JPH10510719A - Human G protein chemokine receptor HDGNR10 - Google Patents

Human G protein chemokine receptor HDGNR10

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JPH10510719A
JPH10510719A JP9500367A JP50036797A JPH10510719A JP H10510719 A JPH10510719 A JP H10510719A JP 9500367 A JP9500367 A JP 9500367A JP 50036797 A JP50036797 A JP 50036797A JP H10510719 A JPH10510719 A JP H10510719A
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JP9500367A
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リ，イ
エム． ルーベン，スティーブン
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ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド
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    • C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus

Abstract

(57)【要約】 ヒトＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするDNA(RNA)ならびに組み替え技術によりこのようなポリペプチドを産生する手順を開示する。このようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定するためのこのようなポリペプチドの利用方法ならびにＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドの過小発現および過剰発現に関連する状態の処置のためのアゴニストおよびアンタゴニストの治療的な使用方法もまた、それぞれ開示する。Ｇタンパク質ケモカインレセプター核酸配列内の変異の検出のための診断方法および宿主由来のサンプルにおける可溶型レセプターのレベルの検出のための診断方法もまた開示する。   (57) [Summary] Disclosed are human G protein chemokine receptor polypeptides and DNA (RNA) encoding such polypeptides and procedures for producing such polypeptides by recombinant techniques. Methods of utilizing such polypeptides to identify antagonists and agonists to such polypeptides and therapeutics of agonists and antagonists for the treatment of conditions associated with underexpression and overexpression of G protein chemokine receptor polypeptides The various uses are also disclosed. Also disclosed are diagnostic methods for detecting mutations in G protein chemokine receptor nucleic acid sequences and for detecting levels of soluble receptor in a sample derived from a host.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＧタンパク質ケモカインレセプターHDGNR10 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド によりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプ チドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に 関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ケモカインレセプターとして 推定的に同定されたヒトの７-膜貫通型レセプターであり、本明細書では、今後 、ときには「Ｇタンパク質ケモカインレセプター」または「HDGNR10」という。 本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。 医学的に重要な多数の生物学的プロセスが、Ｇタンパク質および/またはセカ ンドメッセンジャー（例えば、cAMP）を含むシグナル伝達経路に関与するタンパ ク質により媒介されることは、十分に確立されている（Lefkowitz，Nature，351 :353-354(1991)）。本明細書中では、これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を用 いた経路に関与するタンパク質またはPPGタンパク質という。これらのタンパク 質のいくつかの例は、GPCレセプター（例えば、アドレナリン作用性薬剤および ドーパミンに対するGPCレセプター（Kobilka，B.K.ら，PNAS，84:46-50(1987); Kobilka，B.K.ら，Science，238:650-656(1987); Bunzow，J.R.ら，Nature, 336 :783-787(1988)））、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質（例えば 、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ）、な らびにアクチュエータータンパク質（actuator protein）（例えば、プロテイン キナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ）（Simon，M.I.ら，Science，252:802- 8(1991)）を含む。 例えば、シグナル伝達の１つの形態では、ホルモン結合の効果は、細胞内にお ける酵素アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性化は 、ヌクレオチドGTPの存在に依存し、そしてGTPはまた、ホルモン結合に影響を与 える。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結させ る。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活性化されると、GTPを結合GDP に変 換することが示された。次いで、GTPを有する形態は、活性化されたアデニル酸 シクラーゼに結合する。GTPのGDPへの加水分解は、Ｇタンパク質それ自体により 触媒され、Ｇタンパク質を基底の不活性な形態に戻す。従って、Ｇタンパク質は 、シグナルをレセプターからエフェクターに中継する中間物として、およびシグ ナルの持続時間を制御する時計としての２つの役割を果たす。 Ｇタンパク質共役レセプターの膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、７ つの推定膜貫通ドメインを有するものとして特徴づけられている。このドメイン は、細胞外または細胞質ループにより結合された膜貫通αヘリックスを表すと考 えられる。Ｇタンパク質共役レセプターは、ホルモン、ウイルス、増殖因子およ び神経レセプターのような広範囲の生物学的に活性なレセプターを含む。 Ｇタンパク質共役レセプターは、少なくとも８つの開放性の親水性ループと結 合する、約20〜30アミノ酸のこれらの７つの保存された疎水性の範囲を含むもの として特徴づけられている。共役レセプターのＧタンパク質ファミリーは、精神 病および神経学的な疾病の治療に用いる神経弛緩薬に結合するドーパミンレセプ ターを含む。このファミリーの他の例は、カルシトニン、アドレナリン作用性、 エンドセリン、cAMP、アデノシン、ムスカリン様、アセチルコリン、セロトニン 、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺 伝子１レセプターおよびロドプシン、臭気物質、サイトメガロウイルスレセプタ ーなどを含む。 Ｇタンパク質共役レセプターは、ヘテロ三量体のＧタンパク質により種々の細 胞内の酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合し得る（ Johnsonら、Endoc.,Rev.,10:317-331(1989)を参照のこと）。異なるＧタンパク 質のαサブユニットは好ましくは、細胞内で種々の生物学的機能を調節するため の特定のエフェクターを刺激する。Ｇタンパク質共役レセプターの細胞質残基の リン酸化は、いくつかのＧタンパク質共役レセプターのＧタンパク質共役の調整 のための重要な機構として同定された。Ｇタンパク質共役レセプターは、哺乳動 物宿主内において多くの部位で見出される。 ケモカインは、インタークリンサイトカイン(intercrine cytokine)としても いわれるが、構造的および機能的に関連したサイトカインのサブファミリーであ る。これらの分子は８〜10kdのサイズである。一般的に、ケモカインは20％〜75 ％のアミノ酸レベルの相同性を示し、そして２つのジスフィルド結合を形成する ４つの保存されたシステイン残基により特徴付けられる。最初の２つのシステイ ン残基の配置に基づいて、ケモカインは、αおよびβの２つのサブファミリーに 分類される。αサブファミリーにおいて、最初の２つのシステインは１アミノ酸 により分離され、そして今後「C-X-C」サブファミリーといわれる。βサブファ ミリーにおいて；この２つのシステインは連接した位置にあり、それゆえ、「C- C」サブファミリーといわれる。このように、このファミリーの少なくとも９つ の異なったメンバーがヒトにおいて同定されている。 インタークリンサイトカインは、多岐にわたる種々の機能を示す。顕著な特徴 は、単球、好中球、Ｔリンパ球、好塩基球、および腺維芽細胞を含む、異なる細 胞型の走化性移動を誘導する能力である。多くのサイトカインは前炎症性活性を 有し、そして炎症性反応の間に複数の段階に関与する。これらの活性は、ヒスタ ミン放出の刺激、リソソーム酵素およびロイコトリエンの放出、標的免疫細胞の 内皮細胞への接着性の増大、補体タンパク質の結合の増強、顆粒細胞接着分子お よび補体レセプターの発現誘導、および呼吸爆発を含む。炎症におけるそれらの 関連に加えて、あるケモカインは他の活性を示すことが示唆されてきた。例えば 、マクロファージ炎症性タンパク質１（MIP-1）は造血幹細胞の増殖を抑制し得 、血小板因子４（PF-4）は内皮細胞増殖の潜在的阻害剤であり、インターロイキ ン８（IL-8）はケラチノサイトの増殖を促進し、そしてGROはメラノーマ細胞の オートクリン増殖因子である。 広範な生物学的活性において、ケモカインが、リンパ球のさまよい(trafficki ng)、創傷治癒、造血調節ならびにアレルギー、喘息および関節炎のような免疫 学的疾病を含む多数の生理学的および疾病状態において、関与することは驚くべ きことではない。 本発明の１つの局面によれば、新規の成熟レセプターポリペプチドならびに生 物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログおよ び誘導体が提供される。本発明のレセプターポリペプチドはヒト起源である。 本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドをコードする単 離された核酸分子が提供され、核酸分子は、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、なら びにそのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療 に有用なそのフラグメントを含む。 本発明のさらなる局面によれば、前記ポリペプチドの発現およびその後の前記 ポリペプチドの回収を促進する条件下で、本発明のレセプターポリペプチドをコ ードする核酸配列を含む組換え原核宿主細胞および/または組換え真核宿主細胞 を培養する工程を包含する組換え技術により、このようなレセプターポリペプチ ドを産生するためのプロセスが提供される。 本発明のなおさらなる局面によれば、このようなレセプターポリペプチドに対 する抗体が提供される。 本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そし て活性化するが、または活性化を阻害する化合物のためのスクリーニング方法が 提供される。 本発明のなお別の実施態様によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合 し、そして活性化する化合物を宿主に投与する工程が提供される。この化合物は 、造血、創傷治癒、凝固、新脈管形成の刺激に有用であり、固体腫瘍、慢性感染 、白血病、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患、寄生虫感染、乾唐を処置し、そして増殖因 子活性を刺激する。 本発明の別の局面によれば、ポリペプチドの過少発現、またはレセプターポリ ペプチドのリガンドの過少発現に関連した状態を処置するための遺伝子治療を介 した、本発明のレセプターポリペプチドを投与する方法が提供される。 本発明のなお別の実施態様によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合 し、その活性化を阻害する化合物を宿主に投与する工程が提供される。この化合 物は、アレルギー、アテローム発生、過敏症、悪性腫瘍、慢性および急性の炎症 、ヒスタミンおよびIgE媒介アレルギー反応、プロスタグランジン非依存性発熱 、骨髄不全、珪肺症、類肉腫類、慢性関節リウマチ、ショックおよび好酸球増多 症候群の予防および／または処置に有用である。 本発明のなお別の局面によれば、本発明のポリヌクレオチド配列に特異的にハ イブリダイズするために十分な長さの核酸分子を含有する核酸プローブが提供さ れる。 本発明のなお別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードする核酸配 列中の変異に関連する疾患を検出するため、ならびにこのレセプターポリペプチ ドの可溶型の変化したレベルを検出するための診断アッセイが提供される。 本発明のなおさらなる局面によれば、このようなレセプターポリペプチド、ま たはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DN Aの合成およびDNAベクターの製造に関連するインビトロ目的のために利用するた めのプロセスが提供される。 本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであ るはずである。 以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により包含 されるように、本発明の範囲を限定することを意味しない。 図１は、本発明のＧタンパク質共役レセプターのcDNA配列、および対応する推 定アミノ酸配列を示す。アミノ酸の標準１文字略語を使用する。配列決定を、37 3自動DNAシーケンサー(Applied Biosystems,Inc.)を用いて行った。 図２は、本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターとヒトMCP-1レセプター との間のアミノ酸配列のアライメントを例示する。 本発明の局面によれば、図１の推定のアミノ酸配列（配列番号：２）を有する 成熟ポリペプチド、または1995年６月１日にATCC受託番号第97183号としてAmeri can Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland， 20852，United States of Americaに寄託されたクローンのcDNAによりコードさ れる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供 される。 本発明のポリヌクレオチドはヒト単球由来のcDNAライブラリーで発見された。 これは構造的にＧタンパク質共役レセプターファミリーに関連する。これは、35 2アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む 。このタンパク質は、347アミノ酸の範囲にわたり、ヒトMCP-1レセプターに対し て70.1％の同一性および82.9％の類似性を有する最高度の相同性を示す。 本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA（このDNAは、cDNA、ゲノ ムDNA、および合成DNAを包む）の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖で あり得、そして一本鎖の場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖 であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１（配列番号：１ ）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得るか、 あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１（ 配列番号：１）のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする 異なるコード配列であり得る。 図１の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプ チドをコードするポリヌクレオチドは、以下を包含し得る：成熟ポリペプチドの コード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、ならびに膜貫通(TM)または細 胞内ドメインのようなさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（お よび任意のさらなるコード配列）および非コード配列（例えば、イントロンある いは成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/または3'非コード配列）。 従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列およ び/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託 したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログ および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する 。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子 改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。 従って、本発明は、図１（配列番号：２）に示すものと同じ成熟ポリペプチド 、または寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコ ードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を包 含する。この改変体は、図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託したク ローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはア ナログをコードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変 体、および付加または挿入改変体を包含する。 本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号：１） に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺 伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子 改変体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌク レオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質 的に変化させない。 このポリヌクレオチドはまた、本発明の全長ポリペプチドのTMおよび細胞内ド メインから切断されたポリペプチドの細胞外の一部分であるＧタンパク質ケモカ インレセプターポリペプチドの可溶型をコードし得る。 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列 は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供 する、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。ある いは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用され る場合は、血球凝集素（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ血球凝 集素タンパク質に由来するエピトープと一致する（Wilson，I.ら、Cell，37:767 (1984)）。 用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAセグメントを意味す る；これは、コード領域に先行する領域および後に続く領域（リーダーおよびト レイラー）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間に介在する配列（ イントロン）を含む。 本発明の全長遺伝子のフラグメントは、全長のcDNAを単離するための、および この遺伝子と高い配列類似性を有するか、または類似の生物学的活性を有する他 のcDNAを単離するためのcDNAライブラリーのハイブリダイゼーションプローブと して使用され得る。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも30塩基を有 し、そして例えば、50またはそれ以上の塩基を含み得る。このプローブはまた、 全長の転写産物に対応するcDNAクローン、ならびに調節領域およびプロモーター 領域、エクソン、およびイントロンを含む完全な遺伝子を含むゲノムクローン（ 単数または複数）を同定するために使用され得る。スクリーニングの例として、 オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のDNA配列を使用することに より、遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配列に相補 する配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、このプローブがライブラリーのど のメンバーとハイブリダイズするかを決定するために、ヒトcDNAライブラリー、 ゲノムDNAまたはmRNAをスクリーニングするために使用される。 本発明はさらに、配列間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％そして より好ましくは少なくとも95％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列 にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上 記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌ クレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」 は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95％、そして好ましくは少 なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい実 施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ ヌクレオチドは、図１（配列番号：１）のcDNAまたは寄託したcDNAによりコード される成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保 持するポリペプチドをコードする。 あるいは、このポリヌクレオチドは、少なくとも20塩基、好ましくは30塩基、 そしてより好ましくは50塩基を有し得る。これらは、本発明のポリヌクレオチド にハイブリダイズし、そして、本明細書上記のように、それに対する同一性を有 し、そして活性を保持してもよいし、または保持しなくてもよい。例えば、この ようなポリヌクレオチドは、例えば、このポリヌクレオチドの回収のために配列 番号：１のポリヌクレオチドのプローブとして、あるいは診断プローブまたはPC Rプライマーとして使用され得る。 従って、本発明は、少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、そしてより 好ましくは少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。このポ リヌクレオチドは、配列番号：２のポリヌクレオチドならびにそのフラグメント をコードし、このフラグメントは少なくとも30塩基、そして好ましくは50塩基で ある。そして本発明は、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリヌ クレオチドに関する。 本明細書中でいう寄託物（単数または複数）は、特許手続き上の微生物の寄託 の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、当 業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そして米国特許法第112条の下で 寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオ チドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、 本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる 矛盾も抑えている。寄託物を製造し、または販売するためには実施許諾が必要と され得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。 本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定のアミノ酸配列を有するか、ま たは寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するＧタンパク質ケモカ インレセプターポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント 、アナログおよび誘導体に関する。 用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図１のポリペプチ ドまたは寄託したcDNAにコードされるポリペプチドをいう場合、そのようなポリ ペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性（すなわち、Ｇタンパク質ケモ カインレセプターとしての機能）を保持するか、あるいは、ポリペプチドがＧタ ンパク質ケモカインレセプター（例えば、このレセプターの可溶型）として機能 しないとしても、リガンドまたはレセプターに結合する能力を保持するか、のい ずれかであるポリペプチドを意味する。アナログは、プロタンパク質部分の切断 により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を包含 する。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合 成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（i）１つ以上のアミ ノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ 酸残基）で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基は遺伝コードに よりコードされるアミノ酸残基であってもよく、またはそうでなくてもよいもの 、あるいは(ii)１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは(iii )成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポ リ エチレングリコール）のような別の化合物と融合されているもの、あるいは(iv) さらなるアミノ酸が、ポリペプチドの精製のために成熟ポリペプチドに融合され ているもの、あるいは(v)ポリペプチドのフラグメントが可溶であり（すなわち 膜結合でない）、なおさらに膜結合レセプターにリガンドを結合するものであり 得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示か ら、当業者の範囲内にあると考えられる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形 態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。 本発明のポリペプチドは、配列番号：２（特に成熟ポリペプチド）ならびに配 列番号：２のポリペプチドと少なくとも70％の類似性（好ましくは70％の同一性 ）、そしてより好ましくは配列番号：２のポリペプチドと90％の類似性（より好 ましくは90％の同一性）、そして、さらにより好ましくは配列番号：２のポリペ プチドと95％の類似性（さらにより好ましくは90％の同一性）有するポリペプチ ド、および一般的に少なくとも30アミノ酸およびより好ましくは少なくとも50ア ミノ酸を含むポリペプチドのこのような一部分を有するこのようなポリペプチド の一部分に対するポリペプチドを含む。 当該分野に公知である、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、第２のポリ ペプチドの配列に対して、ポリペプチドのアミノ酸配列およびの保存されたアミ ノ酸置換を比較することにより決定される。 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成による対応 する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメン トは、全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明の ポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチド を合成するために使用され得る。 用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAセグメントを意味す る；これは、コード領域に先行する領域および後に続く領域（「リーダー」およ び「トレイラー」）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間に介在す る配列（イントロン）を含む。 用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合 は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動 物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離 されていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離さ れている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。この ようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／またはこのような ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてそのよ うなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないため、なお単離され 得る。 本発明のポリペプチドは、配列番号：２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチ ド）ならびに配列番号：２のポリペプチドと少なくとも70％の類似性（好ましく は少なくとも70％の同一性）、そしてより好ましくは配列番号：２のポリペプチ ドと少なくとも90％の類似性（より好ましくは少なくとも90％の同一性）、そし てさらにより好ましくは配列番号：２のポリペプチドと少なくとも95％の類似性 （さらにより好ましくは少なくとも95％の同一性）を有するポリペプチドを含み 、そして、また一般的に少なくとも30アミノ酸そしてより好ましくは少なくとも 50アミノ酸を含むポリペプチドのこのような一部分を有するこのようなポリペプ チドの一部分を含む。 当該分野に公知である、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、第２のポリ ペプチドの配列に対して、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存さ れたアミノ酸置換を比較することにより決定される。 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成による対応 する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメン トは全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポ リヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを 合成するために使用され得る。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプ チドの産生に関する。 宿主細胞は、本発明のベクター（これは、例えば、クローニングベクターまた は発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるか、ま たは形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）。ベクターは、例えば 、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主 細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、または本発明 の遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得 る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞に 以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するため に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す るための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクター は、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列を包含する。このよ うなベクターは、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バ キュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせ に由来するベクター、ウイルスDNA（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏 痘ウイルス、および仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能で、か つ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。 適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配 列は、当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入さ れる。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。 発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可 能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例と しては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lacまたはt rp 、λファージPLプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるい はそのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモータ ー。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ター ミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含 有し得る。 さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため の表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼま たはネオマイシン耐性、あるいは例えばE.coliにおけるテトラサイクリン耐性ま たはアンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。 本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列また は制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質 を発現させるために用いられ得る。 適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E.coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）； 昆虫細胞（例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9）；動物細胞（例えば 、CHO、COSまたはBowes黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主 の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。 さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む 組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターま たはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中に、本発明の配列が正方向 または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物 はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含 する）を含む。非常に多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公 知であり、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌 性：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pblues cript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK 223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG4 4、pXT1、pSG(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、他 の任意のプラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ 存続可能である限り、使用され得る。 プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子 から選択され得る。２つの適切なベクターは、PKK232-8およびPCM7である。特に よく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR．PLおよびt rpを包含する。真核生物プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初 期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネ インIを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者 のレベル内である。 さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。 宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細 胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞（例え ば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト ランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエ レクトロポレーションにより達成され得る(Davis,L.，Dibner,M.，Battey,I.，B asic Methods in Molecular Biology，1986)。 宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法で組換え配列によりコードされる遺 伝子産物を産生し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合 成機により合成的に産生され得る。 成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプ ロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物 に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得 る。原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクター および発現ベクターは、Sambrookら，Molecular Clonlng: A Laboratory Manual , 第２版，Cold Spring Harbor,N.Y.，(1989)（この開示は、本明細書中に参考 として援用される）に記載されている。 本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ ーにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAの シス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーター に作用してその転写を増大させる。例として、複製起点のbp100〜270の後期側の SV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複 製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサー が挙げられる。 一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点お よび選択マーカー（例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisi ae のTRP1遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来 のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、解糖酵素（例えば、3ー ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱 ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、 翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質のペ リプラズム空間または細胞外の培地への分泌を指示し得るリーダー配列と適切な 相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現さ れた組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチド を含む融合タンパク質をコードし得る。 細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み 取り相で、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタンパ ク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築される。ベクターは、 １つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望に より宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のために適 切な原核生物宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、 ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々の 種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。 代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、 周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝子エレメントを含む市販 のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。こ のような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Upp sala，Sweden)およびGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)を包含する。こ れらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配 列と組み合わされる。 適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖に続いて、 選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導） により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。 細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段に より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。 タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音 波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法によ り破砕され得る。このような方法は当業者に周知である。 種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い られ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell，23: 175(1981)に記載され るサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細 胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）が含まれる。哺乳動 物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならび に任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部 位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フランキング 非転写配列を含有する。SV40スプライス部位、およびポリアデニル化部位に由来 するDNA配列は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使用され得る 。 Ｇタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドは、以下を包含する方法によ り組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。硫安沈殿またはエタノ ール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセ ルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニテ ィークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、および レクチンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refo lding）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終 的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る 。 本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物 であり得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物中の 細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により産生 され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド は、グリコシル化され得るし、またはグリコシル化されないかもしれない。本発 明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトの疾患に対する処置お よび診断の発見のための研究試薬および材料として使用され得る。 本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターは、本発明のレセプターポリペプ チドの活性化化合物（アゴニスト）または活性化阻害化合物（アンタゴニスト） のスクリーニングのためのプロセスにおいて使用され得る。 一般的に、このようなスクリーニング手法は、本発明のレセプターポリペプチ ドを細胞表面で発現する適切な細胞の提供を含む。このような細胞は、哺乳動物 、酵母、ショウジョウバエ、またはE.Coli由来の細胞を含む。特に、本発明のレ セプターをコードするポリヌクレオチドを用いて、細胞をトランスフェクトし、 それにより、Ｇタンパク質ケモカインレセプターを発現する。次いで、この発現 したレセプターを、結合、刺激または機能的応答の阻害を観察するために試験化 合物と接触させる。 １つのこのようなスクーニング手順は、本発明のＧタンパク質ケモカインレセ プターを発現するためにトランスフェクトされたメラニン保有細胞の使用を含む 。このようなスクリーニング技術は、PCT WO 92/01810（1992年２月６日公開） に記載される。 従って、例えば、このようなアッセイは、スクリーニングされるべきレセプタ ーリガンドおよび化合物の両方と、レセプターをコードするメラニン保有細胞と を接触することにより、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化 合物をスクリーニングするために使用され得る。リガンドにより生じるシグナル の阻害は、化合物がこのレセプターの潜在的なアンタゴニストであること、すな わち、レセプターの活性化を阻害することを示す。 このスクリーニングは、このような細胞とスクリーニングされる化合物とを接 触させることによりレセプターを活性化する化合物を決定するために用いられ得 、かつこのような化合物がシグナルを生じるか否かを決定する、すなわち、この ような化合物がレセプターを活性化するか否かを決定するために用いられ得る。 他のスクリーニング技術は、例えば、Science、246巻、181〜296頁（1989年10 月）に記載されるように、レセプターの活性化により引き起こされる細胞外のpH 変化を測定する系において、Ｇタンパク質ケモカインレセプターを発現する細胞 （例えば、トランスフェクトCHO細胞）の使用を包含する。例えば、化合物は、 本発明のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接触され得、そしてセカンド メッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはpH変化）が、潜在的化合物が レセプターを活性化または阻害するか否かを決定するために測定され得る。 別のこのようなスクリーニング技術は、Ｇタンパク質ケモカインレセプターを コードするRNAをXenopus卵母細胞に導入し、一時的にレセプターを発現させるこ とを包含する。レセプターの活性化を阻害すると思われる化合物をスクリーニン グする場合、次いでそのレセプター卵母細胞は、レセプターリガンドおよびスク リーニングされる化合物と接触され得、続いて、カルシウムシグナルの阻害また は活性化の検出が行われる。 別のスクリーニング技術は、そのレセプターがホスホリパーゼＣまたはＤと連 結しているＧタンパク質ケモカインレセプターの発現を包含する。このような細 胞の代表例としては、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などが挙げられ得る。 スクリーニングは、本明細書中上記のように、レセプターの活性化またはホスホ リパーゼの２次シグナルによるレセプターの活性化の阻害の検出により達成され 得る。 別の方法は、標識リガンドの細胞表面にレセプターを有する細胞への標識リガ ンドの結合の阻害を決定することによる、本発明のアンタゴニストのレセプター ポリペプチドの活性化を阻害する化合物のスクリーニングを包含する。このよう な方法は、細胞がその表面にレセプターを発現するようにＧタンパク質ケモカイ ンレセプターをコードするDNAで真核細胞をトランスフェクトする工程、および 標識形態の公知のリガンドの存在下で細胞と化合物とを接触させる工程を包含す る。リガンドは、例えば、放射活性により標識され得る。標識リガンドがレセプ ターに結合する量は、例えば、レセプターの放射活性の測定により測定される。 レセプターに結合する標識リガンドの減少により決定されるように化合物がレセ プターに結合する場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻害される。 抗体は、本発明のＧタンパク質ケモカインレセプター、またはいくつかの場合 は、Ｇタンパク質ケモカインレセプターに結合するが、Ｇタンパク質ケモカイン レセプターの活性を阻害するようなセカンドメッセンジャー応答を惹起しないオ リゴヌクレオチドを拮抗し得る。抗体は、一般に抗体の抗原結合部位に会合する 独特の決定子を認識する抗イディオタイプ抗体を包含する。潜在的なアンタゴニ スト化合物もまた、Ｇタンパク質ケモカインレセプターのリガンドに密接に関連 するタンパク質、すなわち、リガンドのフラグメントを含み、これは生物学的機 能を欠失しており、そしてＧタンパク質ケモカインレセプターに結合するときに 応答を惹起しない。 アンチセンス技術の使用により調製されるアンチセンス構築物は、三重らせん 形成またはアンチセンスDNAもしくはRNAを介した遺伝子発現を制御するために用 いられ得、これらの方法の両方は、ポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに結合する ことに基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌク レオチド配列の5'コード部分は、長さが約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリ ゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写 に関与する遺伝子の領域に相補的に設計され（三重らせん-Leeら、Nucl．Acids Res.，6:3073(1979); Cooneyら、Science，241:456(1988);およびDervanら、Sci ence，251: 1360(1991)を参照のこと）、それにより、転写およびＧタンパク質 ケモカインレセプターの産生を阻害する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチド はインビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてmRNA分子のＧタンパク質結合レセ プターへの翻訳をブロックする（アンチセンス-Okano、J．Neurochem.，56:560( 1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression ，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)）。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細 胞に送達され得、それによって、アンチセンスRNAまたはDNAが、Ｇタンパク質ケ モカインレセプターの産生を阻害するためにインビボで発現され得る。 例えば、小ペプチドまたはペプチド様分子のような、正常な生物学的活性を阻 害するようなリガンドへの接近を不可能にするＧタンパク質ケモカインレセプタ ーに結合する小分子もまた、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害す るために用いられ得る。 Ｇタンパク質ケモカインレセプターの可溶性形態（例えば、レセプターのフラ グメント）は、本発明のポリペプチドに対するリガンドに結合し、そして膜結合 Ｇタンパク質ケモカインレセプターとの相互作用からリガンドを保護することに よりレセプターの活性化を阻害するために用いられ得る。 本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターに結合し、かつそれを活性化する 化合物は、造血（haematopoiesis）、創傷癒合、凝固、血管形成を刺激するため に、固形腫瘍、慢性感染、白血病、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患、寄生虫感染、乾癬 を処置し、そして増殖因子の活性を刺激するために使用され得る。 本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターに結合し、かつそれを阻害する化 合物は、アレルギー、アテローム発生、過敏性、悪性、慢性および急性炎症、ヒ スタミンおよびIgE媒介アレルギー反応、プロスタグランジン非依存性熱、骨髄 不全、珪肺症、サルコイドーシス、慢性関節リウマチ、ショックおよび好酸球増 他症候群を処置するために使用され得る。 化合物は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組 成物は、治療的有効量の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形 剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキ ストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げ られるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に合わせるべきである。 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つまたはそれ以上の成分で満たされ た１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器 （単数または複数）に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販 売を統制する政府機関により規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は 、ヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を表 す。さらに、本発明の化合物は、他の治療化合物と併用して用いられ得る。 薬学的組成物は、例えば、局所、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、 または皮内経路による簡便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特異症状の 処置および／または予防に効果的な量で投与され得る。一般に、薬学的組成物は 少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日に 約８mg/kg体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日に約10 μg/kg体重から約１mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮される（CONFI RM DOSAGES）。 Ｇタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドおよびアンタゴニストまたは アゴニスト（これらはポリペプチドである）はまた、本発明に従って、インビボ でのこのようなポリペプチドの発現により用いられ得る。これはしばしば「遺伝 子治療」と呼ばれる。 従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ チド（DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細 胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当 該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNA を含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操 作され得る。 同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分 野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発 明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するた めの産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチ ドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプ チドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者 には明らかである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイ ルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビ ヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。 本明細書中上記の、誘導され得るレトロウイルスプラスミドベクター由来のレ トロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、レトロウイ ルス（例えばラウス肉腫ウイルス）、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウ イルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、 脊髄増殖肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスを包含するが、これらに限 定されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、 モロニーマウス白血病ウイルスより誘導される。 ベクターは、１またはそれ以上のプロモーターを含有する。使用され得る適切 なプロモーターは、レトロウイルスLTR；SV40プロモーター；およびMillerら、B iotechniques 、第７巻、９号、980-990（1989）に記載されるヒトサイトメガロ ウイルス(CMV)プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、ヒスト ン、pol III、およびβ−アクチンプロモーターを包含するが、これらに限定し ない真核細胞プロモーターのような細胞プロモーター）を包含するが、これらに 限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロ モーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター、およびB19パルボウイルスプ ロモーターを包含するが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は 、本明細書中に含まれる技術より当業者にとって明らかである。 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下 にある。使用され得る適切なプロモーターは、以下を包含するが、これらに限定 されない：アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモ ーター；またサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターのような異種プロモー ター；RSウイルス(respiratory syncytial virus)（RSV）プロモーター；MMTプ ロモーターのような誘導プロモーター；メタロチオネインプロモーター；ヒート ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoAIプロモーター；ヒトグ ロブリンプロモーター；ヘルペス単純チミジンキナーゼプロモーターのようなウ イルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスLTR（本明細書中上記の 修飾したレトロウイルスLTRを包含する）；β-アクチンプロモーター；およびヒ ト増殖ホルモンプロモーター。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする 遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得る。 レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入する ために使用され、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得る パッケージング細胞の例は、PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-1 9-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、および本明細書中で全体で参 考として援用されるMiller、Human Gene Therapy，第１巻、5-14頁（1990）に記 載されるDAN細胞株を包含するが、これらに限定されない。ベクターは、当該分 野で公知の任意の手法を通じてパッケージング細胞を形質導入し得る。このよう な手法は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO4沈澱を包 含するが、これらに限定されない。１つの他の方法においては、レトロウイルス プラスミドベクターは、リポソーム内にカプセル化され得るか、または脂質と結 合し、次いで宿主に投与され得る。 プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複 数）を包含する感染性レトロウイルスベクター粒子を生じる。次いで、このよう なレトロウイルスベクター粒子は、インビトロ、またはインビボのいずれかにお いて真核細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核細胞は、 ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を発現する。形質導入さ れ得る真核細胞は、胚幹細胞、胚癌細胞、および造血幹細胞、肝細胞、線維芽細 胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、ならびに気管支の上皮細胞を包含す るが、これらに限定されない。 本発明はまた、Ｇタンパク質ケモカインレセプターに結合し得ることが知られ ていないリガンドが、このようなレセプターに結合し得るかどうかを決定するた めの方法を提供し、この方法は、リガンドのＧタンパク質ケモカインレセプター へのリガンドの結合を許容する条件下でＧタンパク質ケモカインレセプターを発 現する哺乳類細胞をリガンドと接触させる工程、レセプターに結合したリガンド の存在を検出する工程、およびこれにより、リガンドがＧタンパク質ケモカイン レセプターに結合するかどうかを決定する工程を包含する。本明細書中に上記の アゴニストおよび／またはアンタゴニストを決定するためのシステムは、レセプ ターに結合するリガンドを決定するためにも使用され得る。 本発明はまた、レセプターをコードするmRNAの存在を検出することにより、細 胞の表面における本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドの発 現を検出する方法を提供し、この方法は、細胞から全mRNAを獲得する工程、およ び獲得したmRNAを、レセプターをコードする核酸分子の配列に含まれる配列と特 異的にハイブリダイズし得る少なくとも10ヌクレオチドの核酸分子を含有する核 酸プローブと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程、プローブにハイブ リダイズしたmRNAの存在を検出する工程、およびそれによって細胞によるレセプ ターの発現を検出する工程を包含する。 本発明はまた、本発明のレセプターポリペプチドに関連するレセプターを同定 するための方法を提供する。これらの関連レセプターは、本発明のＧタンパク質 ケモカインレセプターポリペプチドに対する相同性により、低ストリンジェンシ ーなクロスハイブリダイゼーションにより、または関連する天然あるいは合成の リガンドと相互作用するか、およびまたは本発明のケモカインレセプターポリペ プチドの遺伝的あるいは薬学的遮断後に類似の挙動を惹起するレセプターを同定 することにより、本発明のＧタンパタ質ケモカインレセプターポリペプチドに対 する相同性により同定され得る。 遺伝子のフラグメントは、本発明の遺伝子と高い配列類似性を有するか、また は類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するために、cDNAライブラリー のハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このタイプのプローブ は、少なくとも20塩基、好ましくは少なくとも30塩基、および最も好ましくは少 なくとも50塩基またはそれ以上である。プローブはまた、完全長の転写産物に対 応するcDNAクローン、ならびに調節およびプロモーター領域、エキソンおよびイ ントロンを包含する本発明の完全な遺伝子を含有するゲノムクローン（単数また は複数）を同定するために使用され得る。このタイプのスクリーンの例は、オリ ゴヌクレオチドプローブを合成するための公知のDNA配列を用いて遺伝子のコー ド領域を単離する工程を包含する。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有す る標識オリゴヌクレオチドは、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブ リダイズするかを決定するために、ヒトcDNA、ゲノムcDNA、またはmRNAのライブ ラリーをスクリーニングして使用される。 本発明はまた、診断薬としての本発明の遺伝子の使用を意図する。例えば、い くつかの疾患は、遺伝した欠損遺伝子により生じる。これらの遺伝子は、欠損遺 伝子の配列を正常な遺伝子の配列と比較して検出され得る。結果的に、「変異」 遺伝子は、異常なレセプター活性と関連することが証明され得る。さらに、変異 を実証および同定するためのさらに別の手段として変異レセプター遺伝子を、機 能的なアッセイシステム（例えば、HEK293細胞のレセプター欠損株における、比 色定量アッセイ、MacConkeyプレート上での発現、相補性試験）において発現さ せるために、適切なベクターに挿入し得る。一旦「変異」遺伝子が同定されると 、次いで「変異」レセプター遺伝子のキャリアの集団がスクリーニングされ得る 。 本発明の遺伝子における変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで 検出され得る。診断のための核酸は、血液、尿、唾液、組織生検、および剖検物 質を包含する患者の細胞より得られ得るが、これらに限定されない。ゲノムDNA は、検出のために直接使用され得、または分析前にPCRを用いることにより酵素 的に増幅され得る（Saikiら、Nature、324:163-166(1986)）。RNAあるいはcDNA もまた、また同じ目的のために使用され得る。例として、本発明の核酸に相補的 なPCRプライマーが、本発明の遺伝子の変異を同定および解析するために使用さ れ得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比較における増幅され た産物のサイズの変化により検出され得る。点突然変異は、放射性標識された本 発明のRNAまたは、あるいは、放射性標識された本発明のアンチセンスDNA配列に 、増幅させたDNAをハイブリダイズさせることにより検出され得る。完全に対合 した配列は、リボヌクレアーゼＡ消化または融解温度の差により、誤対合した二 重らせんから区別され得る。このような診断は、出生前試験または新生児の試験 のために特に有用である。 関連遺伝子と「変異」遺伝子との間の配列相違は、直接DNA配列決定法により 明らかにされ得る。さらに、クローニングされたDNAセグメントは、特異的DNAセ グメントを検出するためのプローブとして用いられ得る。この方法の感受性は、 PCRと組み合わせる場合に大きく増強される。例えば、配列プライマーは、二本 鎖PCR産物または修飾PCRにより生成された一本鎖テンプレート分子と共に用いら れる。配列決定は、放射性標識されたヌクレオチドを用いた従来の方法により、 または蛍光タグを用いた自動配列決定法により行われる。 DNA配列の相違に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲル におけるDNAフラグメントの電気泳動的移動度における変化の検出により達成さ れ得る。特定の位置で配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、 RNase保護およびS1保護または化学的切断法（例えば、cottonら、PNAS 、USA、85 :4397-4401(1985)））により明らかにされ得る。 さらに、いくつかの疾患は、mRNAにおける変化により検出され得る遺伝子発現 における変化の結果であるか、またはこれにより特徴づけられる。あるいは、本 発明の遺伝子は、このタイプのレセプターに関連する機能の低下を発現する個体 を同定するための参考として用いられ得る。 本発明はまた、種々の組織における本発明のＧタンパク質ケモカインレセプタ ーポリペプチドの可溶性形態の変化したレベルを検出するための診断アッセイに 関する。宿主に由来するサンプル中の可溶性レセプターポリペプチドのレベルを 検出するために用いられるアッセイは、当業者において周知であり、そして放射 免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット解析、および好ましくは ELISAアッセイを包含する。 ELISAアッセイは、最初に、Ｇタンパク質ケモカインレセプターポリペプチド の抗原に対して特異的な抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を調製する工程 を包含する。さらに、レセプター抗体は、モノクローナル抗体に対して調製され る。レセプター抗体には、例えば放射活性、蛍光、または本実施例においては、 西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような、検出可能な薬剤が付着される。サン プルは、次に宿主から除去され、そしてサンプル中のタンパク質と結合する固体 の支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次い で、ディッシュ上の任意の遊離のタンパク質結合部位は、例えばウシ血清アルブ ミンのような非特異的タンパク質と共にインキュベートすることにより覆われる 。次に、モノクローナル抗体をこのディッシュ中でインキュベートし、その間、 モノクローナル抗体が、ポリスチレンディッシュに付着した任意のＧタンパク質 ケモカインレセプタータンパク質に結合する。全ての未結合モノクローナル抗体 を緩衝液で洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼに連結したレセプター抗体は 、次にディッシュ内に置かれ、Ｇタンパク質ケモカインレセプタータンパク質に 結合した任意のモノクローナル抗体に対するレセプター抗体の結合が生じる。次 いで、未結合レセプター抗体は洗浄される。次いで、ペルオキシダーゼ基質がデ ィッシュに添加され、そして所定の時間間隔で現れた色の量は、標準曲線と比較 すると、所定容量の患者のサンプル中に存在するＧタンパク質ケモカインレセプ タータンパク質の量の測定である。 本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染 色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得る 。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位 置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬 はほとんどない。本発明に従うDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と 疾患に関する遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階である。 簡潔に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を 調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲ ノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化 するプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマ ーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用 される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグ メントを生じる。 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て るための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明 を使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大き なゲノムクローンのプールを用いて部分的局在性の決定(sublocalization)が達 成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング計画 は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別した(flow-sorted )染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築 するためのハイブリダイゼーションによる前選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼー ション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。こ の技術は、50または60塩基という短いcDNAで使用され得る。この技術の総説とし ては、Vermaら，Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと。 一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な 位置を遺伝的地図のデータと相関させられ得る。このようなデータは、例えば、 V．McKusick，Mendelian Inheritance in Man に見出される(Johns Hopkins Uni versity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)。次いで、同 一の染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣 接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する 必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体 には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるようである。 物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患 に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的 原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング解像度で、 そして20kbあたり１遺伝子と仮定する。） このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナ ログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるため の免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、 またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体お よびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物 を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメン トの産生のために使用され得る。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポ リペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ 得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた 抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグ メントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体 を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチド を発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。 モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体 を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohle rおよびMilstein，1975，Nature，256: 495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞 ハイブリドーマ技術(Kozborら，1983，Immunology Today 4: 72)、およびヒトモ ノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら，1985，Mono clonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)が挙げら れる。 単鎖抗体を産生するために記載された技術（米国特許第4,946,778号)を、本発 明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る 。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性のポリペプチド産物に 対するヒト化抗体の発現に使用され得る。 本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのよ うな実施例に限定されないことが理解されるべきである。すべての部または量は 、他に明記しない限り重量基準である。 以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に現れる特定の方法および／ま たは用語が記載される。 「プラスミド」は、小文字のｐの前および／またはそれに続く大文字および／ または数字を示すことにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販 であり、制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手 可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプ ラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には通常明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触 媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市 販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者 に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまた はDNAフラグメントには、約２単位の酵素が約20μlの緩衝溶液中で使用される。 プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的には、代表的には５〜5 0μgのDNAが20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制限 酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃にて の約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者 の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直 接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。 切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら，Nucleic Aclds Res.,８:40 57(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。 「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相 補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成さ れ得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキ ナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連 結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに 連結する。 「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形 成するプロセスをいう(Maniatis,Tら、前出、146頁)。他に提供されていなけれ ば、連結は公知の緩衝液および条件で、大体等モル量の連結されるべきDNAフラ グメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成さ れ得る。 記載しない限り、形質転換はGraham,F.およびVan der Eb，A.，Virology，52: 456-457(1973)の方法に記載のように実施された。 実施例１ HDGNR10 の細菌発現および精製 HDGNR10をコードするDNA配列（ATCC受託番号第97183号）を、プロセスされたH DGNR10タンパク質の５'配列（シグナルペプチド配列を除く）およびHDGNR10遺伝 子に対して３'のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用 いて最初に増幅する。HDGNR10に対応するさらなるヌクレオチドを、それぞれ５' および３'配列に添加した。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５'CGGAA TTCCTCCATGGATTATCAAGTGTCA３'を有し、EcoRI制限酵素部位、それに続くプロセ スされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から始まる18ヌクレオチドのHDGN R10コード配列を含む。３'配列、５'CGGAAGCTTCGTCACAAGCCCACAGATAT３'は、Hin dIII部位に相補的な配列を含み、そして続いてHDGNR10のコード配列の18ヌクレ オチドを含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9（Qiagen，Inc．9259 E ton Avenue，Chatsworth，CA，91311）上の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、 抗生物質耐性（Ampr）、細菌の複製起点（ori）、IPTG調節可能プロモーターオ ペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-Hisタグ、および制限酵素 部位をコードする。次いで、pQE-9をEcoRIおよびHindIIIで消化した。増幅配列 をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列を有するフ レーム内に挿入した。次いで、連結混合物を用いて、E ．coli株M15/rep4（Qiage n,Inc.）をSambrook，J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold S pring Laboratory Press，(1989)に記載の手順により形質転換した。M15/rep4は 、lacIリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（Kanr）を付与する プラスミドpREP4の多数のコピーを含む。形質転換体をLBプレート上で増殖する それらの能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを 選択した。プラスミドDNAを単離し、制限酵素分析により確認した。所望の構築 物を含むクローンを、Amp（100μg/ml）とKan（25μg/ml）との両方を補充したL B培地における液体培養で一晩（O/N）増殖させた。O/N培養物を用いて1:100〜1: 250の比で大きな培養物に接種する。細胞を、600の光学密度（O.D.600）が0.4と 0.6との間になるまで増殖させた。次いで、IPTG（「イソプロピル-B-D-チオガラ クトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にした。IPTGは、lacIリプレッサー を不活性化することにより、P/Oを解放（clear）し遺伝子発現の増加を誘導する 。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により収穫した 。細胞ペレットをカオトロピズムの薬剤６ＭグアニジンHCl中で可溶化した。澄 明後、可溶化されたHDGNR10を6-ヒスタグを含有するタンパク質により堅く結合 させる条件下で、ニッケル−キレートカラム上でのクロマトグラフィーによりこ の溶液から精製した。Hochuli，Eら、J．Chromatography 411: 177-184（1984） 。HDGNR10を６MグアニジンHCl(pH5.0)でカラムから溶出し、そして再生の目的で 、３MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元型）、 および２mMグルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中での12時間のインキ ュベーションの後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析した。 実施例２ COS 細胞における組換えHDGNR10の発現 プラスミドの発現、HDGNR10 HAを、ベクターpcDNAI/Amp（Invitrogen）から誘 導する。ベクターpcDNAI/Ampは以下を含有する：１）SV40複製起点、２）アンピ シリン耐性遺伝子、３）E．coli複製起点、４）ポリリンカー領域、SV40イント ロンそしてポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター。完全なHDGNR10前駆体、 およびその３'末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメ ントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタン パク質発現はCMVプロモーター下で支配される。HAタグは、先に記載されたよう なインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（I．Wil son、H．Niman、R．Heighten、A Cherenson、M．Connolly、およびR．Lerner、1 984，Cell 37，767）。標的タンパク質へのHAタグの融合により、HAエピトープ を認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能になる。 プラスミド構築ストラテジーを以下に記述する： HDGNR10をコードするDNA配列（ATCC受託番号第97183号）を、２つのプライマ ーを用いたPCRにより構築した：５'プライマー５'GTCCAAGCTTGCCACCATGGATTATCA AGTGTCA３'は、HindIII部位、それに続く開始コドンから始まるHDGNR10コード配 列の18ヌクレオチドを含む；３'配列５'CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATG GGTAGCACAAGCCCACAGATATTTC３'は、XhoI部位、翻訳停止コドン、HAタグ、および HDGNR10コード配列の最後の18ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補的 な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、HindIII部位、インフレーム融合したHAタ グが続くHDGNR10コード配列、HAタグに隣接する翻訳終止停止コドン、およびXho I部位を含む。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクター（pcDNAI/Amp）を、HindI IIおよびXhoI限酵素により消化し、そして連結した。連結混合物を、E．coli SU RE株（Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Joll a，CA 92037より入手可能）に形質転換し、形質転換培養物をアンピシリン培地 プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換 体より単離し、そして正しいフラグメントの存在を制限分析で試験した。組換え HDGNR10の発現のために、COS細胞をDEAE-DEXTRAN法により発現ベクターでトラン スフェクトした（J．Sambrook、E．Fritsch、T．Maniatis、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)）。HDGNR10 H Aタンパク質の発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した。（E. Harl ow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborat ory Press，(1988)）。細胞を、トランスフェクションの２日後、35S-システイ ンで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤(RIPA 緩衝液(150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tr is(pH7.5))で溶解した(Wilson，I．ら、同上37:767(1984)）。細胞溶解物および 培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体により沈降させた。沈降したタ ンパク質を15％ SDS-PAGEゲル上で分析した。 実施例３ バキュロウイルス発現系を用いるHDGNR10のクローニングおよび発現 全長のHDGNR10タンパク質をコードするDNA配列（ATCC受託番号第97183号）を 、遺伝子の５'および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用 いて増幅した。 ５'プライマーは、配列５’CGGGATCCCTCCATGGATTATCAAGTGTCA３'を有し、そし てBamHI制限酵素部位、それに続く真核細胞における翻訳の開始に効率的なシグ ナルに類似する4ヌクレオチド（J．Mol．Biol．1987，196，947-950，Kozak，M. ）、およびその直後の、HDGNR10遺伝子の最初の18ヌクレオチド（翻訳開始コド ンは「ATG」である）を含む。 ３'プライマーは、配列５’CGGGATCCCGCTCACAAGCCCACAGATAT３'を有し、制限 エンドヌクレアーゼBamHIの切断部位およびHDGNR10遺伝子の３'非翻訳配列に相 補的な18ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販のキット（「Geneclean」BIO 1 01 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルより単離した。次いで 、フラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIで消化し、そして上記のように精製 した。このフラグメントを、F2と称する。 ベクターpRG1(pVL941ベクターの改変体、下記）をバキュロウイルス発現系を 用いるHDGNR10タンパク質の発現のために用いる（総説について、Summers，M.D. およびSmith，G.E．1987，Amanual of methods for baculovirus vectors and i nsect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station B ulletin No．1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa californi ca核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強いポリヘドリンプロモーター、それに続く 制限エンドヌクレアーゼBamHIの認識部位を含む。シミアンウイルス（SV）40の ポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイル スを容易に選択するために、E．coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘ ドリンプロモーターと同方向に挿入し、その後ポリヘドリン遺伝子のポリアデニ ル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクト野生型ウイルス DNAの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列で両端で隣接させる。多くの 他のバキュロウイルスベクターが、pRG1の代わりに用いられ得る。例えば、pAc3 73、pVL94、およびpAcIM1である（Luckow，V.A.およびSummers，M.D.、Virology ，170:31-39）。 プラスミドを制限酵素BamHIで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔 ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、上記のようにDNAを１ ％アガロースゲルより単離した。このベクターDNAをV2と称する。 フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連 結した。次いで、E．coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIを用いて、 HDGNR10遺伝子を有するプラスミド（pBacHDGNR10）を含む細菌を同定した。クロ ーン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認した。 ５μgのプラスミドpBacHDGNR10を、リポフェクション法（Felgnerら Proc．N atl．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の線状化 したバキュロウイルス（「BaculoGoldTM baculovirus DNA」，Pharmingen，San Diego，CA.）とともにコトランスフェクトした。 1μgのBaculoGoldTMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBacHDGNR10を、50 μlの血清非含有グレース培地（Life Technologis Inc.，Gaithersburg，MD） を含むマイクロタイタープレートの無菌ウエル中で混合した。その後、10μlリ ポフェクチンおよび90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15 分間インキュベートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清非 含有グレース培地１mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細 胞（ATCC CRL．1711）に滴下した。プレートを、新たに加えられた溶液を混合す るために、前後に振とうした。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベート した。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ ウシ胎児血清を補充した１mlのグレース昆虫培地を添加した。プレートをインキ ュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を続けた。 ４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）による記載と同様 にプラークアッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラークの容易な 単離を可能にする、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）を 有するアガロースゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、 Life Technologies Inc.、Gaithersburg、で配布される昆虫細胞培養法およびバ キュロウイルス学の使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。 ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた４日後、青く染色されたプラークをエッ ペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、 200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁した。寒天を、簡 単な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35mm ディッシュに播種されたSf9細胞に感染するために用いた。４日後、これらの培 養ディッシュの上清を回収し、次いで４℃で保存した。 Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充したグレース培地中で培養した。細胞を、 感染多重度（MOI）２で組換えバキュロウイルスV-HDGNR10で感染させた。６時間 後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培 地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換えた。42時間後、５μCi の35Ｓ-メチオニンおよび５μCiの35Ｓシステイン（Amersham）を添加した。細 胞を、さらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集し、そ して標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視 化した。 実施例４ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を、被験者から皮膚生検によって獲得した。得られた組織を組織培 養培地中に入れ、そして小さい切片に分けた。組織の小さな切片は、組織培養フ ラスコの湿った表面上に置かれ、各フラスコ中に約10切片を入れる。フラスコを 上下に回転させ、しっかりと密閉し、室温に一晩放置する。室温で24時間後、フ ラスコを逆転させ、そして組織切片をフラスコの底に固定したまま維持し、そし て新鮮な培地（例えば、10％ FBS、ペニシリン、ストレプトマイシンを有するHa m's F12培地）を添加する。次いで、これを37℃で約１週間インキュベートする 。このとき、新鮮な培地を添加し、そしてその後数日ごとに交換する。さらに２ 週間の培養後、線維芽細胞の単層が生じる。単層をトリプシン化し、そしてより 大きなフラスコに大きく（scale）する。 モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復に隣接するpMV-7（Kirschmeier， P.T.ら、DNA，7: 219-25(1988)）をEcoRIおよびHindIIIを用いて消化し、そして 次いで仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。直鎖状ベクターをアガロースゲル 上で分離し、そしてガラスビーズを用いて精製する。 本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、それぞれ5'および3'末端配列の対 応するPRCプライマーを用いて増幅する。5'プライマーは、EcoRI部位を含有し、 そして3'プライマーは、HindIII部位を含有する。等量のモロニーマウス肉腫ウ イルス直鎖状骨格、ならびにEcoRIおよびHindIIIフラグメントを、T4 DNAリガー ゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、２つのフラグメントの連結に適 切な条件下で維持する。連結混合物を、細菌HB101の形質転換のために使用し、 次いで、これを、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認 する目的のために、カナマイシンを含むアガープレート上にプレートする。 両栄養性pA317またはGP+am12パッケージング細胞を、10％仔ウシ血清（CS）、 ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM ）における組織培養中で、集密的密度に増殖させる。次いで、遺伝子を含むMSV ベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターにより形質導入 する。この時点でパッケージング細胞は、遺伝子を包含する感染性ウイルス粒子 を産生する（この時点でパッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれる ）。 新鮮な培地を形質導入プロデューサー細胞に添加し、その後、集密的プロデュ ーサー細胞の10cmプレートから培地を回収する。感染性ウイルス粒子を含む消費 された培地を、ミリポア（millipore）フィルターを通してフィルター濾過し、 分離したプロデューサー細胞を除去し、そして次いでこの培地を用いて線維芽細 胞を感染させる。培地を、線維芽細胞のサブ集密的プレートから除去し、そして 迅速にプロデューサー細胞からの培地に置き換える。この培地を除去し、そして 新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高い場合、事実上全ての線維芽細胞 が感染され、そして選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、選択マーカー （例えば、neo、またはhis）を有するレトロウイルスベクターを使用することが 必要である。 次いで、操作された線維芽細胞は、単独、あるいはサイトデックス３マイクロ キャリアービーズ上で集密的に増殖させた後のいずれかで宿主に注入される。そ の後、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。 本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、従っ て、特に記載がなければ、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され得る。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                Human G protein chemokine receptor HDGNR10   The present invention relates to newly identified polynucleotides, such polynucleotides Polypeptides, such polynucleotides and polypeptides For the use of tides and the production of such polynucleotides and polypeptides Related. More specifically, the polypeptides of the present invention may be used as chemokine receptors. It is a putatively identified human 7-transmembrane receptor. Sometimes referred to as "G protein chemokine receptor" or "HDGNR10". The invention also relates to inhibiting the action of such polypeptides.   Numerous medically important biological processes involve G protein and / or Proteins involved in signal transduction pathways, including messengers (eg, cAMP) Is well established (Lefkowitz, Nature, 351). : 353-354 (1991)). In the present specification, these proteins are referred to as G proteins. Protein or PPG protein involved in the pathway involved. These proteins Some examples of quality include GPC receptors (eg, adrenergic drugs and GPC receptor for dopamine (Kobilka, B.K. et al., PNAS, 84: 46-50 (1987); Kobilka, B.K. et al., Science, 238: 650-656 (1987); Bunzow, J.R. et al., Nature, 336. : 783-787 (1988))), the G protein itself, an effector protein (eg, , Phospholipase C, adenyl cyclase, and phosphodiesterase) Activator protein (for example, protein Kinase A and protein kinase C) (Simon, M.I., et al., Science, 252: 802- 8 (1991)).   For example, in one form of signal transduction, the effect of hormone binding is Activation of the enzyme adenylate cyclase. Activation of enzymes by hormones Depends on the presence of nucleotide GTP, and GTP also affects hormone binding I can. G protein links the hormone receptor to adenylate cyclase You. G protein binds GTP when activated by hormone receptors. Strange It was shown to change. The form with GTP is then activated adenylic acid Binds to cyclase. Hydrolysis of GTP to GDP depends on the G protein itself. Being catalyzed, it returns the G protein to its basal, inactive form. Therefore, the G protein is , As an intermediate to relay the signal from the receptor to the effector, and It plays two roles as a clock that controls the duration of the null.   The membrane protein gene superfamily of G protein-coupled receptors consists of 7 It has been characterized as having two putative transmembrane domains. This domain Is considered to represent a transmembrane α-helix connected by an extracellular or cytoplasmic loop. available. G protein-coupled receptors include hormones, viruses, growth factors and And a wide range of biologically active receptors such as neuroreceptors.   G protein-coupled receptors bind at least eight open hydrophilic loops. Comprising these seven conserved hydrophobic ranges of about 20-30 amino acids It is characterized as: G protein family of coupled receptors Receptor Binds to Neuroleptic Drugs Used in the Treatment of Diseases and Neurological Diseases Including Other examples of this family include calcitonin, adrenergic, Endothelin, cAMP, adenosine, muscarinic, acetylcholine, serotonin , Histamine, thrombin, kinin, follicle-stimulating hormone, opsin, endothelial differentiation Gene 1 receptor and rhodopsin, odorant, cytomegalovirus receptor And others.   G protein-coupled receptors are variously dependent on heterotrimeric G proteins. It can bind intracellularly to enzymes, ion channels and transporters in the cell ( Johnson et al., Endoc., Rev., 10: 317-331 (1989)). Different G proteins Quality alpha subunit is preferably for regulating various biological functions in the cell. Stimulates certain effectors. Of cytoplasmic residues of G protein-coupled receptors Phosphorylation regulates G protein coupling of some G protein coupled receptors Has been identified as an important mechanism. G protein-coupled receptors are Are found at many sites in the host.   Chemokines are also known as intercrine cytokines. It is a subfamily of structurally and functionally related cytokines You. These molecules are between 8 and 10 kd in size. Generally, chemokines are 20% to 75% % Homology at the amino acid level and forms two disulfide bonds It is characterized by four conserved cysteine residues. The first two stays Based on the arrangement of residues, chemokines are divided into two subfamilies, α and β. being classified. In the alpha subfamily, the first two cysteines are one amino acid And will be referred to as the "C-X-C" subfamily in the future. Beta subfa In Millie; the two cysteines are in an articulated position, and therefore, "C- It is called the "C" subfamily. Thus, at least nine of this family Of different members have been identified in humans.   Intercrine cytokines display a wide variety of different functions. Salient features Are different cell types, including monocytes, neutrophils, T lymphocytes, basophils, and fibroblasts. Ability to induce chemotactic migration of the vesicle type. Many cytokines have pro-inflammatory activity Have and are involved in multiple stages during the inflammatory response. These activities are Stimulation of min release, release of lysosomal enzymes and leukotrienes, Increased adhesion to endothelial cells, enhanced complement protein binding, granule cell adhesion molecules and And induction of complement receptor expression, and respiratory explosion. Their in inflammation In addition to relevance, it has been suggested that certain chemokines exhibit other activities. For example Macrophage inflammatory protein 1 (MIP-1) can suppress the proliferation of hematopoietic stem cells , Platelet factor 4 (PF-4) is a potential inhibitor of endothelial cell proliferation, 8 (IL-8) promotes keratinocyte proliferation, and GRO promotes melanoma cell proliferation. Autocrine growth factor.   In a wide range of biological activities, chemokines are found to wander lymphocytes (trafficki ng), wound healing, hematopoietic regulation and immunity such as allergy, asthma and arthritis It is surprising to be involved in many physiological and disease states, including biological diseases. It is not the case.   According to one aspect of the present invention, novel mature receptor polypeptides and native Fragments, analogs and fragments thereof that are physically active and useful for diagnosis or treatment. And derivatives are provided. The receptor polypeptide of the invention is of human origin.   According to another aspect of the present invention, a simple encoding the receptor polypeptide of the present invention is provided. An isolated nucleic acid molecule is provided, wherein the nucleic acid molecule is mRNA, DNA, cDNA, genomic DNA, And their antisense analogs, and biologically active and diagnostic or therapeutic Including its useful fragments.   According to a further aspect of the present invention, expression of said polypeptide and subsequent Under conditions that facilitate recovery of the polypeptide, the receptor polypeptide of the invention may be cloned. Recombinant prokaryotic and / or eukaryotic host cells containing the nucleic acid sequences to be encoded By recombinant technology including the step of culturing A process for producing a code is provided.   According to a still further aspect of the present invention, there are provided Antibodies are provided.   According to another aspect of the invention, it binds to a receptor polypeptide of the invention and comprises Screening methods for compounds that either activate or inhibit activation Provided.   According to yet another embodiment of the invention, binding to the receptor polypeptide of the invention And administering the activating compound to the host. This compound Useful for hematopoiesis, wound healing, coagulation, stimulation of angiogenesis, solid tumors, chronic infections Treats leukemia, T-cell mediated autoimmune diseases, parasitic infections, Qiantang and Stimulates child activity.   According to another aspect of the invention, underexpression of the polypeptide or receptor polypeptide Via gene therapy to treat conditions associated with under-expression of peptide ligands Thus, there is provided a method for administering the receptor polypeptide of the present invention.   According to yet another embodiment of the invention, binding to the receptor polypeptide of the invention And administering to the host a compound that inhibits its activation. This compound Objects include allergies, atherogenesis, irritability, malignancy, chronic and acute inflammation , Histamine and IgE-mediated allergic reactions, prostaglandin-independent fever , Bone marrow failure, silicosis, sarcomas, rheumatoid arthritis, shock and eosinophilia Useful for prevention and / or treatment of the syndrome.   According to yet another aspect of the present invention, a polynucleotide sequence of the present invention A nucleic acid probe is provided that contains a nucleic acid molecule of sufficient length to hybridize. It is.   According to yet another aspect of the invention, a nucleic acid sequence encoding such a polypeptide is provided. To detect diseases associated with mutations in the sequence, as well as to the receptor polypeptide Diagnostic assays are provided for detecting altered levels of the soluble form of the drug.   According to a still further aspect of the present invention, such a receptor polypeptide, or even Alternatively, polynucleotides encoding such polypeptides may be used in scientific research, DN Utilized for in vitro purposes related to the synthesis of A and the production of DNA vectors Process is provided.   These and other aspects of the invention will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein. Should be.   The following drawings are illustrative of embodiments of the present invention and are encompassed by the claims. As such, it is not meant to limit the scope of the invention.   FIG. 1 shows the cDNA sequence of the G protein-coupled receptor of the present invention and the corresponding inference. 1 shows a constant amino acid sequence. Use the standard one-letter abbreviations for amino acids. Sequencing, 37 3 An automatic DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc.) was used.   FIG. 2 shows the G protein chemokine receptor of the present invention and the human MCP-1 receptor 2 illustrates an amino acid sequence alignment between   According to aspects of the invention, it has the deduced amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). The mature polypeptide, or Ameri as ATCC Accession No. 97183 on June 1, 1995 can Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, encoded by cDNA of clone deposited in United States of America Provided an isolated nucleic acid (polynucleotide) encoding a mature polypeptide Is done.   The polynucleotide of the present invention has been found in a cDNA library derived from human monocytes. It is structurally related to the G protein-coupled receptor family. This is 35 Includes open reading frame encoding two amino acid residue protein . This protein spans a range of 347 amino acids and binds to the human MCP-1 receptor. Shows the highest degree of homology with 70.1% identity and 82.9% similarity.   The polynucleotide of the present invention may be in the form of RNA or DNA (this DNA may be cDNA, Enclosing synthetic DNA and synthetic DNA). DNA is double-stranded or single-stranded Possible and, if single-stranded, the coding strand or the non-coding (antisense) strand Can be The coding sequence encoding the mature polypeptide is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). ) Or the coding sequence of the deposited clone, Alternatively, as a result of the duplication or degeneracy of the genetic code, Encodes the same mature polypeptide as the DNA of SEQ ID NO: 1) or the deposited cDNA It can be a different coding sequence.   The mature polypeptide of FIG. 1 or the mature polypeptide encoded by the deposited cDNA Polynucleotides encoding the tides can include: of the mature polypeptide Coding sequence only; coding sequence for mature polypeptide, and transmembrane (TM) or Additional coding sequences, such as intracellular domains; coding sequences for mature polypeptides (such as And any additional coding sequences) and non-coding sequences (eg, Or the 5 'and / or 3' non-coding sequence of the coding sequence of the mature polypeptide).   Thus, the term "polynucleotide encoding a polypeptide" refers to a polypeptide. A polynucleotide containing only the coding sequence of the And / or polynucleotides containing non-coding sequences.   The present invention further provides a polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG. Fragments and analogs of the polypeptide encoded by the cDNA of the clone selected And variants encoding the above-described polynucleotides encoding derivatives . A variant of a polynucleotide is a naturally occurring allele of the polynucleotide. It may be a variant or a non-naturally occurring variant of a polynucleotide.   Accordingly, the present invention provides a mature polypeptide identical to that shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Or the same mature polypeptide encoded by the cDNA of the deposited clone. The polynucleotide to be loaded, as well as variants of such a polynucleotide. Include. This variant is the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or the deposited protein. A fragment, derivative, or fragment of a polypeptide encoded by the loan cDNA. Code the nalog. Such nucleotide variants include deletion variants, substitution modifications And addition or insertion variants.   As indicated hereinabove, the polynucleotide is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). Naturally occurring alleles of the coding sequence shown in or the coding sequence of the deposited clone It may have a coding sequence that is a gene variant. As known in the art, alleles Variants are polynucleic acids that can have one or more nucleotide substitutions, deletions or additions. Another form of the reotide sequence that substantially functions the encoded polypeptide. Not change.   The polynucleotide may also be a TM and an intracellular domain of a full-length polypeptide of the invention. G-protein chemocha that is an extracellular part of a polypeptide cleaved from the main It may encode a soluble form of the inreceptor polypeptide.   The polynucleotide of the present invention also allows for purification of the polypeptide of the present invention. It may have the coding sequence fused in frame to the marker sequence. Marker sequence Provides for purification of the mature polypeptide fused to a marker in the case of a bacterial host The hexahistidine tag supplied by the pQE-9 vector. is there Alternatively, for example, a marker sequence is used in a mammalian host (eg, COS-7 cells). If so, it may be a hemagglutinin (HA) tag. HA tag is for influenza clot Consistent with an epitope derived from the confluent protein (Wilson, I. et al., Cell, 37: 767. (1984)).   The term "gene" refers to a DNA segment involved in the production of a polypeptide chain This is the region preceding and following the coding region (leader and Railer) as well as the intervening sequences between the individual coding segments (exons) ( Intron).   The fragments of the full-length gene of the present invention are used to isolate full-length cDNA, and Have high sequence similarity to this gene or have similar biological activity A hybridization probe of a cDNA library for isolating the cDNA of Can be used. This type of probe preferably has at least 30 bases. And may include, for example, 50 or more bases. This probe also CDNA clones corresponding to full-length transcripts, as well as regulatory regions and promoters A genomic clone containing the complete gene, including regions, exons, and introns ( One or more). As an example of screening, Using known DNA sequences to synthesize oligonucleotide probes And isolating the coding region of the gene. Complementary to the sequence of the gene of the present invention A labeled oligonucleotide having a sequence that matches Human cDNA library, to determine whether to hybridize Used to screen genomic DNA or mRNA.   The invention further relates to at least 70%, preferably at least 90% and More preferably, if there is at least 95% identity, the sequence described herein above To a polynucleotide that hybridizes to The invention particularly relates to A polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide under stringent conditions. Regarding nucleotides. The term "stringent conditions" as used herein Is that hybridization is at least 95%, and preferably It means that it occurs only when at least 97% identity is present. Favorable fruit In an embodiment, a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide as described herein above. The nucleotides are encoded by the cDNA of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or the deposited cDNA. Retains substantially the same biological function or activity as the mature polypeptide Encodes a polypeptide having the same.   Alternatively, the polynucleotide has at least 20 bases, preferably 30 bases, And more preferably it may have 50 bases. These are the polynucleotides of the invention. And has identity to it, as described hereinabove. And may or may not retain activity. For example, this Such a polynucleotide can be sequenced, for example, for recovery of the polynucleotide. As a probe for the polynucleotide of number 1, or as a diagnostic probe or PC Can be used as an R primer.   Thus, the present invention provides at least 70%, preferably at least 90%, and more Preferably, it relates to polynucleotides having at least 95% identity. This port The polynucleotide is a polynucleotide of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof. Which is at least 30 bases, and preferably 50 bases. is there. The present invention relates to a polynucleotide encoded by such a polynucleotide. Regarding nucleotides.   Deposit (s) referred to herein are deposits of microorganisms for patent purposes Maintained under the Budapest Treaty on the International Recognition of These deposits are It is provided only as a convenience to the merchant, and under 35 U.S.C. 112 It does not acknowledge that a deposit is required. Polynucleotides in the deposit The sequence of the tide, as well as the amino acid sequence of the polypeptide encoded thereby, Any reference to the sequence herein is incorporated by reference herein. Contradictions are also suppressed. A license is required to manufacture or sell the deposit And no such license is granted by this.   The present invention further comprises the deduced amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), or Or a G protein chemocha having an amino acid sequence encoded by the deposited cDNA Inreceptor polypeptides, and fragments of such polypeptides , Analogs and derivatives.   The terms "fragment," "derivative," and "analog" refer to the polypeptide of FIG. Refer to the polypeptide encoded by the cDNA or deposited cDNA. Substantially the same biological function or activity as the peptide (ie, Function as a cytokine receptor) or the polypeptide Functions as a protein chemokine receptor (eg, a soluble form of this receptor) If not, retain or retain the ability to bind ligand or receptor. Means a polypeptide that is somehow. Analogs cut the proprotein part Includes proproteins that can be activated by to produce active mature polypeptides I do.   The polypeptide of the present invention can be a recombinant polypeptide, a natural polypeptide or a synthetic polypeptide. It can be a synthetic polypeptide, preferably a recombinant polypeptide.   Encoded by the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or the deposited cDNA A fragment, derivative or analog of a polypeptide may comprise (i) one or more amino acids. A non-conserved amino acid residue or a non-conserved amino acid residue (preferably a conserved amino acid residue) Acid residues), and such substituted amino acid residues are included in the genetic code. May or may not be a more encoded amino acid residue Or (ii) one or more amino acid residues contain a substituent, or (iii) ) The mature polypeptide is a compound that increases the half-life of the polypeptide (eg, a polypeptide). Re Fused with another compound such as ethylene glycol), or (iv) Additional amino acids are fused to the mature polypeptide for purification of the polypeptide. Or (v) the fragment of the polypeptide is soluble (ie, Non-membrane bound), yet still binds the ligand to the membrane bound receptor obtain. Such fragments, derivatives and analogs may be prepared according to the teachings herein. Are considered to be within the purview of those skilled in the art.   The polypeptides and polynucleotides of the present invention are preferably in isolated form And is preferably purified to homogeneity.   The polypeptide of the present invention comprises SEQ ID NO: 2 (particularly the mature polypeptide) and At least 70% similarity (preferably 70% identity) to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 ), And more preferably 90% similarity (more preferably) to the polypeptide of SEQ ID NO: 2. Preferably 90% identity), and even more preferably the polypeptide of SEQ ID NO: 2. Polypeptides with 95% similarity (even more preferably 90% identity) to peptides And generally at least 30 amino acids and more preferably at least 50 amino acids. Such polypeptides having such a portion of a polypeptide comprising a amino acid Of the polypeptide.   "Similarity" between two polypeptides, as known in the art, is the property of the second polypeptide. The amino acid sequence of the polypeptide and the conserved amino acids Determined by comparing the acid substitution.   Fragments or portions of the polypeptides of the present invention may be prepared by peptide synthesis. Can be used to produce a full-length polypeptide. Therefore, this fragment Can be used as an intermediate to produce a full-length polypeptide. Of the present invention A fragment or portion of a polynucleotide may be a full-length polynucleotide of the invention. Can be used to synthesize   The term "gene" refers to a DNA segment involved in the production of a polypeptide chain This is the region preceding and following the coding region (the “leader” and And “trailers”) and between individual code segments (exons) Sequence (intron).   The term "isolated" refers to a substance that is in its natural environment (e.g., when it occurs in nature). Means taken out of the natural environment). For example, living movement A naturally occurring polynucleotide or polypeptide present in a product is isolated But not separated from some or all of the coexisting materials in the natural system. The same polynucleotide or polypeptide that has been isolated has been isolated. this Such a polynucleotide can be part of a vector and / or The polynucleotide or polypeptide can be part of the composition, and Such a vector or composition is not part of its natural environment, and is therefore obtain.   The polypeptide of the present invention is a polypeptide of SEQ ID NO: 2 (particularly a mature polypeptide). At least 70% similarity with the polypeptide of SEQ ID NO: 2 (preferably Is at least 70% identity), and more preferably the polypeptide of SEQ ID NO: 2. At least 90% similarity (more preferably at least 90% identity) to And even more preferably at least 95% similarity with the polypeptide of SEQ ID NO: 2 (Even more preferably at least 95% identity) And also generally at least 30 amino acids and more preferably at least 30 amino acids Such a polypeptide having such a portion of a polypeptide comprising 50 amino acids Includes a portion of the tide.   "Similarity" between two polypeptides, as known in the art, is the property of the second polypeptide. The amino acid sequence of one polypeptide and its conservation relative to the sequence of the peptide Determined by comparing the substituted amino acid substitutions.   Fragments or portions of the polypeptides of the present invention may be prepared by peptide synthesis. Can be used to produce a full-length polypeptide. Therefore, this fragment Can be used as an intermediate to produce a full-length polypeptide. The present invention A fragment or portion of a polynucleotide may comprise a full-length polynucleotide of the invention. Can be used to synthesize.   The present invention also provides a vector comprising the polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention. Cells genetically engineered with E. coli and polypep of the invention by recombinant technology It relates to the production of pide.   A host cell is a vector of the present invention (for example, a cloning vector or Can be genetically engineered (transduced or otherwise) using an expression vector. Or transformed or transfected). Vectors, for example , Plasmids, virus particles, phages and the like. Manipulated host The cell may be used to activate a promoter, select a transformant, or Can be cultured in conventional nutrient media that has been appropriately modified to amplify You. Culture conditions (eg, temperature, pH, etc.) will depend on the host cell chosen for expression. Conditions previously used, and will be apparent to those skilled in the art.   The polynucleotide of the present invention is used for producing a polypeptide by recombinant technology. Can be used. Thus, for example, a polynucleotide expresses a polypeptide May be included in any one of a variety of expression vectors. Vector like this Encompasses chromosomal, non-chromosomal, and synthetic DNA sequences. This Such vectors include, for example, derivatives of SV40; bacterial plasmids; phage DNA; Culovirus; yeast plasmid; combination of plasmid and phage DNA And viral DNAs (eg, vaccinia, adenovirus, chicken) Pox virus, and pseudorabies). However, is it replicable in the host, Any other vector can be used as long as it is viable.   The appropriate DNA sequence can be inserted into the vector by various procedures. Generally, DNA distribution The row is inserted into the appropriate restriction endonuclease site by procedures known in the art. It is. Such and other procedures are deemed to be within the purview of those skilled in the art.   The DNA sequence in the expression vector can be driven by an appropriate expression control sequence (promoter) And directs the synthesis of mRNA. Representative examples of such promoters May include: the LTR or SV40 promoter,E.coli lacOrt rp , Λ phage PLPromoters and prokaryotic or eukaryotic cells or Is another promoter known to regulate gene expression in the virus - Expression vectors also contain a ribosome binding site for translation initiation and a transcriptional target. Contains a minator. The vector also contains appropriate sequences for amplifying expression. Can have.   Furthermore, the expression vector is preferably for selection of transformed host cells. Phenotypic characteristics (eg, for eukaryotic cell cultures, dihydrofolate reductase or Or neomycin resistance, or for exampleE.coliTetracycline resistance in Or one or more selectable marker genes that provide for ampicillin resistance.   A suitable DNA sequence as described herein above, as well as a suitable promoter sequence or The vector containing the control sequences is used to transform the Can be used to express   Representative examples of suitable hosts may include: bacterial cells (eg,E.coli ,Streptomyces,Salmonella typhimuriumA fungal cell (eg, yeast); Insect cells (eg,Drosophila S2andSpodoptera Sf9); Animal cells (eg, CHO, COS or Bowes melanoma); adenovirus; plant cells and the like. Suitable host The selection of is considered to be within the purview of those skilled in the art from the teachings herein.   More particularly, the present invention also includes one or more of the sequences broadly described above. Includes recombinant constructs. The construct may be a vector (eg, a plasmid vector or Or a viral vector), in which the sequence of the present invention is contained in the forward direction. Or they are inserted in the opposite direction. In a preferred aspect of this embodiment, the construct Further comprises a regulatory sequence operably linked to the sequence (eg, including a promoter). To). Numerous suitable vectors and promoters are available to those of skill in the art. Knowledgeable and available for purchase. The following vectors are provided as examples. Bacteria Gender: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pblues cript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK 223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotic: pWLNEO, pSV2CAT, pOG4 4, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). But other Any of the plasmids or vectors are capable of replicating in the host, and It can be used as long as it is viable.   The promoter region is CAT (chloramphenicol transferase) vector Using any vector that has a desired marker or other Can be selected from Two suitable vectors are PKK232-8 and PCM7. Especially Well known bacterial promoters include lacI, lacZ, T3, T7, gpt, λPR. PLAnd t rp. Eukaryotic promoters include CMV immediate, HSV thymidine kinase, SV40 and late SV40, LTRs from retrovirus, and mouse metallothione Includes In I. Selection of the appropriate vector and promoter is well within the skill of the art. Within the level of.   In a further embodiment, the present invention relates to a host cell containing the above-described construct. Host cells can be higher eukaryotic cells (eg, mammalian cells) or lower eukaryotic cells. Or a host cell can be a prokaryotic cell (eg, a yeast cell). Bacterial cell). The introduction of the construct into the host Transfection, DEAE-dextran mediated transfection, or Can be achieved by Lectroporation (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., B asic Methods in Molecular Biology, 1986).   Using the construct in the host cell, a gene encoded by the recombinant sequence in a conventional manner. Gene products can be produced. Alternatively, the polypeptides of the present invention can It can be produced synthetically by an adult machine.   Mature proteins are suitable for use in mammalian cells, yeast, bacteria, or other cells. And can be expressed under the control of a promoter. The cell-free translation system is also a DNA construct of the present invention. Can be used to produce such proteins using RNA from You. Suitable cloning vectors for use in prokaryotic and eukaryotic hosts And expression vectors are described in Sambrook et al., Molecular Clonlng: A Laboratory Manual. , Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) (the disclosure of which is incorporated herein by reference). Incorporated by reference).   Transcription of a DNA encoding a polypeptide of the present invention by higher eukaryotes may be a vector It is increased by inserting an enhancer sequence into the gene. Enhancers are DNA Cis-acting element, usually about 10 to about 300 bp, To increase its transcription. For example, on the late side of bp 100-270 of the replication origin SV40 enhancer, cytomegalovirus early promoter enhancer, Polyoma enhancer and adenovirus enhancer on the late stage of origin Is mentioned.   Generally, a recombinant expression vector contains an origin of replication and And a selectable marker (eg,E.coliAmpicillin resistance gene andS.cerevisi ae TRP1 gene) and highly expressed genes that direct transcription of downstream structural sequences Contains a promoter. Such promoters are glycolytic enzymes (eg, 3- Phosphoglycerate kinase (PGK)), α-factor, acid phosphatase, or heat It can be derived from an operon encoding a shock protein or the like. The heterologous sequence is Translation initiation and termination sequences and, preferably, A leader sequence that can direct secretion into the lipoplasmic space or into the extracellular medium Assembled in phase. If desired, the heterologous sequence may have desired characteristics (eg, expressed N-terminal identification peptide that provides for the stabilization or simplified purification of a modified recombinant product) May be encoded.   Expression vectors useful for bacterial use include functional promoters and operable readouts. In the interrogation phase, the desired protein with the appropriate translation initiation and termination signals It is constructed by inserting a structural DNA sequence encoding a protein. The vector is Ensure maintenance of one or more phenotypic selectable markers, and vectors, and It contains an origin of replication to provide more amplification in the host. Suitable for transformation A smart prokaryotic host isE.coli,Bacillus subtilis,Salmonella typhimurium, And various species within the genera Pseudomonas, Streptomyces, and Staphylococcus Includes species, but other species can also be used as selections.   As a representative, but non-limiting example, an expression vector useful for bacterial use is Commercially available including the gene elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC 37017) And a bacterial origin of replication. This Commercially available vectors such as, for example, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Upp. sala, Sweden) and GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). This These pBR322 "backbone" portions contain a suitable promoter and the structural elements to be expressed. Combined with columns.   Following transformation of the appropriate host strain and propagation of the host strain to an appropriate cell density, The selected promoter is a suitable means (eg, temperature shift or chemical induction) And the cells are cultured for an additional period.   Cells are typically harvested by centrifugation and applied by physical or chemical means. More disrupted and the resulting crude extract is retained for further purification.   Microbial cells used in protein expression include freeze-thaw cycles, supersonic By any convenient method, including sonication, mechanical disruption, or use of cell lysing agents. Can be crushed. Such methods are well-known to those skilled in the art.   Various mammalian cell culture systems have also been used to express recombinant proteins. Can be Examples of mammalian expression systems are described in Gluzman, Cell, 23: 175 (1981). COS-7 strain of monkey kidney fibroblasts and other cells capable of expressing compatible vectors Cell lines such as C127, 3T3, CHO, HeLa, and BHK cell lines. Feeding Product expression vectors contain an origin of replication, appropriate promoters and enhancers, and Required ribosome binding site, polyadenylation site, splice donor site Position and splice acceptor site, transcription termination sequence, and 5 'flanking Contains non-transcribed sequences. Derived from SV40 splice site and polyadenylation site DNA sequence can be used to provide the necessary non-transcribed genetic elements .   G-protein Chemokine Receptor polypeptides can be prepared by methods including: Can be recovered from recombinant cell culture and purified. Ammonium sulfate precipitation or ethanol Precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphose Lulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity Chromatography, hydroxylapatite chromatography, and Lectin chromatography. If necessary, refold the protein (refo lding) step can be used to complete the arrangement of the mature protein. Last High performance liquid chromatography (HPLC) can be used for the final purification step .   The polypeptides of the present invention may be natural purified products or products of chemical synthetic procedures. Or a prokaryotic or eukaryotic host (eg, in culture) Bacterial, yeast, higher plants, insects, and mammalian cells) Can be done. Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptide of the invention May or may not be glycosylated. Departure The light polypeptide may also include the first methionine amino acid residue.   The polynucleotides and polypeptides of the present invention are useful for treating and treating human diseases. And can be used as research reagents and materials for diagnostic discovery.   The G-protein Chemokine Receptor of the present invention is the receptor polypeptide of the present invention. Tide activating compound (agonist) or activation inhibiting compound (antagonist) Can be used in the process for screening.   Generally, such screening techniques involve the receptor polypeptides of the present invention. Providing appropriate cells that express the cells on the cell surface. Such a cell may be a mammal , Yeast, Drosophila, or cells from E. coli. In particular, the present invention Transfecting the cells with the polynucleotide encoding the sceptor; Thereby, the G protein chemokine receptor is expressed. Then, this expression Tested receptors to observe binding, stimulation or inhibition of functional response Contact with compound.   One such scouring procedure is the G protein chemokine receptor of the present invention. Involves the use of transfected melanophore cells to express . Such a screening technique is described in PCT WO 92/01810 (published February 6, 1992). It is described in.   Thus, for example, such an assay may provide a receptor to be screened. -With both the ligand and the compound, with the melanin-bearing cells encoding the receptor To inhibit the activation of the receptor polypeptide of the present invention by contacting It can be used to screen compounds. Signal generated by ligand Inhibition of a compound indicates that the compound is a potential antagonist of this receptor, In other words, it indicates that receptor activation is inhibited.   This screening involves contacting such cells with the compound to be screened. Can be used to determine compounds that activate the receptor by touching And determine whether such a compound produces a signal, i.e., Such compounds can be used to determine if they activate the receptor.   Other screening techniques are described, for example, in Science, 246, 181-1296 (1989 Oct. Extracellular pH caused by receptor activation, as described in Cells expressing the G protein chemokine receptor in a system for measuring changes (Eg, transfected CHO cells). For example, the compound A cell expressing the receptor polypeptide of the invention can be contacted, and a second If the messenger response (eg, signal transduction or pH change) It can be measured to determine whether to activate or inhibit the receptor.   Another such screening technique is to use the G protein chemokine receptor. The encoding RNA can be introduced into Xenopus oocytes to transiently express the receptor. And Screening for compounds that appear to inhibit receptor activation If so, the receptor oocyte is then receptor ligand and screen Can be contacted with the compound to be cleaned, followed by inhibition of calcium signaling or Is activated.   Another screening technique involves linking the receptor to phospholipase C or D. Includes expression of the associated G protein chemokine receptor. Such a thin Representative examples of vesicles can include endothelial cells, smooth muscle cells, fetal kidney cells, and the like. Screening may involve receptor activation or phospho- Achieved by detecting inhibition of receptor activation by a secondary signal of lipase obtain.   Another method involves labeling a labeled ligand onto a cell having a receptor on the cell surface. Receptor of the invention by determining inhibition of binding of the Screening for compounds that inhibit polypeptide activation. like this A simple method is to use a G-protein chemokine so that cells express the receptor on their surface. Transfecting a eukaryotic cell with the DNA encoding the receptor, and Contacting the cell with the compound in the presence of a known ligand in labeled form You. The ligand can be labeled, for example, by radioactivity. Labeled ligand is receptor The amount bound to the receptor is measured, for example, by measuring the radioactivity of the receptor. The compound is receptive as determined by the decrease in labeled ligand that binds to the receptor. When bound to a putter, the binding of the labeled ligand to the receptor is inhibited.   The antibody may be a G protein chemokine receptor of the invention, or in some cases Binds to the G protein chemokine receptor, but binds to the G protein chemokine Do not elicit a second messenger response that would inhibit receptor activity It can antagonize lignonucleotides. Antibodies generally associate with the antigen-binding site of the antibody Includes anti-idiotype antibodies that recognize unique determinants. Potential antagoni Strike compounds are also closely related to ligands for G protein chemokine receptors Proteins, ie, fragments of ligands, which Lacks the ability to bind to the G protein chemokine receptor Does not elicit a response.   Antisense constructs prepared by use of antisense technology produce triple helix To control gene formation or gene expression via antisense DNA or RNA Both of these methods allow the polynucleotide to bind to DNA or RNA. It is based on that. For example, a polynucleic acid encoding the mature polypeptide of the invention The 5 'coding portion of the leotide sequence is an antisense RNA oligonucleotide approximately 10 to 40 base pairs in length. Used to design gonucleotides. DNA oligonucleotides are transcribed (Triple helix-Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); and Dervan et al., Sci. ence, 251: 1360 (1991)), thereby providing transcription and G proteins. Inhibits chemokine receptor production. Antisense RNA oligonucleotide Hybridizes to mRNA in vivo, and binds to the G protein binding receptor of the mRNA molecule. Block translation into puter (Antisense-Okano, J. Neurochem., 56: 560 ( 1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression , CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). The above oligonucleotides also include Can be delivered to the cell, whereby the antisense RNA or DNA is It can be expressed in vivo to inhibit the production of mokine receptors.   Inhibit normal biological activity, for example, small peptides or peptide-like molecules. G-protein Chemokine Receptors that Prevent Access to Harmful Ligands A small molecule that binds to a protein also inhibits activation of the receptor polypeptide of the invention. Can be used to   Soluble forms of G protein chemokine receptors (eg, receptor ) Binds to a ligand for a polypeptide of the invention and is membrane-bound To protect ligands from interaction with G protein chemokine receptors It can be used to better inhibit receptor activation.   Binds to and activates the G protein chemokine receptor of the present invention Compounds stimulate haematopoiesis, wound healing, coagulation and angiogenesis , Solid tumors, chronic infection, leukemia, T cell mediated autoimmune disease, parasite infection, psoriasis And can be used to stimulate the activity of growth factors.   Compounds that bind to and inhibit the G protein chemokine receptor of the present invention The compound can be used for allergy, atherogenesis, irritability, malignancy, chronic and acute inflammation, Stamin and IgE-mediated allergic reactions, prostaglandin-independent fever, bone marrow Insufficiency, silicosis, sarcoidosis, rheumatoid arthritis, shock and eosinophilia It can be used to treat other syndromes.   The compounds can be used in combination with a suitable pharmaceutical carrier. Such a pair The composition comprises a therapeutically effective amount of the compound, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Agent. Such carriers include saline, buffered saline, and Including sucrose, water, glycerol, ethanol, and combinations thereof But not limited to these. The formulation should suit the mode of administration.   The present invention also relates to a pharmaceutical composition of the invention filled with one or more components. Or a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers. Such a container Manufacture, use, or sale of a drug or biological product with respect to (one or more) Product labeling in the form prescribed by the governmental entity controlling the sale, Indicates an institutional approval for manufacture, use, or sale for human administration You. In addition, the compounds of the present invention can be used in combination with other therapeutic compounds.   Pharmaceutical compositions include, for example, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal, Or they can be administered in a convenient manner by the intradermal route. Pharmaceutical compositions may have specific symptoms It can be administered in an amount effective for treatment and / or prevention. Generally, a pharmaceutical composition is Administered in an amount of at least about 10 μg / kg body weight, and often It is administered in an amount not exceeding about 8 mg / kg body weight. In most cases, the dosage is about 10 μg / kg body weight to about 1 mg / kg body weight, taking into account the administration route, symptoms, etc. (CONFI RM DOSAGES).   G protein chemokine receptor polypeptide and antagonist or Agonists, which are polypeptides, may also be used in vivo according to the invention. Can be used by expression of such polypeptides. This is often called "hereditary Called child treatment.   Thus, for example, a cell from a patient can be a polynucleotide encoding a polypeptide. Can be engineered ex vivo with peptide (DNA or RNA) and then manipulated cells The vesicle is provided to a patient to be treated with the polypeptide. Such a method is It is well known in the art. For example, a cell may comprise an RNA encoding a polypeptide of the invention. Is manipulated by procedures known in the art by use of retroviral particles containing Can be made.   Similarly, cells can be used, for example, to express the polypeptide for in vivo expression of the polypeptide. It can be manipulated in vivo by known procedures in the field. As is known in the art, To produce retroviral particles containing RNA encoding the light polypeptide Producing cells for engineering cells in vivo and for polypeptides in vivo Can be administered to the patient for the expression of the drug. By such a method, the polypeptide of the present invention These and other methods for administering tides are known to those of skill in the art from the teachings of the present invention. It is clear. For example, an expression vehicle for manipulating cells is a retrovirus. It can be something other than Rus (eg, adenovirus). This is the appropriate delivery After combining with the vehicle, it can be used to manipulate cells in vivo.   As described herein above, the inducible retroviral plasmid vector-derived Torovirus is Moloney mouse leukemia virus, spleen necrosis virus, retrovirus Lus (eg Rous sarcoma virus), Harvey sarcoma virus, chicken leukemia c Irs, gibbon leukemia virus, human immunodeficiency virus, adenovirus, Includes, but is not limited to, spinal cord sarcoma virus and mammalian tumor virus Not determined. In one embodiment, the retroviral plasmid vector comprises: It is derived from Moloney mouse leukemia virus.   Vectors contain one or more promoters. Suitable to be used Novel promoters include the retroviral LTR; the SV40 promoter; and Miller et al.B iotechniques Cytomegalo, Vol. 7, No. 9, 980-990 (1989) Virus (CMV) promoter, or any other promoter (eg, Including, but not limited to, Cell promoters, such as eukaryotic cell promoters). Not limited. Other viral promoters that can be used include adenovirus pro Motor, thymidine kinase (TK) promoter, and B19 parvovirus Motor, including but not limited to Choosing the right promoter It will be apparent to those skilled in the art from the techniques included herein.   The nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention may be under the control of a suitable promoter. It is in. Suitable promoters that can be used include, but are not limited to: Not: Adenovirus promoters such as adenovirus major late promoter Heterologous promoters such as the cytomegalovirus (CMV) promoter Respiratory syncytial virus (RSV) promoter; MMT Inducible promoters such as motors; metallothionein promoters; heat Shock promoter; Albumin promoter; ApoAI promoter; Roblin promoter; such as the herpes simplex thymidine kinase promoter Illthymidine kinase promoter; retroviral LTR (as described herein above) Modified retrovirus LTR); β-actin promoter; Growth hormone promoter. Promoters also encode polypeptides It can be a natural promoter that controls the gene.   Retroviral plasmid vectors transduce packaging cell lines Used to form a producer cell line. Can be transfected Examples of packaging cells are PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-1 9-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP + E-86, GP + envAm12, and Miller,Human Gene Therapy, Vol. 1, pp. 5-14 (1990) Listed DAN cell lines, but are not limited thereto. The vector is The packaging cells can be transduced through any technique known in the art. like this Techniques include electroporation, the use of liposomes, and CaPOFourWrap the precipitate Including, but not limited to. In one alternative, the retrovirus Plasmid vectors can be encapsulated in liposomes or bound to lipids. Can be combined and then administered to a host.   Producer cell lines contain a nucleic acid sequence (single or multiple) that encodes the polypeptide. ) Resulting in infectious retroviral vector particles. Then, like this Retroviral vector particles can be used either in vitro or in vivo. And can be used to transduce eukaryotic cells. The transduced eukaryotic cells are Express the nucleic acid sequence (s) encoding the polypeptide. Transduced Possible eukaryotic cells include embryonic stem cells, embryonic carcinoma cells, and hematopoietic stem cells, hepatocytes, fibroblasts. Including vesicles, myoblasts, keratinocytes, endothelial cells, and bronchial epithelial cells But not limited to these.   It is also known that the present invention is capable of binding to G protein chemokine receptors. To determine whether an unliganded ligand can bind to such a receptor A method for preparing a G protein chemokine receptor for a ligand. G protein chemokine receptor under conditions that allow ligand binding to Contacting the emerging mammalian cells with the ligand, the ligand bound to the receptor Detecting the presence of the G protein chemokine Determining whether it binds to the receptor. In the description above A system for determining agonists and / or antagonists comprises a receptor It can also be used to determine the ligand that binds to a protein.   The present invention also provides methods for detecting the presence of mRNA encoding the receptor, Of the G-protein Chemokine Receptor Polypeptide of the Invention on the Surface of Vesicles Providing a method for detecting expression, comprising the steps of obtaining total mRNA from a cell, and And the obtained mRNA are identified with the sequences contained in the sequence of the nucleic acid molecule encoding the receptor. A nucleus containing a nucleic acid molecule of at least 10 nucleotides that is capable of differential hybridization Contacting the probe with an acid probe under hybridizing conditions; Detecting the presence of the redistributed mRNA, and thereby the receptor by the cell Detecting the expression of the protein.   The present invention also identifies a receptor associated with the receptor polypeptide of the present invention. Provide a way to These related receptors are the G proteins of the present invention. Low stringency due to homology to chemokine receptor polypeptide Cross-hybridization or related natural or synthetic A chemokine receptor polypeptide of the invention that interacts with a ligand and / or Identification of receptors that elicit similar behavior after genetic or pharmacological blockade of peptides By doing so, the G protein chemokine receptor polypeptide of the present invention Can be identified by homology.   Fragments of the gene have high sequence similarity to the gene of the invention, or Is a cDNA library to isolate other genes with similar biological activities Can be used as a hybridization probe. This type of probe Has at least 20 bases, preferably at least 30 bases, and most preferably At least 50 bases or more. Probes also bind to full-length transcripts. The corresponding cDNA clones and the regulatory and promoter regions, exons and Genomic clones containing the complete gene of the invention, including Can be used to identify An example of this type of screen is Gene coding using a known DNA sequence to synthesize a oligonucleotide probe. Isolating the cloned region. Has a sequence complementary to the sequence of the gene of the present invention Labeled oligonucleotides are used to identify which members of the library Live human, genomic cDNA, or mRNA to determine Used for screening rallies.   The present invention also contemplates the use of the gene of the present invention as a diagnostic. For example, Some diseases are caused by inherited defective genes. These genes are defective The sequence of the gene can be detected by comparing it to the sequence of the normal gene. As a result, "mutation" The gene may prove to be associated with abnormal receptor activity. In addition, mutation Mutant receptor genes as yet another means for demonstrating and identifying An efficient assay system (eg, in a receptor-deficient strain of HEK293 cells, Colorimetric assay, expression on MacConkey plates, complementation test) Can be inserted into an appropriate vector. Once the "mutant" gene is identified Then, a population of carriers of the "mutated" receptor gene can be screened .   Individuals having a mutation in the gene of the present invention can be obtained at the DNA level by various techniques. Can be detected. Nucleic acids for diagnosis include blood, urine, saliva, tissue biopsy, and autopsy Can be obtained from cells of a patient, including, but not limited to, qualities. Genomic DNA Can be used directly for detection or by using PCR prior to analysis (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986)). RNA or cDNA Can also be used for the same purpose. As an example, complementary to a nucleic acid of the invention PCR primers are used to identify and analyze mutations in the gene of the invention. Can be For example, deletions and insertions are amplified in comparison to the normal genotype. Change in the size of the resulting product. Point mutations are in radiolabeled books The RNA of the invention or, alternatively, the radiolabeled antisense DNA sequence of the invention Can be detected by hybridizing the amplified DNA. Perfect match The mismatched sequences are due to ribonuclease A digestion or due to differences in melting temperatures. It can be distinguished from heavy helices. Such a diagnosis may be a prenatal test or a neonatal test. Especially useful for   Sequence differences between related and "mutant" genes can be determined by direct DNA sequencing. Can be revealed. In addition, the cloned DNA segment contains specific DNA Can be used as a probe to detect fragmentation. The sensitivity of this method is It is greatly enhanced when combined with PCR. For example, two sequence primers For use with single-stranded template molecules generated by strand PCR products or modified PCR It is. Sequencing is by conventional methods using radiolabeled nucleotides. Alternatively, it is performed by an automatic sequencing method using a fluorescent tag.   Genetic testing based on DNA sequence differences can be performed on gels with or without denaturing agents. Achieved by detecting changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments in yeast Can be Sequence changes at certain positions may also be caused by nuclease protection assays (eg, RNase protection and S1 protection or chemical cleavage methods (eg, cotton et al.,PNAS , USA, 85 : 4397-4401 (1985))).   In addition, some diseases have gene expression that can be detected by changes in mRNA Or as a result of a change in. Or a book The gene of the invention may be an individual expressing a reduced function associated with this type of receptor. Can be used as a reference to identify   The present invention also provides a G protein chemokine receptor of the present invention in various tissues. -For diagnostic assays to detect altered levels of soluble forms of polypeptides Related. Determine the level of soluble receptor polypeptide in the host-derived sample Assays used to detect are well known to those of skill in the art and Immunoassays, competitive binding assays, western blot analysis, and preferably Includes ELISA assays.   ELISA assays are first performed with G protein chemokine receptor polypeptides. For preparing an antibody (preferably a monoclonal antibody) specific to the antigen Is included. In addition, receptor antibodies are prepared against monoclonal antibodies. You. Receptor antibodies include, for example, radioactivity, fluorescence, or, in this example, A detectable agent, such as horseradish peroxidase enzyme, is attached. Sun The pull is then removed from the host and the solids that bind to the proteins in the sample (For example, a polystyrene dish). Next And any free protein binding sites on the dish can be, for example, bovine serum albumin. Covered by incubation with non-specific proteins such as min . Next, the monoclonal antibody is incubated in the dish, during which time Any G protein attached to polystyrene dish with monoclonal antibody Binds to chemokine receptor proteins. All unbound monoclonal antibodies Is washed with buffer. Receptor antibody linked to horseradish peroxidase , And then placed in the dish, the G protein chemokine receptor protein Binding of the receptor antibody to any bound monoclonal antibody occurs. Next Then, the unbound receptor antibody is washed. Then, the peroxidase substrate is The amount of color added to the tissue and appearing at a given time interval was compared to a standard curve. Then, the G protein chemokine receptor present in a predetermined volume of patient sample It is a measurement of the amount of the terprotein.   The sequences of the present invention are also valuable for chromosome identification. This sequence is Can specifically target and hybridize to a particular location in a chromosome . In addition, it is now necessary to identify specific sites on the chromosome. Currently, chromosome position Chromosome labeling reagent based on actual sequence data (repeated polymorphism) available for labeling Almost no. The mapping of DNA to chromosome according to the present invention is based on these sequences. This is an important first step in correlating with a disease gene.   Briefly, the sequence consists of the PCR primers (preferably 15-25 bp) from the cDNA. It can be mapped to a chromosome by preparation. Computer analysis of cDNA Does not span more than one exon in nome DNA, thus complicating the amplification process Used to quickly select primers to be used. Then these primers Used for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes Is done. Only hybrids containing the human gene corresponding to the primer are amplification flags Cause a mentor.   PCR mapping of somatic cell hybrids assigns specific DNA to specific chromosomes A quick procedure for The present invention using the same oligonucleotide primer Use a panel of fragments from a particular chromosome or similar size Sublocalization achieved using pools of different genomic clones Can be achieved. Other mapping schemes that can also be used to map to chromosomes Were in-situ hybridised, labeled flow sorted (flow-sorted ) Prescreening on chromosome and construction of chromosome-specific cDNA library Preselection by hybridization to   Fluorescence in situ hybridization of cDNA clones to metaphase chromosome spreads (FISH) can be used to provide a precise chromosomal location in one step. This Can be used with cDNAs as short as 50 or 60 bases. As a review of this technology Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon  See Press, New York (1988).   Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical The location can be correlated with the genetic map data. Such data, for example, V. McKusick, found in Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins Uni versity Welch Medical Library, available online). Then, The relationship between the gene mapped to one chromosomal region and the disease is determined by linkage analysis (physical neighbors). (Inheritance of adjacent genes).   Next, determine the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals There is a need. Mutation is observed in some or all affected individuals but is normal If not observed, this mutation appears to be a causative agent of the disease.   With the current resolution of physical and genetic mapping techniques, disease A cDNA correctly located in a chromosomal region associated with a potential of between 50 and 500 It may be one of the causative genes. (This is a 1 megabase mapping resolution, And assume one gene per 20 kb. )   The polypeptide, a fragment or other derivative thereof, or an analog thereof. Logs, or cells that express them, produce antibodies against them Can be used as an immunogen. These antibodies are, for example, polyclonal antibodies, Or it may be a monoclonal antibody. The invention also relates to chimeric antibodies, single chain antibodies and And humanized antibodies, and Fab fragments, or the products of a Fab expression library Is included. Various procedures known in the art can be used to construct such antibodies and fragments. Can be used for the production of   Antibodies raised against polypeptides corresponding to the sequences of the present invention may be used to Obtained by direct injection of the polypeptide or by administration of the polypeptide to the animal. obtain. The animal is preferably non-human. Then obtained in this way The antibody binds to the polypeptide itself. Thus, the polypeptide flag Antibodies that bind to the entire native polypeptide, even sequences that encode only Can be used to generate Such an antibody is then Can be used to isolate polypeptides from tissues that express.   Antibodies produced by continuous culture of cell lines for preparation of monoclonal antibodies Any technique that provides a can be used. Examples include hybridoma technology (Kohle r and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), trioma technology, human B cells Hybridoma technology (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), and human EBV hybridoma technology for producing noclonal antibodies (Cole et al., 1985, Mono clonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). It is.   The technology described for producing single-chain antibodies (U.S. Pat. Can be adapted to generate single-chain antibodies to light immunogenic polypeptide products . In addition, the transgenic mouse is used as the immunogenic polypeptide product of the present invention. Can be used to express humanized antibodies.   The invention will be further described with reference to the following examples; It should be understood that the present invention is not limited to such an embodiment. All parts or quantities are , On a weight basis unless otherwise specified.   To facilitate understanding of the following examples, certain methods and / or Or terms are described.   "Plasmids" are capitalized with a lower case p followed by and / or followed by a capital letter and / or Or it is specified by showing a number. The starting plasmids herein are commercially available And are publicly available without restriction or obtained according to published procedures It can be constructed from possible plasmids. In addition, a plasmid equivalent to the described plasmid Rasmids are known in the art and are generally apparent to those skilled in the art.   `` Digestion '' of DNA involves touching it with a restriction enzyme that acts only at certain sequences in the DNA. It means to cut by a medium reaction. The various restriction enzymes used herein are commercially available. Are sold and their reaction conditions, cofactors, and other requirements are The known ones were used. For analytical purposes, typically 1 μg of plasmid or For DNA fragments, about 2 units of enzyme are used in about 20 μl of buffer solution. For the purpose of isolating DNA fragments for plasmid construction, typically 5-5 0 μg of DNA is digested in larger volumes with 20-250 units of enzyme. Specific restrictions Appropriate buffers and substrate amounts for the enzymes are specified by the manufacturer. At 37 ° C An incubation time of about 1 hour is usually used, but this is May vary according to instructions. After digestion, run the reaction directly on a polyacrylamide gel. Isolate the desired fragment by electrophoresis.   Size separation of truncated fragments is described by Goeddel, D. et al., Nucleic Aclds Res., 8:40. This is done using an 8% polyacrylamide gel as described by No. 57 (1980).   "Oligonucleotide" refers to a single-stranded polydeoxynucleotide or two phases. Refers to any of the complementary polydeoxynucleotide chains, which are chemically synthesized Can be Such synthetic oligonucleotides have no 5 'phosphate and therefore If no phosphate and ATP are added in the presence of the Do not tie. Synthetic oligonucleotides are converted to non-dephosphorylated fragments. connect.   "Ligation" forms a phosphodiester bond between two double-stranded nucleic acid fragments. (Maniatis, T et al., Supra, p. 146). Must be provided elsewhere For example, ligation may be performed using known buffers and conditions under approximately equimolar amounts of the DNA fragment to be ligated. Achieved using 10 units of T4 DNA ligase (“ligase”) per 0.5 μg Can be   Unless otherwise stated, transformation was performed according to Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1973).                                 Example 1 HDGNR10 Expression and Purification of Bacteria   The DNA sequence encoding HDGNR10 (ATCC Accession No. 97183) was 5 'sequence of DGNR10 protein (excluding signal peptide sequence) and HDGNR10 gene Use PCR oligonucleotide primers corresponding to the 3 'vector sequence And amplify first. Additional nucleotides corresponding to HDGNR10 were each 5 ′ And added to the 3 'sequence. The 5 'oligonucleotide primer has the sequence 5'CGGAA It has TTCCTCCATGGATTATCAAGTGTCA3 ', EcoRI restriction enzyme site, and 18-nucleotide HDGN starting from the predicted terminal amino acid of the mutated protein codon Contains the R10 coding sequence. 3 ′ sequence, 5′CGGAAGCTTCGTCACAAGCCCACAGATAT3 ′ is Hin contains the sequence complementary to the dIII site and is subsequently followed by 18 nucleotides of the coding sequence of HDGNR10. Including otide. Restriction enzyme sites were determined using the bacterial expression vector pQE-9 (Qiagen, Inc. 9259E). ton Avenue, Chatsworth, CA, 91111). pQE-9 is Antibiotic resistance (Ampr), Bacterial origin of replication (ori), IPTG regulatable promoter Pererator (P / O), ribosome binding site (RBS), 6-His tag, and restriction enzyme Code the site. Then, pQE-9 was digested with EcoRI and HindIII. Amplification sequence Is ligated to pQE-9 and contains a histidine tag and a sequence encoding RBS. Inserted into the frame. Then, using the ligation mixture,E . coliStrain M15 / rep4 (Qiage n, Inc.) in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold S. Transformation was performed according to the procedure described in Spring Laboratory Press, (1989). M15 / rep4 is Expresses the lacI repressor, and also expresses kanamycin resistance (Kanr) Contains multiple copies of plasmid pREP4. Grow transformants on LB plates Identified by their ability and identified ampicillin / kanamycin resistant colonies Selected. Plasmid DNA was isolated and confirmed by restriction enzyme analysis. Desired construction The clone containing the product was purified by L supplemented with both Amp (100 μg / ml) and Kan (25 μg / ml). Grow overnight (O / N) in liquid culture in B medium. 1: 100 to 1: using O / N culture Inoculate a large culture at a ratio of 250. Cells are grown at an optical density of 600 (O.D.600) Is 0.4 Propagated to 0.6. Then IPTG ("Isopropyl-B-D-thiogala" Cotopyranoside ") was added to a final concentration of 1 mM. IPTG is a lacI repressor Clears P / O and induces increased gene expression by inactivating . Cells were grown for an additional 3-4 hours. The cells were then harvested by centrifugation . The cell pellet was solubilized in the chaotropic drug 6M guanidine HCl. Clear After lightning, solubilized HDGNR10 binds more tightly to proteins containing 6-His tag This is achieved by chromatography on a nickel-chelate column under conditions Was purified from the above solution. Hochuli, E et al. Chromatography 411: 177-184 (1984) . HDGNR10 was eluted from the column with 6M guanidine HCl (pH 5.0) and for regeneration purposes , 3 M guanidine HCl, 100 mM sodium phosphate, 10 mM glutathione (reduced), And 2 mM glutathione (oxidized form). 12 hours of ink in this solution After incubation, the protein was dialyzed against 10 mM sodium phosphate.                                 Example 2 COS Expression of recombinant HDGNR10 in cells   Plasmid expression, HDGNR10 HA, was derived from the vector pcDNAI / Amp (Invitrogen). Lead. The vector pcDNAI / Amp contains: 1) the SV40 origin of replication, 2) the ampi Syrin resistance gene, 3) E. coli. coli origin of replication, 4) polylinker region, SV40 int CMV promoter followed by a long and polyadenylation site. Complete HDGNR10 precursor, And a DNA fragment encoding an HA tag fused in-frame to its 3 'end The clone was cloned into the polylinker region of the vector. Therefore, the recombinant tan Protein expression is controlled under the CMV promoter. HA tag as described above Corresponding to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein (I. Wil son, H. Niman, R .; Heighten, A Cherenson, M.S. Connolly, and R. Lerner, 1 984, Cell 37, 767). Fusion of HA tag to target protein allows HA epitope This allows easy detection of the recombinant protein using an antibody that recognizes   The plasmid construction strategy is described below:   The DNA sequence encoding HDGNR10 (ATCC Accession No. 97183) was 5 ′ primer 5 ′ GTCCAAGCTTGCCACCATGGATTATCA AGTGTCA3 'is an HDGNR10 coding sequence that starts with a HindIII site followed by a start codon. 3 ′ sequence 5 ′ CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATG GGTAGCACAAGCCCACAGATATTTC 3 ′ has an XhoI site, a translation stop codon, an HA tag, and Complementary to last 18 nucleotides of HDGNR10 coding sequence (not including stop codon) Including sequences. Therefore, the PCR product contains a HindIII site, an in-frame fused HA tag. HDGNR10 coding sequence followed by a translation stop stop codon next to the HA tag, and Xho Includes I site. PCR amplified DNA fragment and vector (pcDNAI / Amp) Digested with II and XhoI restriction enzymes and ligated. The ligation mixture is coli SU RE strain (Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Joll a, available from CA 92037) and transforming the transformed culture into ampicillin medium. Plates were seeded and resistant colonies were selected. Transform plasmid DNA It was isolated from the body and tested by restriction analysis for the presence of the correct fragment. Recombinant For expression of HDGNR10, COS cells were transfected with an expression vector by the DEAE-DEXTRAN method. Sfected (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). HDGNR10 H A protein expression was detected by radiolabeling and immunoprecipitation. (E. Harl ow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborat ory Press, (1988)). Cells were transferred 2 days after transfection35S-Sistay For 8 hours. The culture medium is then collected and the cells are washed with a detergent (RIPA Buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM Tr is (pH 7.5)) (Wilson, I., et al., supra, 37: 767 (1984)). Cell lysates and Both culture media were sedimented with an HA-specific monoclonal antibody. Settled Protein was analyzed on a 15% SDS-PAGE gel.                                 Example 3 Cloning and expression of HDGNR10 using baculovirus expression system   A DNA sequence encoding the full-length HDGNR10 protein (ATCC Accession No. 97183) Using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of the gene And amplified.   The 5 'primer has the sequence 5' CGGGATCCCTCCATGGATTATCAAGTGTCA 3 ', and BamHI restriction enzyme site, followed by an efficient signal to initiate translation in eukaryotic cells 4 nucleotides similar to null (J. Mol. Biol. 1987,196, 947-950, Kozak, M. ), And immediately after it, the first 18 nucleotides of the HDGNR10 gene (translation initiation code) Is "ATG").   The 3 'primer has the sequence 5' CGGGATCCCGCTCACAAGCCCACAGATAT 3 ' Compatible with the endonuclease BamHI cleavage site and the 3 'untranslated sequence of the HDGNR10 gene. Contains complementary 18 nucleotides. The amplified sequence was prepared using a commercially available kit ("Geneclean" BIO 1 01 Inc., La Jolla, Ca.) from a 1% agarose gel. Then Digest the fragment with the endonuclease BamHI and purify as above did. This fragment is called F2.   The vector pRG1 (a modified version of the pVL941 vector, described below) was transformed into a baculovirus expression system. Used for expression of the HDGNR10 protein used (for a review, Summers, M.D. And Smith, G.E. 1987, Manual of methods for baculovirus vectors and i nsect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station B ulletin No. 1555). This expression vector is from Autographa californi The strong polyhedrin promoter of ca nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), followed by Contains the recognition site for the restriction endonuclease BamHI. Simian virus (SV) 40 The polyadenylation site is used for efficient polyadenylation. Recombinant virus In order to easily select the coli β-galactosidase gene Insert in the same direction as the drin promoter, and then polyadenylate the polyhedrin gene. Followed by an activation signal. Polyhedrin sequence is used for co-transfected wild-type virus Flanked at both ends with viral sequences for cell-mediated homologous recombination of DNA. many Other baculovirus vectors can be used in place of pRG1. For example, pAc3 73, pVL94, and pAcIM1 (Luckow, V.A. and Summers, M.D., Virology , 170: 31-39).   The plasmid is digested with the restriction enzyme BamHI and the pups are then digested by procedures known in the art. Dephosphorylated using bovine intestinal phosphatase. Then, as described above, % Agarose gel. This vector DNA is called V2.   Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 were ligated using T4 DNA ligase. Tied. Then, E. coli HB101 cells, and using the enzyme BamHI, Bacteria containing the plasmid having the HDGNR10 gene (pBacHDGNR10) were identified. Black The sequence of the cloned fragment was confirmed by DNA sequencing.   5 μg of the plasmid pBacHDGNR10 was ligated with the lipofection method (Felgner et al., Proc. N). atl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)). Baculovirus ("BaculoGoldTM baculovirus DNA ", Pharmingen, San Diego, CA.).   1 μg BaculoGoldTMViral DNA and 5 μg of plasmid pBacHDGNR10 were μl of serum-free Grace's medium (Life Technologis Inc., Gaithersburg, MD) Were mixed in sterile wells of a microtiter plate containing After that, 10 μl Pofectin and 90 μl of Grace's medium are added, mixed, and mixed at room temperature for 15 minutes. Incubated for minutes. The transfection mixture was then added to serum-free Sf9 insect cells seeded in 35 mm tissue culture plates with 1 ml of Grace's medium containing Cells (ATCC CRL. 1711). Mix plate, freshly added solution In order to shake it back and forth. The plate is then incubated at 27 ° C. for 5 hours did. After 5 hours, the transfection solution was removed from the plate and 10% One ml of Grace's insect medium supplemented with fetal calf serum was added. Ink plate It was returned to the incubator and the culture was continued at 27 ° C. for 4 days.   After 4 days, the supernatant was collected and as described by Summers and Smith (supra). A plaque assay was performed. As an alternative, the blue stained plaque "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) Agarose gel was used. (A detailed description of the "plaque assay" Life Technologies Inc., Gaithersburg, Inc. (It can also be found in the User Guide for Currovirology (pages 9-10)).   Four days after serial dilutions of virus were added to the cells, blue stained plaques were removed. I picked it up with a Pendorf pipette tip. Then, the agar containing the recombinant virus was Resuspended in an Eppendorf tube containing 200 μl Grace's medium. Agar, simple Remove by simple centrifugation and remove the supernatant containing the recombinant baculovirus to 35 mm Used to infect Sf9 cells seeded on the dish. Four days later, these cultures The culture dish supernatant was collected and then stored at 4 ° C.   Sf9 cells were cultured in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. Cells The cells were infected with the recombinant baculovirus V-HDGNR10 at a multiplicity of infection (MOI) of 2. 6 hours Later, the medium was removed and the SF900 II medium free of methionine and cysteine. (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 hours later, 5μCi of35S-methionine and 5 μCi of 35S cysteine (Amersham) were added. Fine The cells are incubated for a further 16 hours, after which the cells are harvested by centrifugation and Proteins labeled by SDS-PAGE and autoradiography It has become.                                 Example 4 Expression via gene therapy   Fibroblasts were obtained from subjects by skin biopsy. Tissue culture obtained Placed in nutrient medium and cut into small sections. Small sections of tissue can be Place on a wet surface of Lasco and place approximately 10 sections in each flask. The flask Rotate up and down, seal tightly and leave at room temperature overnight. After 24 hours at room temperature, Invert the Lasco and keep the tissue section fixed at the bottom of the flask, and And fresh medium (eg, Ha with 10% FBS, penicillin, streptomycin). m's F12 medium). This is then incubated at 37 ° C. for about one week . At this time, fresh medium is added and subsequently changed every few days. 2 more After a week of culture, a monolayer of fibroblasts results. Trypsinize the monolayer, and more Scale into a large flask.   PMV-7 adjacent to the long terminal repeat of Moloney mouse sarcoma virus (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7: 219-25 (1988)), was digested with EcoRI and HindIII, and It is then treated with calf intestinal phosphatase. Agarose gel for linear vector Separate above and purify using glass beads.   The cDNA encoding the polypeptide of the present invention is used as a pair of 5 ′ and 3 ′ terminal sequences, respectively. Amplify using the corresponding PRC primer. The 5 'primer contains an EcoRI site, And the 3 'primer contains a HindIII site. Equivalent amount of Moloney mouse sarcoma The irs linear backbone, and EcoRI and HindIII fragments were Add together in the presence of Ze. The resulting mixture is suitable for ligation of the two fragments. Maintain under severe conditions. The ligation mixture is used for transformation of the bacterium HB101, Then, confirm that the vector has the target gene inserted properly. Plate on an agar plate containing kanamycin for the purpose.   Amphoteric pA317 or GP + am12 packaging cells, 10% calf serum (CS), Dulbecco's modified Eagle's medium containing penicillin and streptomycin (DMEM Grow to confluent density in tissue culture in). Then the MSV containing the gene Add vector to media and transduce packaging cells with vector I do. At this point, the packaging cells are infectious virions containing the gene. (The packaging cell is now called the producer cell) ).   Fresh media is added to the transduced producer cells, followed by a confluent producer. Collect medium from 10 cm plate of donor cells. Consumption including infectious virus particles Filtering the filtered medium through a millipore filter, The separated producer cells are removed and then the fibroblasts are Infect vesicles. The medium is removed from the subconfluent plate of fibroblasts, and Quickly replace the medium from the producer cells. Remove this medium, and Replace with fresh medium. When virus titer is high, virtually all fibroblasts Are infected, and no selection is necessary. If the titer is very low, select the marker (For example,neoOrhis) Can be used is necessary.   The engineered fibroblasts were then used alone or with Cytodex 3 micron. After being grown confluently on carrier beads, they are either injected into the host. So Later, the fibroblasts produce a protein product.   Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, Thus, unless otherwise indicated, the present invention may be practiced within the scope of the appended claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ０７Ｋ 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 5/10 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ルーベン，スティーブン エム. アメリカ合衆国 メリーランド 20832, オルネイ，ヘリテイジ ヒルズ ドライブ 18528──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C07K 14/715 C07K 16/28 16/28 C12N 1/21 C12N 1/21 G01N 33/53 D 5/10 33/566 G01N 33 / 53 C12N 5/00 B 33/566 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM , AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, GE, HU, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LT (72) Invention of LU, LV, MD, MG, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK, TJ, TT, UA, US, UZ, VN Reuben, Stephen M. Maryland, United States 20832, Olney, Heritage Hills Drive 18528

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．以下からなる群から選択されたメンバーを含有する単離されたポリヌクレオ チド： (a)配列番号：２に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (b)ATCC受託番号第97183号に含まれるDNAによりコードされる成熟ポリペプチド をコードするポリヌクレオチド； (c)該ポリヌクレオチド(a)または（b）とハイブリダイズし得、かつ少なくとも7 0％の同一性であるポリヌクレオチド；および (d)該ポリヌクレオチド(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチドフラグメント。 ２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．請求項２に記載のDNAを含有するベクター。 ４．請求項３に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞 。 ５．ポリペプチドを産生するプロセスであって、以下の工程： 前記DNAによりコードされるポリペプチドを請求項４に記載の宿主細胞から発 現する工程 を包含する、プロセス。 ６．ポリペプチドを発現し得る細胞を産生するためのプロセスであって、以下の 工程： 請求項３に記載のベクターで該細胞を形質転換またはトランスフェクトする工 程 を包含する、プロセス。 ７．以下からなる群から選択されるメンバーを含有するレセプターポリペプチ ド： (i)配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグ メント、アナログおよび誘導体；および (ii)ATCC受託番号第97183号のcDNAによりコードされるポリペプチド、ならびに 該ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体。 ８．前記ポリペプチドが配列番号：２の推定アミノ酸配列を有する、請求項７に 記載のポリペプチド。 ９．前記ポリペプチドの活性に作用する抗体、および前記ポリペプチドの活性に 拮抗する抗体からなる群から選択される、請求項７に記載のポリペプチドに対す る抗体。 １０．請求項７に記載のポリペプチドを活性化する化合物。 １１．請求項７に記載のポリペプチドの活性化を阻害する化合物。 １２．請求項１０に記載の化合物の治療的有効量を含有する、Ｇタンパク質ケモ カインレセプターを活性化する必要を有する患者の処置のための組成物。 １３．請求項１１に記載の化合物の治療的有効量を含有する、Ｇタンパク質ケモ カインレセプターを阻害する必要を有する患者の処置のための組成物。 １４．請求項７に記載のポリペプチドを活性化するポリペプチドをコードするDN Aを含有する、Ｇタンパク質ケモカインレセプターを活性化する必要を有する患 者の処置のための組成物であって、該DNAが該DNAコードのポリペプチドの治療的 有効量を産生するためにインビボで発現する、組成物。 １５．前記レセプターポリペプチドの活性化を阻害するポリペプチド化合物をコ ードするDNAを含有する、請求項７に記載のＧタンパク質ケモカインレセプター を阻害する必要を有する患者の処置のための組成物であって、該DNAが該ポリペ プチド化合物の治療的有効量を産生するためにインビボで発現する、組成物。 １６．請求項７に記載のレセプターポリペプチドに結合し、かつこれを活性化す る化合物を同定するための方法であって、以下の工程： 該レセプターポリペプチドへの化合物の結合を許容するのに十分な条件下で、 該レセプターポリペプチドを細胞表面上で発現する細胞と化合物を接触させる工 程であって、該レセプターは該レセプターポリペプチドに対する該化合物の結合 に応答して検出可能なシグナルを提供し得る第二の要素と会合する、工程；およ び 該化合物が該第二の要素により産生される該シグナルを検出することにより有 効なアゴニストであるかを同定する工程、 を包含する、方法。 １７．請求項７に記載のポリペプチドに結合し、かつこの活性化を阻害する化合 物を同定するための方法であって、以下の工程： 前記レセプターポリペプチドへの結合を許容する条件下で、該レセプターポリ ペプチドを細胞表面上で発現する細胞とスクリーニングされる化合物とを接触さ せる工程であって、該レセプターは該レセプターポリペプチドに対する化合物の 結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る第二の要素と会合する、工程、 および、 該化合物が、リガンドと該ポリペプチドとの相互作用から生成されたシグナル の非存在を検出することにより該ポリペプチドの活性化を阻害するかどうかを決 定する工程、 を包含する、方法。 １８．請求項７に記載のポリペプチドの過少発現に関連する疾患またはその疾患 に対する感受性の診断のためのプロセスであって、以下の工程： 該ポリペプチドをコードする核酸配列における変異を決定する工程、 を包含する、プロセス。 １９．前記ポリペプチドが該ポリペプチドの可溶性フラグメントであり、かつレ セプターに対するリガンドと結合し得る、請求項７に記載のポリペプチド。 ２０．宿主由来のサンプルにおける請求項１９に記載のポリペプチドの存在につ いて分析する工程、 を包含する、診断プロセス。[Claims] 1. An isolated polynucleotide containing a member selected from the group consisting of: Chid: (a) a polynucleotide encoding the polypeptide shown in SEQ ID NO: 2; (b) mature polypeptide encoded by the DNA contained in ATCC Accession No. 97183 A polynucleotide encoding; (c) capable of hybridizing with the polynucleotide (a) or (b), and having at least 7 A polynucleotide that is 0% identical; and (d) a polynucleotide fragment of the polynucleotide (a), (b) or (c). 2. The polynucleotide according to claim 1, wherein the polynucleotide is DNA. 3. A vector containing the DNA according to claim 2. 4. A host cell transformed or transfected with the vector of claim 3. . 5. A process for producing a polypeptide, comprising the following steps:   The polypeptide encoded by the DNA is generated from the host cell according to claim 4. The process to show Including the process. 6. A process for producing a cell capable of expressing a polypeptide, comprising: Process:   A process for transforming or transfecting the cells with the vector according to claim 3. About Including the process. 7. Receptor polypeptide containing a member selected from the group consisting of: Do: (i) a polypeptide having the deduced amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a flag thereof , Analogs and derivatives; and (ii) a polypeptide encoded by the cDNA of ATCC Accession No. 97183, and Fragments, analogs and derivatives of the polypeptide. 8. The polypeptide of claim 7, wherein the polypeptide has the deduced amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The polypeptide of any one of the preceding claims. 9. An antibody that acts on the activity of the polypeptide; and The polypeptide according to claim 7, which is selected from the group consisting of antagonistic antibodies. Antibodies. 10. A compound that activates the polypeptide of claim 7. 11. A compound that inhibits activation of the polypeptide of claim 7. 12. A G protein chemo containing a therapeutically effective amount of the compound of claim 10. A composition for the treatment of a patient in need of activating a cytokine receptor. 13. A G protein chemo comprising a therapeutically effective amount of the compound of claim 11. A composition for the treatment of a patient in need of inhibiting the cytokine receptor. 14． A DN encoding a polypeptide that activates the polypeptide according to claim 7. Patients in need of activating G protein chemokine receptor containing A A composition for the treatment of an elderly person, wherein said DNA is a therapeutic agent for the polypeptide encoding said DNA. A composition that is expressed in vivo to produce an effective amount. 15. A polypeptide compound that inhibits activation of the receptor polypeptide; The G protein chemokine receptor according to claim 7, which contains DNA to be loaded. A composition for the treatment of a patient in need of inhibiting the DNA, wherein the DNA comprises the polypeptide. A composition that is expressed in vivo to produce a therapeutically effective amount of a peptide compound. 16. Binds and activates the receptor polypeptide of claim 7. A method for identifying a compound comprising the steps of:   Under conditions sufficient to permit binding of the compound to the receptor polypeptide, Contacting a compound with a cell that expresses the receptor polypeptide on the cell surface The receptor binds the compound to the receptor polypeptide. Associating with a second element capable of providing a detectable signal in response to And   The compound is activated by detecting the signal produced by the second element. Identifying an effective agonist, A method comprising: 17． A compound that binds to the polypeptide of claim 7 and inhibits its activation. A method for identifying an object, comprising:   Under conditions permitting binding to the receptor polypeptide, the receptor polypeptide Contacting cells expressing the peptide on the cell surface with the compound to be screened Wherein the receptor comprises a compound for the receptor polypeptide. Associating with a second element capable of providing a detectable signal in response to binding, and,   A signal generated by the compound from the interaction of the ligand with the polypeptide Detection of the absence of a protein to determine whether it inhibits activation of the polypeptide The process of determining A method comprising: 18. A disease associated with the under-expression of the polypeptide according to claim 7, or a disease thereof. A process for diagnosing susceptibility to, comprising the following steps:   Determining a mutation in the nucleic acid sequence encoding the polypeptide; Including the process. 19. The polypeptide is a soluble fragment of the polypeptide; The polypeptide of claim 7, which is capable of binding a ligand for a sceptor. 20. The presence of the polypeptide according to claim 19 in a sample derived from a host. Analysis process, The diagnostic process.
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