JPH11507807A - 皮膚の光老化のインビボおよびインビトロモデル - Google Patents
皮膚の光老化のインビボおよびインビトロモデルInfo
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Abstract
(57)【要約】
ヒトエラスチンプロモーターを発現することができる形質転換マウスを提供する。この形質転換マウスから得られるマウス線維芽細胞培養物もまた提供される。さらに、この形質転換マウスまたはこれらのマウスから得られる線維芽細胞培養物を用いて光障害を阻止しうる化合物を同定する方法を提供する。
Description
【発明の詳細な説明】
皮膚の光老化のインビボおよびインビトロモデル
発明の背景
皮膚の老化は、本来の年代的なものによる老化および外因的な日光を浴びるこ
との両方の結果である。モンタナら(Montagna et al.),J．Am．Acad．Dermatol
．1989，21:907-918；クリグマン、エル．エッチ．(Kligman，L.H．)，Agingand
the Skin．Raven Press，New York，1989，pp．331-346；テイラーら(Taylor e
t al．)、J．Am．Acad．Dermatol．1990，221:1-15。老化の外見と関連する変化
の大半は慢性的日光障害の結果である。ウォーレンら(Warren et al.),J.Am．Ac
ad．Dermatol．1991，25:751-760；フランセス、シィー.(Frances,C.)およびロ
バート、エル.(Robert，L．)、Int．J．Dermatol．1984，23:166-179。皮膚表面
の著しい変化は、光老化した皮膚によく見られる深い皺および木目の荒さを伴う
。光老化した皮膚の主な組織病理学的変化は、通常の組織病理学的検査において
染色する性質のエラスチンを有する物質の蓄積であり、日光弾力線維症と呼ばれ
ている。免疫組織化学的染色は、エラスチン(チェンら(Chen et al.)，J．Inves
t．Dermatol．1986，87：334-337; メラら(Mera et al．)、Br．J.Dermatol．19
87，117：21-27)フィブリン(チェンら、J．Invest．Dermatol．1986，87：334-3
37；ダルバックら(Dahlback et al．)、J．Invest．Dermatol．1990，94：284-2
91；ベルンスタインら(Bernstein et al.)、J.Invest．Dermatol．1994，103：1
82-186)および弾性線維の通常の成分であるベルシカン(versican)(ツィマーマン
ら(Zimmerman et al.)、J．Cell．Biol．1994，124: 817-825)からなる日光弾力
線維症を含む僅かに形成された線維を示した。エラスチン、フィブリンおよびベ
ルシカンmRNAにおける同等の増加が、同じ個人の通常の皮膚からの線維芽細胞と
比べて光障害を受けた皮膚からの線維芽細胞において示された。ベルンスタイン
ら、J．Invest．Dermatol．1994，103：182-186。日光障害の皮膚における上昇
したエラスチンmRNAレベルは高められたエラスチンプロモーター活性の結果であ
り、これはクロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ(CAT)レポーター遺伝子と結合したヒトエラスチンプロモ
ーターからなるDNA 構築物で線維芽細胞を短期トランスフェクションすることに
より示される。ベルンスタインら、J．Invest．Dermatol．1994，103：182-186
。
ヒトエラスチンプロモーター/CAT 構築物を発現する形質転換マウス系が皮膚
の光老化におけるエラスチンプロモーター活性化の役割をさらに研究するために
開発された。これらのマウスは組織- 特異的および発育段階的に調節された方法
でヒトエラスチンプロモーター活性を発現する。プロモーター活性は紫外線にお
ける小さな増加の相関的要素としてこのモデルにおいて研究され、分析の感度を
示す。さらに、紫外線に対し一回だけの暴露後に定量的データを得ることができ
る。この形質転換マウスおよびこのマウスから得られる線維芽細胞は、皮膚の光
老化を研究するためのインビボおよびインビトロモデルとしておよび光老化に対
して保護しうる薬剤の同定において有用である。
本発明の概要
本発明の目的は、ヒトエラスチンプロモーターを発現することのできる形質転
換マウスを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ヒトエラスチンプロモーターを発現することので
きる形質転換マウスから得られるマウス線維芽細胞培養物を提供することである
。
形質転換マウスまたはこれらのマウスから得られる線維芽細胞のいずれかを用
いて皮膚の光老化を阻止することができる化合物を同定するための方法もまた提
供される。
本発明の詳細な記載
大きな変化は、慢性的に日光を浴びる結果として皮膚表面で起こる。主な変化
は多量の異常弾性物質の沈着であり、これは日光弾力線維症と言われる。日光弾
力線維症はエラスチンおよびフィブリン mRNA およびエラスチンプロモーター活
性の上昇を伴うことが分かっている。皮膚の光老化を研究するための、および皮
膚の光障害を阻止しうる化合物を試験するために有用な形質転換マウスモデルが
ここにおいて開発された。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
(CAT)レポーター遺伝子と結合したヒトエラスチンプロモーターを組織- 特異的
および発育段階的に調節された方法で発現するこの形質転換マウス系を使用して
、インビボおよびインビトロでのヒトエラスチンプロモーター活性における紫外
線A(UVA)および紫外線B(UVB)の効果を試験することができる。
マウスにおいてUVB の一回の線量(491.4 mJ/cm2)によりプロモーター活性が8.
5 倍まで増加し、一方UVA(38.2 J/cm2)ではより少ない1.8 倍の増加が測定され
た。さらに、インビトロ研究では、UVB(5.5 mJ/cm2)に反応してエラスチンプロ
モーター活性は30倍以上の増加であったが、UVA(2.2 J/cm2)に対しては何の変化
もないことが分かった。これらの結果により、光老化におけるエラスチンプロモ
ーター活性化におけるUVB の役割および寄与因子としてのUVA の役割が確認され
る。インビトロの結果は、他の炎症からの早期炎症サイトキンおよび皮膚の常在
細胞によるなんらかの寄与に加えて、皮膚線維芽細胞におけるUVの直接刺激効果
を示唆する。
本発明において、マウスの皮膚を直接照射することによるインビボのおよび皮
膚移植片から増殖する皮膚線維芽細胞を照射することによるインビトロの両方に
より、紫外線照射に反応するヒトエラスチンプロモーター活性の研究が可能にな
る形質転換マウスモデルが開発された。動物モデルでの光老化における紫外線の
効果を調べるこれまでの研究は、弾性線維損傷、日光弾力線維症、皮膚の皺およ
び皮膚の弛みを測定していた。紫外線に反応した浮腫および紅斑の発生に対する
マウスおよびヒトの作用スペクトルの間の類似性は、マウスモデルが紫外線に対
するヒトの反応とよく似ていることを示唆する。たとえば、マウス皮膚の皺は、
慢性的光障害の皮膚に生じるヒトの皺と似ている。これらの変化はマウスの皮膚
でより迅速に生じ、ヒトで起こるであろう紫外線作用をより迅速に評価すること
ができる。しかしながら、これまでの研究において測定された幾つかのパラメー
ターの中には差異があることも明らかである。たとえば、マウスはヒトと同じ方
法では紅斑は生じないし、紫外線に反応したマウスにおける弾性線維変化は慢性
的光障害を受けたヒトの皮膚に生じるものと質的に異なる。さらに、毛のないマ
ウスに存在する多数の皮膚組織嚢胞は紫外線に反応して増殖するが、この反応は
ヒトの皮膚では臨床的な関係はない。高いUVA 量に対する特定のマウスにおける
反応である皮膚の弛みは、マウスにおける組織病理学的関係を有するようには見
えず、そしてヒトの反応に対し臨床的関係を有するようには見えない。最後に、
マウスの皮膚はヒトの皮膚に比べて比較的薄く、したがって紫外線を通しやすく
なる。このことは、一部は、紫外線に対するマウス皮膚のより強い反応の原因と
なるであろう。しかしながら、ヒトと比べてマウス皮膚のより薄い厚みもまた、
UVA と比較したUVB の強力な作用を大きくするであろう。UVB はヒトにおいて大
部分の表皮のみを通過するだけであり、一方マウスでは、UVB に晒された皮膚の
相対的割合がより大きい。本発明の形質転換マウスモデルにおけるヒトエラスチ
ンプロモーターを利用することは、紫外線に対するヒトの反応をより正確に反映
すると思われる。
UVA またはUVB の一回の暴露後の最大プロモーター活性化のおおよその時間お
よびプロモーター上昇の期間を測定した。マウスを、UVB 245.7 mJ/cm2またはUV
A 38.2 J/cm2一回の線量で処理した。CAT 分析により測定されたように、エラス
チンプロモーター活性はUVB 暴露後24時間で最大であり、対照物の4.6 倍の増加
であった。CAT 活性は照射後72時間は増加したままであり、対照物のほぼ２倍の
レベルであった。96時間までに、活性は対照物の1/3 以下に落ちた。UVA 照射後
、CAT 活性は光暴露後12-24 時間で最大であり、これはより少ない増加を示し対
照物の２倍以下であった。この増加はUVA 暴露後48時間まで続いた。UVA 暴露後
72時間までに、CAT 活性が対照物の1/3 まで落ちた。UVB 照射後のCAT 活性にお
ける最も早い増加を測定するために、マウスをUVB 照射後１、２、３および６時
間目に収穫した。CAT 活性における20% の増加が暴露後１時間で測定され、70%
の上昇が暴露後２時間で測定された。
CAT活性が年齢の相関的要素として低下するので、最初の12時間の時点後、時
間経過実験(time-course experiments))は相対的CAT 活性を低く評価した。時間
経過実験のための対照は12時間の時点で摘出された。内因性CAT 活性における低
下が考えられる場合、CAT 活性は、UVB 処理マウスでは光暴露後72時間まで、UV
A 処理マウスでは48時間まで、最大レベルまたはその付近のままであった。UVA
暴露後72時間までおよびUVB 暴露後96時間までに、CAT 活性は光暴露後12時間目
に屠殺された対照マウスの1/3 まで落ちた。4-5 日齢の対照マウスもより若い
対照マウスの1/3 である基底CAT 活性を示した後72および96時間目に未処理マウ
スを屠殺した。したがって、8-9 日齢のマウスにおける内因性CAT 活性の基底は
同一腹の５日齢マウスの1/3 まで低下する。
UVB 処理マウスにおけるエラスチンプロモーター活性についての投与- 反応性
の関係は、UVB 一回だけの投与後に観察された。光老化の他のインビボモデルは
、測定可能な効果を示すためにより長い時間にわたって多数の処理を必要とする
。実験的に作られたマウスにおける弾力線維症は、最初にサムズら(Sams et al.
)により非常に多量の紫外線を用いて作られた。J．Invest．Dermatol．1964，43
:467-471。これらの研究において、一群のマウスは蛍光管の列から３カ月にわた
って1,040 ヒト最小紅斑投与量(MEDs)を受け、一方他の群は260 回の処理で52週
間にわたって13,000MEDsを受けた。弾力線維症はエラスチンの病理化学的染色に
より示され、照射されたマウスにおいて、増加したエラスチン染色を示した。こ
の初期の報告から、多数の研究者は皮膚弾力線維症の製造を評価する皮膚の光老
化のネズミモデルを使用してきた。サムズら、J．Invest．Dermatol．1964，43:
467-471；ナカムラ、ケー．(Nakamura，K.)およびジョンソン、ダブリュ．シィ
．(Johnson，W.C.)，J．Invest．Dermatol．1968，51:253−258；ベルガーら(Be
rger et al.)，Arch．Dermatol．Res．1980，269:39-49；クリグマン、エル．エ
ッチ.(Kligman，L.H.)，Arch．Dermatol．Res．1982，272：229-238；クリグマ
ンら、J．Invest．Dermatol．1982，78:181-189;ポウルセンら(Poulsen et al.)
,Br.J.Dermatol．1984，110:531-538; クリグマンら、J．Invest．Dermatol.198
5,84:272−276；ビセットら(Bissett et al.)、Photochem．Photobiol．1987，4
6:367-376；ビセットら、Photochem．Photobiol．1989，50:763-769;ウルフら(W
ulf et al．)、Photodermatology 1989，6:44-51; クリグマン、エル．エッチ．
およびセイレ、アール．エム.(Sayre，R.M.)、Photochem.Photobiol．1991，53:
237-242；およびモラン、エム.(Moran，M.)およびグランスタイン、アール．デ
ィ.(Granstein，R.D.)、J．Invest．Dermatol．1994,103: 797 - 800。これらの
研究における紫外線を用いた処置の回数は、13から62週にわたって36回から260
回の範囲である。これは、最近の研究において使用される１回の投与と対照的で
ある。したがって、この研究において同じUVB ランプ
を用いて測定可能な日光弾力線維症を作るのに用いられるUVBの全線量は、本発
明のモデルで使用される最大線量よりも多い６倍(ビセットら、Photochem．Phot
obiol.1987，46:367-376)からほぼ40倍(ポウルセンら、Br．J．Dermatol．1984
，110:531-538)までの範囲である。
UVB およびUVA に反応するエラスチンプロモーターの上昇はまた線量依存性で
あることが測定された。紫外線の線量を増加して適用され、皮膚は光暴露後24時
間目に摘出された。30.7、122.8 および491.4 mJ/cm2のUVB 照射に反応して、CA
T 活性は、それぞれ対照より1.7、4.1 および8.5 倍以上に増加した。UVA 照射
に反応して、CAT 活性におけるより少ない増加が見られた。9.5 および38.2 J/c
m2の投与は、それぞれ、対照より1.6 倍および1.7 倍以上に増加するという結果
であった。
かなり短い処理時間および紫外線の投与が必要なことに加えて、本発明の形質
転換マウスモデルは定量的データをもたらす。弾力線維症を定量化するために画
像分析システムを使用したクリグマンおよびセイレ、Photochem．Photobiol．19
91，53:237-242を除いて、先行技術において弾力線維症の程度を評価するために
使用されるパラメーターは、主観的に評価された。
インビトロのCAT 活性における紫外線の影響もまた測定された。形質転換マウ
スの皮膚移植片から得られる初期の継代線維芽細胞を照射し、24時間後にCAT 活
性の測定のために摘出した。UVB の線量は0.7 から10.9 mJ/cm2の範囲であり、
最も高い線量ではCAT 活性が30倍以上に増加した。CAT 分析により測定されるよ
うに、プロモーター活性は、5.5 mJ/cm2の線量でピークであり、これは40秒の処
理時間に相当した。CAT 活性はUVB 線量が増加するに従って約30倍に上昇したま
ま最後にはCAT 活性が低下する結果となり、これは細胞死に相当する。対照的に
、2.2 J/cm2までのUVA の線量は、インビトロでCAT 活性を増加せず、これは18
分間以上の光処理時間に相当する。より長い処理時間の結果、細胞死が起こった
。
8-メトキシプソラレン(8-MOP)およびUVA を組合せたもの(PUVAと言う)で処理
する能力は、このモデルにおいてエラスチンプロモーター活性を上方に調節(upr
egulate)することも見出された。PUVAを用いた皮膚疾患の処置は、慢性的
に光障害を受けた皮膚において見られるものと同じ処置された皮膚における臨床
的変化を起こす。PUVA- 処置を行った患者は、日光が原因の変化である非- メラ
ノーマ皮膚癌、色素変化および皺特性を生じる。8-MOP またはUVA 単独で処理し
た線維芽細胞培養物は未処理対照物と比較してCAT 活性になんら大きな変化を示
さなかった。しかしながら、PUVAで処理した細胞培養物は、UVA 1 J/cm2と8- MO
P 投与量それぞれ0.3、1.0および3.0μg/mlである 8-MOPとの反応において、CAT
活性が2.6-、13.2- および2.0 倍の増加を示した。最も高い投与量の8-MOP（3.
0μg/ml）は低投与量より多数の光付加物を作り出すことが予想されたが、エラ
スチンプロモーター活性の誘発はこの投与量ではかなり低下し、これは細胞生存
率の低下のためと思われる。たんぱく質分析は最も高い8-MOP 投与量で細胞死を
示す摘出された全たんぱく質における投与量依存性低下を示した。8-MOP または
UVA 単独で処置されたマウスは未処理対照物と比較してCAT 活性において大きな
変化を示さなかった。しかしながら、PUVA処理マウスはCA T活性において3.1 倍
の増加を示し、これは同様にPUVAに応答するエラスチンプロモーターのインビボ
活性化を示す。
本発明の形質転換マウスモデルは、紫外線の一回の投与に反応するヒトエラス
チンプロモーター活性を測定する、迅速で定量的な手段を提供する。強化された
CAT 活性はUVB およびUVA の両方に応答して示された。さらに、インビボおよび
インビトロの両方での紫外線の作用を研究するための能力はさらに紫外線による
エラスチンプロモーター活性化の原因であるメカニズムの研究を可能にする。こ
のモデルはまたサンスクリーンおよび太陽光線の作用を変える他の化合物を迅速
に評価するための道具を提供する。さらに、このモデルを、PUVA処理を用いて行
なう研究におけるように特異的遺伝子におけるプソラレンのような処理の作用を
研究するために使用することもできる。
本発明のモデルを使用して皮膚の光障害を防止することのできる化合物を同定
する方法もまた提供される。一つの実施態様において、ヒトエラスチンプロモー
ターを発現することのできる形質転換マウスの皮膚へ試験化合物を施す。次いで
形質転換マウスをUVB またはUVA のいずれかの紫外線に暴露し、マウスにおける
ヒトエラスチンプロモーター活性を測定する。これに代わって、形質転換マウス
を8-MOP 次いでUVA に晒す。次いで、ヒトエラスチンプロモーター活性を、試験
化合物で処理しなかった紫外線の等量へ晒された形質転換マウスのものと比較し
て、試験化合物が紫外線に対して保護をもたらすかどうかを調べる。別の実施態
様において、ヒトエラスチンプロモーターを発現しうる形質転換マウスから得ら
れる線維芽細胞を試験化合物で処理する。処理した線維芽細胞を次いでUVB 照射
または8-MOP 次いでUVA 照射に晒し、線維芽細胞におけるヒトエラスチンプロモ
ーター活性を測定する。この活性は、UVB または8-MOP 次いでUVA の同じ線量に
晒されるがしかし試験化合物では処理していない形質転換マウスからの線維芽細
胞と比較して、試験化合物が暴露に対して保護をもたらすかどうかを測定する。
以下の非限定的例を、本発明をさらに説明するために提供する。
実施例
実施例１：ヒトエラスチンプロモーターを発現する形質転換マウス
CAT レポーター遺伝子と結合した5.2 kbヒトエラスチンプロモーターを発現す
る形質転換マウスの純系を使用した。フス- ウォンら(Hus-Wong et al．)、J.Bi
ol．Chem．1994，269:18072-18075。これらのマウスは組織- 特異的および発育
段階調節した方法でヒトエラスチンプロモーターを発現する。4-5 日齢マウスは
、この日齢では目視できうるほど毛が生えていないので、使用された。
実施例２：線維芽細胞培養物
組織培養物プラスチック皿上に組織標本を移しそして細胞を周囲の領域へ移動
させることにより形質転換マウスの皮膚から線維芽細胞培養物を確立した。最初
の培養物を、10% ウシ胎児血清、1mM L-グルタミンおよび抗生物質を補給したダ
ルベッコ変性イーグル培地(DME)中、37℃で維持した。最初の細胞培養物をトリ
プシン分解により継代培養を行い、２、３回継代培養を行ったサブカルチュアを
照射実験のために使用した。紫外線へ暴露後、細胞を10% ウシ胎児血清を補給し
たDME 培地において24時間インキュベーションし、次いで実施例３に記載のよう
にCAT 活性の測定のために摘出した。
実施例３：CAT分析
形質転換マウスの皮膚においておよびこれらの動物から確立された線維芽細胞
培養物においてヒトエラスチンプロモーター/ CAT レポーター遺伝子構築物の発
現を調べるために、CAT 活性を測定した。皮膚からCAT を抽出するために、組織
ホモジナイザー(ニューヨーク、ウェストバリーのブリンクマン インスツルメ
ント社(Brinkmann Instruments，Inc．),Westbury，NY)を用いて、標本を0.25ト
リス- HCl、pH7.5 中でホモジナイズした。ホモジネートを、４℃で15分間10,00
0 Xgで遠心分離し、上澄み中のたんぱく質濃縮物を市販のたんぱく質分析キット
（カリフォルニア州、リッチモンドのバイオーラド ラボラトリーズ(Bio-Rad L
aboratories)，Richmond，CA)により測定した。たんぱく質100 μgを含む上澄み
のアリコートを使用して、良く知られている方法で[14C]クロラムフェニコール
とともにインキュベーションすることにより、CAT 活性を分析した。放射性クロ
ラムフェニコールのアセチル化および非- アセチル化形を薄層クロマトグラフィ
ーにより分離し、CAT 活性をアセチル化形の放射能の各サンプルにおける全放射
能の割合として決定した。
実施例４：UV供給源
UVB 投与のために、狭い間隔で一列に並べた７本のウェスティングハウス（We
stinghouse）FS-40 太陽灯を使用し、35cmの距離で均一な照射を行った。UVA の
照射を、前述したような列の７本のシルバニア(Sylvania)FR40T12 PUVA ランプ
を用いて行い、2mm 厚の窓ガラスを通過させて320nm 以下の波長を除去した。35
cmでのエネルギー出力をソーラーライト型(Solar Light model)3D UVAおよびUVB
検出器(ペンシルバニア州、フィラデルフィアのソーラーライト社(Solar Light
Company，Philadelphia，PA))で測定した。FX-40 太陽灯の出力は、38cmでUVB23
.4単位/ 時間であり、ここで１単位は紅斑作用エネルギー21mJ/cm2に相当する。
窓ガラスを通過したFR40T12 PUVAランプに対する出力は2.02 mW/cm2であり、UVB
は検出されなかった。
実施例５：照射
マウスを光の列の中心下に置き、接着テープで固定し、これらの脊椎表面を蛍
光管から35cmの距離で紫外線へ晒す。未処理対照マウスを同様の方法で固定した
。最大プロモーター活性の時間およびUVA およびUVB 照射に続く上昇したプロモ
ーター活性の期間を決定するために、時間経過実験を行った。線量は、中程度の
プロモーター活性を示す量に従って選択された。マウスは、UVB で1/2 時間（線
量245.7 mJ/cm2)またはUVA で5.2 時間(線量3 8.2 J/cm2)照射された。次いで照
射した皮膚をCAT 活性測定のために次の72-96 時間にかけて摘出した。対照マウ
スを最初の時点（照射後12時間）で屠殺した。UVB 照射に対する最も早い時期の
CAT 活性の反応を調べるために、UVB 暴露後１、２、３および６時間目にマウス
を摘出した。非照射マウスを対照マウス後24、48、72および96時間目に摘出し、
その期間にわたる内因性CAT活性における落ち込みを測定した。
UVB に対する線量/ 反応の関係を調べるために、30.7、122.8 および491.4 mJ
/cm2の線量を、それぞれ0.06、0.25および１時間かけて与えた。UVA に対する線
量/ 反応の関係を、9.5 および38.2 J/cm2の線量を利用して、それぞれ、1.3 お
よび5.2 時間かけて与えることにより調べた。各実験について、同一腹からのマ
ウスのみを使用した。光暴露後、マウスを24時間母親の元へ戻し、次いで屠殺し
てCAT 活性を測定するために皮膚を摘出した。少なくとも２匹のマウスを、各実
験における各線量および時間について使用した。
前記のような線維芽細胞培養物を、0.7、1.4、2.7、5.5および10.9J/cm2の線
量に相当するUVBへそれぞれ５、10、20、40および80秒間暴露した。培養物を、0
.3、0.6、1.1および2.2 J/cm2の線量に対応するUVA へ2.3、4.6、9.2および18.4
分間暴露した。組織培養物培地による光吸収を防止するために、照射直前に、組
織培養物培地を細胞から除き、細胞を被覆するのに十分なリン酸緩衝溶液(PBS)
の薄層に換えた。対照未照射細胞もまたPBS中に入れた。最後の光線量を投与し
た直後に、すべての皿の培地を入れ換えた。同一腹のマウスからの線維芽細胞の
みを与えられた実験に対して使用し、最初の数回の継代に利用した。細胞の二つ
の皿を各時点について使用した。
実施例６：PUVA 処理
インビトロ：実施例２に記載のように得られた線維芽細胞培養物を６群に分け
、以下のように処理した。対照細胞はUVA または8-MOP を受けなかった。UVA 対
照は、UVA 1 J/cm2を受け、8-MOP との予備インキュベーションはない。8-MOP対
照は8-MOP の最も高い投与量(３μg/ml)を受けるがUVAは受けない。PUVA処理細
胞は、リン酸緩衝溶液(PBS)中の8-MOP 0.3、1.0 または3.0 μg/mlのいずれかと
ともに予備インキュベーションし、次いでUVA 1 J/cm2に晒した。8-MOP を、PBS
中に8-MOP を所望の濃度まで希釈することにより投与した。培養物へ施す前、組
織培養培地を除き、細胞をPBS で二回リンスした。細胞を、8-MOP 3mlと共に直
径10cmの皿において12.5分間インキュベーションした。UVA 対照をPBS 等量中に
12.5分間入れ、次いでUVA を照射した。処理後、細胞をPBSで二回洗浄し、組織
培養培地を全ての皿において置き換えた。同一腹を代表するマウスからの線維芽
細胞だけをいずれの実験に対しても使用し、継代2-3回に利用した。各時点につ
き２皿の細胞を使用した。照射後24時間目に最大プロモーター活性が生じるので
、光処理後24時間目にCAT 活性の測定のために細胞を摘出した。
インビボ：マウスを光の列の中心下に置き、接着テープで固定し、蛍光管から
38cmの距離で皮膚表面をUVA に暴露した。未照射の対照マウスを同様の方法で固
定した。各実験に対し、同一腹のマウスのみを使用した。8-MOP で処理したマウ
スは、8-MOP 2mg/mlを含むエタノール性溶液25μlを受け、これらの背中へ15分
および7.5 分間の二度適用し、その後UVA（10 J/cm2）暴露を行った。8-MOP 対
照マウスは8-MOP を同一局所に適用された。PUVA処理マウスは8-MOP およびUVA
の両方を受けた。光処理後、マウスの背中を70% イソプロピルアルコールパッド
で二度リンスして過剰の8-MOP を除去した。マウスを屠殺し、光処理後24時間目
のCAT 活性を測定するために皮膚を摘出した。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項
【提出日】１９９７年５月９日
【補正内容】
請求の範囲
１．（a） ヒトエラスチンプロモーターを発現することのできる形質転換マウ
スの皮膚へ試験化合物を施し；
（b） 形質転換マウスを、UVB照射、UVA照射、または8-メトキシプソラレ
ン後のUVA照射 に暴露し；
（c） 形質転換マウスにおけるヒトエラスチンプロモーター活性を測定す
る
ことを含む皮膚の光障害を阻止することのできる化合物を同定する方法。
２．（a） ヒトエラスチンプロモーターを発現することのできる形質転換マウ
スから得られる線維芽細胞を試験化合物と接触させ；
（b） UVB照射 または8-メトキシプソラレン後のUVA照射 に線維芽細胞を
暴露し；そして
（c） 線維芽細胞におけるヒトエラスチンプロモーター活性を測定する
ことを含む皮膚の光障害を阻止することができる化合物の同定方法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．ヒトエラスチンプロモーターを発現することのできる形質転換マウス。 ２．ヒトエラスチンプロモーターを発現することのできる形質転換マウスから 得られるマウス線維芽細胞培養物。 ３．（a） ヒトエラスチンプロモーターを発現することのできる形質転換マウ スの皮膚へ試験化合物を施し； （b） 形質転換マウスを、UVB照射、UVA照射、または8-メトキシプソラレ ン後のUVA照射 に暴露し； （c） 形質転換マウスにおけるヒトエラスチンプロモーター活性を測定す る ことを含む皮膚の光障害を阻止することのできる化合物を同定する方法。 ４．（a） ヒトエラスチンプロモーターを発現することのできる形質転換マウ スから得られる線維芽細胞を試験化合物と接触させ； （b） UVB照射 または8-メトキシプソラレン後のUVA照射 に線維芽細胞を 暴露し；そして （c） 線維芽細胞におけるヒトエラスチンプロモーター活性を測定する ことを含む皮膚の光障害を阻止することができる化合物の同定方法。
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| Bernerd et al. | UVA exposure of human skin reconstructed in vitro induces apoptosis of dermal fibroblasts: subsequent connective tissue repair and implications in photoaging | |
| Bernstein et al. | Ultraviolet radiation activates the human elastin promoter in transgenic mice: a novel in vivo and in vitro model of cutaneous photoaging | |
| Clydesdale et al. | Ultraviolet light induced injury: immunological and inflammatory effects | |
| Scharffetter et al. | UVA irradiation induces collagenase in human dermal fibroblasts in vitro and in vivo | |
| Applegate et al. | Induction of heme oxygenase: a general response to oxidant stress in cultured mammalian cells | |
| Petersen et al. | Ultraviolet A irradiation stimulates collagenase production in cultured human fibroblasts | |
| Miyauchi-Hashimoto et al. | Enhanced inflammation and immunosuppression by ultraviolet radiation in xeroderma pigmentosum group A (XPA) model mice | |
| US5648061A (en) | In vivo and in vitro model of cutaneous photoaging | |
| Garmyn et al. | Effect of aging and habitual sun exposure on the genetic response of cultured human keratinocytes to solar-simulated irradiation | |
| Roza et al. | The induction and repair of DNA damage and its influence on cell death in primary human fibroblasts exposed to UV-A or UV-C irradiation | |
| Monfrecola et al. | The effect of visible blue light on the differentiation of dendritic cells in vitro | |
| Seo et al. | Anti-aging effect of rice wine in cultured human fibroblasts and keratinocytes | |
| Honda et al. | Interleukin-1β and macrophage migration inhibitory factor (MIF) in dermal fibroblasts mediate UVA-induced matrix metalloproteinase-1 expression | |
| JPH11507807A (ja) | 皮膚の光老化のインビボおよびインビトロモデル | |
| Rosen et al. | Ultraviolet radiation induction of ornithine decarboxylase in rat keratinocytes | |
| Trautinger et al. | Expression of the 72‐kD heat shock protein is induced by ultraviolet A radiation in a human fibrosarcoma cell line | |
| Teran et al. | Cultured nasal polyps from nonatopic and atopic patients release RANTES spontaneously and after stimulation with phytohemagglutinin | |
| Cruz Jr et al. | Thymidine dinucleotides inhibit contact hypersensitivity and activate the gene for tumor necrosis factor α | |
| US6018098A (en) | In vivo and in vitro model of cutaneous photoaging | |
| Bernstein et al. | Evaluation of sunscreens with various sun protection factors in a new transgenic mouse model of cutaneous photoaging that measures elastin promoter activation | |
| Petersen et al. | Regulation and inhibition of collagenase expression by long‐wavelength ultraviolet radiation in cultured human skin fibroblasts | |
| Zhang | Animal Models of Skin Disorders | |
| HÖNIGSMANN et al. | Unscheduled DNA synthesis in normal human skin after single and combined doses of V‐A, UV‐B and UV‐A with methoxsalen (PUVA) | |
| Yamazaki et al. | XPA gene-deficient, SCF-transgenic mice with epidermal melanin are resistant to UV-induced carcinogenesis | |
| Miyauchi-Hashimoto et al. | Ultraviolet radiation-induced suppression of natural killer cell activity is enhanced in xeroderma pigmentosum group A (XPA) model mice |
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|---|---|---|---|
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