Wagenbach，M.J.およびJulius，D.，Nature（London）371:519-52 3(1994);Valera，S.，Hussy，N.，Evans，R.J.，Adami，N.，North，R.A.，Surp renant，AおよびBuell，G.，Nature（London）371:516-519(1994)）。 ATPは、下垂体細胞培養物においてイノシトールリン酸蓄積および細胞内Ca2+ 代謝を刺激することが示されており（Davidson，J.S.，Wakefield，I.K.，Sohni us，U.，van der Merwe，P.A.およびMillar，R.P.，Endocrinology 126:80-87(1 990)）、そして胎児視床下部ニューロン培養物のデータは、ATPが神経性内分泌 系において調節役割を有する可能性を示唆している（Chen，Z.P.，Levy，A.およ びLightman，S.L.，Brain Res．641:249-256(1994)）。ATPおよびUTPはATPレセ プターに作用して、下垂体ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）-応答細胞に おいて迅速かつ劇的に細胞質Ca2+を増大させる（Chen，Z.P.，Levy，A.，McArdl e，C.A.およびLightman，S.L.，Endocrinology 135:1280-1283(1994)）。ATPレ セプターはまた、下垂体ゴナドトロピンの顕著な放出を媒介し得、そしてATPが 下垂体細胞から細胞外に放出され得ることを媒介し得る。 本発明の１つの局面によれば、新規の成熟レセプターポリペプチド、ならびに 生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログお よび誘導体が提供される。本発明のレセプターポリペプチドはヒト起源である。 本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドをコードする単 離された核酸分子が提供され、この核酸分子は、mRNA、cDNA、ゲノムDNA、なら びにそれらのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性で、かつ診断または 治療に有用なそれらのフラグメントを含む。 本発明の別の局面によれば、ATCC寄託番号第97333号を含むヒトcDNAにより発 現される成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。 本発明のさらなる局面によれば、上記ポリペプチドの発現およびその後の上記 ポリペプチドの回収を促進する条件下で、本発明のレセプターポリペプチドをコ ードする核酸配列を含む組換え原核生物宿主細胞および/または組換え真核生物 宿主細胞を培養することを含む組換え技術によって、このようなレセプターポリ ペプチドを産生するためのプロセスが提供される。 本発明のなおさらなる局面によれば、このようなレセプターポリペプチドに対 する抗体が提供される。 本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合してそれ を活性化するか、またはその活性化を阻害する化合物のスクリーニング方法が提 供される。 本発明のなお別の実施態様によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合 してそれを活性化し、下垂体細胞の生理的応答を媒介して黄体形成ホルモン放出 を刺激する化合物を宿主に投与するプロセスが提供される。 本発明の別の局面によれば、ポリペプチドの過小発現またはレセプターポリペ プチドに対するリガンドの過小発現に関連した症状を処置するために、遺伝子治 療を通じて本発明のレセプターポリペプチドを投与する方法が提供される。 本発明のなお別の実施態様によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合 して、そして本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物を投与 するプロセスが提供され、それらは、アンギナ、心筋梗塞および脳卒中、血栓溶 解、血管形成、ならびに嚢胞性線維症を含む動脈血栓症の予防および／または処 置に有用である。 本発明のなお別の局面によれば、本発明のポリヌクレオチド配列に対して特異 的にハイブリダイズするのに充分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供さ れる。 本発明のさらに別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードする核酸 配列中の変異に関連した疾患を検出するため、およびレセプターポリペプチドの 可溶性形態の変化したレベルを検出するための診断アッセイが提供される。 本発明のなおさらなる局面によれば、科学的研究、DNAの合成およびDNAベクタ ーの製造に関連したインビトロ目的のためのこのようなレセプターポリペプチド またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するプロセ スが提供される。 本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであ るはずである。 以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により包含 されるような本発明の範囲を限定することを意味しない。 図１は、本発明のＧタンパク質結合レセプターのcDNA配列、および対応する推 定アミノ酸配列を示す。アミノ酸の標準１文字略語を使用する。配列決定を、37 3自動DNAシーケンサー(Applied Biosystems,Inc.)を用いて行った。 図２は、本発明のポリペプチド（上列）（配列番号２）とマウスP2uレセプタ ー（配列番号９）との間のアミノ酸配列相同性を示す。 本発明の１つの局面によれば、図１の推定のアミノ酸配列（配列番号２）を有 する成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供 される。 本発明のポリヌクレオチドは、ヒト胎盤由来のcDNAライブラリーで発見された 。これは構造的にＧタンパク質結合レセプターファミリーに関連し、そしてこの フ ァミリーの推定のメンバーである。これは、334アミノ酸残基のタンパク質をコ ードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、マウスP2u レセプターに最も高い程度の相同性を示し、全アミノ酸範囲にわたって29.787％ の同一性および51.064％の類似性を有する。 本発明の別の局面によれば、1995年11月６日に、アメリカンタイプカルチャー コレクション（12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USA）に 寄託されたATCC寄託番号第97333号に含まれるヒトcDNAによって発現される成熟 ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。寄託され た物質は、全長ATPレセプターcDNAを含むpBluescript SK(-)プラスミドである。 寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約 の下に維持されている。株は改変不可能であり、そして特許の発行の際に公に発 表される制限または条件の範囲外である。これらの寄託物は、当業者に対する便 宜として提供されるにすぎず、そして米国特許法第112条第35項の下で寄託が必 要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配 列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書 中に参考として援用され、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑 えている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要と され得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。本 明細書中にわたる「ポリヌクレオチド」の参照は、上記に寄託したDNAを含む。 本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA（このDNAは、cDNA、ゲノ ムDNA、および合成DNAを含む）の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖で あり得、そして一本鎖の場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖 であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１（配列番号１） に示すコード配列と同一であり得るか、またはそのコード配列が、遺伝コードの 重複または縮重の結果として、図１（配列番号１）のDNAと同じ成熟ポリペプチ ドをコードする異なるコード配列であり得る。 図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以 下を含み得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード 配列およびさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に 応じてさらなるコード配列）および非コード配列（例えば、イントロンあるいは 成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/または3’非コード配列）。 従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列およ び/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。 本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ ドのフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリ ヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチ ドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しな い改変体であり得る。 従って、本発明は、図１（配列番号２）に示すものと同じ成熟ポリペプチドを コードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を 含む。この改変体は、図１（配列番号２）のポリペプチドのフラグメント、誘導 体またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体 、置換改変体、および付加または挿入改変体を含む。 本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）に 示すコード配列の天然に存在する対立遺伝予改変体であるコード配列を有し得る 。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体は、1つ以上のヌクレオチドの置 換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これは コードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。 このポリヌクレオチドはまた、ATPレセプターポリペプチドの可溶性形態をコ ードし得、これは、本発明の全長ポリペプチドのTMおよび細胞内ドメインから切 除されたポリペプチドの細胞外部分である。 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列 は、例えば、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精 製を提供する、pQEベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る 。あるいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使 用される場合は、血球凝集素（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ 血 球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する（Wilson，I.ら、Cell，37 :767(1984)）。 本発明はさらに、配列間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、そし てより好ましくは少なくとも95％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配 列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中 上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ ヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件 」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95％、そして好ましくは 少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい 実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポ リヌクレオチドは、図１（配列番号１）のcDNAによりコードされる成熟ポリペプ チドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持する（すなわち、 ポリペプチドが膜結合ATPレセプターとして機能しないとしても、レセプターに 対してリガンドを結合する能力を保持することにより可溶性ATPレセプターとし て機能する（例えば、二次メッセンジャー応答を誘発することによる））ポリペ プチドをコードする。 あるいは、このポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダ イズし、そして本明細書中の上記のようにそれに同一性を有する、少なくとも15 塩基、好ましくは少なくとも30塩基そしてより好ましくは少なくとも50塩基を有 し、そして、このポリヌクレオチドは活性を保持し得るか、または保持し得ない 。例えば、このようなポリヌクレオチドは配列番号１のポリヌクレオチド、また はその改変体に対するプローブとして（例えば、ポリヌクレオチドの回収のため 、または診断プローブもしくはPCRプライマーとして）供され得る。 従って本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに 対して、少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性、そして より好ましくは少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチド、およびそれ らに相補的なポリヌクレオチド、ならびにそれらの部分（少なくとも30の連続し た塩基、そして好ましくは少なくとも50の連続した塩基を有する）ならびにその ようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。 この遺伝子のフラグメントは、cDNAライブラリーのためのハイブリダイゼーシ ョンプローブとして用いられて、本発明の遺伝子に高い配列類似性を有するか、 または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離し得る。このタイプのプロ ーブは、少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも30塩基そして最も好ましくは 少なくとも50塩基以上である。このプローブはまた、全長転写産物に対応するcD NAクローン、およびゲノムクローン、または本発明の遺伝子を完全に含むクロー ン（制御領域およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む）を同 定するために使用され得る。このタイプのスクリーニングの例は、公知のDNA配 列を使用することにより、遺伝子のコード領域を単離して、オリゴヌクレオチド プローブを合成することを含む。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する 標識オリゴヌクレオチドは、ヒトcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリー をスクリーニングしてプローブがハイブリダイズするライブラリーのメンバーを 決定するのに使用される。 本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有する、ATPレセ プターポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナロ グ、および誘導体に関する。 用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１（配列番 号２）のポリペプチドをいう場合、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物 学的機能または活性を保持する（すなわち、ATPレセプターとして機能する）か 、あるいは、ポリペプチドがＧタンパク質結合レセプター（例えば、このレセプ ターの可溶型）として機能しないとしても、リガンドをレセプターに結合する能 力を保持するか、のいずれかであるポリペプチドを意味する。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合 成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 図１（配列番号２）のポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログ は、(i)１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基 （好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されたアミ ノ酸残基は遺伝的コードによりコードされ得るアミノ酸残基であってもよく、ま たはそうでなくてもよいもの、あるいは(ii)１つ以上のアミノ酸残基が置換基を 含有するもの、あるいは(iii)成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増 加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合 されているもの、あるいは(iv)成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精 製に使用されるさらなるアミノ酸が、成熟ポリペプチドに融合されているもの、 あるいは(v)ポリペプチドのフラグメントが可溶性（すなわち、膜に結合してお らず、なおさらに膜結合レセプターに対するリガンドに結合する）であるもので あり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教 示から、当業者の範囲内にあると考えられる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形 態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。 本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（特に、成熟ポリペプチ ド）ならびに配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも70％の類似性（好ま しくは少なくとも70％の同一性）、より好ましくは配列番号２のポリペプチドに 対して少なくとも90％の類似性（より好ましくは少なくとも90％の同一性）そし てなおより好ましくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも95％の類似 性（なおより好ましくは少なくとも95％の同一性）を有するポリペプチドを含み 、さらに、このようなポリペプチドの部分で、一般的に少なくとも30アミノ酸、 そしてより好ましくは少なくとも50アミノ酸を含むそのようなポリペプチドの部 分も含む。 当該分野で公知のように、２ポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプ チドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの 配列に対して比較することにより決定される。 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成によって対 応する全長ポリペプチドを生成するために使用され得、それゆえ、このフラグメ ントは、全長ポリペプチドを生成するための中間体として使用され得る。本発明 のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチ ドを合成するために使用され得る。 用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を生成することに関連したDNAのセグメン トを意味し；これは、コード領域の前後の「リーダーおよびトレーラー（traile r）」領域ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イン トロン）を含む。 用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合 は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動 物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離 されていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離さ れている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。この ようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／またはこのような ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてそのよ うなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないため、なお単離され 得る。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプ チドの産生に関する。 宿主細胞は、本発明のベクター（これは、例えば、クローニングベクターまた は発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるか、ま たは形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）。ベクターは、例えば 、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主 細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、または本発明 の遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得 る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞に 以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するため に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す るための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクター は、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列を包含する。このよ うなベクターは、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バ キュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせ に由来するベクター、ウイルスDNA（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏 痘ウイルス、および仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能で、か つ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。 適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配 列は、当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入さ れる。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。 発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可 能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例と しては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lacまたはt rp 、λファージPLプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるい はそのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモータ ー。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ター ミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含 有し得る。 さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため の表現型特性（例えば、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター ゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばE.coliにおけるテトラサイクリン耐 性またはアンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有す る。 本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列また は制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質 を発現させるために用いられ得る。 適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E.coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）； 昆虫細胞（例えば、DrosophilaおよびSpodoptera Sf9）；動物細胞（例えば、CH O、COSまたはBowes黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選 択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。 さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む 組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターま たはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中に、本発明の配列が正方向 または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物 はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含 する）を含む。非常に多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公 知であり、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌 性：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pblues ript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK2 23-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核生物性：pWLNEO、pSV2CAT、p OG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、 他の任意のプラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、か つ存続可能である限り、使用され得る。 プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフエラーゼ）ベク ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子 から選択され得る。２つの適切なベクターは、PKK232-8およびPCM7である。特に よく知られた細菌プロモーターは、lacI，lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PLおよびt rpを包含する。真核生物プロモーターは、CMV即時初期型、HSVチミジンキナーゼ 、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチ オネインIを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当 業者のレベル内である。 さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。 宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細 胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞（例え ば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト ランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエ レクトロポレーションにより達成され得る(Davis,L.，Dibner,M.，Battey,I.，B asic Methods in Molecular Biology,(1986))。 宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法で組換え配列によりコードされる遺 伝子産物を産生し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合 成機により合成的に産生され得る。 成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプ ロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物 に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得 る。原核生物宿主および真核生物宿主での使用に適切なクローニングベクターお よび発現ベクターは、Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual， 第２版，Cold Spring Harbor,N.Y.，(1989)（この開示は、本明細書中に参考と して援用される）に記載されている。 本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ ーにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAの シス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーター に作用してその転写を増大させる。例として、複製起点のbp100〜270の後期側の SV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複 製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサー が挙げられる。 一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点お よび選択マーカー（例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisi ae のTRP1遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指向する高発現遺伝子由来 のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、解糖酵素（例えば、3- ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱 ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、 翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質のペ リプラズム空間または細胞外の培地への分泌を指向し得るリーダー配列と適切な 相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現さ れた組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチド を含む融合タンパク質をコードし得る。 細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターを有する作動可能 な読み取り相に、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望の タンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築される。ベクタ ーは、１つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ 所望により宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のた めに適切な原核生物宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimur ium 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種 々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。 代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、 周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝的エレメントを含む市販 のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。こ のような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Upp sala，Sweden)およびGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)を含む。これら のpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と 組み合わされる。 適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖に続いて、 選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導） により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。 細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段に より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。 タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音 波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を含む任意の便利な方法により破 砕され得る。このような方法は当業者に周知である。 種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い られ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell，23:175(1981)に記載され るサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細 胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）が含まれる。哺乳動 物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならび に任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部 位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５'フランキング 非転写配列をまた含有する。SV40スプライス部位、およびポリアデニル化部位に 由来するDNA配列は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するために使用され 得る。 ATPレセプターポリペプチドは、以下を含む方法により組換え細胞培養物から 回収され、そして精製され得る。硫安沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イ オンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフ ィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー 、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフ ィー。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refolding）工程が、成熟タ ンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマト グラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。 本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物 であり得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物中の 細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により産生 され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド は、グリコシル化されてもよいし、またはグリコシル化されなくてもよい。本発 明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、研究用試薬ならびにヒト疾 患に対する処置および診断の発見のための物質として使用され得る。 本発明のATPレセプターポリペプチドは、本発明のレセプターポリペプチドを 活性化する（アゴニスト）またはその活性化を阻害する（アンタゴニスト）化合 物のスクリーニングのプロセス中で使用され得る。 一般的に、このようなスクリーニング手順は、その細胞表面で本発明のレセプ ターポリペプチドを発現する適切な細胞を提供することを含む。このような細胞 は、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエまたはE.coliに由来する細胞を含む。特 に、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェ クトし、それにより、本発明のポリペプチドを発現させるのに用いられる。次に 、発現されたレセプターは、試験化合物と接触されて、機能応答の結合、刺激ま たは阻害を観察する。 １つのこのようなスクリーニング手順は、本発明のポリペプチドを発現するた めにトランスフェクトされるメラニン保有細胞の使用を含む。このようなスクリ ーニング技術は、PCT WO 92/01810（1992年２月６日公開）に記載されている。 従って、例えば、このようなアッセイは、レセプターリガンドおよびスクリー ニングされるべき化合物の両方と、レセプターをコードするメラニン保有細胞と を接触させることにより、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する 化合物をスクリーニングするために使用され得る。リガンドにより生じるシグナ ルの阻害は、化合物がこのレセプターの潜在的なアンタゴニストであること、す なわち、ATPレセプターの活性化を阻害することを示す。 このスクリーニングは、このような細胞とスクリーニングされる化合物とを接 触させ、そしてそのような化合物がシグナルを生じるか、すなわち、このような 化合物がレセプターを活性化するかを決定することによりレセプターを活性化す る化合物を決定するために用いられ得る。 他のスクリーニング技術は、例えば、Science、246巻、181〜296頁（1989年10 月）に記載されるように、レセプターの活性化により引き起こされる細胞外のpH 変化を測定する系において、本発明のポリペプチドを発現する細胞（例えば、ト ランスフェクトCHO細胞）の使用を含む。例えば、化合物は、本発明のレセプタ ーポリペプチドを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応 答（例えば、シグナル伝達またはpH変化）は、潜在的な化合物がレセプターを活 性化するか、または阻害するかどうかを決定するために測定され得る。 別のこのようなスクリーニング技術は、本発明のポリペプチドをコードするRN AをXenopus卵母細胞に導入し、一過的にレセプターを発現させることを含む。次 いでそのレセプター卵母細胞は、レセプターの活性化を阻害すると考えられる化 合物をスクリーニングする場合には、レセプターリガンドおよびスクリーニング される化合物と接触され得、続いて、カルシウムシグナルの阻害または活性化の 検出が行われる。 別のスクリーニング技術は、そのポリペプチドがホスホリパーゼＣまたはＤと 連結している本発明のポリペプチドの発現を包含する。このような細胞の代表例 としては、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などが挙げられ得る。スクリーニ ングは、本明細書中上記のように、レセプターの活性化またはホスホリパーゼの ２次シグナルによるレセプターの活性化の阻害の検出により達成され得る。 別の方法は、細胞表面にレセプターを有する細胞への標識リガンドの結合の阻 害を決定することによる、本発明のアンタゴニストのレセプターポリペプチドの 活性化を阻害する化合物をスクリーニングする工程を含む。このような方法は、 細胞がその表面にATPレセプターを発現するようにATPレセプターポリペプチドを コードするDNAで真核生物細胞をトランスフェクトする工程、および標識形態の 公知のリガンドの存在下で細胞と化合物とを接触させる工程を含む。リガンドは 、例えば、放射活性により標識され得る。標識リガンドがATPレセプターに結合 した量は、例えば、ATPレセプターの放射活性の測定により測定される。ATPレセ プターに結合する標識リガンドの減少により決定されるように化合物がATPレセ プターに結合する場合、標識リガンドのATPレセプターへの結合は阻害される。 Ｇタンパク質結合レセプターは、哺乳動物宿主において遍在性であり、そして 多くの生物学的機能（多くの病理状態を含む）を担う。従って、一方で本発明の ATPレセプターポリペプチドを刺激し、そして他方でその機能を阻害し得る化合 物および薬物を見出すことが望ましい。 例えば、Ｇタンパク質結合レセプターを活性化する化合物は、治療目的（例え ば、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、尿貯留（urinary retention ）、および骨粗鬆症の処置）に用いられ得る。 一般に、Ｇタンパク質結合レセプターの活性化を阻害する化合物は、種々の治 療目的（例えば、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前 立腺肥大、ならびに精神病および神経性疾患（精神分裂病、繰病性興奮、うつ病 、譫妄、痴呆または重篤な精神遅滞、ハンチントン舞踏病またはGilles dila To urett症候群のようなジスキネジーを含む）の処置、内因性食欲不振の逆転およ び過食症の制御など）に用いられ得る。 抗体、またはいくつかの場合ではオリゴヌクレオチドが本発明のATPレセプタ ーをアンタゴナイズし得、これらはATPレセプターに結合するが、ATPレセプター の活性を阻害するように２次メッセンジャー応答を惹起しない。抗体は、一般に 抗体の抗原結合部位に会合する独特の決定基を認識する抗イディオタイプ抗体を 含む。潜在的なアンタゴニスト化合物もまた、ATPレセプターのリガンドに密接 に関連するタンパク質、すなわち、リガンドのフラグメントを含み、これは生物 学的機能を欠失しており、そしてATPレセプターに結合するときに応答を惹起し ない。 アンチセンス技術の使用によって調製されたアンチセンス構築物は、三重らせ ん形成もしくはアンチセンスDNAまたはRNAを介して遺伝子発現を制御するために 用いられ得、これらの方法の両方は、ポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに結合す ることに基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌ クレオチド配列の5'コード部分は、長さが約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオ リゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転 写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重らせん-Leeら、 Nucl．Acids Res.，6:3073(1979);Cooneyら、Science，241:456(1988);およびDe rvanら、Science，251:1360(1991)を参照のこと）、それにより、転写およびATP レセプターの産生を阻害する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボ でmRNAにハイブリダイズし、そしてmRNA分子のＧタンパク質結合レセプターへの 翻訳をブロックする（アンチセンス-0kano、J．Neurochem.，56:560（199l);Oll godeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press ，Boca Raton，FL(1988)）。上記のオリゴヌクレオチドはまた細胞に送達され得 、それによって、アンチセンスRNAまたはDNAが、ATPレセプターの産生を阻害す るためにインビボで発現され得る。 ATPレセプターに結合する小分子は、正常な生物学的活性が妨げられるように リガンドへの接近を不可能にし、例えば、小ペプチドまたはペプチド様分子はま た、本発明のATPレセプターポリペプチドの活性化を阻害するのに使用され得る 。 可溶性形態のATPレセプター（例えば、このレセプターのフラグメント）は、 リガンドに結合し、そしてこのリガンドが膜結合ATPレセプターと相互作用する ことを妨げることによってレセプターの活性化を阻害するために使用され得る。 一般に、スクリーニング手順によって決定されるATPレセプターに対するアン タゴニストは、種々の治療目的のために供され得る。例えば、このようなアンタ ゴニストは、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、精神疾患、 鬱病、偏頭痛、嘔吐、および良性前立腺肥大の処置のために使用されてきた。 本発明のATPレセプターに特異的なアンタゴニストは、アンギナ、心筋梗塞お よび脳卒中、血栓症、血管形成、および嚢胞性線維症を含む動脈血栓の処置に使 用され得る。このアンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本 明細書中に記載される）と一緒の組成で供され得る。 Ｇタンパク質結合レセプターに対するアゴニストはまた、喘息、パーキンソン 病、急性心不全、低血圧、尿貯留、および骨粗鬆症の処置のような治療目的のた めに有用である。 本発明のレセプターに対するアゴニストは、慢性気管支炎の処置およびを含む 下垂体細胞、特に性腺刺激ホルモン産生細胞における生理的反応（黄体形成ホル モン放出を含む）を媒介するのに使用され得る。 アンタゴニストまたはアゴニスト化合物は、適切な薬学的キャリアと組み合わ せて用いられ得る。このような組成物は、治療的有効量の化合物、および薬学的 に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理 食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、 およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投 与の態様に合わせるべきである。 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上 の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器（単数また は複数）に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制す る政府機関により規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は、ヒトへの 投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を表す。さらに 、本発明の薬学的組成物は、他の治療化合物と併用して用いられ得る。 薬学的組成物は、例えば、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、ま たは皮内経路による簡便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特異症状の処 置および／または予防に効果的な量で投与される。一般に、薬学的組成物は少な くとも約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日に約８ mg/kg体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日に約10μg/k g体重から約１mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮される。 ATPレセプターポリペプチドおよび化合物（これらはポリペプチドである）は 、本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により用いられ 得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる 従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ チド（DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細 胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当 該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNA を含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操 作され得る。 同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分 野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発 明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するた めのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作するため、およびインビボで のポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発 明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教 示から当業者には明らかなはずである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒ クルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。こ れは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために 使用され得る。 本明細書中で上記で言及されたレトロウイルスプラスミドベクターが由来する レトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓懐死ウイルス、レトロ ウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウ イルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、 骨髄増殖肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルス）を含む細胞に由来し得るが、 これに限定されない。一つの実施態様において、このレトロウイルスプラスミド ベクターはモロニーマウス白血病ウイルス由来である。 ベクターは１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーター は、レトロウイルスLTR;SV40プロモーター；およびMillerら、Biotechniques ７ 巻、第９号、980-990(1989)に記載されるヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロ モーターまたは任意の他のプロモーター（例えば、真核生物細胞性プロモーター のような細胞性プロモーターはヒストン、pol IIIおよびβアクチンプロモータ ーを含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない。使用さ れ得る他のウイルス性プロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミ ジンキナーゼ（TK）プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターを含 むが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含ま れる教示により、当業者にとって明らかである。 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下 にある。使用され得る適切なプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモー ターのようなアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス（CMV ）プロモーターのような異種プロモーター；RSウイルス（RSV）プロモーター；M MTプロモーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーター； 熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター;ApoAIプロモーター；ヒトグ ロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイ ルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスLTR（本明細書中上記に記 載の改変されたレトロウイルスLTRを含む）；βアクチンプロモーター；ならび にヒト成長ホルモンプロモーターを含むが、これらに限定されない。プロモータ ーはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであ り得る。 レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質転換して 、プロデューサー細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得 るパッケージング細胞の例は、PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT -19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12および、Miller，Human Gene Therapy ，１巻、５〜14頁（1990）（これは、本明細書中で全文が参照として援 用される）に記載されたDAN細胞株を含むが、これらに限定されない。このベク ターは、パッケージング細胞を当該分野で公知の任意の手段で形質導入し得る。 そのような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO4 沈澱を含むが、これらに限定されない。一つの代替手段において、レトロウイル スプラスミドベクターは、リポソームにカプセル化され得るか、または脂質に結 合されて、次いで宿主に投与され得る。 プロデューサー細胞株は、このポリペプチドをコードする核酸配列（単数また は複数）を含む感染性レトロウイルス粒子を生成する。次に、そのようなレトロ ウイルスベクター粒子は、真核生物細胞をインビトロまたはインビボのいずれか で形質導入するのに使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチ ドをコードする核酸配列（単数または複数）を発現する。形質導入され得る真核 生物細胞は、胚性幹細胞、胚性ガン腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維 芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞および気管支表皮細胞を含むが、 これらに限定されない。 本発明はまた、ATPレセプターに結合し得ることが知られていないリガンドが 、このようなレセプターに結合し得るかどうかを決定するための方法を提供し、 この方法は、ATPレセプターへのリガンドの結合を許容する条件下でATPレセプタ ーを発現する哺乳動物細胞をリガンドと接触させる工程、レセプターに結合する リガンドの存在を検出する工程、およびこれにより、リガンドがレセプターに結 合するかどうかを決定する工程を包含する。本明細書中に上記のアゴニストおよ び／またはアンタゴニストを決定するための系は、レセプターに結合するリガン ドを決定するためにも使用され得る。 本発明はまた、レセプターをコードするmRNAの存在を検出することにより、細 胞の表面における本発明のATPレセプターポリペプチドの発現を検出する方法を 提供し、この方法は、細胞から全mRNAを得る工程、およびそのように得られたmR NAを、レセプターをコードする核酸分子の配列に含まれる配列と特異的にハイブ リダイズし得る少なくとも10ヌクレオチドの核酸分子を含有する核酸プローブと 、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程、プローブにハイブリダイズした mRNAの存在を検出する工程、およびそれによって細胞によるレセプターの発現を 検出する工程を含む。 本発明はまた、本発明のレセプターポリペプチドに関連したレセプターを同定 する方法を提供する。これらの関連したレセプターは、本発明のATPレセプター ポリペプチドとの相同性により、低ストリンジェンシー交叉ハイブリダイゼーシ ョンによってか、または関連する天然のもしくは合成のリガンドと相互作用する および／または本発明のATPレセプターポリペプチドの遺伝学的または薬理学的 遮断後の同様の行動を除外するレセプターを同定することによって、同定され得 る。 本発明はまた、診断（例えば、いくつかの疾患が遺伝的欠損遺伝子に起因す る）としての本発明の遺伝子の使用を包含する。これらの遺伝子は、欠損遺伝子 の配列を正常遺伝子の配列と比較することによって検出され得る。結果として、 「変異」遺伝子が異常なレセプター活性に付随していることが証明され得る。さ らに、変異を証明または同定するなお別の手段として、機能アッセイ系（例えば 、比色アッセイ、McConkeyプレートにおける発現、HEK293細胞のレセプター欠損 株における相補実験）において、変異レセプター遺伝子を発現のための適切なベ クターに挿入し得る。一旦、「変異」遺伝子が同定されると、次に、「変異」レ セプター遺伝子のキャリアのための集団をスクリーニングし得る。 本発明の遺伝子における変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで 検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、組 織生検、および剖検物質を含むがこれらに限定されない）より得られ得る。ゲノ ムDNAは、検出のために直接使用され得るか、または分析前にPCR（Saikiら、Nat ure 、324:163-166(1986)）を用いることにより酵素的に増幅され得る。RNAある いはcDNAもまた、また同じ目的のために使用され得る。例として、本発明の核酸 に相補的なPCRプライマーが、本発明の遺伝子における変異を同定および解析す るために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比較に おける増幅された産物のサイズの変化により検出され得る。点変異は、放射性標 識された本発明のRNAまたは、あるいは、放射標識された本発明のアンチセンスD NA配列に、増幅されたDNAをハイブリダイズさせることにより同定され得る。完 全にマッチした配列は、RNaseA消化または融解温度の差により、ミスマッチした 二重らせんと区別され得る。このような診断方法は、特に出生前または新生児の 診断でさえも有用である。参照遺伝子と「変異体」との間の配列差異は、直接DN A配列決定法により明らかにされ得る。さらに、クローン化されたDNAセグメント は、特定のDNAセグメントを検出するためのプローブとして使用され得る。この 方法の感度は、PCRと組み合わせた場合に著しく亢進される。例えば、配列プラ イマーが二本鎖のPCR産物または改変PCRにより生成された一本鎖テンプレート分 子とともに使用される。この配列決定は、放射標識ヌクレオチドを用いた従来の 手順によるか、または蛍光タグを用いた自動配列決定手順により実行される。 DNA配列の差異に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲル におけるDNAフラグメントの電気泳動的移動度における変化の検出により達成さ れ得る。特異的な位置の配列変化はまた、核保護アッセイ（例えば、RNaseおよ びS1保護または化学切断法（例えば、cottonら、PNAS，USA，85:4397-4401 1985 ）により明らかにされ得る。 さらに、いくつかの疾患は、mRNAにおける変化により検出され得る遺伝子発現 における変化の結果であり、もしくは、その変化により特徴づけられる。あるい は、本発明の遺伝子は、このタイプのレセプターに関連した機能の減少を発現す る固体を同定するための参照として使用され得る。 本発明はまた、種々の組織において本発明のATPレセプターポリペプチドの可 溶性形態の変化したレベルを検出するための診断的アッセイにも関連する。宿主 由来の試料における可溶性レセプターポリペプチドのレベルを検出するためのア ッセイは当業者に公知であり、そして放射免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウ ェスタンブロット解析を含み、そして好ましくは、ELISAアッセイとして知られ る。 ELISAアッセイは初めに、ATPレセプターポリペプチドの抗原に特異的な抗体、 好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらに、レポーター抗体 をそのモノクローナル抗体に対して調製する。レポーター抗体に対して放射能、 蛍光または本実施例における西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような検出試薬 を結合させる。ここで、試料を宿主から取り出し、固体支持体（例えば、試料中 のタンパク質に結合するポリスチレンディッシュ）上でインキュベートする。次 いで、ディッシュ上のすべての遊離タンパク質結合部位を、ウシ血清アルブミン のような非特異的タンパク質とともにインキュベートすることによりカバーする 。次に、モノクローナル抗体をディッシュ中でインキュベートし、その間にモノ クローナル抗体がポリスチレンディッシュに結合している任意のATPレセプター タンパク質に結合する。全ての未結合モノクローナル抗体を緩衝液で洗浄除去す る。西洋ワサビペルオキシダーゼに連結したレポーター抗体を、ここで、ディッ シュ中にいれ、レポーター抗体がATPレセプタータンパク質に結合した任意のモ ノクローナル抗体に結合する。次いで、未結合のレポーター抗体を洗浄除去する 。次いで、ペルオキシダーゼ基質をディッシュに加え、そして所定の時間に発色 した 量を、標準曲線と比較した場合の患者試料の所定の容量中に存在するATPレセプ タータンパク質の量の測定値とした。 本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染 色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得る 。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位 置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬 はほとんどない。本発明に従うDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と 疾患に関する遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階である。 簡潔に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を 調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲ ノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化 するプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマ ーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用 される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグ メントを生じる。 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て るための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明 を使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大き なゲノムクローンのプールを用いて部分的局在性の決定(sublocalization)が達 成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピングスト ラテジーには、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別した(f low-sorted)染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラ リーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択が含まれる。 cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼー ション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。こ の技術は、50または60塩基という短いcDNAで使用され得る。この技術の総説とし ては、Vermaら，Human Chromosomes:a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと。 一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な 位置を遺伝的地図のデータと相関させられ得る。このようなデータは、例えば、 V．McKusick，Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である）に見出される。次いで、同 一の染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣 接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する 必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体 には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるようである。 物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患 に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的 原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング解像度で、 そして20kbあたり１遺伝子と仮定する。） このポリペプチド、そのフラグメントもしくは他の誘導体、またはそれらのア ナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるた めの免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体 、またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体 およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産 物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメ ントの産生のために使用され得る。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポ リペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ 得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた 抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグ メントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体 を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチド を発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。 モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体 を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohle rおよびMilstein，1975，Nature，256:495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞 ハイブリドーマ技術(Kozborら，1983，Immnology Today 4:72)、およびヒトモノ クローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら，1985，Monocl onal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)が挙げられ る。 単鎖抗体を産生するために記載された技術（米国特許第4,946,778号)を、本発 明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る 。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性のポリペプチド産物に 対するヒト化抗体の発現に使用され得る。 上記の抗体は、本発明のポリペプチドを使用して、固体支持体への抗体の付着 、および精製されることを所望されるポリペプチドをカラムに通過させることに よるアフィニティークロマトグラフィーを実施すること、および精製ポリペプチ ドを回収することにより単離し得る。 本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのよ うな実施例に限定されないことが理解されるべきである。すべての部または量は 、他に明記しない限り重量基準である。 以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に現れる特定の方法および／ま たは用語が記載される。 「プラスミド」は、大文宇および／または数字の後ろおよび／またはその前の 小文字のｐにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、 制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプ ラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミド が当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触 媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市 販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者 に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまた はDNAフラグメントには、約２単位の酵素が約20μlの緩衝溶液中で使用される。 プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的には、代表的には５〜5 0μgのDNAが20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制限 酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃にて の約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者 の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直 接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。 切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら，Nucleic Acids Res.,８： ４057(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる 。 「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相 補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成さ れ得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキ ナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連 結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに 連結する。 「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形 成するプロセスをいう(Maniatis,Tら、前出、146頁)。他に提供されていなけれ ば、連結は公知の緩衝液および条件で、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラ グメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成さ れ得る。 記載しない限り、形質転換はGraham,F.およびVan der Eb，A.，Virology，52: 456-457(1973)の方法に記載のように実施された。 実施例１ ATP レセプターの細菌発現および精製 ATPレセプターをコードするDNA配列（ATCC受託番号第97333号）を、プロセス されたATPレセプタータンパク質の５'配列（シグナルペプチド配列を除く）およ びATPレセプター遺伝子に対して３'のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレ オチドプライマーを用いて最初に増幅する。ATPレセプターに対応するさらなる ヌクレオチドを、それぞれ５'および３'配列に添加する。５'オリゴヌクレオチ ドプライマーは、配列５'CCGCAGATCAATGCTGGGGATCATGGCA３'（配列番号３）を有 し、これはBgl II制限酵素部位、それに続くプロセスされたタンパク質の推定末 端アミノ酸から始まる18ヌクレオチドのATPレセプターコード配列を含む。３'配 列、５'CGGCTCTAGATCACTTTTCTCTGAATGA３'（配列番号４）は、XbaI部位に相補的 な配列を含み、そして続いてATPレセプターの18ヌクレオチドおよびATPレセプタ ーDNAインサートの3'側に位置するベクター配列を含む。制限酵素部位は、細菌 発現ベクターpQE-9(Qiagen，Inc．Chatsworth，CA)上の制限酵素部位に対応する 。pQE-9は、抗生物質耐性（Ampr）、細菌の複製起点（ori）、IPTG調節可能プロ モーターオペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-Hisタグ、およ び制限酵素部位をコードする。次いで、pQE-9をBgIIIおよびXbaIで消化する。増 幅配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列とイ ンフレームで挿入する。次いで、連結混合物を用いて、E ．coli株M15/rep 4（Qi agen，Inc.）をSambrook，J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Col d Spring Laboratory Press，(1989)に記載の手順により形質転換する。M15/rep 4はプラスミドpREP4の多数のコピーを含有する。これは、lacIリプレッサーを発 現し、そしてまたカナマイシン耐性（Kanr）を付与する。形質転換体をLBプレー ト上で増殖するそれらの能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン 耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、制限酵素分析により確認す る。所望の構築物を含むクローンを、Amp（100μg/ml）とKan（25μg/ml）との 両方を補充したLB培地における液体培養で一晩（O/N）増殖させる。O/N培養物を 用いて1:100〜1:250の比で大規模な培養物に接種する。細胞を、600の光学密度 （O.D.600)が0.4と0.6との間になるまで増殖させる。次いで、IPTG（「イソプロ ピル-B-D-チオガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にする。IPTGは 、1acIリプレッサーを不活性化することにより、P/Oを解放（clear）し遺伝子発 現の増加を誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心 分離により収集する。細胞ペレットをカオトロピック薬剤６ＭグアニジンHCl中 で可溶化する。明澄化後、可溶化ATPレセプターを、6-Hisタグを含有するタンパ ク質により堅く結合し得る条件下で、ニッケル−キレートカラム上でのクロマト グラフィーによりこの溶液から精製する（Hochuli，Eら、J．Chromatography 41 1:177-184(1984)）。ATPレセプターを６MグアニジンHCl(pH5.0)でカラムから溶 出し、そして再生の目的で、３MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、 10mMグルタチオン（還元型）、および2mMグルタチオン（酸化型）に調整する。 この溶液中での12時間のインキュベーションの後、タンパク質を10mMリン酸ナト リウムに対して透析する。 実施例２ バキュロウイルス発現系を用いるATPレセプターのクローニングおよび発現 全長のATPレセプタータンパク質をコードするDNA配列（ATCC受託番号第97333 号）を、この遺伝子の５'および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプラ イマーを用いて増幅する： ５'プライマーは、配列５'CGGGATCCCTCCATGCTGGGGATCATGGCA３'（配列番号５ ）を有し、そしてBamHI制限酵素部位（太字）、それに続く真核細胞における翻 訳の開始に効率的なシグナルに類似する４つのヌクレオチド（Kozak，M.，J．Mo l．Biol．196，947-950，（1987））を含有する。これは、ATPレセプター遺伝子 の最初の18ヌクレオチドのすぐ後ろである（転写の開始コドン「ATG」に下線を 付する）。 ３'プライマーは、配列５'CGGGATCCGCTCACTTTTCTCTGAATGA３'（配列番号６） を有し、制限エンドヌクレアーゼBamHIの切断部位（太字）およびATPレセプター 遺伝子の３'非翻訳配列に相補的な18ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販の キット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロー スゲルより単離する。次いで、このフラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIで 消化し、そして１％アガロースゲルで再び単離する。このフラグメントを、F2と 称する。 ベクターRG1（pVL941ベクターの改変体、下記）をバキュロウイルス発現系を 用いるATPレセプタータンパク質の発現のために用いる（総説について、Summers ，M.D.およびSmith，G.E．1987，Amanual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Sta tion Bulletin No．1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa cal ifornica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強いポリヘドリンプロモーター、それ に続く制限エンドヌクレアーゼBamHIの認識部位を含む。サルウイルス（SV）40 のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイ ルスを容易に選択するために、E．coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポリ ヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、その後ポリヘドリン遺伝子のポリアデ ニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクト野生型ウイル スDNAの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列で両端で隣接させる。多く の他のバキュロウイルスベクターが、pRG1の代わりに用いられ得る。例えば、pA c373、pVL941，およびpAcIM1である（Luckow，V.A.およびSummers，M.D.、Virol ogy，170:31-39）。 プラスミドを制限酵素BamHIで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔 ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、市販のキット（「Gene clean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca）を用いてDNAを１％アガロースゲルより単 離する。このベクターDNAをV2と称する。 フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連 結する。次いで、E．coliH B101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIを用いて、 ATPレセプター遺伝子を有するプラスミド（pBac-ATPレセプター）を含む細菌を 同定する。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認する。 ５μgのプラスミドpBacATPレセプターを、リポフェクション法（Felgnerら P roc．Natl．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の 線状化したバキュロウイルス（「BaculoGoldTM baculovirus DNA」，Pharmingen ，San Diego，CA.）とともにコトランスフェクトする。 1μgのBaculoGoldTMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBacATPレセプター を、50μlの血清非含有グレース培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg ，MD）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、10 μlのリポフェクチンおよび90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温 にて15分間インキュベートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、 血清非含有グレース培地１mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9 昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下する。プレートを、新たに加えられた溶液を 混合するために、前後に振盪する。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベ ートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして 10％ウシ胎児血清を補充した1mlのグレース昆虫培地を添加する。プレートをイ ンキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を続ける。 ４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）による記載と同様 にプラークアッセイを行う。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単 離を可能にする、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）を有 するアガロースゲルを用いる。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Li fe Technologies Inc.、Gaithersburg、で配布される昆虫細胞培養法およびバキ ュロウイルス学の使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。 連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に加え、そして青く染色されたプラークを エッペンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を 、200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁する。寒天を、 手短な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35 mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染するために用いる。４日後、これらの 培養ディッシュの上清を回収し、次いで４℃で保存する。 Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充したグレース培地中で増殖させる。細胞を 、感染多重度（MOI）２で組換えバキュロウイルスV-ATPレセプターで感染させる 。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF 900 II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換える。42時間後 、５μCiの35Ｓ-メチオニンおよび５μCiの35Ｓシステイン（Amersham）を添加 する。細胞をさらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により収集 し、そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによ り可視化する。 実施例３ COS 細胞における組換えATPレセプターの発現 プラスミドの発現、ATPレセプターHAを、ベクターpcDNAI/Amp（Invitrogen） から誘導する。ベクターpcDNAI/Ampは以下を含有する：１）SV40複製起点、２） アンピシリン耐性遺伝子、３）E．coli複製起点、４）ポリリンカー領域、SV40 イントロンおよびポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター。完全なATPレセプ ター前駆体、およびその３'末端にインフレームで融合されたHAタグをコードす るDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化する。それゆ え、組換えタンパク質発現はCMVプロモーター下で支配される。HAタグは、先に 記載されたようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対 応する（I．Wilson、H．Niman、R.Heighten、A Cherenson、M．Connolly、およ びR．Lerner、1984，Cell 37，767（1984））。標的タンパク質へのHAタグの融 合により、HAエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出 が可能になる。 プラスミド構築ストラテジーを以下に記載する： ATPレセプターをコードするDNA配列（ATCC受託番号第97333号）を、２つのプ ライマーを用いたクローン化されたPCRにより構築する：５'プライマー５'GTCCA AGCTTGCCACCATGCTGGGGATCATGGCA３'（配列番号７）は、HindIII部位（太線）、 それに続く開始コドンから始まるATPレセプターコード配列の18ヌクレオチドを 含む；３'配列５'CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACTTTTCTCTGAAT GAAAG３'（配列番号８）は、XhoI部位（太線）、翻訳停止コドン、HAタグ、およ びATPレセプターコード配列の最後の18ヌクレオチド（停止コドンは含まない） に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、HindIII部位、インフレームで融 合したHAタグが続くATPレセプターコード配列、HAタグに隣接する翻訳終結停止 コドン、およびXhoI部位を含む。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクター（pcDN AI/Amp）を、HindIIIおよびXhoI制限酵素により消化し、そして連結する。連結 混合物を、E．coli SURE株（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA，9203 7）に形質転換し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、そし て耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、そして正 しいフラグメントの存在を制限分析で試験する。組換えATPレセプターの発現の ために、COS細胞をDEAE-DEXTRAN法により発現ベクターでトランスフェクトする( J．Sambrook、E．Fritsch、T．Maniatis、Molecular Cloning:A Laboratory Man ual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)）。ATPレセプターHAタンパク質の 発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出する（E．Harlow，D．Lane，An tibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press， (1988)）。細胞を、トランスフェクションの２日後、35S-システインで８時間標 識する。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液(150mM NaCl、１％NP-40、0.1％SDS、１％NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris(pH7.5))で溶 解する(Wilson，I.ら、同上 37:767(1984)）。細胞溶解物および培養培地の両方 を、HA特異的モノクローナル抗体により沈降させる。沈降したタンパク質を15％ SDS-PAGEゲル上で分析する。 実施例４ 遺伝子治療を介した発現 線維芽細胞は皮膚生検により被験体から得る。得られた組織を組織培養培地に 置き、そして小片に分離する。組織の小さな塊を、組織培養フラスコの湿った表 面に置き、それぞれのフラスコには約10個の塊をおく。フラスコを逆さまにし、 きつく閉め、そして室温に一晩放置する。室温で24時間後、フラスコを逆さまに し、そして組織の塊をフラスコの底に固定したままで、そして新鮮な培地（例え ば、10％FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むHamのF12培地）を 加える。次いで、これを37℃で約一週間インキュベートする。この時点で、新鮮 な培地を添加し、そして数日おきに次々に交換する。培養でのさらに２週間後、 線維芽細胞の単層が現れる。単層をトリプシン処理し、そしてより大きいフラス コに移す。 モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復が隣接するpMV-7（Kirschmeier， P.T．ら、DNA、7:219-25(1988)）を、EcoRIおよびHindIIIで消化し、続いて仔ウ シ小腸ホスファターゼで処理する。線形ベクターをアガロースゲルで画分し、そ してガラスビーズを用いて精製する。 本発明のポリペプチドをコードするcDNAは、それぞれ５'および３'末端配列に 相当するPCRプライマーを用いて増幅する。EcoRI部位を含む５'プライマー、お よび３'プライマーは、HindIII部位をさらに含む。等量のモロニーマウス肉腫ウ イルス線形骨格および増幅したEcoRIおよびHindIIIフラグメントを、T4DNAリガ ーゼの存在下、一緒に添加する。得られる混合物を、２つのフラグメントの連結 に適切な条件下で維持する。連結混合物を、細菌HB 101を形質転換するのに 使用し、次いでベクターが目的の遺伝子を適切に挿入したことを確認する目的で 、カナマイシン含有寒天上にプレートする。 広宿主性pA317またはGP+am12パッケージング細胞は、組織培養中で、10％仔ウ シ血清（CS）、ペニシリン、およびストレプトマイシン添加Dulbecco改変Eagle の培地（DMEM）中、コンフルエント濃度にまで増殖させる。次いで、この遺伝子 を含むMSVベクターを培地に加え、そしてパッケージング細胞をこのベクターで 形質導入する。パッケージング細胞は、ここでこの遺伝子を含む感染性ウイルス 粒子を産生する（パッケージング細胞をここでプロデューサー細胞という）。 新鮮な培地を形質導入されたプロデューサー細胞に加え、続いて培地をコンフ ルエントプロデューサー細胞の10cmプレートから回収する。使用した培地は、感 染性ウイルス粒子を含んでおり、ミリポアフィルターを通じて濾過し、剥離した プロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を線維芽細胞を感染させるのに使 用する。培地を線維芽細胞のサブコンフルエントのプレートから除去し、そして 即座にプロデューサー細胞由来の培地と交換する。この培地を除去し新鮮な培地 と交換する。ウイルス力価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞が感染して おり、選択は必要でない。力価が非常に低い場合は、neoやhisのような選択マー カーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。 次いで、操作された線維芽細胞を、単独でか、またはサイトデックス３マイク ロキャリアビーズ上でコンフルエントにまで増殖させた後のいずれかで宿主に注 入する。ここで、線維芽細胞はタンパク質産物を産生する。 本発明の多くの改変および変形が上記の教示を考慮すれば可能であり、したが って、特に記載された以外にも、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され 得る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                     Human G protein-coupled receptor   The present invention relates to newly identified polynucleotides, such polynucleotides Polypeptides, such polynucleotides and polypeptides For the use of tides and the production of such polynucleotides and polypeptides Related. The polypeptide of the present invention comprises a human 7-transmembrane G protein-coupled receptor. It is. More specifically, the 7-transmembrane coupled receptor is a human ATP receptor It has been speculatively identified. The present invention also inhibits the action of such polypeptides. About doing.   Numerous medically important biological processes involve G protein and / or Proteins involved in signal transduction pathways, including messengers (eg, cAMP) Is well established (Lefkowitz, Nature, 351). : 353-354 (1991)). In the present specification, these proteins are referred to as G proteins. Also referred to as proteins involved in pathways or PPG proteins. These proteins Some examples of quality include G-protein coupled (GPC) receptors (eg, GPC Receptors for Drenergic Drugs and Dopamine (Kobilka, B.K. Et al., PNAS, 84: 46-50 (1987); Kobilka, B.K. et al., Science, 238: 650-656 (1987); Bun. zow, J.R., et al., Nature, 336: 783-787 (1988))), G protein itself, Receptor proteins (eg, phospholipase C, adenyl cyclase, and Sphodiesterase) and actuator-protein (actuator protein) in) (eg, protein kinase A and protein kinase C) (Simon, M .I. Et al., Science, 252: 802-8 (1991)).   For example, in one form of signal transduction, the effect of hormone binding is Activation of the enzyme adenylate cyclase. Activation of enzymes by hormones Depends on the presence of nucleotide GTP, and GTP also affects hormone binding I can. G protein links the hormone receptor to adenylate cyclase You. G protein binds GTP to GDP when activated by hormone receptors Type It was shown to convert. The form with GTP is then activated adenyl Binds to acid cyclase. Hydrolysis of GTP to GDP depends on the G protein itself. And returns the G protein to its basal, inactive form. Therefore, G tamper Proteins are intermediates that relay signals from the receptor to the effector, and Plays two roles as a clock that controls the duration of the signal and signal.   Extracellular nucleotides such as ATP are responsible for platelet aggregation, vasoconstriction, cell division, Numerous biological functions including muscle and skeletal muscle contraction, and peripheral and central nerve transmission Can be affected. Gordon, J.L., Biochem. J. 233: 309-319 (1986). These ATP Extracellular effects are described in Burnstock G ((1978) Cell Membrane receptors for Drugs and H ormones: A multidisciplinary approach (ed. by Straub, R.W. and Bolis L.) 107 Pp. 118, Raven Press, New York))TwoClassified as a receptor It is mediated through the phosphorus receptor. PTwoReceptors increase smooth muscle tension Based on the order of ATP analog capabilitiesTwoX and PTwoy is subclassified (Burns tock G. and Kennedy, C., Gen. Pharmacol. 16: 433-440 (1985)). More recently Has further expanded the number of purinergic receptor subtypes (Burnstock G., Cell  Membrane receptors for Drugs and Hormones: A multidisciplinary approach (E. Straub, R.W. and Bolis L.) pp. 107-118, Raven Press, New York (978) ), P stimulated by ADP by being antagonized by ATPTwot rece P that recognizes puter subtype, UTP and ATPTwou receptor subtype (Murri n, R.J.A. and Boparder, M.R.Mol. Pharmacol. 41: 561-568 (1992)), and ATPFour-P that recognizes and causes cell membrane permeationTwoz receptor subtype added Was.   PC12 cells, which have numerous neural features and are used as neural models In extracellular ATP, rapid and transient increases in intracellular calcium levels and And release of neurotransmitters (Fasolato, C. Pizzo, P. and Pozzan, T., J. . Blol. Chem. 265: 20351-20355 (1990); Sela, D., Ram, E. and Atlas, D .; J. Biol. Chem. 266: 17990-17994 (1991); Majid, M.A., Okajima, F. and Kondo, Y. ., Biochem. Biophy. Acta 1136: 283-289 (1992)). Purine P on PC12 cellsTwoLes The scepter enables this interaction. New PTwoReceptor stimulates ATP [Ca2+] And α-35Characteristics of S-ATP binding (Kim, W.K. and Rabin, R.A., J. Blo. Chem., 269 (9): 6471-6477 (1994)).   Although the role of nucleotides in metabolism is well established, extracellular trans Their potential weight as a mitter, regulator, or modulator The necessity was recently recognized. Extracellular ATP is found in inositol in many cell types and preparations. Induces various responses such as stimulation of ureophospholipid inversion and activation of membrane conductivity (Burnstock, G., Nucleosides Nucleotides 10: 917-930 (19 91); Bean, B.P., Trends Pharmacol Sci. 13: 87-90 (1992); Edwards F.A., Gibb , A.J. and Colquhoun, D., Nature (London) 359: 144-147 (1992); Kastritis, C .H.C., Salm, A.K. and McCarthy, K., J. Neurochem. 58: 1277-1284 (1992)). These responses are PTwoATP receptor called purinoceptor Are known to be mediated by this family. (Burnstock, G. and Kennedy, C. ., Gen. Pharmacol. 16: 433-440 (1985); Gordon J.L., Biochem. J. 233: 309-319 (1986); Dubyak, G.R., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4; 295-300 (1991)), Some of them have been cloned (Lustig, K.D., Shiau, A.K., B rake, A.J. and Julius, D., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 90: 5113-5117 (1993 ); Webb, T.E., Simon, J., Krishek, B.J., Bateson, A.N., Smart, T.G., King , B.F., Burnstock, G., and Barnard, E.A., FEBS Lett 324: 219-225 (1993); Brake, A.J., Wagenbach, M.J. and Julius, D., Nature (London) 371: 519-52. 3 (1994); Valera, S., Hussy, N., Evans, R.J., Adami, N., North, R.A., Surp. renant, A and Buell, G., Nature (London) 371: 516-519 (1994)).   ATP is associated with inositol phosphate accumulation and intracellular Ca in pituitary cell cultures.2+ It has been shown to stimulate metabolism (Davidson, J.S., Wakefield, I.K., Sohni us, U., van der Merwe, P.A. and Millar, R.P., Endocrinology 126: 80-87 (1 990)), and data from fetal hypothalamic neuron cultures show that ATP is neuroendocrine. Suggest a possible regulatory role in the system (Chen, Z.P., Levy, A. and And Lightman, S.L., Brain Res. 641: 249-256 (1994)). ATP and UTP are ATP Acting on the pituitary gonadotropin-releasing hormone (GnRH) -responsive cells Quickly and dramatically in cytoplasmic Ca2+(Chen, Z.P., Levy, A., McArdl e, C.A. and Lightman, S.L., Endocrinology 135: 1280-1283 (1994)). ATP Les Scepters can also mediate significant release of pituitary gonadotropins, and ATP It can mediate that it can be released extracellularly from pituitary cells.   According to one aspect of the invention, a novel mature receptor polypeptide, and Fragments, analogs and the like that are biologically active and useful for diagnosis or therapy And derivatives are provided. The receptor polypeptide of the invention is of human origin.   According to another aspect of the present invention, a simple encoding the receptor polypeptide of the present invention is provided. An isolated nucleic acid molecule is provided, wherein the nucleic acid molecule is mRNA, cDNA, genomic DNA, And their antisense analogs, and biologically active and diagnostic or Includes those fragments that are useful for treatment.   According to another aspect of the present invention, a human cDNA comprising ATCC deposit no. Provided is an isolated nucleic acid molecule encoding the mature polypeptide to be expressed.   According to a further aspect of the invention, the expression of said polypeptide and the subsequent Under conditions that facilitate recovery of the polypeptide, the receptor polypeptide of the invention may be cloned. A recombinant prokaryotic host cell and / or recombinant eukaryote containing the nucleic acid sequence to be encoded. By recombinant techniques, including culturing host cells, such receptor poly A process for producing a peptide is provided.   According to a still further aspect of the present invention, there are provided Antibodies are provided.   According to another aspect of the present invention, it binds to and binds to a receptor polypeptide of the present invention. Screening methods for compounds that activate or inhibit the activation of Provided.   According to yet another embodiment of the invention, binding to the receptor polypeptide of the invention Activates it and mediates the physiological response of pituitary cells to release luteinizing hormone A process for administering to a host a compound that stimulates   According to another aspect of the invention, underexpression of a polypeptide or receptor polypeptide Gene therapy to treat conditions associated with under-expression of the ligand for the peptide Methods are provided for administering a receptor polypeptide of the present invention through therapy.   According to yet another embodiment of the invention, binding to the receptor polypeptide of the invention And administering a compound that inhibits activation of the receptor polypeptide of the invention Processes that include angina, myocardial infarction and stroke, thrombolysis Solution, angiogenesis, and prevention and / or treatment of arterial thrombosis, including cystic fibrosis. Useful for installation.   According to yet another aspect of the invention, specific for a polynucleotide sequence of the invention A nucleic acid probe comprising a nucleic acid molecule of sufficient length to hybridize It is.   According to yet another aspect of the invention, a nucleic acid encoding such a polypeptide For detecting diseases associated with mutations in the sequence and for receptor polypeptides. Diagnostic assays are provided for detecting altered levels of a soluble form.   According to still further aspects of the present invention, scientific research, DNA synthesis and DNA vectors Such receptor polypeptides for in vitro purposes related to the production of proteins Or a process utilizing a polynucleotide encoding such a polypeptide. Is provided.   These and other aspects of the invention will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein. Should be.   The following drawings are illustrative of embodiments of the present invention and are encompassed by the claims. It is not meant to limit the scope of the invention as described.   FIG. 1 shows the cDNA sequence of the G protein-coupled receptor of the present invention, and the corresponding inference. 1 shows a constant amino acid sequence. Use the standard one-letter abbreviations for amino acids. Sequencing, 37 3 An automatic DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc.) was used.   FIG. 2 shows that the polypeptide of the present invention (upper row) (SEQ ID NO: 2) and mouse PTwou receptor -(SEQ ID NO: 9).   According to one aspect of the present invention, comprising the deduced amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Nucleic acids (polynucleotides) encoding mature polypeptides provided Is done.   The polynucleotide of the present invention was found in a cDNA library derived from human placenta . It is structurally related to the G-protein coupled receptor family, and H It is a member of the family of the family. This encodes a 334 amino acid residue protein. Includes open reading frames to read. This protein is found in mouse PTwou Shows the highest degree of homology to the receptor, 29.787% over the entire amino acid range And a similarity of 51.064%.   According to another aspect of the invention, on November 6, 1995, American Type Culture Collection (12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA) Maturation expressed by the human cDNA contained in the deposited ATCC Deposit No. 97333 An isolated polynucleotide encoding a polypeptide is provided. Deposited The material used is the pBluescript SK (-) plasmid containing the full-length ATP receptor cDNA.   Deposits are subject to the Budapest Treaty on International Recognition of Deposits of Microorganisms for Patent Procedures Is maintained under. The shares are immutable and publicly issued at the time of the patent issuance. Outside the limits or conditions expressed. These deposits are available to those skilled in the art. Provided only as a matter of convenience and must be deposited under 35 U.S.C. 112.35. I do not admit that it is needed. Arrangement of polynucleotide contained in deposit The sequences, as well as the amino acid sequences of the polypeptides encoded thereby, are described herein. And any conflicts with the sequence descriptions herein. I have. A license is required to manufacture, use, or sell the deposit And no such license is granted by this. Book References to "polynucleotide" throughout the specification include the DNA deposited above.   The polynucleotide of the present invention may be in the form of RNA or DNA (this DNA may be cDNA, DNA, and synthetic DNA). DNA is double-stranded or single-stranded Possible and, if single-stranded, the coding strand or the non-coding (antisense) strand Can be The coding sequence encoding the mature polypeptide is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) Or the coding sequence may be identical to the coding sequence shown in As a result of duplication or degeneracy, the same mature polypeptide as the DNA of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) Can be different coding sequences that encode the code.   The polynucleotide encoding the mature polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) May include: only the coding sequence for the mature polypeptide; the coding for the mature polypeptide Sequence and additional coding sequence; coding sequence for mature polypeptide (and Depending on the additional coding sequence) and non-coding sequences (eg, introns or 5 'and / or 3' non-coding sequences of the mature polypeptide coding sequence).   Thus, the term "polynucleotide encoding a polypeptide" refers to a polypeptide. A polynucleotide containing only the coding sequence of the And / or polynucleotides containing non-coding sequences.   The present invention further relates to a polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Polypeptides as described herein that encode fragments, analogs, and derivatives of It relates to variants of nucleotides. A variant of the polynucleotide may be a polynucleotide. Naturally occurring allelic variants of polynucleotides or polynucleotides May be a variant.   Thus, the present invention provides the same mature polypeptide as shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Encoding polynucleotides, as well as variants of such polynucleotides. Including. This variant is a fragment of the polypeptide of FIG. Code body or analog. Such nucleotide variants are deletion variants , Substitution variants, and addition or insertion variants.   As shown herein above, the polynucleotide is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). May have a coding sequence that is a naturally occurring allelic pre-variant of the coding sequence shown . As is known in the art, an allelic variant is one or more nucleotide substitutions. Another form of a polynucleotide sequence that may have substitutions, deletions or additions, Does not substantially alter the function of the encoded polypeptide.   The polynucleotide also encodes a soluble form of the ATP receptor polypeptide. Which can be cut from the TM and intracellular domains of the full-length polypeptides of the invention. The extracellular portion of the removed polypeptide.   The polynucleotide of the present invention also allows for purification of the polypeptide of the present invention. It may have the coding sequence fused in frame to the marker sequence. Marker sequence For example, in the case of a bacterial host, the purification of the mature polypeptide fused to the marker Can be a hexahistidine tag supplied by the pQE vector . Alternatively, for example, the marker sequence is used in a mammalian host (eg, COS-7 cells). If used, it may be a hemagglutinin (HA) tag. HA tag for influenza blood Consistent with an epitope derived from the hemagglutinin protein (Wilson, I. et al., Cell, 37 : 767 (1984)).   The invention further provides that at least 70%, preferably at least 90%, and And more preferably at least 95% identity, the arrangement described herein above. For polynucleotides that hybridize to a column. The invention particularly relates to A polynucleotide that hybridizes to the above polynucleotide under stringent conditions. For nucleotides. As used herein, the term "stringent conditions "Means that hybridization is at least 95% between sequences, and preferably Meaning occurs only when at least 97% identity is present. preferable In one embodiment, a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide as described herein above. The polynucleotide is a mature polypeptide encoded by the cDNA of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). Retains substantially any of the same biological functions or activities as tide (ie, Even if the polypeptide does not function as a membrane-bound ATP receptor, It retains the ability to bind the ligand to the soluble ATP receptor. Function (eg, by eliciting a second messenger response) Code the peptide.   Alternatively, the polynucleotide is hybridized to a polynucleotide of the invention. At least 15 and have identity thereto as described hereinabove. Bases, preferably at least 30 bases and more preferably at least 50 bases. And the polynucleotide may or may not retain activity . For example, such a polynucleotide may be the polynucleotide of SEQ ID NO: 1, or Is used as a probe for the variant (for example, for recovery of a polynucleotide) , Or as a diagnostic probe or PCR primer).   Accordingly, the present invention relates to a polynucleotide encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2. On the other hand, at least 70% identity, preferably at least 90% identity, and More preferably, a polynucleotide having at least 95% identity, and Polynucleotides complementary to them, as well as portions thereof (at least 30 contiguous Bases, and preferably having at least 50 consecutive bases) Polypeptides encoded by such polynucleotides.   Fragments of this gene are used for hybridization in cDNA libraries. Has high sequence similarity to the gene of the present invention, Alternatively, other genes with similar biological activities can be isolated. This type of professional Is at least 15 bases, preferably at least 30 bases and most preferably It has at least 50 bases or more. This probe also has a cD corresponding to the full-length transcript. NA clones and genomic clones, or clones completely containing the gene of the present invention (Including control and promoter regions, exons and introns) Can be used to determine Examples of this type of screening are known DNA sequences. By using the sequence, the coding region of the gene can be isolated and the oligonucleotide Synthesizing a probe. Has a sequence complementary to the sequence of the gene of the present invention Labeled oligonucleotides can be libraries of human cDNA, genomic DNA, or mRNA To screen for library members to which the probe hybridizes. Used to make decisions.   The present invention further provides an ATP receptor having the deduced amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Polypeptides, as well as fragments of such polypeptides, analogs And derivatives.     The terms "fragment", "derivative", and "analog" are shown in FIG. A polypeptide substantially the same as such a polypeptide when referring to the polypeptide of item 2) Retains biological function or activity (ie, functions as an ATP receptor) Alternatively, the polypeptide is a G protein-coupled receptor (eg, this receptor Ability to bind the ligand to the receptor, even if it does not function as a soluble form of A polypeptide that either retains or is forceful.   The polypeptide of the present invention can be a recombinant polypeptide, a natural polypeptide or a synthetic polypeptide. It can be a synthetic polypeptide, preferably a recombinant polypeptide.   A fragment, derivative, or analog of the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) Means that (i) one or more amino acid residues are conserved amino acid residues or non-conserved amino acid residues (Preferably conserved amino acid residues), and such substituted amino acids The acid residue may be an amino acid residue that can be encoded by the genetic code, or Or (ii) one or more amino acid residues may substitute for a substituent. Or (iii) the mature polypeptide increases the half-life of the polypeptide. Fused with another compound, such as a compound to be added (eg, polyethylene glycol) Or (iv) refinement of the mature polypeptide or proprotein sequence. Further amino acids used for the production are fused to the mature polypeptide, Alternatively, (v) the fragment of the polypeptide is soluble (ie, And still further binds to ligands for membrane-bound receptors) possible. Such fragments, derivatives and analogs are described in the teachings herein. From the illustration, it is considered to be within the purview of those skilled in the art.   The polypeptides and polynucleotides of the present invention are preferably in isolated form And is preferably purified to homogeneity.   The polypeptide of the present invention may be a polypeptide of SEQ ID NO: 2 (particularly, a mature polypeptide). At least 70% similarity to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 (preferably Or at least 70% identity), more preferably to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 At least 90% similarity (more preferably at least 90% identity) Even more preferably at least 95% similarity to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 Polypeptides having the same (even more preferably at least 95% identity) And, further, in part of such a polypeptide, generally at least 30 amino acids, And more preferably a portion of such a polypeptide comprising at least 50 amino acids Including minutes.   As is known in the art, "similarity" between two polypeptides is The amino acid sequence of the tide and its conserved amino acid substitutions can be Determined by comparing against the sequence.   Fragments or portions of the polypeptides of the present invention can be bound by peptide synthesis. Can be used to produce the corresponding full-length polypeptide, and Can be used as an intermediate to produce a full-length polypeptide. The present invention The fragment or portion of the polynucleotide of the present invention is a full-length polynucleotide according to the present invention. Can be used to synthesize the code.   The term "gene" refers to a segment of DNA associated with producing a polypeptide chain. Which means "leader and trailer" around the coding region. r) "region and intervening sequences (in) between the individual coding segments (exons). TRON).   The term "isolated" refers to a substance that is in its natural environment (e.g., when it occurs in nature). Means taken out of the natural environment). For example, living movement A naturally occurring polynucleotide or polypeptide present in a product is isolated But not separated from some or all of the coexisting materials in the natural system. The same polynucleotide or polypeptide that has been isolated has been isolated. this Such a polynucleotide can be part of a vector and / or The polynucleotide or polypeptide can be part of the composition, and Such a vector or composition is not part of its natural environment, and is therefore obtain.   The present invention also provides a vector comprising the polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention. Cells genetically engineered with E. coli and polypep of the invention by recombinant technology It relates to the production of pide.   A host cell is a vector of the present invention (for example, a cloning vector or Can be genetically engineered (transduced or otherwise) using an expression vector. Or transformed or transfected). Vectors, for example , Plasmids, virus particles, phages and the like. Manipulated host The cell may be used to activate a promoter, select a transformant, or Can be cultured in conventional nutrient media that has been appropriately modified to amplify You. Culture conditions (eg, temperature, pH, etc.) will depend on the host cell chosen for expression. Conditions previously used, and will be apparent to those skilled in the art.   The polynucleotide of the present invention is used for producing a polypeptide by recombinant technology. Can be used. Thus, for example, a polynucleotide expresses a polypeptide May be included in any one of a variety of expression vectors. Vector like this Encompasses chromosomal, non-chromosomal, and synthetic DNA sequences. This Such vectors include, for example, derivatives of SV40; bacterial plasmids; phage DNA; Culovirus; yeast plasmid; combination of plasmid and phage DNA And viral DNAs (eg, vaccinia, adenovirus, chicken) Pox virus, and pseudorabies). However, is it replicable in the host, Any other vector can be used as long as it is viable.   The appropriate DNA sequence can be inserted into the vector by various procedures. Generally, DNA distribution The row is inserted into the appropriate restriction endonuclease site by procedures known in the art. It is. Such and other procedures are deemed to be within the purview of those skilled in the art.   The DNA sequence in the expression vector can be driven by an appropriate expression control sequence (promoter) And directs the synthesis of mRNA. Representative examples of such promoters May include: the LTR or SV40 promoter,E.coli lac ort rp , Λ phage PLPromoters and prokaryotic or eukaryotic cells or Is another promoter known to regulate gene expression in the virus - Expression vectors also contain a ribosome binding site for translation initiation and a transcriptional target. Contains a minator. The vector also contains appropriate sequences for amplifying expression. Can have.   Furthermore, the expression vector is preferably for selection of transformed host cells. Phenotypic characteristics (eg, dihydrofolate reductor for eukaryotic cell culture) Ze or neomycin resistance, or for exampleE.coliResistance to tetracycline Or one or more selectable marker genes that provide for You.   A suitable DNA sequence as described herein above, as well as a suitable promoter sequence or The vector containing the control sequences is used to transform the Can be used to express   Representative examples of suitable hosts may include: bacterial cells (eg,E.coli ,Streptomyces,Salmonella typhimuriumA fungal cell (eg, yeast); Insect cells (eg,DrosophilaandSpodoptera Sf9); Animal cells (eg, CH O, COS or Bowes melanoma); adenovirus; plant cells and the like. Choosing the right host Choices are considered to be within the purview of those skilled in the art from the teachings herein.   More particularly, the present invention also includes one or more of the sequences broadly described above. Includes recombinant constructs. The construct may be a vector (eg, a plasmid vector or Or a viral vector), in which the sequence of the present invention is contained in the forward direction. Or they are inserted in the opposite direction. In a preferred aspect of this embodiment, the construct Further comprises a regulatory sequence operably linked to the sequence (eg, including a promoter). To). Numerous suitable vectors and promoters are available to those of skill in the art. Knowledgeable and commercially available. The following vectors are provided as examples. Bacteria Gender: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pblues ript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK2 23-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotic: pWLNEO, pSV2CAT, p OG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). But, Any other plasmids or vectors that are capable of replicating in the host It can be used as long as it is viable.   Promoter region is CAT (chloramphenicol transferase) vector Using any vector that has a desired marker or other Can be selected from Two suitable vectors are PKK232-8 and PCM7. In particular Well known bacterial promoters include lacI, lacZ, T3, T7, gpt, λPR, PLAnd t rp. Eukaryotic promoters are CMV immediate early, HSV thymidine kinase , Early and late SV40, LTR from retrovirus, and mouse metalloti Includes Onein I. Selection of appropriate vectors and promoters is Within the level of the trader.   In a further embodiment, the present invention relates to a host cell containing the above-described construct. Host cells can be higher eukaryotic cells (eg, mammalian cells) or lower eukaryotic cells. Or a host cell can be a prokaryotic cell (eg, a yeast cell). Bacterial cell). The introduction of the construct into the host Transfection, DEAE-dextran mediated transfection, or Can be achieved by Lectroporation (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., B asic Methods in Molecular Biology, (1986)).   Using the construct in the host cell, a gene encoded by the recombinant sequence in a conventional manner. Gene products can be produced. Alternatively, the polypeptides of the present invention can It can be produced synthetically by an adult machine.   Mature proteins are suitable for use in mammalian cells, yeast, bacteria, or other cells. And can be expressed under the control of a promoter. The cell-free translation system is also a DNA construct of the present invention. Can be used to produce such proteins using RNA from You. Cloning vectors and vectors suitable for use in prokaryotic and eukaryotic hosts And expression vectors are described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) (the disclosure of which is incorporated herein by reference. Which is incorporated by reference).   Transcription of a DNA encoding a polypeptide of the present invention by higher eukaryotes may be a vector It is increased by inserting an enhancer sequence into the gene. Enhancers are DNA Cis-acting element, usually about 10 to about 300 bp, To increase its transcription. For example, on the late side of bp 100-270 of the replication origin SV40 enhancer, cytomegalovirus early promoter enhancer, Polyoma enhancer and adenovirus enhancer on the late stage of origin Is mentioned.   Generally, a recombinant expression vector contains an origin of replication and And a selectable marker (eg,E.coliAmpicillin resistance gene andS.cerevisi ae TRP1 gene) and highly expressed genes that direct transcription of downstream structural sequences Contains a promoter. Such promoters are glycolytic enzymes (eg, 3- Phosphoglycerate kinase (PGK)), α-factor, acid phosphatase, or heat It can be derived from an operon encoding a shock protein or the like. The heterologous sequence is Translation initiation and termination sequences and, preferably, A leader sequence capable of directing secretion to the lipoplasmic space or extracellular medium and an appropriate Assembled in phase. If desired, the heterologous sequence may have desired characteristics (eg, expressed N-terminal identification peptide that provides for the stabilization or simplified purification of a modified recombinant product) May be encoded.   Useful expression vectors for bacterial use are operable with a functional promoter Readout phase with the appropriate translation initiation and termination signals. It is constructed by inserting a structural DNA sequence that encodes a protein. Vector -Ensures the maintenance of one or more phenotypic selectable markers and vectors, and It optionally contains an origin of replication to provide for amplification in the host. Transformation Prokaryotic hosts suitable forE.coli,Bacillus subtilis,Salmonella typhimur ium And species within the genera Pseudomonas, Streptomyces, and Staphylococcus Although encompassing various species, other species can also be used as selections.   As a representative, but non-limiting example, an expression vector useful for bacterial use is Commercially available containing the genetic elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC 37017) And a bacterial origin of replication. This Commercially available vectors such as, for example, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Upp. sala, Sweden) and GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). these The pBR322 "backbone" portion of the plasmid contains a suitable promoter and the structural sequence to be expressed. Be combined.   Following transformation of the appropriate host strain and propagation of the host strain to an appropriate cell density, The selected promoter is a suitable means (eg, temperature shift or chemical induction) And the cells are cultured for an additional period.   Cells are typically harvested by centrifugation and applied by physical or chemical means. More disrupted and the resulting crude extract is retained for further purification.   Microbial cells used in protein expression include freeze-thaw cycles, supersonic Break by any convenient method, including sonication, mechanical disruption, or use of cell lysing agents Can be crushed. Such methods are well-known to those skilled in the art.   Various mammalian cell culture systems have also been used to express recombinant proteins. Can be Examples of mammalian expression systems are described in Gluzman, Cell, 23: 175 (1981). COS-7 strain of monkey kidney fibroblasts and other cells capable of expressing compatible vectors Cell lines such as C127, 3T3, CHO, HeLa, and BHK cell lines. Feeding Product expression vectors contain an origin of replication, appropriate promoters and enhancers, and Required ribosome binding site, polyadenylation site, splice donor site Position and splice acceptor site, transcription termination sequence, and 5 'flanking It also contains non-transcribed sequences. SV40 splice site and polyadenylation site The derived DNA sequence is used to provide the necessary non-transcribed genetic elements obtain.   ATP receptor polypeptide can be obtained from recombinant cell culture by methods including: It can be recovered and purified. Ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction, On or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography , Hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography , Hydroxylapatite chromatography, and lectin chromatography Yee. If necessary, the protein refolding step can It can be used to complete protein placement. Finally, high-performance liquid chromatography Chromatography (HPLC) can be used for the final purification step.   The polypeptides of the present invention may be natural purified products or products of chemical synthetic procedures. Or a prokaryotic or eukaryotic host (eg, in culture) Bacterial, yeast, higher plants, insects, and mammalian cells) Can be done. Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptide of the invention May be glycosylated or unglycosylated. Departure The light polypeptide may also include the first methionine amino acid residue.   The polynucleotides and polypeptides of the present invention can be used as research reagents and human diseases. It can be used as a substance for treatment and diagnosis of a disease.   The ATP receptor polypeptide of the present invention comprises the receptor polypeptide of the present invention. Compounds that activate (agonists) or inhibit their activation (antagonists) Can be used in the process of object screening.   Generally, such screening procedures involve the receptor of the present invention on their cell surface. Providing appropriate cells expressing the polypeptide. Such cells Includes cells from mammals, yeast, Drosophila or E. coli. Special In addition, the polynucleotide encoding the receptor of the present invention can be used to transfer cells. Used to express a polypeptide of the invention. next The expressed receptor is contacted with a test compound to bind, stimulate or stimulate a functional response. Or observe inhibition.   One such screening procedure is for expressing a polypeptide of the invention. The use of melanophore cells to be transfected for Such a script The cleaning technology is described in PCT WO 92/01810 (published February 6, 1992).   Thus, for example, such an assay may require receptor ligands and screens. Both the compound to be trained and the melanophore that encodes the receptor Inhibits activation of the receptor polypeptide of the present invention by contacting It can be used to screen compounds. Signa caused by ligand Inhibition of the compound indicates that the compound is a potential antagonist of this receptor. That is, it indicates that it inhibits the activation of ATP receptor.   This screening involves contacting such cells with the compound to be screened. And whether such a compound produces a signal, ie, Activate the receptor by determining if the compound activates the receptor Can be used to determine a compound.   Other screening techniques are described, for example, in Science, 246, 181-1296 (1989 Oct. Extracellular pH caused by receptor activation, as described in In a system for measuring changes, cells expressing the polypeptide of the present invention (for example, Transfected CHO cells). For example, the compound may be a receptor of the invention. -Can be contacted with cells expressing the polypeptide and The answer (eg, signal transduction or pH change) is that the potential compound activates the receptor. It can be measured to determine if it is sexually active or inhibits.   Another such screening technique is RN encoding a polypeptide of the invention. Introducing A into Xenopus oocytes and transiently expressing the receptor. Next The receptor oocytes are thought to inhibit receptor activation. If screening for compounds, the receptor ligand and screening And then subsequently inhibit or activate the calcium signal. Detection is performed.   Another screening technique is to use the polypeptide with phospholipase C or D Includes expression of a linked polypeptide of the invention. Representative examples of such cells Examples include endothelial cells, smooth muscle cells, fetal kidney cells and the like. Screenini Can activate the receptor or activate phospholipase, as described hereinabove. This can be achieved by detecting inhibition of receptor activation by a secondary signal.   Another method is to block the binding of labeled ligand to cells that have receptors on the cell surface. Determining the harm of the receptor polypeptide of the antagonist of the present invention. Screening a compound that inhibits activation. Such a method ATP receptor polypeptide so that the cell expresses the ATP receptor on its surface. Transfecting eukaryotic cells with the encoding DNA; Contacting the cell with the compound in the presence of a known ligand. The ligand is , For example, by radioactivity. Labeled ligand binds to ATP receptor The determined amount is measured, for example, by measuring the radioactivity of the ATP receptor. ATP reception The compound is ATP receptor as determined by the decrease in labeled ligand binding to the When bound to a putter, the binding of the labeled ligand to the ATP receptor is inhibited.   G protein-coupled receptors are ubiquitous in mammalian hosts, and Responsible for many biological functions, including many pathological conditions. Therefore, on the other hand, Compounds that can stimulate ATP receptor polypeptide and, on the other hand, inhibit its function It is desirable to find things and drugs.   For example, compounds that activate G-protein coupled receptors may be useful for therapeutic purposes (eg, For example, asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, hypotension, urinary retention ), And treatment of osteoporosis).   In general, compounds that inhibit the activation of G protein-coupled receptors are available for various treatments. The purpose of treatment (eg, hypertension, angina, myocardial infarction, ulcer, asthma, allergy, pre-benign Ovarian hypertrophy, as well as psychosis and neurological disorders (schizophrenia, recurrent excitement, depression , Delirium, dementia or severe mental retardation, Huntington's chorea or Gilles dila To treatment (including dyskinesias such as urett syndrome), reversal of endogenous anorexia and And control of binge eating).   The antibody, or in some cases the oligonucleotide, may be an ATP receptor of the invention. Can antagonize and bind to the ATP receptor, but the ATP receptor Does not elicit a second messenger response as it inhibits the activity of Antibodies are generally Anti-idiotypic antibodies that recognize unique determinants associated with the antigen-binding site of the antibody Including. Potential antagonist compounds are also closely related to ATP receptor ligands Proteins, ie, fragments of ligands, which Biological function and elicits a response when binding to the ATP receptor Absent.   Antisense constructs prepared by use of antisense technology are To control gene expression via tumorigenesis or antisense DNA or RNA Both of these methods can be used to bind polynucleotides to DNA or RNA. It is based on things. For example, a polynucleotide encoding a mature polypeptide of the present invention. The 5 'coding portion of the nucleotide sequence is an antisense RNA fragment approximately 10 to 40 base pairs in length. Used to design lignonucleotides. DNA oligonucleotides are Designed to be complementary to the region of the gene involved in transcription (triple helix-Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); and De. rvan et al., Science, 251: 1360 (1991)), thereby allowing transcription and ATP Inhibits receptor production. Antisense RNA oligonucleotides are in vivo Hybridizes to mRNA at and binds the mRNA molecule to the G protein-coupled receptor. Block translation (antisense-0kano, J. Neurochem., 56: 560 (199l); Oll godeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press , Boca Raton, FL (1988)). The above oligonucleotides can also be delivered to cells. , Whereby antisense RNA or DNA inhibits ATP receptor production For expression in vivo.   Small molecules that bind to ATP receptors may interfere with normal biological activity Access to the ligand is not possible, for example, small peptides or peptide-like molecules Can also be used to inhibit the activation of the ATP receptor polypeptide of the invention .   The soluble form of the ATP receptor (eg, a fragment of this receptor) Binds to a ligand, and this ligand interacts with a membrane-bound ATP receptor Can be used to inhibit receptor activation by preventing activation.   In general, an antibody to the ATP receptor determined by the screening procedure Tagonists can be provided for various therapeutic purposes. For example, such anta Gonists include hypertension, angina, myocardial infarction, ulcers, asthma, allergies, mental illness, It has been used for the treatment of depression, migraine, vomiting, and benign prostatic hypertrophy.   Antagonists specific to the ATP receptor of the present invention include angina, myocardial infarction and And treatment of arterial thrombi, including stroke, thrombosis, angiogenesis, and cystic fibrosis. Can be used. The antagonist can be a pharmaceutically acceptable carrier (eg, the present (Described in the specification).   Agonists for G-protein coupled receptors also include asthma, Parkinson Disease, acute heart failure, hypotension, urinary retention, and treatment of osteoporosis. Useful for   Agonists to the receptors of the invention include treatment of chronic bronchitis and Physiological response in pituitary cells, especially gonadotropin-producing cells (luteinizing hormone) (Including monkey release).   The antagonist or agonist compound is combined with a suitable pharmaceutical carrier. Can be used. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the compound, and And an acceptable carrier or excipient. Such carriers include physiological Saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol, ethanol, And combinations thereof, but are not limited thereto. The prescription is Should be adapted to the mode of application.   The invention also relates to one or more components filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the invention. A pharmaceutical pack or kit comprising the container of Such containers (single or Controls the manufacture, use, or sale of drugs or biological products Product labeling in a format prescribed by government agencies, which may be Represents an institutional approval in manufacture, use, or sale for administration. further The pharmaceutical compositions of the present invention can be used in combination with other therapeutic compounds.   Pharmaceutical compositions can be, for example, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal, or Or it can be administered in a convenient manner by the intradermal route. Pharmaceutical compositions may be used to treat Administered in an amount effective for placement and / or prevention. In general, pharmaceutical compositions Administered in an amount of at least about 10 μg / kg body weight, and often they It is administered in an amount not exceeding mg / kg body weight. In many cases, the dosage is about 10 μg / k / day The dose ranges from g body weight to about 1 mg / kg body weight, taking into account the administration route, symptoms, and the like.   ATP receptor polypeptides and compounds (these are polypeptides) Used in accordance with the present invention by expression of such a polypeptide in vivo. obtain. This is often called "gene therapy"   Thus, for example, a cell from a patient can be a polynucleotide encoding a polypeptide. Can be engineered ex vivo with peptide (DNA or RNA) and then manipulated cells The vesicle is provided to a patient to be treated with the polypeptide. Such a method is It is well known in the art. For example, a cell may comprise an RNA encoding a polypeptide of the invention. Is manipulated by procedures known in the art by use of retroviral particles containing Can be made.   Similarly, cells can be used, for example, to express the polypeptide for in vivo expression of the polypeptide. It can be manipulated in vivo by known procedures in the field. As is known in the art, To produce retroviral particles containing RNA encoding the light polypeptide Producer cells for manipulating cells in vivo and in vivo May be administered to a patient for expression of the polypeptide. In this way, These and other methods for administering the disclosed polypeptides are described in the teachings of the present invention. It should be clear to the skilled person from the illustration. For example, expression vehicles for manipulating cells The vesicle can be other than a retrovirus (eg, an adenovirus). This It can be used to manipulate cells in vivo after combination with a suitable delivery vehicle. Can be used.   The retroviral plasmid vector referred to herein above is derived from Retroviruses include Moloney mouse leukemia virus, spleen necrosis virus, retro Virus (eg, Rous sarcoma virus, Harvey sarcoma virus, avian leukemia Irs, gibbon leukemia virus, human immunodeficiency virus, adenovirus, Myeloproliferative sarcoma virus, and breast tumor virus). It is not limited to this. In one embodiment, the retroviral plasmid The vector is derived from Moloney murine leukemia virus.   The vector contains one or more promoters. Suitable promoter that can be used Are retroviral LTRs; SV40 promoter; and Miller et al.Biotechniques 7 Vol. 9, No. 980-990 (1989), the human cytomegalovirus (CMV) pro Motor or any other promoter (eg, a eukaryotic cellular promoter Cellular promoters such as histone, pol III and beta actin promoters -Including, but not limited to). Used Other viral promoters that can be used are the adenovirus promoter, thym Includes gin kinase (TK) promoter and B19 parvovirus promoter However, the present invention is not limited to these. Selection of an appropriate promoter is included herein. Will be apparent to those skilled in the art from the teachings made.   The nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention may be under the control of a suitable promoter. It is in. Suitable promoters that can be used are adenovirus major late promoters. Adenovirus promoters, such as promoters; or cytomegalovirus (CMV A) a heterologous promoter such as a promoter; a RS virus (RSV) promoter; Inducible promoters such as MT promoter, metallothionein promoter; Heat shock promoter; albumin promoter; ApoAI promoter; Robin promoter; a virus such as the herpes simplex thymidine kinase promoter Rustymidine kinase promoter; retroviral LTR (described hereinabove Β-actin promoter; and Include, but are not limited to, the human growth hormone promoter. Promoter Is also a natural promoter that controls the gene encoding the polypeptide. Can get.   Retroviral plasmid vector transforms a packaging cell line , Used to form producer cell lines. Can be transfected Examples of packaging cells include PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT -19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP + E-86, GP + envAm12 and Miller,Human Gene Therapy 1, Vol. 5-14 (1990), which is hereby incorporated by reference in its entirety. As well as, but not limited to, the DAN cell lines described in US Pat. This baek The translator can transduce the packaging cells by any means known in the art. Such means include electroporation, the use of liposomes, and CaPOFour Including but not limited to precipitation. In one alternative, retrovirus Plasmid vectors can be encapsulated in liposomes or bound to lipids. Can be combined and then administered to a host.   The producer cell line is a nucleic acid sequence (single or single) encoding this polypeptide. Produce infectious retroviral particles containing Then, such a retro Viral vector particles can eukaryotic cells either in vitro or in vivo. Can be used for transduction. The transduced eukaryotic cell is a polypeptide Expresses the nucleic acid sequence (s) encoding the code. Eukaryotes that can be transduced Biological cells include embryonic stem cells, embryonal carcinoma cells, and hematopoietic stem cells, hepatocytes, and fibrils. Including blasts, myoblasts, keratinocytes, endothelial cells and bronchial epidermal cells, It is not limited to these.   The present invention also provides ligands that are not known to be capable of binding to ATP receptors. Providing a method for determining whether it can bind to such a receptor, This method uses the ATP receptor under conditions that permit binding of the ligand to the ATP receptor. Contacting a mammalian cell expressing a protein with a ligand, binding to the receptor Detecting the presence of the ligand, and thereby binding the ligand to the receptor. Determining whether they match. In the present specification, the above-mentioned agonist and A system for determining a receptor and / or antagonist comprises a ligand binding to a receptor. Can also be used to determine the code.   The present invention also provides methods for detecting the presence of mRNA encoding the receptor, A method for detecting the expression of the ATP receptor polypeptide of the present invention on the surface of cells The method comprises the steps of obtaining total mRNA from the cell, and the mRNA thus obtained. NA is specifically hybridized with a sequence contained in the sequence of the nucleic acid molecule encoding the receptor. A nucleic acid probe containing a nucleic acid molecule of at least 10 nucleotides capable of redistribution; Contacting under hybridizing conditions, hybridized to the probe detecting the presence of the mRNA, and thus, the expression of the receptor by the cell Detecting.   The present invention also identifies a receptor associated with the receptor polypeptide of the present invention. Provide a way to These related receptors are the ATP receptors of the present invention. Low stringency cross-hybridization due to homology with polypeptide Interacts with the relevant or related natural or synthetic ligands And / or genetic or pharmacological of the ATP receptor polypeptide of the present invention Can be identified by identifying receptors that exclude similar behavior after blockade You.   The present invention also provides diagnostics (eg, some diseases are caused by genetically defective genes). )). These genes are defective genes Is compared with the sequence of a normal gene. as a result, It can be shown that the "mutant" gene is associated with abnormal receptor activity. Sa Furthermore, yet another means of demonstrating or identifying mutations is the use of functional assay systems (eg, , Colorimetric assay, expression on McConkey plates, receptor deficiency in HEK293 cells In complementation experiments in strains), a suitable vector Can be inserted into the reactor. Once the “mutated” gene is identified, the “mutated” Populations for carriers of the scepter gene may be screened.   Individuals having a mutation in the gene of the present invention can be obtained at the DNA level by various techniques. Can be detected. Nucleic acids for diagnosis may be derived from patient cells (eg, blood, urine, saliva, tissues). Tissue biopsy, and autopsy material, including but not limited to). Geno DNA can be used directly for detection, or PCR (Saiki et al.,Nat ure 324: 163-166 (1986)). There is RNA Alternatively, cDNA can also be used for the same purpose. By way of example, the nucleic acids of the invention PCR primers that identify and analyze mutations in the gene of the invention Can be used to For example, deletions and insertions can be compared to normal genotypes. Change in the size of the amplified product in the kit. Point mutation is a radioactive marker Identified RNA of the invention or or radiolabeled antisense D of the invention It can be identified by hybridizing the amplified DNA to an NA sequence. Complete All matched sequences were mismatched due to RNaseA digestion or differences in melting temperatures. It can be distinguished from double helix. Such diagnostic methods are particularly useful for prenatal or neonatal Even diagnosis is useful. Sequence differences between the reference gene and the "mutant" A can be revealed by sequencing. In addition, cloned DNA segments Can be used as probes to detect specific DNA segments. this The sensitivity of the method is significantly enhanced when combined with PCR. For example, Immers are double-stranded PCR products or single-stranded template generated by modified PCR. Used with children. This sequencing was performed using conventional radiolabeled nucleotides. This is done either by a procedure or by an automated sequencing procedure using fluorescent tags.   Genetic testing based on DNA sequence differences can be performed on gels with or without denaturing agents. Achieved by detecting changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments in yeast Can be Sequence changes at specific locations can also be detected in nuclear protection assays (eg, RNases and And S1 protection or chemical cleavage methods (eg, cotton et al.,PNAS,USA, 85: 4397-4401 1985 ).   In addition, some diseases have gene expression that can be detected by changes in mRNA Or as a result of or characterized by the change in. There Indicate that the gene of the invention expresses a reduced function associated with this type of receptor. Can be used as a reference to identify a solid.   The invention also provides for the ability of the ATP receptor polypeptides of the invention to be expressed in a variety of tissues. It also relates to diagnostic assays for detecting altered levels of the soluble form. Host Method for detecting the level of soluble receptor polypeptide in a sample of Assays are known to those of skill in the art and include radioimmunoassays, competitive binding assays, Western blot analysis, and is preferably known as an ELISA assay. You.   An ELISA assay initially comprises an antibody specific for the antigen of the ATP receptor polypeptide, It preferably involves preparing a monoclonal antibody. In addition, reporter antibodies Is prepared against the monoclonal antibody. Radioactivity for the reporter antibody, Fluorescent or detection reagents such as horseradish peroxidase enzyme in this example To combine. Here, the sample is removed from the host and the solid support (eg, in the sample) On a polystyrene dish that binds to the protein. Next Remove all free protein binding sites on the dish with bovine serum albumin. By incubating with a non-specific protein such as . Next, the monoclonal antibody is incubated in the dish, during which Any ATP receptor with a clonal antibody bound to a polystyrene dish Binds to proteins. Wash off any unbound monoclonal antibody with buffer You. The reporter antibody linked to horseradish peroxidase was Any reporter antibody bound to the ATP receptor protein. Binds to noclonal antibodies. Next, the unbound reporter antibody is washed away. . The peroxidase substrate is then added to the dish and developed at a given time did ATP receptor present in a given volume of a patient sample when the amount is compared to a standard curve. It was the measured value of the amount of the terprotein.   The sequences of the present invention are also valuable for chromosome identification. This sequence is Can specifically target and hybridize to a particular location in a chromosome . In addition, it is now necessary to identify specific sites on the chromosome. Currently, chromosome position Chromosome labeling reagent based on actual sequence data (repeated polymorphism) available for labeling Almost no. The mapping of DNA to chromosome according to the present invention is based on these sequences. This is an important first step in correlating with a disease gene.   Briefly, the sequence consists of the PCR primers (preferably 15-25 bp) from the cDNA. It can be mapped to a chromosome by preparation. Computer analysis of cDNA Does not span more than one exon in nome DNA, thus complicating the amplification process Used to quickly select primers to be used. Then these primers Used for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes Is done. Only hybrids containing the human gene corresponding to the primer are amplification flags Cause a mentor.   PCR mapping of somatic cell hybrids assigns specific DNA to specific chromosomes A quick procedure for The present invention using the same oligonucleotide primer Use a panel of fragments from a particular chromosome or similar size Sublocalization achieved using pools of different genomic clones Can be achieved. Other mapping lists that can also be used to map to chromosomes For the strategy, in situ hybridization, labeled flow sorting (f low-sorted) chromosome prescreening and chromosome-specific cDNA library Pre-selection by hybridization to construct a tree is included.   Fluorescence in situ hybridization of cDNA clones to metaphase chromosome spreads (FISH) can be used to provide a precise chromosomal location in one step. This Can be used with cDNAs as short as 50 or 60 bases. As a review of this technology Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon See Press, New York (1988).   Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical The location can be correlated with the genetic map data. Such data, for example, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins University Welch  (Available online from the Medical Library). Then, The relationship between the gene mapped to one chromosomal region and the disease is determined by linkage analysis (physical neighbors). (Inheritance of adjacent genes).   Next, determine the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals There is a need. Mutation is observed in some or all affected individuals but is normal If not observed, this mutation appears to be a causative agent of the disease.   With the current resolution of physical and genetic mapping techniques, disease A cDNA correctly located in a chromosomal region associated with a potential of between 50 and 500 It may be one of the causative genes. (This is a 1 megabase mapping resolution, And assume one gene per 20 kb. )   The polypeptide, its fragments or other derivatives, or their Nalogs, or cells that express them, produce antibodies against them. Can be used as an immunogen. These antibodies are, for example, polyclonal antibodies Or a monoclonal antibody. The present invention also relates to chimeric antibodies, single-chain antibodies And production of humanized antibodies and Fab fragments or Fab expression libraries Things. Various procedures known in the art can be used to construct such antibodies and fragments. Can be used for the production of   Antibodies raised against polypeptides corresponding to the sequences of the present invention may be used to Obtained by direct injection of the polypeptide or by administration of the polypeptide to the animal. obtain. The animal is preferably non-human. Then obtained in this way The antibody binds to the polypeptide itself. Thus, the polypeptide flag Antibodies that bind to the entire native polypeptide, even sequences that encode only Can be used to generate Such an antibody is then Can be used to isolate polypeptides from tissues that express.   Antibodies produced by continuous culture of cell lines for preparation of monoclonal antibodies Any technique that provides a can be used. Examples include hybridoma technology (Kohle r and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), trioma technology, human B cells Hybridoma technology (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), and human EBV hybridoma technology for producing clonal antibodies (Cole et al., 1985, Monocl onal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). You.   The technology described for producing single-chain antibodies (U.S. Pat. Can be adapted to generate single-chain antibodies to light immunogenic polypeptide products . In addition, the transgenic mouse is used as the immunogenic polypeptide product of the present invention. Can be used to express humanized antibodies.   The antibodies described above can be used to attach the antibodies to a solid support using the polypeptides of the invention. And passing the polypeptide desired to be purified through the column. Affinity chromatography, and purified polypeptide Can be isolated by recovering the compound.   The invention will be further described with reference to the following examples; It should be understood that the present invention is not limited to such an embodiment. All parts or quantities are , On a weight basis unless otherwise specified.   To facilitate understanding of the following examples, certain methods and / or Or terms are described.   "Plasmids" may be located after and / or before the number and / or number. Specified by lowercase p. The starting plasmids herein are commercially available, Projects that are either publicly available without restriction or available according to published procedures Can be constructed from Rasmid. Additionally, a plasmid equivalent to the described plasmid Are known in the art and will be apparent to those skilled in the art.   `` Digestion '' of DNA involves touching it with a restriction enzyme that acts only at certain sequences in the DNA. It means to cut by a medium reaction. The various restriction enzymes used herein are commercially available. Are sold and their reaction conditions, cofactors, and other requirements are The known ones were used. For analytical purposes, typically 1 μg of plasmid or For DNA fragments, about 2 units of enzyme are used in about 20 μl of buffer solution. For the purpose of isolating DNA fragments for plasmid construction, typically 5-5 0 μg of DNA is digested in larger volumes with 20-250 units of enzyme. Specific restrictions Appropriate buffers and substrate amounts for the enzymes are specified by the manufacturer. At 37 ° C An incubation time of about 1 hour is usually used, but this is May vary according to instructions. After digestion, run the reaction directly on a polyacrylamide gel. Isolate the desired fragment by electrophoresis.   Size separation of truncated fragments is described by Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: Performed using an 8% polyacrylamide gel described by U.S. Pat. .   "Oligonucleotide" refers to a single-stranded polydeoxynucleotide or two phases. Refers to any of the complementary polydeoxynucleotide chains, which are chemically synthesized Can be Such synthetic oligonucleotides have no 5 'phosphate and therefore If no phosphate and ATP are added in the presence of the Do not tie. Synthetic oligonucleotides are converted to non-dephosphorylated fragments. connect.   "Ligation" forms a phosphodiester bond between two double-stranded nucleic acid fragments. (Maniatis, T et al., Supra, p. 146). Must be provided elsewhere If the ligation is carried out using known buffers and conditions, an approximately equimolar amount of the DNA Achieved using 10 units of T4 DNA ligase (“ligase”) per 0.5 μg Can be   Unless otherwise stated, transformation was performed according to Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1973).                                 Example 1 ATP Bacterial expression and purification of the receptor   A DNA sequence encoding ATP receptor (ATCC Accession No. 97333) can be processed 5 'sequence (excluding signal peptide sequence) and ATP receptor protein Oligonucleotides corresponding to the vector sequence 3 'to the ATP and ATP receptor genes First amplify using otide primers. Further corresponding to ATP receptor Nucleotides are added to the 5 'and 3' sequences, respectively. 5 'oligonucleotid Primer has the sequence 5 'CCGCAGATCAATGCTGGGGATCATGGCA 3' (SEQ ID NO: 3). This is the Bgl II restriction site followed by the putative end of the processed protein. Contains the 18 nucleotide ATP receptor coding sequence starting from the terminal amino acid. 3 'arrangement The sequence 5′CGGCTCTAGATCACTTTTCTCTGAATGA 3 ′ (SEQ ID NO: 4) is complementary to the XbaI site Sequence and then the 18 nucleotides of the ATP receptor and the ATP receptor -Contains the vector sequence located 3 'to the DNA insert. Restriction enzyme sites Corresponds to a restriction enzyme site on the expression vector pQE-9 (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA) . pQE-9 is resistant to antibiotics (Ampr), Bacterial origin of replication (ori), IPTG-regulated pro Motor operator (P / O), ribosome binding site (RBS), 6-His tag, And restriction enzyme sites. Then, pQE-9 is digested with BgIII and XbaI. Increase The width sequence is ligated to pQE-9 and combined with the sequence encoding the histidine tag and RBS. Frame. Then, using the ligation mixture,E . coliStrain M15 / rep 4 (Qi agen, Inc.), Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Col. d Transform by the procedure described in Spring Laboratory Press, (1989). M15 / rep 4 contains multiple copies of plasmid pREP4. It fires the lacI repressor Manifestation and also kanamycin resistance (Kanr). LB play of transformants Identified by their ability to grow on cells and ampicillin / kanamycin Select resistant colonies. Isolate plasmid DNA and confirm by restriction analysis You. Clones containing the desired construct were combined with Amp (100 μg / ml) and Kan (25 μg / ml). Grow overnight (O / N) in liquid culture in LB medium supplemented with both. O / N culture Used to inoculate a large culture at a ratio of 1: 100 to 1: 250. Cells at an optical density of 600 (O.D.600) Is grown between 0.4 and 0.6. Then IPTG ("Isopro Pill-BD-thiogalactopyranoside ") to a final concentration of 1 mM. IPTG Inactivates 1acI repressor to release (clear) P / O and generate gene Induce the current increase. The cells are grown for an additional 3-4 hours. Then, centrifuge the cells Collect by separation. Cell pellet in chaotropic drug 6M guanidine HCl And solubilize. After clarification, the solubilized ATP receptor was replaced with a protein containing a 6-His tag. Chromatography on a nickel-chelate column under conditions that can bind more tightly to the matrix Purify from this solution by chromatography (Hochuli, E et al., J. Chromatography 41). 1: 177-184 (1984)). Dissolve ATP receptor from column with 6M guanidine HCl (pH 5.0) 3M guanidine HCl, 100 mM sodium phosphate, Adjust to 10 mM glutathione (reduced form) and 2 mM glutathione (oxidized form). After a 12-hour incubation in this solution, the protein was reduced to 10 mM sodium phosphate. Dialyze against lium.                                 Example 2 Cloning and expression of ATP receptor using baculovirus expression system   DNA sequence encoding the full-length ATP receptor protein (ATCC Accession No. 97333) ) Are replaced with PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of this gene. Amplify using an immer:   The 5 'primer has the sequence 5'CGGGATCCCTCCATGCTGGGGATCATGGCA 3 '(SEQ ID NO: 5 ) And BamHI restriction enzyme site (bold), followed by translation in eukaryotic cells Four nucleotides (Kozak, M., J. Mo.) similar to a signal efficient for initiation of translation. l. Biol. 196, 947-950, (1987)). This is the ATP receptor gene Immediately after the first 18 nucleotides (underline the transcription start codon "ATG") Attached).   The 3 'primer has the sequence 5'CGGGATCCGCTCACTTTTCTCTGAATGA 3' (SEQ ID NO: 6) With the restriction endonuclease BamHI cleavage site (bold) and the ATP receptor Contains 18 nucleotides complementary to the 3 'untranslated sequence of the gene. The amplified sequence is 1% agarose using a kit ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) Isolate from Sgel. This fragment is then digested with the endonuclease BamHI. Digest and isolate again on a 1% agarose gel. This fragment is called F2 Name.   The vector RG1 (a modified version of the pVL941 vector, shown below) was transformed into a baculovirus expression system. Used for expression of the ATP receptor protein used (for a review, Summers , M.D. and Smith, G.E. 1987, Manual of methods for baculovirus vectors  and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Sta tion Bulletin No. 1555). This expression vector is Autographa cal Strong polyhedrin promoter of ifornica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV), it Followed by a recognition site for the restriction endonuclease BamHI. Simian virus (SV) 40 The polyadenylation site of is used for efficient polyadenylation. Recombinant ui In order to easily select Luz, Escherichia coli β-galactosidase gene Insert in the same direction as the hedrin promoter, and then A nilation signal follows. Polyhedrin sequence in co-transfected wild-type virus Flanked at both ends by viral sequences for cell-mediated homologous recombination of DNA. Many Other baculovirus vectors can be used in place of pRG1. For example, pA c373, pVL941, and pAcIM1 (Luckow, V.A. and Summers, M.D., Virol ogy, 170: 31-39).   The plasmid is digested with the restriction enzyme BamHI and the pups are then digested by procedures known in the art. Dephosphorylate using bovine intestinal phosphatase. Then, a commercially available kit ("Gene DNA was isolated from 1% agarose gel using “clean” BIO 101 Inc., La Jolla, Ca). Let go. This vector DNA is called V2.   Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 were ligated using T4 DNA ligase. Tie. Then, E. Transform E. coli H B101 cells and use the enzyme BamHI to Bacteria containing a plasmid containing the ATP receptor gene (pBac-ATP receptor) Identify. The sequence of the cloned fragment is confirmed by DNA sequencing.   5 μg of the plasmid pBacATP receptor was used for lipofection (Felgner et al. roc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)). Linearized baculovirus ("BaculoGoldTM baculovirus DNA ”, Pharmingen , San Diego, CA.).   1 μg BaculoGoldTMViral DNA and 5 μg of plasmid pBacATP receptor With 50 μl of Grace's medium without serum (Life Technologies Inc., Gaithersburg) , MD) in a microtiter plate containing sterile wells. Then 10 Add μl Lipofectin and 90 μl Grace's medium, mix, and add And incubate for 15 minutes. The transfection mixture is then Sf9 seeded in 35 mm tissue culture plates with 1 ml of serum-free Grace's medium Drops on insect cells (ATCC CRL 1711). Plate the newly added solution Shake back and forth to mix. The plate is then incubated at 27 ° C for 5 hours. To After 5 hours, the transfection solution is removed from the plate, and Add 1 ml Grace's insect medium supplemented with 10% fetal calf serum. Plate Return to incubator and continue culturing at 27 ° C. for 4 days.   After 4 days, the supernatant was collected and as described by Summers and Smith (supra). Perform plaque assay. As a modification, a simple method of blue plaque staining was used. "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) Agarose gel is used. (A detailed description of the "plaque assay" is also available from Li Insect cell culture method and Baki distributed by fe Technologies Inc., Gaithersburg. (It can also be found in the user's guide to neurovirology (pages 9-10)).   Four days after serial dilution, virus was added to cells and blue stained plaques were removed. Pick up with the tip of an Eppendorf pipette. Then, the agar containing the recombinant virus was Resuspend in an Eppendorf tube containing 200 μl Grace's medium. Agar, Remove by brief centrifugation and remove supernatant containing recombinant baculovirus for 35 minutes. Used to infect Sf9 cells seeded on mm dishes. Four days later, these The culture dish supernatant is collected and then stored at 4 ° C.   Sf9 cells are grown in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. Cells Infect with recombinant baculovirus V-ATP receptor at multiplicity of infection (MOI) 2 . After 6 hours, the medium was removed and SF deprived of methionine and cysteine Replace with 900 II medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 hours later , 5μCi35S-methionine and 5 μCi35Add S cysteine (Amersham) I do. Incubate cells for an additional 16 hours, then collect cells by centrifugation And label the labeled proteins by SDS-PAGE and autoradiography. And visualize it.                                 Example 3 COS Expression of recombinant ATP receptor in cells   Plasmid expression, ATP receptor HA, vector pcDNAI / Amp (Invitrogen) Derived from. The vector pcDNAI / Amp contains: 1) SV40 origin of replication, 2). Ampicillin resistance gene, 3) E. coli. coli origin of replication, 4) polylinker region, SV40 CMV promoter followed by an intron and polyadenylation site. Complete ATP receptor Encoding a precursor of the promoter and an HA tag fused in-frame to its 3 'end The resulting DNA fragment is cloned into the polylinker region of the vector. Soy sauce However, recombinant protein expression is controlled under the CMV promoter. HA tag first For epitopes from influenza hemagglutinin protein as described (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, and And R. Lerner, 1984, Cell 37, 767 (1984)). Fusion of HA tag to target protein Easy detection of recombinant proteins using antibodies that recognize the HA epitope Becomes possible.   The plasmid construction strategy is described below:   The DNA sequence encoding the ATP receptor (ATCC Accession No. 97333) was Constructed by cloned PCR using primer: 5'primer 5'GTCCA AGCTTGCCACCATGCTGGGGATCATGGCA 3 ′ (SEQ ID NO: 7) has a HindIII site (thick line), 18 nucleotides of the ATP receptor coding sequence starting from the start codon Including; 3 ′ sequence 5 ′ CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACTTTTCTCTGAAT GAAAG 3 ′ (SEQ ID NO: 8) contains an XhoI site (thick line), a translation stop codon, an HA tag, And the last 18 nucleotides of the ATP receptor coding sequence (not including the stop codon) And a sequence complementary to Therefore, the PCR product is fused in frame with the HindIII site. ATP receptor coding sequence followed by combined HA tag, translation termination arrest adjacent to HA tag Includes codons and XhoI site. PCR amplified DNA fragments and vectors (pcDN AI / Amp) is digested with HindIII and XhoI restriction enzymes and ligated. Linking The mixture is coli SURE strain (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, 9203 7), and inoculate the transformed culture on an ampicillin medium plate. To select resistant colonies. Plasmid DNA is isolated from transformants and The presence of new fragments is tested by restriction analysis. Expression of recombinant ATP receptor For transfection, COS cells are transfected with an expression vector by the DEAE-DEXTRAN method ( J. Sambrook, E.A. Fritsch, T .; Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Man ual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). ATP receptor HA protein Expression is detected by radiolabeling and immunoprecipitation (E. Harlow, D. Lane, An. tibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Cells were transferred 2 days after transfection358 hours with S-cysteine Understand. The culture medium is then harvested and the cells are washed with detergent (RIPA buffer (150 mM  NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM Tris (pH 7.5)) (Wilson, I. et al., Ibid., 37: 767 (1984)). Both cell lysate and culture medium Is precipitated with an HA-specific monoclonal antibody. 15% of precipitated protein  Analyze on SDS-PAGE gel.                                 Example 4 Expression via gene therapy   Fibroblasts are obtained from the subject by skin biopsy. Transfer the obtained tissue to a tissue culture medium. Place and separate into small pieces. Place a small mass of tissue on a wet table in a tissue culture flask. Place on a surface and place about 10 clumps in each flask. Turn the flask upside down, Tighten tightly and leave at room temperature overnight. After 24 hours at room temperature, invert the flask While the tissue mass remains fixed at the bottom of the flask and fresh medium (eg, For example, Ham's F12 medium containing 10% FBS, penicillin, and streptomycin) Add. It is then incubated at 37 ° C. for about one week. At this point, fresh Fresh medium is added and changed one after another every few days. After another two weeks in culture, A monolayer of fibroblasts appears. Trypsinize the monolayer, and Transfer to Ko.   PMV-7 flanked by long terminal repeats of Moloney mouse sarcoma virus (Kirschmeier, P.T. DNA, 7: 219-25 (1988)) was digested with EcoRI and HindIII, followed by pups. Treat with small intestinal phosphatase. The linear vector is fractionated on an agarose gel and And purified using glass beads.   The cDNA encoding the polypeptide of the present invention has 5 ′ and 3 ′ terminal sequences, respectively. Amplify using the corresponding PCR primers. 5 'primer containing EcoRI site And the 3 'primer further comprise a HindIII site. Equivalent amount of Moloney mouse sarcoma The Ils linear scaffold and the amplified EcoRI and HindIII fragments were Are added together in the presence of the enzyme. Combine the resulting mixture with the two fragments Under appropriate conditions. The ligation mixture is used to transform bacteria HB101. Used to confirm that the vector has inserted the gene of interest properly. , Plate on agar containing kanamycin.   Broad host pA317 or GP + am12 packaging cells were cultured in tissue culture at 10% Dulbecco Modified Eagle with Cysera (CS), Penicillin, and Streptomycin In confluent medium (DMEM). Then this gene The MSV vector containing is added to the medium and the packaging cells are Transduce. The packaging cell is where the infectious virus containing this gene Produce particles (the packaging cells are referred to herein as producer cells).   Fresh medium is added to the transduced producer cells, and the medium is subsequently Recover from 10 cm plate of Luent producer cells. The medium used is sensitive Contains infectious virus particles, filtered through a Millipore filter and stripped Remove the producer cells and then use this medium to infect fibroblasts. To use. Removing the medium from the subconfluent plate of fibroblasts, and Immediately replace with media from producer cells. Remove this medium and use fresh medium Replace with If the virus titer is high, virtually all fibroblasts are infected And no selection is required. If the titer is very low, select a marker such as neo or his. It is necessary to use a retroviral vector with a car.   The engineered fibroblasts were then used alone or in a Cytodex 3 microphone. Injected into the host after growth to confluence on microcarrier beads. Enter. Here, fibroblasts produce a protein product.   Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, Thus, other than as specifically described, the present invention may be practiced within the scope of the appended claims. obtain.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 13/08 Ａ６１Ｋ 31/00 ６１３Ｅ 19/10 ６１９Ｅ 25/14 ６２６Ｅ 25/16 ６２６Ｆ 25/18 ６２６Ｇ 37/00 ６３７ Ａ６１Ｋ 31/70 31/70 35/76 35/76 38/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 13/08 A61K 31/00 613E 19/10 619E 25/14 626E 25/16 626F 25/18 626G 37 / 00 637 A61K 31/70 31/70 35/76 35/76 38/00 48/00 48/00 C07K 14/705 C07K 14/705 C12P 21/02 C C12P 21/02 C12Q 1/68 A C12Q 1/68 G01N 33/53 D G01N 33/53 33/566 33/566 A61K 37/02

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．以下からなる群から選択されるメンバーと少なくとも70％の同一性を有する ポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド： （a）図１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレ オチド； （b）（a）のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド；および （c）（a）または（b）のポリヌクレオチドの少なくとも30塩基を含むポリヌク レオチド。 ２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ４．図１に示されるポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオ チド。 ５．図１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチ ド。 ６．図１に示されるヌクレオチド93からヌクレオチド1094までを含む、請求項２ に記載のポリヌクレオチド。 ７．図１に記載のポリペプチドの可溶性形態をコードする、請求項１に記載のポ リヌクレオチド。 ８．以下からなる群から選択されるメンバーと少なくとも70％同一であるポリヌ クレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド： （a）ATCC寄託番号第97333号に含まれるヒトcDNAにより発現される同じ成熟ポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチド； （b）（a）のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド；および （c）（a）または（b）のポリヌクレオチドの少なくとも30塩基を含むポリヌク レオチド。 ９．前記ポリヌクレオチドが、ATCC寄託番号第97333号に含まれるヒトcDNAによ り発現される同じ成熟ポリペプチドをコードする、請求項８に記載の単離された ポリヌクレオチド。 １０．前記ポリヌクレオチドが、ATCC寄託番号第97333号に含まれるヒトcDNAに より発現されるポリペプチドをコードする、請求項８に記載の単離されたポリヌ クレオチド。 １１．請求項２に記載のDNAを含むベクター。 １２．請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。 １３．請求項１２に記載の宿主細胞からベクター中に含まれるヒトcDNAによって コードされるポリペプチドを発現する工程、を含むポリペプチドを産生するプロ セス。 １４．請求項１１のベクターで細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程 、それにより、細胞が該ベクターに含まれるヒトcDNAによってコードされるポリ ペプチドを発現する を含む、細胞を産生するプロセス。 １５．以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド： （a）図１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも70％同一 であるポリペプチド；および （b）（a）のポリペプチドの少なくとも30アミノ酸残基を含むポリペプチド。 １６．前記ポリペプチドが図１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に 記載のポリペプチド。 １７．請求項１５に記載のポリペプチドに対する抗体。 １８．請求項１５に記載のポリペプチドに対するアゴニスト。 １９．請求項１５に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト。 ２０．ATPレセプターを活性化する必要を有する患者の処置のための方法で、以 下を含む方法：請求項１８に記載のアゴニストの治療有効量を患者に投与する工 程。 ２１．ATPレセプターを阻害する必要を有する患者の処置のための方法で、以下 を含む方法：請求項１９に記載のアンタゴニストの治療有効量を患者に投与する 工程。 ２２．前記アゴニストがポリペプチドであり、そして治療有効量の該アゴニスト が、該アゴニストをコードするDNAを患者に対して提供する工程、およびインビ ボで該アゴニストを発現させる工程により投与される、請求項２０に記載の方法 。 ２３．前記アンタゴニストがポリペプチドであり、そして治療有効量の該アンタ ゴニストが、該アンタゴニストをコードするDNAを患者に対して提供する工程、 およびインビボで該アンタゴニストを発現させる工程により投与される、請求項 ２１に記載の方法。 ２４．請求項１５に記載のポリペプチドに結合し、そして該ポリペプチドを活性 化する化合物を同定する方法で、以下を含む方法： その表面上にATPレセプターを発現する細胞を、化合物と、該レセプターへの 化合物の結合を可能にするに充分な条件下で、接触させる工程、該レセプターは 該レセプターへの化合物の結合に応答した検出可能なシグナルを提供し得る第二 の構成物と会合する；および 化合物が該レセプターに結合した場合、該第二の構成物によって生成したシグ ナルを検出することにより同定する工程。 ２５．請求項１５に記載のポリペプチドに結合し、そして該ポリペプチドの活性 化を阻害する化合物を同定する方法で、以下を含む方法： その表面上にATPレセプターを発現する細胞を、該レセプターに結合すること が知られる分析的に検出可能なリガンドおよびスクリーニングされる化合物と、 該レセプターへの結合を可能にする条件下で、接触させる工程、該レセプターは 該レセプターへの化合物の結合に応答した検出可能なシグナルを提供し得る第二 の構成物と会合する；および 化合物が該レセプターの活性化を阻害するかどうかを、リガンドと該レセプタ ーの相互作用によって生成したシグナルの不在を検出することにより測定する工 程。 ２６．請求項１５に記載のポリペプチドの過小発現に関連する疾患、または疾患 に対する感受性を診断するためのプロセスであって、以下を含むプロセス： 該ポリペプチドをコードする核酸配列中の変異を測定する工程。 ２７．前記ポリペプチドがポリペプチドの可溶性フラグメントであり、そして該 ポリペプチドに対してリガンドを結合し得る、請求項１５に記載のポリペプチド 。 ２８．診断プロセスであって、以下を含むプロセス： 宿主由来の試料中の請求項２７に記載のポリペプチドの存在を分析する工程。[Claims] 1. Has at least 70% identity to a member selected from the group consisting of: An isolated polynucleotide comprising a polynucleotide: (A) Polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in FIG. Otide; (B) a polynucleotide that is complementary to the polynucleotide of (a); and (C) a polynucleotide comprising at least 30 bases of the polynucleotide of (a) or (b) Leotide. 2. The polynucleotide according to claim 1, wherein the polynucleotide is DNA. 3. 2. The polynucleotide according to claim 1, wherein said polynucleotide is RNA. 4. 2. The polynucleotide of claim 1, which encodes the polypeptide shown in FIG. Chid. 5. 3. The polynucleotide of claim 2, comprising the nucleotide sequence shown in FIG. De. 6. 3. It comprises nucleotide 93 to nucleotide 1094 shown in FIG. 3. The polynucleotide according to item 1. 7. 2. The polypeptide of claim 1, which encodes a soluble form of the polypeptide of FIG. Renucleotide. 8. A polynuclear that is at least 70% identical to a member selected from the group consisting of: An isolated polynucleotide comprising a nucleotide: (A) the same mature polyprotein expressed by the human cDNA contained in ATCC Deposit No. 97333 A polynucleotide encoding a peptide; (B) a polynucleotide that is complementary to the polynucleotide of (a); and (C) a polynucleotide comprising at least 30 bases of the polynucleotide of (a) or (b) Leotide. 9. The polynucleotide is derived from a human cDNA contained in ATCC Deposit No. 97333. 9. The isolated polypeptide of claim 8, which encodes the same mature polypeptide expressed. Polynucleotide. 10. The polynucleotide is a human cDNA contained in ATCC Deposit No. 97333. 9. The isolated polynucleotide of claim 8, which encodes a more expressed polypeptide. Creotide. 11. A vector comprising the DNA according to claim 2. 12. A host cell comprising the vector according to claim 11. 13. A human cDNA contained in a vector from the host cell according to claim 12. Expressing the encoded polypeptide. Seth. 14． Transforming or transfecting a cell with the vector of claim 11. Thereby allowing the cells to be ligated with the poly- gen encoded by the human cDNA contained in the vector. Express peptide A process for producing cells. 15. A polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:   (A) at least 70% identical to the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in FIG. Is a polypeptide; and   (B) A polypeptide comprising at least 30 amino acid residues of the polypeptide of (a). 16. 16. The method of claim 15, wherein the polypeptide has the amino acid sequence shown in FIG. The polypeptide of any one of the preceding claims. 17． An antibody against the polypeptide of claim 15. 18. An agonist for the polypeptide of claim 15. 19. An antagonist to the polypeptide of claim 15. 20. A method for treating a patient having a need to activate the ATP receptor, comprising the steps of: 19. A method comprising: administering to a patient a therapeutically effective amount of the agonist of claim 18. About. 21. A method for treating a patient having a need to inhibit the ATP receptor, comprising: Administering to the patient a therapeutically effective amount of the antagonist of claim 19. Process. 22. The agonist is a polypeptide, and a therapeutically effective amount of the agonist Providing a patient with DNA encoding the agonist, and 21. The method of claim 20, wherein the method is administered by expressing the agonist in vivo. . 23. The antagonist is a polypeptide, and a therapeutically effective amount of the anta. A gonist providing the patient with DNA encoding the antagonist, And administering the antagonist in vivo. The method of claim 21. 24. Binding to the polypeptide of claim 15 and activating said polypeptide. A method for identifying a compound to be converted, comprising:   A cell expressing the ATP receptor on its surface is treated with a compound and the receptor Contacting under conditions sufficient to allow binding of the compound, wherein the receptor comprises A second that can provide a detectable signal in response to binding of a compound to the receptor. With the composition of   When a compound binds to the receptor, the sigma generated by the second construct A step of identifying by detecting null. 25. 16. A polypeptide which binds to the polypeptide of claim 15 and the activity of said polypeptide. A method for identifying a compound that inhibits activation, comprising:   Binding cells expressing the ATP receptor on its surface to the receptor An analytically detectable ligand and a compound to be screened, Contacting under conditions that allow binding to the receptor, wherein the receptor comprises A second that can provide a detectable signal in response to binding of a compound to the receptor. With the composition of   Whether the compound inhibits activation of the receptor is determined by determining whether the ligand and the receptor Measurement by detecting the absence of a signal generated by the interaction of About. 26. A disease or disease associated with under-expression of the polypeptide according to claim 15. A process for diagnosing susceptibility to, including:   Measuring a mutation in the nucleic acid sequence encoding the polypeptide. 27. The polypeptide is a soluble fragment of the polypeptide; and The polypeptide of claim 15, wherein the polypeptide is capable of binding a ligand to the polypeptide. . 28. A diagnostic process that includes:   Analyzing the presence of the polypeptide of claim 27 in a sample derived from the host.
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