JPH11507325A - 血栓症を処置するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 血栓形成の疾病素因を有する患者を、アセチルサリチル酸およびクエン酸、および必要に応じて亜鉛の塩の組成物で効果的に処置する。アスピリンとクエン酸との組み合わせは、アスピリン単独よりも血小板凝集能の阻害において有意により有効であることが見出された。従って、例えば、アテローム性動脈硬化症、血管外科手術患者、または他の心臓血管疾患の予防または処置におけるヒトまたは動物の被験体の血栓症の可能性を低減するための新しい方法および組成物が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 血栓症を処置するための方法 発明の分野 本発明は、血栓症を処置するまたは予防するための方法および組成物に関する 。より詳細には、本発明は、患者の循環血液中の血小板凝集を減少させるための 方法および組成物を提供する。 発明の背景 心臓血管疾患(CVD)の罹病者の少なくとも半分が、血栓形成による主要血管閉 塞が生じるまで無徴候性である。このような事象は生命維持に必要な循環の欠損 を引き起こし、しばしば生命および四肢の生存能力を危険にさらす。 血栓形成は、損傷を受けた血管壁と凝集した血小板および活性化された凝固因 子との複雑な相互作用を包含する。循環している非活性化血小板は、正常内皮に 、または互いに付着しないが、血管の内膜内皮が破壊された場合、これらの血小 板は、露出された内皮下のコラーゲンに付着する。これが止血栓形成の第１段階 であり、内皮細胞によって産生されるフォンビルブランド(vW)因子と呼ばれるタ ンパク質の関与が必要とされる。vW因子は血管壁および血漿中の両方おいてに見 出され、血小板付着の間に血小板表面膜に存在するレセプターに結合する。次に 、血小板は、創傷部位で形成されるコラーゲンおよびトロンビンにより開始され る反応で、活性化される。これらの刺激は、膜リン脂質である、ホスファチジル イノシトール３リン酸を加水分解する酵素である、ホスホリパーゼＣを活性化す る。この反応の産物は、プロテインキナーゼＣを活性化し、そしてまた血小板サ イトゾルのカルシウム濃度を上昇させる。結果として、一連の漸進性の重複事象 が生じる。血小板は、形を変え、そして長い偽足(pseudopod)を発生する。レセ プターは、血小板表面膜上に集合し、そしてフィブリノゲンおよび他の付着性タ ンパク質はこのレセプターに結合して、血小板の互いの膠着が生じる。アラキド ン酸が膜リン脂質から遊離され、そしてコラーゲン誘導性血小板活性化に重要な 補因子として作用するプロスタグランジンＨ₂(PGH₂)、およびそれ自身で付加的 な血 小板アクチベータとして作用し得るトロンボキサンＡ₂(TxA₂)を含む産物に酸化 される。血小板の成分が分泌され、血小板活性化を刺激し、そして形成する(gro wing)止血栓中に新しい血小板をまた補充し得るアデノシン２リン酸(ADP)を含む 。 血小板凝集に続いて、循環血中のフィブリノーゲンは、フィブリンに転換され 、適所で止血性血小板栓と物理的に結合する。血小板表面は、血液凝固の酵素/ 補因子複合体が血小板表面で形成されるに必要な凝固促進性リン脂質を露出する ように、再編成される。血小板a-顆粒からの血小板第Ｖ因子の分泌は、酵素/補 因子複合体の１つについて重要な構成成分を提供する。結果として、トロンビン が、血小板表面で生じる量が増加し、そして凝集した血小板から外へ発散して血 小板栓が損傷部位で固まるのを補助するフィブリン鎖の形成を伴って、トロンビ ンはフィブリノーゲンをフィブリンに転換する。さらに、血小板内のメカニズム は活性化され、血小板アクチノマイシンの萎縮が生じる。これにより、血小板栓 が圧縮されそして強化され、さらに損傷部位に固定される。 インビボでの血栓形成の制御において、血小板凝集は、PGH₂誘導体プロスタサ イクリン(PGI₂)により媒介される。プロスタサイクリンはまた血管拡張剤であり 、血管内膜内皮を血小板相互作用に対して不活性にすると考えられている。従っ て、TxA₂およびPGI₂は血小板凝集に対して反対の効果を有し、そして心臓血管系 における血栓形成の制御に対する各々の生理学的効果の程度は、主にそれらの量 的均衡により決定される(Bush，H．L.Jr.ら、「プロスタサイクリンとトロンボ キサンＡ₂との好ましい均衡は、ヒトインサイチュの静脈グラフトの早期開通を 促進する」、J．Vasc．Surg.，1:149-159(1984); Coker，S．J．ら、「不整脈に 関する虚血性心筋からのトロンボキサンおよびプロスタサイクリンの放出」、Na ture，291:323-334(1981); Hunter，G．C.ら、「動脈壁トロンボキサン：血栓症 素因を作る外科処置後の優位性」、J．Vasc．Surg.，1:314-319(1984); およびZ muda，A.ら、「ウサギにおける実験的アテローム性動脈硬化症：プロスタサイク リンの血小板凝集能、トロンボキサンA₂生成能、および抗凝集能」、Prostaglan dins，14:1035(1977))。 血栓形成を変化させる治療的処置は、主に凝集反応の阻害に焦点が当てられて いる。この目的のために最も広範に受容されている薬剤は、アセチルサリチル酸 (ASA)、またはアスピリンである。アラキドン酸カスケードにおいて、アスピリ ンは、シクロオキシゲナーゼインヒビターとして作用し、アラキドン酸のPGH₂前 駆体のプロスタグランジンＧ₂(PGG₂)への転換をブロックする。PGG₂は、TxA₂とP GI₂の両方の前駆体であるので、アスピリンは、これらの因子の凝集誘導効果お よび凝集阻害効果のそれぞれを、両方ともブロックする。抗血栓剤として、アス ピリンは、様々な程度で成功している。最少量のアスピリンが血小板阻害に要求 されるが、ほとんどの臨床試験は、比較的高用量に関連している。高用量のアス ピリンの、TxA₂およびPGI₂両方に対する非選択的で強力な阻害により、研究者ら は、低用量療法の使用の理論的な利点を考えるようになった。ヒトにおける凝集 促進性(proaggregatory)TxA₂の好ましい阻害は、単回用量のアスピリン投与また は短期間の累積効果に限定されてきた。アスピリンの有益な効果の程度および持 続時間は、このような被験体に固有の血栓症の潜在性に高度に依存することがさ らに見出された(Zammit，M.ら、「小口径動脈プロテーゼ法(Small Cabilar Arte rial Prostheses)におけるアスピリン療法；長期間の実験観察」、J．Vasc．Sur g.，1(6):839-851(1984))。多くの個体に対して、アスピリンは認識可能な抗凝 集活性をほとんどまたは全く有さず、血栓形成の素因の減少に有効ではない。 アスピリン療法に関連するいくつかの問題を克服するために、特定のトロンボ キサンシンセターゼインヒビター(TSI)の利用が以前に提案されたが、これは抗 凝集性PGI₂の形成を阻害することなく、凝集促進性TxA₂の形成を阻害する。種々 のイミダゾール誘導体が、この目的のために(単独または低用量アスピリン療法 と組み合わせるかのいずれかでの使用のために)提案されている。例えば、Kapla n，S.ら、「選択的で延長された抗血小板効果についての新しい組み合わせ療法 ：イヌにおける結果」、Stroke，17:450-454(1986)を参照のこと。亜鉛イオンが 、インビトロでコラーゲン誘導性血小板凝集およびセロトニン放出に対する阻害 活性を有すること(Chapvil，M.ら、「亜鉛イオンの血小板凝集およびセロトニン 放出反応に対する阻害効果」、Life Sciences，(16):561-572(1975))、およびイ ンビトロでの血小板活性化因子(PAF)に対する阻害効果を有すること(Arch．Bioc hem．Biophys.，272(2):466-475(1989);Arch．Biochem．Biophys.,260(2):841-8 46(1988))、および、ヒドロキシ尿素、クエン酸およびアスコルビン酸が インビトロで植物のリポキシゲナーゼ活性を阻害すること(Bekheet，I．A.ら、 「リポキシゲナーゼ活性に対するいくつかのインヒビターの効果」、Alex．Sci. Exch.，7(3):389-398(1986))がまた示唆されている。 発明の要旨 血栓形成についての素因を有する患者が、アスピリンおよびクエン酸、ならび に必要に応じて薬学的に受容可能な亜鉛の塩を含む組成物で効果的に処置され得 ることが今や見出された。アスピリンとクエン酸との組み合わせは、アスピリン 単独よりも血小板凝集の阻害に極めて有効であることが見出された。従って、ヒ トまたは動物被験体の血小板凝集能力を低減するための新しい方法が開示される 。この新しい方法は、アテローム性動脈硬化症の血栓症合併症の予防または処置 のような、心臓血管の患者の処置に非常に有効である。 図の簡単な説明 図１は、典型的なアデノシン２リン酸(ADP)誘導性血小板凝集反応のグラフで あり、血小板が豊富な血漿(PRP)を介する光透過のパーセントを、凝集の誘導後 の時間の関数として示す；および、 図２は、PRP中のインビトロでのADP誘導性血小板凝集反応のグラフであり、未 処置(ベースライン、黒丸で表す)、クエン酸ナトリウムへの曝露後(白四角)、ア スピリンおよびクエン酸ナトリウム(黒四角)、アスピリン単独(白丸)、クエン酸 (黒三角)、アスピリンおよびクエン酸(白三角)、水単独(点線)、または水および エタノール(破線)を表す。 好ましい実施態様の説明 本発明により、アスピリンとクエン酸とを含む治療学的組成物が、血小板活性 の減少に対し、アスピリン単独よりも極めて有効であることが見出された。従っ て、本発明の１つの局面は、治療有効量のアスピリンとクエン酸とを含む組成物 を患者に投与する工程を包含する、患者における血栓形成についての素因を減少 する方法を提供する。１つの特に好ましい実施態様において、患者は、血小板凝 集を減少させるに有効な量のアスピリン、クエン酸、および必要に応じて亜鉛塩 を投与することにより処置される。これにより、血小板凝集経路の少なくとも部 分的なブロックにより、血栓形成の傾向が減少する。 本発明の他の局面は、患者に投与した場合、血小板凝集を減少させるに有効な 量のアスピリンおよびクエン酸を含む治療学的組成物を提供する。特に好ましい 実施態様において、本発明の組成物は、アスピリン、クエン酸、および亜鉛塩を 含む。 本発明の方法および組成物は、血栓形成の危険性が高い患者、例えば、アテロ ーム性動脈硬化症、血管外科処置患者、および他のタイプの心臓血管疾患を伴う 患者の処置において、予防的または治療的処置に使用され得る。 本発明の１つの局面によれば、血小板凝集を減少させるに有効な量のアセチル サリチル酸およびクエン酸が、患者に投与される。アセチルサリチル酸およびク エン酸の有効であるが毒性のない量は、当業者の医者により容易に決定され得る 。この目的に必要とされる正確な量は、患者の体重、患者の生理学的状態、患者 の血栓症可能性、所望の効果、および他の要素に依存する。しかし、ほとんどの 目的について、アセチルサリチル酸は、少なくとも約0.5mg/患者の体重のkg/日 、より好ましくは、約２〜約４mg/患者の体重のkg/日、そしてクエン酸は、少な くとも約0.5mg/患者の体重のkg/日、より好ましくは、約２〜約４mg/患者の体重 のkg/日で患者に投与される。 さらに別の局面において、前述に従って、および患者の血小板凝集能低減を生 じるに有効な量の薬学的に受容可能な量の亜鉛塩を、患者にさらに投与すること により患者を処置する。ほとんどの場合、この目的にためには、亜鉛塩は少なく とも約0.01 mg/患者の体重のkg/日が有効であるが、所望の場合、有意に高い用 量が用いられ得る。適切な亜鉛塩としては、例えば、薬学的に受容可能なZn²⁺の 付加塩(例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩 、マロン酸塩、サリチル酸塩、リンゴ酸塩、グルコン酸塩、フマル酸塩、コハク 酸塩、アスコルビン酸塩、メタンスルホン酸塩、アルギニン、または類似の薬学 的受容可能な塩)が挙げられる。現在、特に好ましい塩として、酢酸亜鉛および 硫酸亜鉛が挙げられる。 本発明の別の局面において、血小板凝集を減少させるに有効な量のアセチルサ リチル酸およびクエン酸、および患者の血小板凝集の減少を生じるのに有効な量 の薬学的に受容可能な亜鉛塩(上述)、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含 む組成物が、提供される。本発明の好ましい組成物は、単位投薬量投与(例えば 、毎日の決まった投与量)について設計され、そして下記の範囲内での典型的な 量の活性化合物を含み得る： 化合物 量(mg/用量) アセチルサリチル酸 50-650 クエン酸 50-650 亜鉛塩 0-100 現在特に好ましい経口投与についての例示となる実施態様において、本発明の 組成物は、約100〜約200mg/用量のアセチルサリチル酸と約100〜約200mg/用量の クエン酸とを含む。組成物はさらに約0.5〜約２mg/用量の薬学的に受容可能な亜 鉛塩を含み得る。 本発明の組成物は、温血動物に任意の有効な薬学的に受容可能な形態(例えば 、経口、非経口または不溶解性の投薬形態において、経皮製剤において、または 舌下錠あるいは鼻腔スプレー)で投与され得る。適切な非経口投与経路としては 、例えば、化合物の筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が挙 げられる。ほとんどの目的について、経口投与が好ましい。 経口投与のための固形投薬形態としては、カプセル、錠剤、ピル、粉末、およ び顆粒が挙げられる。このような固形投薬形態において、活性化合物は、少なく とも１つの不活性な希釈剤(例えば、スクロース、ラクトース、またはスターチ) と混合され得る。このような投薬形態は、通常の実施として、不活性な希釈剤以 外のさらなる基質(例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤)をまた含 み得る。カプセル、錠剤、およびピルの場合、投薬形態はまた、緩衝化剤を含み 得る。錠剤およびピルは、腸溶性コーティングでさらに調製され得る。 経口投与のための液体投薬形態としては、当該分野で一般に使用される水のよ うな不活性な希釈剤を含む、薬学的に受容可能な乳濁液、溶液、懸濁液、シロッ プおよびエリキシルが挙げられる。これらの不活性な希釈剤のほかにも、本発明 の組成物はまた、湿潤剤のようなアジュバント、乳化剤、および懸濁剤、および 甘味料、香味料ならびに芳香剤を含み得る。 活性化合物に加えて、非経口注射のための本発明に従う組成物は、薬学的に受 容可能な滅菌水溶液または非水性溶液、懸濁液、または乳濁液を含み得る。適切 な非水性キャリア、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例としては、プロピレング リコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびエチル オレイン酸のような注射可能な有機エステルが挙げられる。このような組成物は また、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および散剤のようなアジュバントを含み得る。 これらは、例えば、細菌保持フィルターにより濾過することにより、または滅菌 剤剤を組成物に取り込むことにより、殺菌され得る。これらはまた、滅菌水、ま たは他の注射可能な滅菌媒体に使用直前に溶解され得る滅菌固体組成物の形態に 製造され得る。 前述は、以下の実施例と組み合わせてより十分に理解され得る。以下の実施例 は例示の目的のために示されるのであって、制限されるものではない。 実施例 下記の実施例で使用するように、血小板凝集を、Omniscribe B-5000チャート レコーダーを備えるPayton２重チャネル凝集測定器上で、3.8％クエン酸ナトリ ウムで凝固防止した静脈血から調製した血小板が豊富な血漿(PRP)を用いて、Bor n，GVR、「アデノシン２リン酸による血液血小板凝集およびその可逆性」、Natu re，194:927-929(1962)の濁度測定法に従って行った。血小板凝集は、アデノシ ン２リン酸(ADP)で誘導される。アデノシン２リン酸に反応する血小板凝集の速 度および持続時間は、血液の血栓症の可能性の測定として使用され得る(Kaplan, S.ら、「小口径動脈グラフトの実施におけるレシピエントの予め決定された血栓 症の可能性の効果」、J．Vasc．Surg.,3:311-321(1986)を参照のこと、その開示 は本明細書中で参考として援用される)。自己血小板が乏しい血漿(PPP)を使用し て、PRP中の血小板数を250,000±25,000血小板/mlに調整した。37℃で３分後、A DPをPRPに加え、最終濃度を2.5μMにし、そして、凝集反応の変化を、凝集曲線 の変化により表されるように阻害の程度により評価した。図１（時間の関数とし て伝達の比率(％Tran)を表す、代表的なアデノシン２リン酸誘導性血小板凝集曲 線)を参照して、血小板凝集(PA)を、以下の方程式（１）により決定した： PA＝Amp R・S_Sum・Plt R （１）。 ここで、Amp Rは、Ａ_maxで割ったAmp１に等しく(図１を参照のこと)、Amp１は、 最初の凝集波幅(図１)の高さであり、Ａmaxは、凝集曲線の最大の高さ(Amp１＋A mp２、図１)であり、Ｓ_sumは、全凝集面積(すなわち、Ｓ₁＋Ｓ₂、図１)であり、 Ｓ₁は、最初の凝集面積であり(図１を参照のこと)、Ｓ₂は、２次凝集面積であり 、そしてPlt Rは、調整した血小板数で割った実際の血小板数の割合により決定 される正規パラメーターである。 実施例１ アスピリン単独投与への血小板凝集反応が不十分である16人のヒト患者に、以 下の処方物を有する組成物を毎日投与した： アスピリン 158mg クエン酸 158mg 塩酸チアミン ８mg 酢酸亜鉛 １mg 全量/用量 325mg。 各患者のPA値(％伝達・分で表示)を、任意の薬物で処置する前(NM)、および/ またはアスピリン単独処置後(ASA)、およびさらに前述の組成物の単回用量を毎 日投与した種々の期間後(Post Treatment)で決定した。結果を表１に示す： NM＝非薬物処置 ASA＝アスピリン単独 PT＝処置後 nd＝試験せず MV＝平均値 表１に見られ得るように、当該分野で公知であるように、アスピリン単独(ASA )投与により、ヒトにおける血小板凝集は部分的に減少した。しかし、本発明の 代表的な組成物の毎日の投与により、アスピリン単独により誘導されるよりも、 さらに実質的な血小板凝集の減少が予想外に生じた。 実施例２ インビトロでの血小板凝集に対する種々の成分の効果を示すために、イヌ血液 由来の血小板が豊富な血漿(PRP)の８つの独立したサンプルを、下記の成分で処 理し、10μM ADPの最終濃度で誘導し、そして上記のように、血小板凝集反応に ついて試験した。結果を、図２の血小板凝集曲線に示す。ベースライン(非薬物 処置コントロール)を、点で表し、エタノール中の2.5mM スピリンで処理したPRP を白丸で表し；10mM クエン酸ナトリウム単独で処理したPRPを白四角で表し、エ タノール中および水中の2.7mM スピリンおよび10mM クエン酸ナトリウムでそれ ぞれ処理したPRPを黒四角で表し；10mM クエン酸単独で処理したPRPを黒三角で 表し、エタノール中および水中の2.7mM アスピリンおよび10mM エン酸でそれぞ れ処理したPRPを白三角で表し；そして10μLの水または10μLの水および2.5μL のエタノールで処理したPRPを有するコントロールを点線および破線で、それぞ れ表す。図２に見られるように、アスピリンとクエン酸との組み合わされた阻害 効果は、各化合物の別々の効果よりも、またはクエン酸ナトリウムと組み合わさ れたアスピリンの効果よりも実質的に優れていた。 実施例３ 血管手術後に血栓性血管閉塞の１度以上の発生を経験した後の６人の患者を、 処置のために選択した。各被験体の血栓症の症状は、従来のアスピリン療法によ り不十分に制御されていると臨床的に判断された。６人のそれぞれの被験体を、 ２次的な血管閉塞の危険性が高く、そして、生命および四肢の損失の有意な可能 性があると判断した。各被験体に、実施例１の組成物の単回用量で毎日の処置レ ジメを行った。全ての被験体を日常的に試験し、そして２か月から12か月以上に わたる期間の間処置レジメを開始してから、臨床的に観察され得る血栓性閉塞は 生じなかった。各被験体は、彼らの以前の症状に関連する合併症は生じず、そし てそうでなければ要求される重要な(significant)入院および医学的処置は必要 ないと判断された。 ほとんどのヒトおよび動物の被験体における本発明の実施の治療的効果として は、血小板凝集の劇的な阻害が挙げられ、それとともに結果として血栓性閉塞事 象の実質的な減少または除去を伴う。本発明の組成物の血小板活性に対する阻害 作用は、アスピリン単独により引き起こされるよりも、非常により効果的である ことが示された。さらに、本発明に従って処置された患者の主観的な臨床的経験 は、症状の欠如、合併症から比較的免れていること、そして総括的に高い生活の 質により判断されるように、非常に好ましく、処置前の状態に著しく対照的であ る。従って、本発明の方法および組成物は、十分な臨床処置が以前は利用可能で なかった、生命を脅かす血栓形成の素因を有する患者を長期的に継続的して予防 的または治療的に処置するための安全で有効な手段を提供する。 実施例４ アスピリン(アセチルサリチル酸、ASA)とクエン酸との組み合わせの毎日の投 与が、ASA療法単独よりも血小板凝集のより優れた阻害を提供するという仮定を 試験するために、シングルセンター(single center)、二重盲検定を行った。 この仮説を評価するために、268人の見かけ上健康なボランティアを、血小板 凝集状態およびASA療法に対する感受性を確認するためにスクリーニングした。 全参加者に、スクリーニング評価の前の午後10時以降は絶食し、そして約束の日 の前の10日間は、ASA含有製品の摂取を避けるように指導した。血液サンプルを 、標準的な静脈穿刺技術を用いて、午前8:00〜午前10:00の間に回収した。血小 板凝集反応をBorn、「アデノシン２リン酸による血液血小板の凝集およびその可 逆性」、Nature 4832:927-929(1962)の、濁度測定手順を用いて測定し、そしてS aadら、「血小板凝集は、外部的に支持された癒着ダクロン大腿膝窩バイパスグ ラフトの失敗を正確に予測し得る」J．Vascular Surgery 18(4):587-594(1993) の血小板凝集評価法により定量した。30を越えるベースライン血小板凝集(PA)値 を有する個体は、最低３日間、325mgのASAを摂取させた後に再試験を行った。AS Aで処置したPA値が30を越えたままであったボランティアに、本研究に続けて参 加してもらうよう依頼した。24人のボランティア(15人の男性および９人の閉経 後の女性)を、次の段階(phase)の研究に登録した。 本研究に登録された各人に、本研究参加中は、ASA含有製品を摂取しないよう に指導した。本研究における各人を無作為に４つのグループのうちの１つに配置 し、各グループに下記の４種類の薬物の１つの毎日の投与を受けるように指示し た： １．プラシーボ(非薬物処置)； ２．325mg ASA； ３．162.5mgのASAおよび162.5mgのクエン酸(CA)；および ４．325mgのクエン酸 先述の薬物を、２週間の間、毎日摂取するように指導し、そして各参加者につい ての血小板凝集分析を、下記のように２週間の処置期間の最初と最後に行った。 薬物処置しない残りの２週間の期間を処置期間後に指示し、次いで各患者を上記 で固定した４つのグループの別の１つに無作為に配置した。先述の手順を各研究 の参加者が４つの実験群のそれぞれに参加するまで繰り返した。本研究の進行の 間、４種の薬物は全て、同一の見かけのゼラチンカプセルに入れ、参加者にはカ プセルの中身を知らせなかった。薬物分配の順番および順序は、研究の参加者に は知らせなかった。個人は、募集された順序で薬物の順序を割り当てられた。薬 物は、サンプル回収および血小板凝集分析に関与しない研究化学者によって、調 製され、そして分配された。血液の採取および予定の約束は、カプセルの分配ま たは血小板凝集分析に関与しない、瀉血を行う医師により指揮された。血小板凝 集試験を、カプセル分配または血液サンプル回収に関与しない研究関係者により 、参加者群または用いた薬物を明らかにしない暗号化したサンプルに対して行っ た。24人の参加者全てについてのデータ回収の完了後、回収したデータを分析し た。 上述の研究の間、各参加者の血小板凝集を以下のように決定した。標準的な静 脈穿刺技術を使用して、絶食した血液を、実際の血小板数を決定するために、ED TA Na₂とともに５mLバキュテーナーチューブ(vacutainer tube)(Becton Dickins on Co.,Rutherford，NJ)に回収した。3.8％緩衝化クエン酸ナトリウムを入れた ２本の4.5mLバキュテーナーチューブを、凝集研究のために用いた(drawn)。 全血小板の計数を、Technicon H*1 血液分析器(Technicon Co.,New York，NY) により行った。血小板凝集研究をBornの濁度測定法に従って行った。血小板が豊 富な血漿を、赤血球および白血球が十分に沈殿するまで遠心分離して、クエン酸 血液から調製した。血小板が豊富な血漿の上清のアリコートを保存した後、血液 をより高速で再度遠心分離し、血小板をペレットに澄明化し、血小板が乏しい血 漿上清を得た。凝集のための試験血漿サンプルを、血小板が豊富な血漿のアリコ ートを血小板が乏しい血漿で、サンプルが250,000±25,000/mm³の血小板数を有 するまで希釈することにより調製した。血小板凝集反応を定量するために、標準 的な伝達期間の10％および90％を、血小板が乏しい血漿および血小板が豊富な血 漿について、それぞれ使用し、そして試験時間を８分間で固定した。アデノシン ２リン酸(ADP)試薬(Dade Laboratories，Miami，FL)を、製造会社の指示に従っ て、毎日蒸留水を用いて再調整することにより調製した。450μLの標準化した血 漿サンプルを、Fluke 1752A Data Acquisition System(John Fluke Mfg．Co.,Ev erett，WA)により駆動される707レコーダー(Chrono-log Corp.，Havertown，PA) を用いて、Chrono-log 560 VS凝集測定器中で37℃で３分間インキュベートした 後、最終濃度2.5μLのADP 50μLを添加し、そして続いて起こる凝集を、専用の 分析用ソフトウエア(Cybermed Technology Co.,Seattle，WA)でモニターした。 全ての凝集研究は、サンプル回収の３時間以内に完了させた。 各サンプルの血小板凝集(PA)値を、以下の式により得た： PA値＝AmpR・S_sum・PltR ここで； Amp R＝Amp１/Amax(図１を参照のこと、A_max＝Amp１＋Amp２) S_sum＝曲線下の面積(図１を参照のこと、Ｓ₁＋Ｓ₂) Plt R＝実際の血小板数/調整した血小板数 上記のデータを、以下の表２および表３にまとめる。表２は、血小板凝集値に おけるベースラインからの平均変化を示す。 表３は、処置群の比較についてのｐ値を示す 先述より、ASA/CA療法により、血小板凝集が大きく減少される(平均で約19の減 少)ことが明らかである。次に大きな変化は、８〜10の減少であり、ASA単独によ り得られた。プラシーボおよびクエン酸(CA)処置は、統計学的に差異はなく；平 均変化は０と異ならなかった。これらのデータは、アスピリンとクエン酸との両 方での処置により、アスピリン単独による処置よりも血小板凝集が統計学的に有 意に減少されること、およびクエン酸単独処置は、インビボで血小板凝集に対す る影響を有しないことを示す。 本発明の方法および組成物の種々の改変および適用は、先述から当業者には明 らかである。このような改変および適用はいずれも、先行技術により除外される 範囲以外は添付の請求の範囲内にあることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 カプラン，アレキサンダー アメリカ合衆国 ワシントン 98043，マ ウントレイクテラス，66ティーエイチ ア ベニュー ウエスト 22603

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 独占的な所有権および特権が請求される本発明の実施態様は、以下のように規 定される： １．患者において血小板凝集を阻害する方法であって、少なくとも約0.5mg/患者 の体重のkg/日のアセチルサリチル酸と少なくとも約0.5mg/患者の体重のkg/日の クエン酸を含む組成物とを、患者に投与する工程を包含する、方法。 ２．約２mg〜約４mg/患者の体重のkg/日のアセチルサリチル酸が前記患者に投与 される、請求項１に記載の方法。 ３．約２mg〜約４mg/患者の体重のkg/日のクエン酸が前記患者に投与される、請 求項１に記載の方法。 ４．前記患者の血小板凝集活性を減少させるに有効な量の薬学的に受容可能な亜 鉛塩を患者へ投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。 ５．少なくとも約0.01mg/患者の体重のkg/日の、薬学的に受容可能な亜鉛塩が前 記患者に投与される、請求項４に記載の方法。