【発明の詳細な説明】
組み換えプロテウス ブルガリス(Proteus vulgaris)株におけるコンドロイチナ
ーゼの産生
発明の分野
本発明は、コンドロイチン硫酸のような天然の外因性のコンドロイチナーゼＩ
およびIIのインデューサーの非存在下にプロテウス ブルガリス(Proteus vulga ris
)細胞での大量のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼIIタンパク
質の産生をコードするプラスミドの調製、同定および単離に関する。
発明の背景
コンドロイチナーゼは、ヒトの眼の網膜と硝子体との間の接着を媒介するプロ
テオグリカンの成分、コンドロイチン硫酸に作用する細菌起源の酵素である。コ
ンドロイチナーゼ酵素の例は、細菌プロテウス ブルガリス(Proteus vulgaris)
(P．vulgaris)により産生されるコンドロイチナーゼＡＢＣ、およびＡ．アウレ
センス(A．aurescens)により産生されるコンドロイチナーゼＡＣである。コンド
ロイチナーゼＡＢＣおよびＡＣは、タンパク質コアを分解することなく、タンパ
ク質−多糖複合体中の多糖側鎖を分解することにより機能する。
ヤマガタ(Yamagata)ら（J．Biol．Chem．243:1523-1535、1968）は、Ｐ．ブル
ガリス(P．vulgaris)の抽出物からのコンドロイチナーゼＡＢＣの精製を記述す
る。この酵素は、それがコンドロイチンもしくはヒアルロン酸を分解するより大
きな速度で、ｐＨ８でグルコサミノグリカン、コンドロイチン４-硫酸、デルマ
タン硫酸およびコンドロイチン６-硫酸
（それぞれコンドロイチン硫酸Ａ、Ｂ、およびＣとも称され、これらはプロテオ
グリカンの側鎖である）を選択的に分解する。分解生成物は、高分子量の不飽和
のオリゴ糖および不飽和の二糖である。しかしながら、コンドロイチナーゼＡＢ
Ｃはケラト硫酸、ヘパリンもしくはヘパリン硫酸に作用しない。
コンドロイチナーゼの使用は、それにより硝子体の除去を促進する、硝子体の
眼の神経網膜への接着の迅速で特異的かつ非外科的な破裂を包含する。例えばヘ
イグマン(Hageman)、米国特許第5,292,509号を参照。
コンドロイチナーゼＡＢＣは本発明でコンドロイチナーゼＩと称される。Ｐ．
ブルガリス(P．vulgaris)のコンドロイチナーゼＩは、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分
離される場合に約110kDaの見かけの分子量で移動する。コンドロイチナーゼＩの
ＳＤＳ-ＰＡＧＥの分離での二重線の出現が報告されている（サトー(Sato)ら、A
gric．Biol．Chem．50:4、1057-1059、1986）。しかしながら、この二重線は、
無傷のコンドロイチナーゼＩおよび90kDaの分解生成物を表す（1995年４月24日
に申請された米国特許出願第08/431,068号、同第08/428,949号、同第08/428,946
号、同第08/428,948号、同第08/428,945号および同第08/428,947号を参照（代理
人ドケット第0646/1B017US1-0646/1B017US6号）、係属中）。商業的なコンドロ
イチナーゼＩタンパク質調製物は、変化しやすい量のこの90kDaの分解生成物お
よび付加的な18kDaの分解生成物を含有する。
別のコンドロイチナーゼすなわちコンドロイチナーゼIIもまたＰ．ブルガリス
(P．vulgaris)から単離されそして精製されている。コンドロイチナーゼIIは、
約112kDaのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる見かけの分子量をもつ990アミノ酸のポリペプ
チドである。電子スプレーおよびレーザー
ディソープションの質量分析法により決定される場合その分子量はそれぞれ111,
772±27および111,725±20ダルトンである。コンドロイチナーゼIIは8.4〜8.45
の等電点を有する。その酵素活性はコンドロイチナーゼＩのものと異なるがしか
しこれに相補的である。コンドロイチナーゼＩは、プロテオグリカンをエンド分
解的に(endolytically)切断してエンド生成物の二糖、ならびに、四糖であると
考えられる最低２種の他の生成物を生成する。コンドロイチナーゼIIは、プロテ
オオグリカンのコンドロイチナーゼＩ分解のこれらの四糖生成物の最低１種を分
解する。
天然のすなわち野生型のＰ．ブルガリス(P．vulgaris)細菌株は、典型的には
、通常の成育条件下で有意量のコンドロイチナーゼＩおよびIIを産生しない。Ｐ
．ブルガリス(P．vulgaris)の野生型株は、唯一の炭素源としてコンドロイチン
硫酸のような誘導基質を提供することにより、検出可能なレベルのコンドロイチ
ナーゼを産生するよう誘導され得る。しかしながら、サメの軟骨から得られるコ
ンドロイチン硫酸は高価であり、また、制限された量でのみ入手可能である。あ
るいは、大腸菌(E.coli)中のクローニングされたコンドロイチナーゼＩおよび
IIの遺伝子が人工的インデューサーを含む異種発現系を使用して発現され得、こ
れもまたコンドロイチナーゼＩおよびIIの産生の費用を増加させる。
かように、当該技術分野において、外因性インデューサーを必要としない、Ｐ
．ブルガリス(P．vulgaris)のコンドロイチナーゼＩおよびIIの産生の必要が存
在する。
発明の要約
コンドロイチナーゼＩおよびIIをコードするプラスミドｐＬＰ2-１５
３１ならびにコンドロイチナーゼＩをコードするプラスミドｐＬＰ2-１５２１が
提供される。これらのプラスミドは、野生型の大腸菌(E．coli)およびＰ．ブル
ガリス(P．vulgaris)細胞を形質転換するのに使用される。形質転換された細胞
は、天然の外因性のコンドロイチナーゼＩおよびIIのインデューサーの非存在下
にコンドロイチナーゼＩおよびIIもしくはコンドロイチナーゼＩの産生をコード
するＤＮＡを産生する。加えて、形質転換されたＰ．ブルガリス(P．vulgaris)
細胞は、外因性のコンドロイチナーゼＩおよびIIのインデューサーの非存在下に
、外因性のコンドロイチナーゼＩおよびIIのインデューサー（１種もしくは複数
）の存在下で野生型Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)により産生される量の過剰の
量でそれぞれの酵素を産生する。
出発プラスミドｐＬＰ2-７５１および中間プラスミドｐＬＰ2-７７０、ｐＬＰ2
-１５１２、ｐＬＰ2-１２６３、ｐＬＰ2-１５０８、ｐＬＰ2-１５１０、ｐＬＰ2
-１５１４、ｐＬＰ2-１５１８およびｐＬＰ2-１５２５もまた提供される。これ
らの中間プラスミドは、典型的に、ｐＬＰ2-１５３１およびｐＬＰ2-１５２１の
調製で使用される。ｐＬＰ2-１５１２由来の約3970bpのBglII/EcoRI断片、ｐＬ
Ｐ2-１５１４由来の約2550bpのEcoRI/SmaI断片、およびｐＬＰ2-１５１８由来の
約6520bpのBglII/SmaI(AvaＩ)断片がさらに開示される。
コンドロイチナーゼＩおよび／もしくはIIを産生するための形質転換されたＰ
．ブルガリス(P．vulgaris)細胞の使用もまた企図される。上のＰ．ブルガリス(P
．vulgaris)細胞は細菌培養培地中および外因性のコンドロイチナーゼＩおよび
IIのインデューサーの非存在下で培養される。細胞はその後培養系から収穫され
、そしてコンドロイチナーゼＩお
よび／もしくはII酵素が回収される。好ましくは、コンドロイチナーゼＩおよび
IIは、
（ａ）収穫されたＰ．ブルガリス(P．vulgaris)の不純物を除去されたホモジ
ェネートを調製すること、このホモジェネートは5.8ないし7.4のｐＨを有する；
（ｂ）このホモジェネートを、ホモジェネート中のコンドロイチナーゼＩおよ
びコンドロイチナーゼIIを含むいかなる正に荷電されたタンパク質も負に荷電さ
れた支持体と非共有結合を形成するように、負に荷電された陽イオン交換樹脂ク
ロマトグラフィー支持体上に負荷すること；
（ｃ）ｐＨ7.0〜9.5で、コンドロイチン硫酸の水溶液を用い、支持体からコン
ドロイチナーゼタンパク質を合わせて親和性で溶出すること；
（ｄ）親和性で溶出されたタンパク質を合わせたものを陰イオン交換樹脂クロ
マトグラフィー支持体上に負荷して結合されない溶出物を得ること；そして
（ｅ）結合されない溶出物中のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナー
ゼIIタンパク質を回収すること、
により回収される。
タンパク質は金属キレート形成クロマトグラフィーによりさらに精製され得る
。
図面の簡単な説明
第１図はｐＬＰ2-７５１からのｐＬＰ2-１５１８の調製法の概要の図解である
。
第２図はｐＡＣＹＣ１８４およびｐＬＰ2-１５１８からのｐＬＰ2-１５３１の
調製法の概要の図解である。
発明の詳細な説明
本発明は、プロテウス ブルガリス(Proteus vulgaris)での大量のコンドロイ
チナーゼＩおよびIIタンパク質を産生するための構築物および方法を包含する。
コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼII
コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼIIは、プロテオグリカンに存
在するものを包含するコンドロイチン硫酸の分解を触媒するＰ．ブルガリス(P．vulgaris
)により産生される酵素である。各酵素の物理的および酵素的特徴が第
１表中に要約される。
野生型Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)株
Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)の野生型株は、唯一の炭素源としてコンドロイ
チン硫酸のような外因性のコンドロイチナーゼＩおよびIIのインデューサーを含
有する培養系で成育される場合にのみ、検出可能なレベルの酵素的に活性のコン
ドロイチナーゼＩおよびIIを容易に蓄積する。
例えば、多くの炭素源を含有する栄養培地(rich medium)中、もしくは唯一の炭
素源として例えばグルコースを含有する最小培地中のような、そうしたインデュ
ーサーのない培地中でのＰ．ブルガリス(P．vulgaris)の野生型株の成育は、コ
ンドロイチナーゼＩもしくはIIの活性の些細なもしくは検出可能でない蓄積をも
たらす。
構築物
コンドロイチナーゼＩタンパク質およびコンドロイチナーゼIIタンパク質の双
方をコードする遺伝子は、EcoRI切断部位により隣接された長さ約30kbのＰ．ブ
ルガリス(P．vulgaris)のゲノムＤＮＡ配列上に存在し、これはＬＰ2-７５１と
称されるコスミドクローン内に含有される（下の実施例１を参照）。本発明によ
り、Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)のコンドロイチナーゼＩおよび／もしくはコ
ンドロイチナーゼIIタンパク質（１種もしくは複数）をコードするＤＮＡが、Ｐ
．ブルガリス(P．vulgaris)細胞で複製するプラスミド中にクローニングされる
。好ましくは、このプラスミドは、コンドロイチナーゼＩおよびIIの遺伝子が、
構成プロモーターとしてはたらく配列のすぐ３’に置かれるように工作される。
プロモーターは、プロモーター配列のすぐ下流すなわち３’に配置される遺伝子
配列の転写を刺激するＤＮＡ配列である。構成プロモーターは、外因性の転写イ
ンデューサーの存在に独立に、下流の配列（例えばコンドロイチナーゼＩおよび
／もしくはIIをコードする配列）の転写を刺激するＤＮＡ配列である。
本発明のプロモーターもしくは構成プロモーターは、そのプロモーター配列が
例えばコンドロイチン硫酸のような外因性のインデューサーによる発現の誘導に
関与する調節配列が存在しないかもしくは機能性でな
いように工作される場合には、野生型Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)細胞でコン
ドロイチナーゼＩ遺伝子の上流に典型的に存在する本来のコンドロイチナーゼＩ
プロモーター由来でありうる。あるいは、コンドロイチナーゼＩおよびIIの遺伝
子が連結されるプロモーターは、他のＰ．ブルガリス(P．vulgaris)遺伝子のプ
ロモーター領域、もしくは、例えば、Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)中での例え
ばクロラムフェニコール、テトラサイクリンおよびアンピシリンのような抗生物
質に対する耐性を分け与える大腸菌(E．coli)の遺伝子のプロモーター領域のよ
うな、Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)での転写を刺激する別の既知の構成プロモ
ーターを含みうる。相同のコンドロイチナーゼプロモーターの配列もしくは異種
プロモーターの配列の双方は、当該技術分野でよく知られている組み換えＤＮＡ
法を使用して、欠失、挿入および置換により変更されうる（例えば、マニアテイ
ス(Maniatis)ら、Molecular Cloning、コールド スプリング ハーバー ラボ
ラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、1982を参照）。
上に記述されるような、プロモーターに連結されたコンドロイチナーゼＩおよ
び／もしくはコンドロイチナーゼIIのコーディング配列に加え、本発明での使用
に適するプラスミドは、そのプラスミドがＰ．ブルガリス(P．vulgaris)中で高
コピー数まで複製することを可能にする配列、ならびに選択可能なマーカーをコ
ードする配列を包含する。選択可能なマーカーは、テトラサイクリン、アンピシ
リン、クロラムフェニコール、カナマイシンもしくはストレプトマイシンに対す
る耐性を分け与える遺伝子産物を含みうる。好ましくは、コンドロイチナーゼＩ
および／もしくはIIをコードするプラスミドは、例えばクロラムフェニコールア
セチ
ルトランスフェラーゼのようなクロラムフェニコール耐性の特徴をコードする遺
伝子を包含する。適するプラスミドの例は、制限なしに、ｐＢＲ３２２、ｐＮＥ
Ｂ１９３、ｐＵＣ１９およびそれらからの誘導体（ニューイングランド バイオ
ラブス(New England Biolabs)、マサチューセッツ州ビバリー）を包含する。
構成プロモーターの制御下にコンドロイチナーゼＩおよび／もしくはコンドロ
イチナーゼIIタンパク質をコードするプラスミドがＰ．ブルガリス(P．vulgaris
)細胞中に導入される。適する宿主細胞は、野生型Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)
（例えばＡＴＣＣ株６８９６）、1995年６月７日に申請された米国特許出願第08
/476,261号に記述されるもののような突然変異Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)株
（代理人ドケット第0646/0BI23）を制限なしに包含する、Ｐ．ブルガリス(P．vu lgaris
)のいかなる株も包含する。プラスミドの導入は、例えば電気穿孔法もし
くはカルシウムに媒介される細胞の浸透化のような当該技術分野でよく知られた
いずれかのＤＮＡ形質転換法により達成されうる。好ましくは、電気穿孔法が、
Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)宿主細胞へのＤＮＡの効果的な取り込みを達成す
るのに使用される。
有用かつ好ましい構成プロモーターの選択を包含する、有用かつ好ましいコン
ドロイチナーゼＩおよび／もしくはIIをコードするプラスミドの選択は、各プラ
スミドで個々のＰ．ブルガリス(P．vulgaris)培養系を形質転換すること、形質
転換体を選択すること、ならびに、形質転換体を、それらのコンドロイチナーゼ
Ｉおよび／もしくはコンドロイチナーゼIIの産生について分析することにより達
成される。相対的なコンドロイチナーゼ産生の予備的評価（例えばプロモーター
の欠失の収められ
た(nested)組が分析される場合のような）のためには、コロニースクリーニング
法が使用され得る。
一態様において、本来のコンドロイチナーゼＩの上流領域（仮定のプロモータ
ーを包含する）は、例えば、Bal31でのエキソ核酸分解的(exonucleolytic)切断
をかけられて５’欠失突然変異体の収められた組を生じる。突然変異体の混合物
がＰ．ブルガリス(P．vulgaris)を形質転換するのに使用される。クローンのラ
イブラリーが、外因性のインデューサーの非存在下に広げられそしてコンドロイ
チナーゼの産生についてのスクリーニングをかけられる。
適するスクリーニング法は、コンドロイチナーゼ特異的な抗体に結合するかま
たはコンドロイチン硫酸もしくはプロテオグリカンの分解を触媒するかのいずれ
かのコロニーを検出するものを包含するがしかしこれらに制限されない。コロニ
ーイムノブロッティングアッセイは、例えば、ハーロウ(Har1ow)とレーン(Lane)
、Λntibodies，A Laboratory Manual、コールド スプリング ハーバー ラボ
ラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)(1988)に開示されるもののようなよ
く知られた方法を使用する。コンドロイチナーゼの酵素活性に依存する検出アッ
セイは、制限なしに、下に記述されるコンドロイチン枯渇法およびコンドロイチ
ンもしくはコンドロイチン加水分解を検出する比色アッセイを包含する。いずれ
のスクリーニング法（イムノブロッティングおよびコンドロイチン枯渇）も、最
初の同定およびその後の構成する突然変異細胞のコロニー精製の段階のいずれで
も使用され得る。
一態様において、抗体に基づくスクリーニング法が、例えばコンドロイチン硫
酸のような外因性のインデューサーが培養培地に存在しない場
合でさえ、以下のように、コンドロイチナーゼＩおよびIIを産生するＰ．ブルガ
リス(P．vulgaris)のコロニーを同定するのに使用される。すなわち、
（１）Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)培養系を、栄養培地またはコンドロイチ
ン硫酸および／もしくはＮ-アセチルガラクトサミンを欠くカザミノ酸補充最小
培地のいずれかを含有するアガープレート上に置かれるフィルター上に接種する
。このフィルターは、ナイロン、紙、ニトロセルロース、もしくは二フッ化ポリ
ビニリジエン、好ましくはニトラン(NYTRAN)（シュライヒャー アンド シュエ
ル(Schleicher & Schuell)、ニューハンプシャー州キーン）から成りうる。この
段階に至適なコロニー密度はプレートあたり約1000である。
（２）フィルターをその後、コンドロイチナーゼのポリペプチドが細胞から放
出されそしてフィルター上に固定されるようになるように、プレートから、フィ
ルター上の細胞を浸透しかつ分解する溶液に移す。
（３）フィルターをその後、例えば、ヤギ抗コンドロイチナーゼＩ抗体および
／もしくはウサギ抗コンドロイチナーゼII抗体のような、コンドロイチナーゼＩ
および／もしくはコンドロイチナーゼIIに対し向けられる特異的な抗体とともに
インキュベーションする。
（４）最後に、特異的に結合された抗体を、いずれかの酵素、蛍光、放射活性
もしくは当該技術分野でよく知られた他の検出手段を使用して検出する。
ヤギ抗コンドロイチナーゼＩ抗体は、（ａ）1994年４月22日に申請された米国
特許出願第08/231,534号に記述される精製方法を使用して、過剰発現プラスミド
（1994年４月22日に申請された米国特許出願第08/233,
008号、下で'008出願、に開示されるような）からのコンドロイチナーゼＩを発
現する大腸菌(E．coli)株からＰ．ブルガリス(P．vulgaris)のコンドロイチナー
ゼＩを精製すること、および（ｂ）精製されたコンドロイチナーゼＩをフロイン
トのアジュバントと混合しそして生じる乳剤をヤギに接種すること、により調製
される。ウサギ抗コンドロイチナーゼII抗体は、（ａ）過剰発現するプラスミド
（'008出願に開示されるような）からのコンドロイチナーゼIIを発現する大腸菌
(E．coli)株からＰ．ブルガリス(P．vulgaris)のコンドロイチナーゼIIを精製す
ること、および（ｂ）精製されたコンドロイチナーゼIIをフロイントのアジュバ
ントと混合しそして生じる乳剤をウサギに接種すること、により調製される。抗
体の精製および分析の手順は当該技術分野でよく知られるものである。
抗体スクリーニングの好ましい態様において、Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)
のコロニーは、「20-10-5」培地を含有するアガープレート上に置かれるニトラ
ンフィルター上で成育される。この培地は20g/1のトリプトン、10g/1の酵母エキ
ス、および５g/1の塩化ナトリウムを包含する。ウシ血清アルブミンの溶液を細
菌のコロニーを含有するフィルターに噴霧してバックグラウンド部位をブロッキ
ングした後、フィルターを液体クロロホルムに数時間浮かせるかもしくはクロロ
ホルムに浸された紙の上に置き、コンドロイチナーゼを遊離させ、そしてそれら
をコンドロイチナーゼを産生するコロニーのすぐ近くでフィルターに結合させる
。洗浄されたフィルターをその後、（１）ヤギ抗コンドロイチナーゼＩ抗体、（
２）ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ抗体(バイオラッド(BioRad))、そして（
３）フィルターに結合されたペルオキシダーゼを可視化するた
めの発色試薬（バイオラッド(BioRad)）、とともに連続的にインキュベーション
する。同時に、コロニー精製された形質転換された野生型Ｐ．ブルガリス(P．vu lgaris
)細胞を、コンドロイチン硫酸を欠くおよび含有する培地上で成育させて
、スクリーニング手順のそれぞれネガティブコントロールおよびポジティブコン
トロールとしてはたらかせる。
このアッセイを使用して検出可能な量のコンドロイチナーゼＩおよび／もしく
はIIを表すコロニーを拾い、希釈し、プレート上に再接種し、そして検出処置全
体を反復する。数周期のコロニー精製を、この様式で、各個々の株の純粋な培養
系が得られるまで実行する。
別の態様において、コンドロイチン枯渇アッセイが、コンドロイチナーゼＩお
よび／もしくはIIを産生するコロニーを同定するのに使用される。この手順では
、突然変異誘発されたＰ．ブルガリス(P．vulgaris)培養系を、上に記述される
ようにフィルター上に接種し、そしてこのフィルターを、栄養培地もしくはコン
ドロイチン硫酸を欠くカザミノ酸補充最小培地のいずれかを含有するアガープレ
ート上に置く。一夜成育の後、フィルターを、５mgコンドロイチン硫酸/mlおよ
びフィルターに結合された細菌のコロニーでのタンパク質合成を阻害するのに有
効な濃度でのタンパク質合成阻害剤好ましくは100μg/mlテトラサイクリンを補
充されたアガーを含有するプレートに移す。約４ないし約８時間インキュベーシ
ョンの後、フィルターを取り除き、そして、プレートにそれぞれ約10mlの0.5％
塩化セチルピリジニウム（シグマ ケミカル カンパニー(Sigma Chemical Co.)
、ミズーリ州セントルイス）を多量に注ぐ。この処理は、コンドロイチン硫酸に
、アガー内で濁った沈殿物を形成させる。コンドロイチナーゼＩおよびIIを合成
するコロニーは、眼により容易に
見えるようにされるコロニーを取り巻く明かな透明の帯を生じる。
外因性のインデューサー、コンドロイチン硫酸もしくはＮ-アセチルガラクト
サミンの非存在下でコンドロイチナーゼＩおよびIIの検出可能な産生を提供する
、上のスクリーニングアッセイにより出現するコンドロイチナーゼをコードする
プラスミドが、定量的様式でコンドロイチナーゼの産生について分析される。個
々のコロニーを、小スケール（３〜５ml）の醗酵培養系中に接種し、そして振と
うしながら30〜37℃でインキュベーションする。サンプルを、成育の開始後異な
る時点で取り出し、細胞をフレンチ・プレスを使用して破裂させ、そしてコンド
ロイチナーゼタンパク質の量および酵素活性を細胞のホモジェネートで測定する
。有用なプラスミドは、細菌培養系のＡ600単位あたり最低0.2コンドロイチナー
ゼ活性単位の産生をもたらすものである。好ましくは、本発明のプラスミドを使
用するコンドロイチナーゼＩおよび／もしくはコンドロイチナーゼIIの発現は、
細菌培養系のＡ600単位あたり最低0.5コンドロイチナーゼ活性単位の産生をもた
らす。
精製
形質転換されたＰ．ブルガリス(P．vulgaris)株により産生されたコンドロイ
チナーゼＩおよびII酵素は、均質性まで（すなわちコンドロイチナーゼＩおよび
IIの純粋な混合物を得ること）共精製されることができ、そして、共精製された
酵素は例えば硝子辺縁部網膜剥離での使用に適する。
多様な方法が、天然のコンドロイチナーゼＩおよびIIを単離しそして精製する
のに使用され得るとは言え、好ましいアフィニティークロマトグラフィーは、
（ａ）突然変異のＰ．ブルガリス(P．vulgaris)細胞の不純物を除去されたホ
モジェネートを調製すること、このホモジェネートは5.8ないし7.4のｐＨを有す
る、
（ｂ）このホモジェネートを、ホモジェネート中のコンドロイチナーゼＩおよ
びコンドロイチナーゼIIを含むいかなる正に荷電されたタンパク質も負に荷電さ
れた支持体と非共有結合を形成するように、負に荷電された陽イオン交換樹脂ク
ロマトグラフィー支持体上に負荷すること、
（ｃ）ｐＨ7.0〜9.5で、コンドロイチン硫酸の水溶液を用い、支持体からコン
ドロイチナーゼタンパク質を合わせて親和性で溶出すること、
（ｄ）親和性で溶出されたタンパク質を合わせたものを陰イオン交換樹脂クロ
マトグラフィー支持体上に負荷して結合されない溶出物を得ること、そして
（ｅ）結合されない溶出物中のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナー
ゼIIタンパク質を回収すること、
を包含する。
タンパク質は、
（１）結合されない溶出物を、金属キレート形成アフィニティークロマトグラ
フィー支持体と接触させてコンドロイチナーゼタンパク質をさらに結合させるこ
と、
（２）適切な溶媒で溶出すること、そして
（３）コンドロイチナーゼタンパク質を回収すること、
による金属キレート形成クロマトグラフィーによりさらに精製され得る。
所望される場合は、共精製されたタンパク質は、さらなる陽イオン交換クロマ
トグラフィーを必要とする付加的な処理段階により相互から分
離され得る。個々に精製されたタンパク質は、共精製処置により得られたものと
別の比で使用され得る。
好ましい態様の記述
以下の実施例は制限なしに本発明を例証する。全てのクローニング段階は別に
指摘されない限り大腸菌(E．coli)でである。
実施例１：Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)におけるコンドロイチナーゼＩおよびI
Iの発現のためのプラスミドの構築
Ａ．コンドロイチナーゼＩおよびIIタンパク質をコードするＤＮＡ断片の組み立
て
全体の戦略は、コンドロイチナーゼＩおよびIIの遺伝子を含有するがしかし上
流の調節領域の大部分を欠くＤＮＡ断片を創製することであった。最終的な断片
は、それが適切に置かれたBglIIおよびSmaIの切断部位を含有するプラスミドベ
クター中に挿入され得るように、BglII-SmaI切断部位により隣接されることが所
望された。コンドロイチナーゼ領域は最初は半分で工作され、そしてその後再集
成されてこの結果を達成した。
BglII-SmaI断片の構築で使用された段階が第１図に図解される。この図で、コ
ンドロイチナーゼＩをコードするＤＮＡは「１１０Ｋ」と称され、また、コンド
ロイチナーゼIIをコードするＤＮＡは「１１２Ｋ」と称される。
出発プラスミドはｐＬＰ2-７５１と称されるコスミドクローンであった。これ
はEcoRI切断部位により隣接される−30kbのＰ．ブルガリス(P. vulgaris)ゲノム
ＤＮＡ挿入物を含有する。この挿入物は内部EcoRI切断部位を含有するため、Eco
RI切断は20kbおよび10kbの２個のEcoRI断片
としての挿入されたＤＮＡの回収をもたらし、これらはそれぞれ任意に左および
右と称される。コンドロイチナーゼＩ遺伝子全体は20kbのＤＮＡ断片の右側末端
に配置される。コンドロイチナーゼII遺伝子はコンドロイチナーゼＩ遺伝子の右
のすぐ下流に配置される。この遺伝子の近接部分は20kbのEcoRI断片の一番右の
端にある一方、この遺伝子の残存する遠位部分は10kbのEcoRI断片上にある。コ
ンドロイチナーゼII遺伝子のコーディング配列は右方に伸長し、そしてEcoRI切
断部位の右に約2300bpで終わる。さらにおよそ240bp下流が唯一のSmaI切断部位
である。
ｐＬＰ2-７５１はまた、コンドロイチナーゼＩ遺伝子全体およびコンドロイチ
ナーゼII遺伝子の近接部分を含有する10kbのNsiI断片も含有する。この断片はｐ
Ｌｐ2-７５１の20kbのEcoRI断片の右側に位置するが、しかし隣接する10kbのEco
RI断片内にさらに400bp右に伸長する。従って、10kbのNsiI断片は上に記述され
る内部EcoRI切断部位を含有する。
ｐＬＰ2-７５１からの重なり合う10kbのNsiIおよび10kbのEcoRIの断片を以下
のようにサブクローニングした。ｐＬｐ2-７５１をNsiIで切断し、そして、10kb
のNsiI断片を単離しそしてNsiIリンカーを含有するｐＩＢＩ２４誘導体（インタ
ーナショナル バイオテクノロジーズ インク(International Biotechnolgies
，Inc.)、コネティカット州ニューヘイヴン）中にクローニングした。この段階
はＬＰ2-７７０と称されるプラスミドを生じた(第１図)。ｐＬＰ2-７７０をその
後、EcoRVで切断して、コンドロイチナーゼＩ遺伝子の５'末端に、コンドロイチ
ナーゼのオペロンの調節遺伝子およびこれらのタンパク質の調節結合部位のおそ
らく全部もしくは一部をたぶん含有する、約3700bpの配列決定されない上流のＤ
ＮＡを除去した。EcoRV末端を脱リン酸化し、その後、BglIIリ
ンカーを脱リン酸化された末端に連結した。生じるプラスミドをＬＰ2-１５１２
と称した。BglII切断部位のすぐ下流は、ヌクレオチド40および62で開始する仮
定されるコンドロイチナーゼのプロモーターの−35および−10要素であった。コ
ンドロイチナーゼＩの開始コドンはヌクレオチド119にある。コンドロイチナー
ゼＩの終止コドンはヌクレオチド3182にあり、また、コンドロイチナーゼIIの開
始コドンは位置3238にある。このＤＮＡは位置3974にEcoRI切断部位を含有し、
プラスミドｐＬＰ2-１５１４に含有されるものに対応し（下を参照）、そして位
置4363のNsiI切断部位に伸長する。従って、ｐＬＰ2-１５１２のBglIIおよびEco
RIでの切断は、コンドロイチナーゼＩ遺伝子全体およびコンドロイチナーゼII遺
伝子の５'近接部分を含有するおよそ3970bpの断片を生じた。同時に、プラスミ
ドＬＰ2-７５１をEcoRIで切断し、そして上に記述される10kbのEcoRI断片をｐＮ
ＥＢ１９３誘導体（ニューイングランド バイオラブス(New England Biolabs)
、マサチューセッツ州ビバリー）のEcoRI切断部位にクローニングして、ＬＰ2-
１２６３と称されるプラスミドを生じた。このプラスミドをAvaIで切断しそして
自己連結し、プラスミドＬＰ2-１５１０を形成した。この段階はコンドロイチナ
ーゼIIコーディング配列の下流の約7450bpのＤＮＡを除去した。ｐＬＰ2-１５１
０をその後、唯一のベクター由来AatII切断部位で切断し、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノウ(Klenow)断片で埋め(fill in)、脱リン酸化し、そしてBglIIリンカ
ーをその部位で連結した。ＬＰ2-１５１４と称される生じるプラスミドは、コン
ドロイチナーゼII遺伝子の３'の遠位部分を含有するおよそ2550bpのEcoRI/SmaI
（AvaI）挿入物を含有する。
最後の段階で、上に記述されるようにプラスミドＬＰ2-１５１２から
単離された3970bpのBglII/EcoRI断片を、BglIIおよびEcoRIで切断されていたｐ
ＬＰ2-１５１４中にクローニングした。ＬＰ2-１５１８と称される生じるプラス
ミドは、コンドロイチナーゼＩおよびIIの遺伝子断片を含有するおよそ6520bpの
BglII-SmaI（AvaI）挿入物を有する。
Ｂ．Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)発現ベクターの構築
プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ＡＴＣＣ番号37033）を、上に記述されるBglII
-SmaI（AvaI）コンドロイチナーゼ断片の受容体としてはたらくよう工作した。
この構築の段階は第２図に示される。
ｐＡＣＹＣ１８４をAvaIで切断し、その後、末端をＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノウ(Klenow)断片を使用して埋め、脱リン酸化し、そして合成BglIIリンカーに
連結して、プラスミドＰＬ2-１５０８を形成した。このプラスミドをその後、Hi
ndIIIで切断し、埋め、脱リン酸化し、そして合成SmaIリンカーと連結して、プ
ラスミドＬＰ2-１５２５を形成した。
最後の段階で、ｐＬＰ2-１５２５をBglIIおよびAvaIで切断し、そして脱リン
酸化した。およそ2850bpの断片（複製開始点およびクロラムフェニコール耐性遺
伝子を包含する）をその後、コンドロイチナーゼＩおよびIIの断片を含有するBg
lII/AvaI挿入物に連結して、プラスミドＬＰ2-１５３１を生じた。このプラスミ
ドをもつ大腸菌(E．coli)株はＬＬ４１３６と称される。
Ｃ．コンドロイチナーゼＩの発現プラスミドの構築
コンドロイチナーゼＩのみの構築物もまた、ｐＡＣＹＣ１８４のBclI切断部位
でにBglIIリンカーを含有するｐＡＣＹＣ１８４のBglII-SphIで切断された誘導
体に、ｐＬＰ2-１５１２からのBglIIないしSphI（位置3414）断片を挿入するこ
とにより調製した。SphI切断部位はｐＡＣＹ
Ｃ１８４のテトラサイクリン耐性遺伝子の内部にある。生じるプラスミドはＬＰ2
-１５２１と称され、そして大腸菌(E．coli)株ＬＬ４０９３に含有される。
実施例２：コンドロイチナーゼＩおよびIIの発現ベクターでのプロテウス ブル
ガリス(Proteus vulgaris)の形質転換
プロテウス ブルガリス(Proteus vulgaris)株ＬＬ２４８０（野生型）および
ＬＬ２４９２（コンドロイチナーゼの構成発現を表す）を、以下の手順を使用し
てプラスミドで形質転換した。
各株の一夜培養系を、20-10-5培地に接種し、そして37℃で培養系が0.5のＡ60
0に到達するまでインキュベーションした。細胞を遠心分離により収集し、そし
て冷蒸留水中で繰り返し洗浄した。それらをその後冷20％グリセロール中で150
倍に濃縮し、そして−70℃で凍結させて保存した。
電気穿孔法を、バイオラッド ジーンパルサー(BioRad Gene Pulser)を使用し
て実行した。200μlの洗浄された細胞を１〜10μlのＤＮＡ（0.1〜2.0μgのＤＮ
Ａに対応する）と0.2cmのキュベット中で混合し、そして、200オームの抵抗体を
もつ25μファラドのコンデンサーを使用して2.4キロボルトでパルスを与えた(pu
lsed)。電気穿孔された細胞をその後、２mlの20-10-5培地中に接種し、そしてそ
の培養系を37℃で約75分間インキュベーションし、その後それらを25μg/mlのク
ロラムフェニコールを含有する20-10-5アガー上で培養した。37℃での一夜イン
キュベーションの後、クロラムフェニコール耐性のコロニーを観察した。各形質
転換体の少なくとも１個のコロニーをクロラムフェニコールアガー上に線状に塗
布した。個々のコロニーをその後、25μg/mlのクロラムフェ
ニコールを含有する20-10-5液体培地中に接種し、そして37℃で一夜成育させた
。グリセロールをその後添加しそして株を−70℃で保存した。
形質転換されたプラスミドは、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＬＰ2-１５２１およびｐ
ＬＰ2-１５３１であった。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４、ｐＬＰ2-１５２１およ
びｐＬＰ2-１５３１で形質転換された株ＬＬ２４８０はそれぞれ株ＬＬ４２０２
、ＬＬ４１９８およびＬＬ４１９２と称された。ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＬＰ2-１
５２１およびｐＬＰ2-１５３１で形質転換された株ＬＬ２４９２はそれぞれ株Ｌ
Ｌ４１１９、ＬＬ４１０７、およびＬＬ４１４２と称された。
実施例３：コンドロイチナーゼＩおよびIIの産生の分析
上の実施例２で記述されたように調製された、プラスミドで形質転換されたＰ
．ブルガリス(P．vulgaris)株を、それらのコンドロイチナーゼＩおよびIIの産
生について分析した。成育培地は25μg/mlのクロラムフェニコールを含有するカ
ザミノ酸補充最小培地であった。インキュベーションは30℃で実行し、そして、
サンプルを成育の開始後７および24時間に採取した。開始細胞濃度は約106〜107
細胞/mlであった。各場合で、細胞を遠心分離により収集し、フレンチ圧細胞で
破裂させ、そしてコンドロイチナーゼ酵素活性アッセイをかけた。培養系のＡ60 0
単位あたりの活性単位として表される結果が第２表に示される。
ｐＬＰ2-１５３１は構成のおよび調節されたの双方のプロテウス(Proteus)宿
主株でコンドロイチナーゼＩおよびIIの増加された産生を分け与える。プラスミ
ドＬＰ2-１５２１はコンドロイチナーゼＩのみの増加された産生を分け与える。
かように、調節された株ではバックグラウンドの高レベルのコンドロイチナーゼ
Ｉがみられるが、しかしコンドロイチナーゼIIは観察されない。構成株では、ｐ
ＬＰ2-１５２１は高レベルのコンドロイチナーゼＩおよび低レベルのコンドロイ
チナーゼIIを分け与える。この株でのコンドロイチナーゼIIの産生はこの遺伝子
の染色体のコピーからの発現に帰される。
上に挙げられる特許、出願、試験法、および開示は、これによりそっくりその
まま引用により組み込まれる。
本発明の多くの変形物は、上に詳述される記述に照らして当業者にそれら自身
を示唆することができる。全てのこうした明かな変形物は付録
としてつけられる請求の範囲の完全な意図される範囲内にある。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(Ｃ１２Ｎ 9/16
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 9/16
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ
，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，
ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ
Ｔ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ
，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，
ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 カンドケ，キラン・マノハー
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10954
ナヌエット・イーストアリソンアベニュー
120
(72)発明者 ルツペン，マーク・エドワード
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10923
ガーナービル・リーコート６