JP2002541774A - 酸化的損傷を防止する薬剤を評価するためのシステムと方法 - Google Patents
酸化的損傷を防止する薬剤を評価するためのシステムと方法Info
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Abstract
(57)【要約】
ヒトエラスチンプロモーターを発現することが可能なトランスジェニックマウスに由来する、内部に反応性酸素種を生成させるマウス線維芽細胞培養物の中での酸化的損傷を抑制または防止することが可能な薬剤を同定するためのインビトロシステムが提供される。このシステムにより酸化的損傷を抑制または防止することが可能な薬剤の同定法も提供される。
Description
【０００１】 発明の背景 慢性的な日光曝露は、結局は、日光による損傷皮膚の特徴にして、光老化とひ
とまとめに称される、しわ、たるみ、色素変化および皮膚癌をもたらしてしまう
（クリグマン，Ａ．Ｍ．［Kligman, A. M.］のJAMA、210：2377-2380、1969；ギ
ルチュレスト，Ｂ．Ａ．［Gilchrest, B.A.］のJ. Am. Acad. Dermatol.、21：6
10-613、1989）。光老化皮膚を特徴付けているしわ、たるみおよび黄変部の下に
ある光老化皮膚の真皮中における主要な病理組織学的変化は、普通はコラーゲン
に富んでいる真皮に代わって、天日性弾力線維症(solar elastosis)と称される
大量の異常な弾性物質の蓄積である（メラ［Mera］等のBr. J. Dermatol.、117
：21-27、1987；バーンステイン［Bernstein］等のJ. Invest. Dermatol.、103
：182-186、1994）。天日性弾力線維症発生の主たる事象の１つは、エラスチン
プロモーターの活性化である（バーンステイン等のJ. Invest. Dermatol.、105
：269-273、1995）。
とまとめに称される、しわ、たるみ、色素変化および皮膚癌をもたらしてしまう
（クリグマン，Ａ．Ｍ．［Kligman, A. M.］のJAMA、210：2377-2380、1969；ギ
ルチュレスト，Ｂ．Ａ．［Gilchrest, B.A.］のJ. Am. Acad. Dermatol.、21：6
10-613、1989）。光老化皮膚を特徴付けているしわ、たるみおよび黄変部の下に
ある光老化皮膚の真皮中における主要な病理組織学的変化は、普通はコラーゲン
に富んでいる真皮に代わって、天日性弾力線維症(solar elastosis)と称される
大量の異常な弾性物質の蓄積である（メラ［Mera］等のBr. J. Dermatol.、117
：21-27、1987；バーンステイン［Bernstein］等のJ. Invest. Dermatol.、103
：182-186、1994）。天日性弾力線維症発生の主たる事象の１つは、エラスチン
プロモーターの活性化である（バーンステイン等のJ. Invest. Dermatol.、105
：269-273、1995）。
【０００２】 インビボおよびインビトロのシステムにおいて皮膚光老化のモデルを作る、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ・レポーター遺伝子（CAT）に
結合したヒトエラスチンプロモーターを発現するトランスジェニックマウス系統
が開発された（バーンステイン等のJ. Invest. Dermatol.、105：269-273、1995
）。これらマウスの細胞は、表現型上は正常であるけれども、ヒトエラスチンプ
ロモーター／CAT構成を有し、エラスチンプロモーター活性を紫外線（ＵＶ）の
ような刺激に応答して測定できるようになっている。これらのマウスおよびそれ
らの皮膚から誘導された線維芽細胞培養物は、皮膚の光損傷を抑制することが可
能な化合物を同定する速くかつ敏感な手段となることが証明されている（バーン
ステイン等のJ. Invest. Dermatol.、105：269-273、1995；バーンステイン等の
Photochem. Photobiol.、64：369-74、1996；バーンステイン等のJ. Am. Acad.
Dermatol.、37：725-729、1997）。
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ・レポーター遺伝子（CAT）に
結合したヒトエラスチンプロモーターを発現するトランスジェニックマウス系統
が開発された（バーンステイン等のJ. Invest. Dermatol.、105：269-273、1995
）。これらマウスの細胞は、表現型上は正常であるけれども、ヒトエラスチンプ
ロモーター／CAT構成を有し、エラスチンプロモーター活性を紫外線（ＵＶ）の
ような刺激に応答して測定できるようになっている。これらのマウスおよびそれ
らの皮膚から誘導された線維芽細胞培養物は、皮膚の光損傷を抑制することが可
能な化合物を同定する速くかつ敏感な手段となることが証明されている（バーン
ステイン等のJ. Invest. Dermatol.、105：269-273、1995；バーンステイン等の
Photochem. Photobiol.、64：369-74、1996；バーンステイン等のJ. Am. Acad.
Dermatol.、37：725-729、1997）。
【０００３】 ＵＶが皮膚を損傷させる多種多様な機構の中に反応性酸素種の生成がある（ミ
ヤチ，Ｙ．［Miyachi, Y.］のJ. Dermatol. Sci.、9：79-86、1995）。反応性酸
素種はＵＶ曝露の結果として直ちに生成するか、またはＵＶ誘発傷害に続いて起
こることが多い炎症反応の結果として生じ得るものである。日焼けの紅斑はＵＶ
による損傷の臨床上の証拠であるけれども、炎症性浸潤は紅斑がなくても病理組
織学的には明らかであって、真皮をＵＶ誘発損傷が生じた後で何日も遊離ラジカ
ルに継続曝露させる可能性がある（クリグマン，Ａ．Ｍ．のJAMA、210：2377-23
80、1969；ラブカー［Lavker］等のJ. Am. Acad. Dermatol.、32：53-62、1995
）。皮膚の光損傷における遊離ラジカルの役割は十分に実証されている（ラナデ
ィブ，Ｎ．Ｓ．［Ranadive, N. S.］およびメノン，Ｉ．Ａ．［Menon, I. A］.
のPathol. Immunopathol. Res.、5：118-139、1986；ミヤチ，Ｙ．およびイマム
ラ，Ｓ．［Imamura, S.］のPhotodermatol. Photoimmunol. Photomed.、7：49-5
0、1990；ミヤチ，Ｙ．のJ. Dermatol. Sci.、9：79-86、1995；およびピーク［
Peak］等のPhotochem. Photobiol.、54：197-203、1991）。皮膚中におけるＵＶ
誘発遊離ラジカル生成も証明されている（ピーク等のPhotochem. Photobiol.、5
4：197-203、1991；およびノリンズ，Ａ．Ｌ．［Norins, A. L.］のJ. Invest.
Dermatol.、39：445-448、1962）。さらに、酸化的損傷に対して保護するある種
の酵素、例えばスーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼはＵＶ曝露後に
大きく減少し（ペンス，Ｂ．Ｃ．［Pence, B. C.］およびネーラー，Ｍ．Ｆ．［
Naylor, M. F.］のJ. Invest. Dermatol.、95：213-216、1990；マエダ［Maeda
］等のPhotochem. Photobiol.、54：737-740、1991；シンドー，Ｙ．［Shindo,
Y.］およびハシモト，Ｔ．［Hashimoto, T.］のJ. Dermatol. Sci.、14：225-23
2、1997）、また遊離ラジカルを掃去する酸化防止剤のＵＶに対する保護作用が
証明されている（デリオス［DeRios］等のJ. Invest. Dermatol.、70：123-125
、1975；およびビセット［Bissett］等のJ. Soc. Cosmet. Chem.、43：85-92、1
992）。研究者は、最近、キサンチンとキサンチンオキシダーゼとの系をインビ
トロで使用すると、生成した遊離ラジカルに応答してエラスチンmRNAが産生する
ことを証明したが、これは天日性弾力線維症の発生における酸化ストレスの役割
に対する証拠となるものである（カワグチ［Kawaguchi］等のFree Radical Biol
. Med.、23：162-165、1997）。
ヤチ，Ｙ．［Miyachi, Y.］のJ. Dermatol. Sci.、9：79-86、1995）。反応性酸
素種はＵＶ曝露の結果として直ちに生成するか、またはＵＶ誘発傷害に続いて起
こることが多い炎症反応の結果として生じ得るものである。日焼けの紅斑はＵＶ
による損傷の臨床上の証拠であるけれども、炎症性浸潤は紅斑がなくても病理組
織学的には明らかであって、真皮をＵＶ誘発損傷が生じた後で何日も遊離ラジカ
ルに継続曝露させる可能性がある（クリグマン，Ａ．Ｍ．のJAMA、210：2377-23
80、1969；ラブカー［Lavker］等のJ. Am. Acad. Dermatol.、32：53-62、1995
）。皮膚の光損傷における遊離ラジカルの役割は十分に実証されている（ラナデ
ィブ，Ｎ．Ｓ．［Ranadive, N. S.］およびメノン，Ｉ．Ａ．［Menon, I. A］.
のPathol. Immunopathol. Res.、5：118-139、1986；ミヤチ，Ｙ．およびイマム
ラ，Ｓ．［Imamura, S.］のPhotodermatol. Photoimmunol. Photomed.、7：49-5
0、1990；ミヤチ，Ｙ．のJ. Dermatol. Sci.、9：79-86、1995；およびピーク［
Peak］等のPhotochem. Photobiol.、54：197-203、1991）。皮膚中におけるＵＶ
誘発遊離ラジカル生成も証明されている（ピーク等のPhotochem. Photobiol.、5
4：197-203、1991；およびノリンズ，Ａ．Ｌ．［Norins, A. L.］のJ. Invest.
Dermatol.、39：445-448、1962）。さらに、酸化的損傷に対して保護するある種
の酵素、例えばスーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼはＵＶ曝露後に
大きく減少し（ペンス，Ｂ．Ｃ．［Pence, B. C.］およびネーラー，Ｍ．Ｆ．［
Naylor, M. F.］のJ. Invest. Dermatol.、95：213-216、1990；マエダ［Maeda
］等のPhotochem. Photobiol.、54：737-740、1991；シンドー，Ｙ．［Shindo,
Y.］およびハシモト，Ｔ．［Hashimoto, T.］のJ. Dermatol. Sci.、14：225-23
2、1997）、また遊離ラジカルを掃去する酸化防止剤のＵＶに対する保護作用が
証明されている（デリオス［DeRios］等のJ. Invest. Dermatol.、70：123-125
、1975；およびビセット［Bissett］等のJ. Soc. Cosmet. Chem.、43：85-92、1
992）。研究者は、最近、キサンチンとキサンチンオキシダーゼとの系をインビ
トロで使用すると、生成した遊離ラジカルに応答してエラスチンmRNAが産生する
ことを証明したが、これは天日性弾力線維症の発生における酸化ストレスの役割
に対する証拠となるものである（カワグチ［Kawaguchi］等のFree Radical Biol
. Med.、23：162-165、1997）。
【０００４】 反応性酸素種は、皮膚光老化を持つトランスジェニックマウスモデルに由来す
る線維芽細胞中のプロモーターレベルにおけるエラスチンの産生を刺激すること
がここに証明された。さらに、この系中において酸化的損傷に対し保護してエラ
スチン産生の刺激を抑制することが知られている薬剤の能力も証明された。従っ
て、本発明は、ヒトエラスチンプロモーターを発現することが可能なトランスジ
ェニックマウスに由来するマウス線維芽細胞培養物、およびそのマウス線維芽細
胞培養物内に反応性酸素種を生成させる作用物質(means)により、酸化的損傷に
対して保護することが可能な薬剤を同定するためのインビトロシステムおよび方
法に関する。
る線維芽細胞中のプロモーターレベルにおけるエラスチンの産生を刺激すること
がここに証明された。さらに、この系中において酸化的損傷に対し保護してエラ
スチン産生の刺激を抑制することが知られている薬剤の能力も証明された。従っ
て、本発明は、ヒトエラスチンプロモーターを発現することが可能なトランスジ
ェニックマウスに由来するマウス線維芽細胞培養物、およびそのマウス線維芽細
胞培養物内に反応性酸素種を生成させる作用物質(means)により、酸化的損傷に
対して保護することが可能な薬剤を同定するためのインビトロシステムおよび方
法に関する。
【０００５】 発明の概要 本発明の１つの目的は、ヒトエラスチンプロモーターを発現することが可能な
トランスジェニックマウスに由来するマウス線維芽細胞培養物、およびそのマウ
ス線維芽細胞培養物内に反応性酸素種を生成させる作用物質を含んで成る、酸化
的損傷を抑制または防止することが可能な薬剤を同定するためのインビトロシス
テムを提供することである。
トランスジェニックマウスに由来するマウス線維芽細胞培養物、およびそのマウ
ス線維芽細胞培養物内に反応性酸素種を生成させる作用物質を含んで成る、酸化
的損傷を抑制または防止することが可能な薬剤を同定するためのインビトロシス
テムを提供することである。
【０００６】 このシステムを用いて、酸化的損傷を抑制または防止することが可能な薬剤を
同定する方法も提供される。 発明の詳しい説明 酸化的損傷は、ＵＶによる表皮損傷に比較して、真皮において、より一層大き
な作用を示し得る。かくして、皮膚のしわおよびたるみとして臨床上明らかな光
老化の発生は、表皮中に生ずるＵＶ誘発皮膚癌よりも遊離ラジカル誘発機構でよ
り一層多くもたらされるだろう。この証拠として、遊離ラジカル誘発損傷に対す
る線維芽細胞の感受性が表皮細胞に比較してより大きいこと（アップルゲートＬ
．Ａ．［Applegate, L. A.］およびフレンク，Ｅ．［Frenk, E.］のPhotodermat
ol. Photoimmunol. Photomed.、11：95-101、1995；モイサン［Moysan］等のPho
todermatol. Photoimmunol. Photomed.、11：192-197、1995；マサキ，Ｈ．［Ma
saki, H.］およびサクライ，Ｈ．［Sakurai, H.］のJ. Dermatol. Sci.、14：20
7-216、1997）、および遊離ラジカルを生成させる循環性炎症細胞(circulating
inflammatory cells)は真皮を通って巡り、表皮にはそれほど頻繁には侵入しな
いという事実が挙げられる。また、長波長の方のＵＶは、直接的なDNA損傷はそ
れほどもたらされないが（セットロー，Ｒ．Ｂ．［Setlow, R. B.］のScience、
153：379-386、1966）、悪影響を主として酸化機構で及ぼし、皮膚中により一層
深く侵入してそれらのエネルギーの多くを真皮の中に蓄え得る。かくして、損傷
の遊離ラジカル機構は、UVA誘発光老化が起こる主たる手段となる可能性がある
。
同定する方法も提供される。 発明の詳しい説明 酸化的損傷は、ＵＶによる表皮損傷に比較して、真皮において、より一層大き
な作用を示し得る。かくして、皮膚のしわおよびたるみとして臨床上明らかな光
老化の発生は、表皮中に生ずるＵＶ誘発皮膚癌よりも遊離ラジカル誘発機構でよ
り一層多くもたらされるだろう。この証拠として、遊離ラジカル誘発損傷に対す
る線維芽細胞の感受性が表皮細胞に比較してより大きいこと（アップルゲートＬ
．Ａ．［Applegate, L. A.］およびフレンク，Ｅ．［Frenk, E.］のPhotodermat
ol. Photoimmunol. Photomed.、11：95-101、1995；モイサン［Moysan］等のPho
todermatol. Photoimmunol. Photomed.、11：192-197、1995；マサキ，Ｈ．［Ma
saki, H.］およびサクライ，Ｈ．［Sakurai, H.］のJ. Dermatol. Sci.、14：20
7-216、1997）、および遊離ラジカルを生成させる循環性炎症細胞(circulating
inflammatory cells)は真皮を通って巡り、表皮にはそれほど頻繁には侵入しな
いという事実が挙げられる。また、長波長の方のＵＶは、直接的なDNA損傷はそ
れほどもたらされないが（セットロー，Ｒ．Ｂ．［Setlow, R. B.］のScience、
153：379-386、1966）、悪影響を主として酸化機構で及ぼし、皮膚中により一層
深く侵入してそれらのエネルギーの多くを真皮の中に蓄え得る。かくして、損傷
の遊離ラジカル機構は、UVA誘発光老化が起こる主たる手段となる可能性がある
。
【０００７】 現在、UVB遮断に有効な多数の日焼け止め剤が市場に出ているが、より高い日
焼け止め指数(Sun Protection Factors)を得るために、UVA保護剤も次第に多く
の量で日焼け止め剤に配合されるようになりつつある。現在入手できる日焼け止
め剤に、効果的な遊離ラジカル掃去剤を配合することにより、さらなる改善がも
たらされる可能性がある。従って、日光による酸化的損傷を抑制または防止する
薬剤を同定するシステムの必要が存在する。
焼け止め指数(Sun Protection Factors)を得るために、UVA保護剤も次第に多く
の量で日焼け止め剤に配合されるようになりつつある。現在入手できる日焼け止
め剤に、効果的な遊離ラジカル掃去剤を配合することにより、さらなる改善がも
たらされる可能性がある。従って、日光による酸化的損傷を抑制または防止する
薬剤を同定するシステムの必要が存在する。
【０００８】 米国特許第５，６４８，０６１号明細書は、マウスの皮膚に対する直接照射に
よるインビボでの、および皮膚の体外移植組織から増殖せしめられた皮膚線維芽
細胞に対する照射によるインビトロでの両紫外線照射に応答して、ヒトエラスチ
ンプロモーター活性を調べるのを可能にするトランスジェニックマウスモデルを
開示している。これら皮膚線維芽細胞中でのハイポキサンチンとキサンチンオキ
シダーゼとの系による反応性酸素種の生成は、エラスチンプロモーター活性に６
倍の増加をもたらすことがここに証明された。さらに、この増加は、酸化的損傷
に対して保護することが知られている酵素であるカタラーゼの添加によりなくす
ことができる。従って、これらのマウス線維芽細胞培養物内にハイポキサンチン
とキサンチンオキシダーゼとの系のような反応性酸素種を生成させる作用物質を
配合すると、酸化的損傷を防ぎ得る薬剤を評価するための敏感なシステムがもた
らされる。このシステムを用いると、ＵＶ曝露に由来する酸化的損傷に対して保
護することができる薬剤を速やかにスクリーニングすることができ、そしてさら
に研究し、最終的には日焼け止め剤に配合するための有望な候補薬剤の同定を行
うことができる。
よるインビボでの、および皮膚の体外移植組織から増殖せしめられた皮膚線維芽
細胞に対する照射によるインビトロでの両紫外線照射に応答して、ヒトエラスチ
ンプロモーター活性を調べるのを可能にするトランスジェニックマウスモデルを
開示している。これら皮膚線維芽細胞中でのハイポキサンチンとキサンチンオキ
シダーゼとの系による反応性酸素種の生成は、エラスチンプロモーター活性に６
倍の増加をもたらすことがここに証明された。さらに、この増加は、酸化的損傷
に対して保護することが知られている酵素であるカタラーゼの添加によりなくす
ことができる。従って、これらのマウス線維芽細胞培養物内にハイポキサンチン
とキサンチンオキシダーゼとの系のような反応性酸素種を生成させる作用物質を
配合すると、酸化的損傷を防ぎ得る薬剤を評価するための敏感なシステムがもた
らされる。このシステムを用いると、ＵＶ曝露に由来する酸化的損傷に対して保
護することができる薬剤を速やかにスクリーニングすることができ、そしてさら
に研究し、最終的には日焼け止め剤に配合するための有望な候補薬剤の同定を行
うことができる。
【０００９】 この新しいシステムを用いて一連の実験を行った。 第一の実験セットでは、トランスジェニックマウスの皮膚に由来する線維芽細
胞をハイポキサンチンとキサンチンオキシダーゼとの系と共にインキュベートす
るための最適時間幅を、時間量を増加させてハイポキサンチンとキサンチンオキ
シダーゼとの系に細胞を曝露し、そして２４時間のインキュべート後に、実施例
３に概説されるようにしてCAT活性を測定することによって求めた。CAT活性は、
９０分のインキュベート後にピークが生ずるまで着実に増加した。さらに長いイ
ンキュベート時間は細胞毒性を過度に大きくし、かつそれに対応してCAT活性を
低下させた。かくして、さらなる研究のために、ハイポキサンチンおよびキサン
チンオキシダーゼと接触する細胞には９０分のインキュベート時間が選ばれた。
胞をハイポキサンチンとキサンチンオキシダーゼとの系と共にインキュベートす
るための最適時間幅を、時間量を増加させてハイポキサンチンとキサンチンオキ
シダーゼとの系に細胞を曝露し、そして２４時間のインキュべート後に、実施例
３に概説されるようにしてCAT活性を測定することによって求めた。CAT活性は、
９０分のインキュベート後にピークが生ずるまで着実に増加した。さらに長いイ
ンキュベート時間は細胞毒性を過度に大きくし、かつそれに対応してCAT活性を
低下させた。かくして、さらなる研究のために、ハイポキサンチンおよびキサン
チンオキシダーゼと接触する細胞には９０分のインキュベート時間が選ばれた。
【００１０】 ハイポキサンチンおよびキサンチンオキシダーゼの線維芽細胞培養物に対する
９０分間の添加は、ヒトエラスチンプロモーター活性を、CAT検定法で測定して
、未処理対照細胞の同活性の６．０±０．６倍（平均±sem）まで増加させた。
ハイポキサンチンおよびキサンチンオキシダーゼ曝露直前の、１０，０００Ｕ／
ｍＬのカタラーゼの添加はこの増加を完全になくした。ハイポキサンチンおよび
キサンチンオキシダーゼに曝露されたカタラーゼ処理細胞には対照細胞を越える
増加はないことが証明され、その活性は未処理対照の平均１．０±０．１倍であ
った。トリパンブルー排除(trypan blue exclusive)は、ハイポキサンチン／キ
サンチンオキシダーゼにより処理された、およびハイポキサンチン／キサンチン
オキシダーゼとカタラーゼとで処理された細胞の毒性は１５％未満であることを
証明した。
９０分間の添加は、ヒトエラスチンプロモーター活性を、CAT検定法で測定して
、未処理対照細胞の同活性の６．０±０．６倍（平均±sem）まで増加させた。
ハイポキサンチンおよびキサンチンオキシダーゼ曝露直前の、１０，０００Ｕ／
ｍＬのカタラーゼの添加はこの増加を完全になくした。ハイポキサンチンおよび
キサンチンオキシダーゼに曝露されたカタラーゼ処理細胞には対照細胞を越える
増加はないことが証明され、その活性は未処理対照の平均１．０±０．１倍であ
った。トリパンブルー排除(trypan blue exclusive)は、ハイポキサンチン／キ
サンチンオキシダーゼにより処理された、およびハイポキサンチン／キサンチン
オキシダーゼとカタラーゼとで処理された細胞の毒性は１５％未満であることを
証明した。
【００１１】 よって、ヒトエラスチンプロモーターを発現させ、そしてハイポキサンチンと
キサンチンオキシダーゼとの系のような、反応性酸素種の生成作用物質を含んで
成るこれらのマウス線維芽細胞培養物は、酸化的損傷に対して保護することが可
能な薬剤を同定するための有用なシステムを提供する。酸化的損傷に対して保護
を与えると推測される試験薬剤は、反応性酸素種生成作用物質の添加前にマウス
線維芽細胞培養物に加えることができる。次いで反応性酸素種生成作用物質を加
え、そして選択されたある一定時間後に、好ましくはハイポキサンチンとキサン
チンオキシダーゼとの系については９０分後にマウス線維芽細胞培養物中のヒト
エラスチンプロモーター活性を定量する。１つの好ましい態様においては、エラ
スチンプロモーター活性は、マウス線維芽細胞培養物のレポーター遺伝子の発現
、即ちCAT活性を測定することによって定量される。次に、試験薬剤に曝露され
たマウス線維芽細胞培養物中のヒトエラスチンプロモーター活性を、試験薬剤に
曝露されなかったが、反応性酸素種の生成作用物質にはなおも曝露されている対
照線維芽細胞培養物中のエラスチンプロモーター活性と比較する。酸化的損傷に
対して保護を与える薬剤は、試験薬剤および反応性酸素種生成作用物質に曝露さ
れたマウス線維芽細胞培養物中のヒトエラスチンプロモーター活性を対照線維芽
細胞培養物と比較して低下させるそのような試験薬剤であると確認される。
キサンチンオキシダーゼとの系のような、反応性酸素種の生成作用物質を含んで
成るこれらのマウス線維芽細胞培養物は、酸化的損傷に対して保護することが可
能な薬剤を同定するための有用なシステムを提供する。酸化的損傷に対して保護
を与えると推測される試験薬剤は、反応性酸素種生成作用物質の添加前にマウス
線維芽細胞培養物に加えることができる。次いで反応性酸素種生成作用物質を加
え、そして選択されたある一定時間後に、好ましくはハイポキサンチンとキサン
チンオキシダーゼとの系については９０分後にマウス線維芽細胞培養物中のヒト
エラスチンプロモーター活性を定量する。１つの好ましい態様においては、エラ
スチンプロモーター活性は、マウス線維芽細胞培養物のレポーター遺伝子の発現
、即ちCAT活性を測定することによって定量される。次に、試験薬剤に曝露され
たマウス線維芽細胞培養物中のヒトエラスチンプロモーター活性を、試験薬剤に
曝露されなかったが、反応性酸素種の生成作用物質にはなおも曝露されている対
照線維芽細胞培養物中のエラスチンプロモーター活性と比較する。酸化的損傷に
対して保護を与える薬剤は、試験薬剤および反応性酸素種生成作用物質に曝露さ
れたマウス線維芽細胞培養物中のヒトエラスチンプロモーター活性を対照線維芽
細胞培養物と比較して低下させるそのような試験薬剤であると確認される。
【００１２】 次の非限定実施例は本発明をさらに説明するために与えられるものである。 実施例 実施例１：ヒトエラスチンプロモーターを発現する線維芽細胞培養物 前記（バーンステイン等のJ. Invest. Dermatol.、105：269-273、1995；およ
びバーンステイン等のPhotochem. Photobiol.、64：369-74、1996）のように、
エラスチンプロモーターの活性化の測定を可能にするCATレポーター遺伝子に結
合した５．２−ｋｂヒトエラスチンプロモーターを発現するトランスジェニック
マウスの同型接合系統の皮膚に由来する線維芽細胞を使用した。これらのマウス
は、表現型上は正常であるけれども、CAT活性について検定すると、ヒトエラス
チンプロモーターを発現する（スー−ウォング［Hsu-Wong］等のJ. Biol. Chem.
、269：18072-18075、1994；バーンステイン等のJ. Invest. Dermatol.、105：2
69-273、1995；およびバーンステイン等のPhotochem. Photobiol.、64：369-74
、1996）。
びバーンステイン等のPhotochem. Photobiol.、64：369-74、1996）のように、
エラスチンプロモーターの活性化の測定を可能にするCATレポーター遺伝子に結
合した５．２−ｋｂヒトエラスチンプロモーターを発現するトランスジェニック
マウスの同型接合系統の皮膚に由来する線維芽細胞を使用した。これらのマウス
は、表現型上は正常であるけれども、CAT活性について検定すると、ヒトエラス
チンプロモーターを発現する（スー−ウォング［Hsu-Wong］等のJ. Biol. Chem.
、269：18072-18075、1994；バーンステイン等のJ. Invest. Dermatol.、105：2
69-273、1995；およびバーンステイン等のPhotochem. Photobiol.、64：369-74
、1996）。
【００１３】 線維芽細胞培養物は、組織標本をプラスチック製組織培養皿に外植し、そして
細胞をそれら体外移植組織を取り巻いている培養皿の領域に移行させることによ
り、トランスジェニックマウスから確立された。この一次培養物は、１０％の子
ウシ血清（FCS）、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび抗生物質が補充されたダルベ
ッコ（Dulbecco）の改変イーグル培地（DMEM）中に３７℃において保持された。
この一次細胞培養物をトリプシン処理により継代培養し、そして３代または４代
の継代培養物をハイポキサンチン／キサンチンオキシダーゼに曝露した。
細胞をそれら体外移植組織を取り巻いている培養皿の領域に移行させることによ
り、トランスジェニックマウスから確立された。この一次培養物は、１０％の子
ウシ血清（FCS）、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび抗生物質が補充されたダルベ
ッコ（Dulbecco）の改変イーグル培地（DMEM）中に３７℃において保持された。
この一次細胞培養物をトリプシン処理により継代培養し、そして３代または４代
の継代培養物をハイポキサンチン／キサンチンオキシダーゼに曝露した。
【００１４】 実施例２：ハイポキサンチン／キサンチンオキシダーゼにより生成せしめられ た遊離ラジカルに対する曝露 FCSを１０％含むDMEMを取り出し、細胞をリン酸緩衝食塩水（phosphate buffe
red saline: PBS）中で洗浄し、そしてDMEMをFCSの添加なしで置換した。次に、
５００μＭのハイポキサンチン（ＭＯ州、セントルイス［St. Louis］のシグマ
・ケミカル社［Sigma Chemical Co.］）および８０ｍＵ／ｍＬのキサンチンオキ
シダーゼ（ＭＯ州、セントルイスのシグマ・ケミカル社）の両者を、３７℃で９
０分間インキュベートされた線維芽細胞培養物に加えた。ハイポキサンチンおよ
びキサンチンオキシダーゼの濃度を、ミッチェル［Mitchell］等による以前の研
究（Biochemistry、29：2802-2807、1990）に基づいて選択した。細胞をハイポ
キサンチン／キサンチンオキシダーゼと共にインキュベートするための最適時間
幅は、細胞をハイポキサンチン／キサンチンオキシダーゼに１５分間、３０分間
、６０分間、９０分間および１２０分間曝露し、そして実施例３に概説されるよ
うにしてCAT活性を測定することにより求められた。ハイポキサンチン／キサン
チンオキシダーゼに対する曝露後に、細胞をPBS中で濯ぎ、そしてFCSを含むDMEM
中で２４時間インキュベートし、次いでCAT活性の測定のために収穫した（スー
−ウォング等のJ. Biol. Chem.、269：18072-18075、1994；バーンステイン等の
J. Invest. Dermatol.、105：269-273、1995；およびバーンステイン等のPhotoc
hem. Photobiol.、64：369-74、1996）。上記の２４時間インキュベートはプロ
モーターの最大活性化の時間であって、これはハイポキサンチン／キサンチンオ
キシダーゼに対する曝露後に生じることが決定された。対照細胞は、ハイポキサ
ンチン／キサンチンオキシダーゼの添加のない同一の方法で処理した。
red saline: PBS）中で洗浄し、そしてDMEMをFCSの添加なしで置換した。次に、
５００μＭのハイポキサンチン（ＭＯ州、セントルイス［St. Louis］のシグマ
・ケミカル社［Sigma Chemical Co.］）および８０ｍＵ／ｍＬのキサンチンオキ
シダーゼ（ＭＯ州、セントルイスのシグマ・ケミカル社）の両者を、３７℃で９
０分間インキュベートされた線維芽細胞培養物に加えた。ハイポキサンチンおよ
びキサンチンオキシダーゼの濃度を、ミッチェル［Mitchell］等による以前の研
究（Biochemistry、29：2802-2807、1990）に基づいて選択した。細胞をハイポ
キサンチン／キサンチンオキシダーゼと共にインキュベートするための最適時間
幅は、細胞をハイポキサンチン／キサンチンオキシダーゼに１５分間、３０分間
、６０分間、９０分間および１２０分間曝露し、そして実施例３に概説されるよ
うにしてCAT活性を測定することにより求められた。ハイポキサンチン／キサン
チンオキシダーゼに対する曝露後に、細胞をPBS中で濯ぎ、そしてFCSを含むDMEM
中で２４時間インキュベートし、次いでCAT活性の測定のために収穫した（スー
−ウォング等のJ. Biol. Chem.、269：18072-18075、1994；バーンステイン等の
J. Invest. Dermatol.、105：269-273、1995；およびバーンステイン等のPhotoc
hem. Photobiol.、64：369-74、1996）。上記の２４時間インキュベートはプロ
モーターの最大活性化の時間であって、これはハイポキサンチン／キサンチンオ
キシダーゼに対する曝露後に生じることが決定された。対照細胞は、ハイポキサ
ンチン／キサンチンオキシダーゼの添加のない同一の方法で処理した。
【００１５】 ハイポキサンチン／キサンチンオキシダーゼ処理だけに加えて、細胞はハイポ
キサンチン／キサンチンオキシダーゼと、９０分間同時インキュベートされた１
０，０００Ｕ／ｍＬのカタラーゼ（ＭＯ州、セントルイスのシグマ・ケミカル社
）とによっても処理され、そして処理に続いて２４時間後に上記で概説したよう
にして収穫された。所定のいずれの実験にも同一腹（litter）を表すマウス由来
の繊維芽細胞が用いられた。細胞の４つの皿を各実験条件（対照、ハイポキサン
チン／キサンチンオキシダーゼ、およびハイポキサンチン／キサンチンオキシダ
ーゼ＋カタラーゼ）について使用し、そして実験を２回ずつ繰り返して各実験条
件について合計８つの値を得た。
キサンチン／キサンチンオキシダーゼと、９０分間同時インキュベートされた１
０，０００Ｕ／ｍＬのカタラーゼ（ＭＯ州、セントルイスのシグマ・ケミカル社
）とによっても処理され、そして処理に続いて２４時間後に上記で概説したよう
にして収穫された。所定のいずれの実験にも同一腹（litter）を表すマウス由来
の繊維芽細胞が用いられた。細胞の４つの皿を各実験条件（対照、ハイポキサン
チン／キサンチンオキシダーゼ、およびハイポキサンチン／キサンチンオキシダ
ーゼ＋カタラーゼ）について使用し、そして実験を２回ずつ繰り返して各実験条
件について合計８つの値を得た。
【００１６】 ハイポキサンチン／キサンチンオキシダーゼ、およびハイポキサンチン／キサ
ンチンオキシダーゼ＋カタラーゼの細胞生存率に及ぼす影響を、トリパンブルー
（ＭＯ州、セントルイスのシグマ・ケミカル社）排除法（ジョン・ウィレイ・ア
ンド・サンズ社［John Wiley & Sons, Inc.］（ニューヨーク［New York］）の
刊行（１９９２年）になるオースベル［Ausubel］等の著作・分子生物学におけ
る簡略プロトコル［Short protocols in molecular biology］、第２版、第１
１−２４頁）を用いて調べ、そしてそのデータの統計評価のために対ｔ−検定（
paired t-test analysis）を行った。
ンチンオキシダーゼ＋カタラーゼの細胞生存率に及ぼす影響を、トリパンブルー
（ＭＯ州、セントルイスのシグマ・ケミカル社）排除法（ジョン・ウィレイ・ア
ンド・サンズ社［John Wiley & Sons, Inc.］（ニューヨーク［New York］）の
刊行（１９９２年）になるオースベル［Ausubel］等の著作・分子生物学におけ
る簡略プロトコル［Short protocols in molecular biology］、第２版、第１
１−２４頁）を用いて調べ、そしてそのデータの統計評価のために対ｔ−検定（
paired t-test analysis）を行った。
【００１７】 実施例３：CAT検定 トランスジェニックマウスの皮膚中、およびこれらの動物から確立された線維
芽細胞培養物中のヒトエラスチンプロモーター／CATレポーター遺伝子構成の発
現を測定するために、CAT活性を定量した。皮膚からCATを抽出するために、それ
らの標本を、ｐＨ７．５の０．２５トリス（Tris）−HCl中で、組織ホモジナイ
ザー（ＮＹ州、ウエストベリー［Westbury］のブリンクマン・インスツルメンツ
社［Brinkmann Instruments, Inc.］）を用いて均質化させた。その均質化物を
１０，０００Ｘｇにおいて４℃で１５分間遠心分離し、そしてその上澄液中の蛋
白質濃度を市販の蛋白質検定キット（ＣＡ州、リッチモンド［Richmond］のバイ
オ−ラド・ラボラトリーズ社［Bio-Rad Laboratories］）で定量した。周知の方
法による［14Ｃ］クロラムフェニコールと共にインキュベートすることによるCA
T活性の検定に、１００μｇの蛋白質を含んでいる上記上澄液のアリコットを用
いた。放射性クロラムフェニコールのアセチル化体および非アセチル化体を薄層
クロマトグラフィーにより分離し、そしてそのアセチル化体中の放射能によりCA
T活性を各試料中の総放射能のパーセントとして求めた。
芽細胞培養物中のヒトエラスチンプロモーター／CATレポーター遺伝子構成の発
現を測定するために、CAT活性を定量した。皮膚からCATを抽出するために、それ
らの標本を、ｐＨ７．５の０．２５トリス（Tris）−HCl中で、組織ホモジナイ
ザー（ＮＹ州、ウエストベリー［Westbury］のブリンクマン・インスツルメンツ
社［Brinkmann Instruments, Inc.］）を用いて均質化させた。その均質化物を
１０，０００Ｘｇにおいて４℃で１５分間遠心分離し、そしてその上澄液中の蛋
白質濃度を市販の蛋白質検定キット（ＣＡ州、リッチモンド［Richmond］のバイ
オ−ラド・ラボラトリーズ社［Bio-Rad Laboratories］）で定量した。周知の方
法による［14Ｃ］クロラムフェニコールと共にインキュベートすることによるCA
T活性の検定に、１００μｇの蛋白質を含んでいる上記上澄液のアリコットを用
いた。放射性クロラムフェニコールのアセチル化体および非アセチル化体を薄層
クロマトグラフィーにより分離し、そしてそのアセチル化体中の放射能によりCA
T活性を各試料中の総放射能のパーセントとして求めた。
Claims (2)
- 【請求項１】 酸化的損傷を抑制または防止することが可能な薬剤を同定す
るためのインビトロシステムであって、 ヒト−エラスチンプロモーターを発現することが可能なトランスジェニックマ
ウスに由来するマウス線維芽細胞培養物；および 上記マウス線維芽細胞培養物内に反応性酸素種を生成させる作用物質 を含んで成る上記のインビトロシステム。 - 【請求項２】 酸化的損傷を抑制または防止することが可能な薬剤を同定す
る方法であって、 酸化的損傷に対して保護を与えると推測される試験薬剤を、ヒト−エラスチン
プロモーターを発現することが可能なトランスジェニックマウスに由来するマウ
ス線維芽細胞培養物に加え； 反応性酸素種の生成作用物質を上記マウス線維芽細胞培養物に加え； 選択されたある一定時間後に、上記試験薬剤に曝露された上記マウス線維芽細
胞培養物中のヒト−エラスチンプロモーター活性を測定し；そして 上記試験薬剤に曝露された上記マウス線維芽細胞培養物中の測定されたヒト−
エラスチンプロモーター活性を、対照線維芽細胞培養物中のヒト−エラスチンプ
ロモーター活性と比較する 工程を含んで成り、この場合上記の測定されたヒト−エラスチンプロモーター活
性の減少が、上記試験薬剤が酸化的損傷を抑制または防止していることを示す、
上記の同定方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12141899P | 1999-02-23 | 1999-02-23 | |
| US60/121,418 | 1999-02-23 | ||
| PCT/US2000/004438 WO2000049876A1 (en) | 1999-02-23 | 2000-02-22 | System and method for evaluating agents which prevent oxidative damage |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002541774A true JP2002541774A (ja) | 2002-12-10 |
Family
ID=22396604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000600496A Pending JP2002541774A (ja) | 1999-02-23 | 2000-02-22 | 酸化的損傷を防止する薬剤を評価するためのシステムと方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1162886A4 (ja) |
| JP (1) | JP2002541774A (ja) |
| AU (1) | AU760969B2 (ja) |
| CA (1) | CA2362904A1 (ja) |
| WO (1) | WO2000049876A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2437498A1 (en) * | 2001-02-05 | 2002-08-15 | Shen Quan Pan | Methods and kits for identifying scavengers of reactive oxygen species (ros) |
| EP2392674A3 (en) * | 2005-04-29 | 2012-03-07 | The University of Tennessee Research Foundation | Cellular biomarker antioxidant assay and uses thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2219976A1 (en) * | 1995-05-24 | 1996-11-28 | Eric Bernstein | An in vivo and in vitro model of cutaneous photoaging |
| US5648061A (en) * | 1995-05-24 | 1997-07-15 | Thomas Jefferson University | In vivo and in vitro model of cutaneous photoaging |
| US5840734A (en) * | 1997-05-06 | 1998-11-24 | Thomas Jefferson University | Use of tempol in the prevention of photoaging |
| US6066327A (en) * | 1997-12-17 | 2000-05-23 | Color Access, Inc. | Antioxidant mixture |
-
2000
- 2000-02-22 EP EP00910266A patent/EP1162886A4/en not_active Withdrawn
- 2000-02-22 JP JP2000600496A patent/JP2002541774A/ja active Pending
- 2000-02-22 CA CA002362904A patent/CA2362904A1/en not_active Abandoned
- 2000-02-22 WO PCT/US2000/004438 patent/WO2000049876A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-02-22 AU AU32388/00A patent/AU760969B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1162886A4 (en) | 2003-02-12 |
| AU3238800A (en) | 2000-09-14 |
| AU760969B2 (en) | 2003-05-22 |
| WO2000049876A1 (en) | 2000-08-31 |
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| CA2362904A1 (en) | 2000-08-31 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040709 |