JPH11507072A - ボツリヌス毒素またはボツリヌス神経毒の薬学的組成物および製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ボツリヌス毒素またはボツリヌス神経毒と有効量のトレハロースおよびメチオニンを含む凍結乾燥した薬学的組成物は室温以上の温度で４カ月以上の保存寿命を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 ボツリヌス毒素またはボツリヌス神経毒の薬学的組成物および製造方法 発明の分野 本発明は一般的にボツリヌス毒素に関するものである。より詳細に述べるなら ば、本発明は、ボツリヌス毒素またはボツリヌス神経毒を含む新規の保存安定性 のある凍結乾燥した薬学的組成物およびその組成物の製造方法に関する。 発明の背景 細菌性食物中毒の最も重大な型は、クロストリジウムボツリナム（Clostridiu m botulinum ）が産生する神経毒によって起きるボツリヌス中毒症である。その 毒素は普通は食物中の原因生物によってあらかじめ形成され、その後腸管から吸 収され、循環系を介して運動神経シナプスに運ばれ、そこでその毒素の作用が正 常な神経伝達をブロックする。Ｃ．ボツリナムの種々の血清型は、毒性活性は同 様ではあるが抗原性の異なる神経毒を産生する。米国では血清型Ａ毒素がボツリ ヌス中毒症の主な原因であり、Ｂ型毒素はヨーロッパで最も流行している。 １９７９年に、結晶性Ａ型ボツリヌス毒素複合体が米国の食品研究所／ウィス コンシン−マジソン大学食物微生物学毒物学部のシャンツ（E.J.Shantz）によっ て作られた。それは筋肉機能亢進性障害（ハイパーアクティブ マッスル ディ スオーダーズ）、例えば斜 視、眼瞼痙攣、痙性斜頸などを治療するために医学的に用いられている。治療は ナノグラム量の毒素を機能亢進性筋肉に直接注射することを含む。毒素はシナプ ス接合部からのアセチルコリン放出を阻止し、被注射筋の活性低下を起こす。 市販のボツリヌス毒素複合体製剤を機能亢進性筋肉およびその他の症状の治療 のために使用する場合の主な欠点は、患者に抗体またはその他の種類の免疫が発 生することである。毒素複合体のタンパク質が患者の免疫系によって異物として 認識され、それが抗体産生を剌激するのである。これは種々の筋肉機能亢進性障 害のボツリヌス毒素による治療を無効にする。中和抗体を発生する患者の数を減 らす一つの方法は精製した神経毒を使用することである。もう一つの方法は凍結 乾燥後により高い特異的活性を有する、より保存安定性のある生成物を用いるこ とである。なぜならば活性タンパク質の変性が比較的少ないからである。この生 成物は現在入手できる生成物ほどには抗原性をあらわさず、治療のためにはより 少量ですむ。 ボツリヌス毒素は表面変性、熱およびアルカリ性条件による変性を非常に受け やすい。毒素複合体または神経毒の凍結乾燥は、その生成物を安定で臨床医が使 用しやすい形で供給する最も経済的かつ実際的方法である。現在の市販のＡ型ボ ツリヌス毒素生成物は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）５．０ｍｇ／ｍｌおよび 塩化ナトリウム９．０ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ７．３）中にＡ型毒素複合体５００ｎｇ ／ｍｌを組み合わせることによって作られる。溶解後、０．１ｍｌを乾燥し、１ バイアルあたり１００±３０活性単位（Ｕ）の毒素、０．５ｍｇのＨＳＡ、およ び０．９ｍｇの塩化ナトリウムを得る。この生成物は１．０ｍｌのｄＨ₂Ｏで希 釈すると生理食塩液濃度０ ．９％が得られる。毒素複合体を用いる現在の市販処方は乾燥後約２．５Ｕ／ｎ ｇの比毒性を有する。乾燥中のかなり大きい活性損失（９０％までの）は不活性 毒素を生成せしめる。それは抗体形成を促進するトキソイドとして作用する。現 在の市販製品は、保存寿命１年間、表示された有効性を維持するために−１０℃ 以下の温度で保存しなければならない。 Ｃ．ボツリナムによって産生されるＡ型神経毒は、最低７種類の異なった非共 有結合タンパク質の複合体の一部としてその毒素中に存在する。その神経毒は毒 素複合体より活性である。高品質Ａ型毒素複合体は１ｍｇあたり３×１０⁷マウ ス腹腔内５０％致死量（ＬＤ₅₀）の比毒性を有する。精製された神経毒、すなわ ちクロマトグラフィーによって毒素複合体の他のタンパク質から分離された神経 毒は１ｍｇあたり９×１０⁷〜１×１０⁸ＬＤ₅₀の比毒性を有する。医学的分野で は１単位（Ｕ）が１ＬＤ₅₀と考えられる。毒素力価は体重１８〜２２ｇの雌白マ ウスで、公式分析化学学会、６１巻、９６ページ（１９７８）に記載されている シャンツおよびカウター（Kautter）の方法によって測定される。 巣状異緊張症（フォーカルジストニア）の治療を模するために種々のＡ型毒素 製剤を反復注射するウサギモデルを用いて、種々の毒素製剤の免疫原性を評価し た。そのモデルは、白ウサギに致死量以下の毒素を長期間にわたって注射し、そ の動物血清の、少量だが注意深く定量した精製Ａ型毒素を中和する能力を試験す ることからなる。我々の結果から、米国で現在入手できる、試験した全製剤のな かで最も低い比毒性を有する生成物が、現在までに試験した全製剤のなかで最も 抗原性が大きいことがわかった。これらの結果は、高 比活性製剤が患者に中和抗体を発生させる可能性を減らすことを示唆する。 我々はこれまでに、実質上純粋なボツリヌスＡ型神経毒、ヒト血清アルブミン （ＨＳＡ）およびトレハロースを含むあらかじめ凍結乾燥した水性処方から作ら れる薬学的組成物が、凍結乾燥後の活性毒素の回収を改善する（＞８０％）こと を発見した。市販されている毒素複合体の代わりに純粋な神経毒を使用すると、 米国食品医薬品局によって定められたバイアルあたりの活性Ｕの必要数値を得る ために必要な毒素量が減少した。この改善は各バイアル中の不活性毒素（トキソ イド）の量も減らし、それによって製剤を患者に注射した後の抗体形成の可能性 を減らす。 我々はこれまでに、予備凍結乾燥処方にトレハロースを加えることによって得 た組成物は比較的高い保存温度で長い貯蔵寿命（例えば３７℃で６カ月）をもつ ことも発見した。 発明の概要 我々は今や、凍結乾燥されたボツリヌス毒素または神経毒含有組成物の保存寿 命が、例えばメチオニンまたはシステインなどのチオアルキルアミノ酸の変性防 御量を、ボツリヌス毒素または神経毒、例えばアルブミンなどの安定化タンパク 質、および例えばトレハロースなどの多糖類糖質、を含む水性の予備凍結乾燥処 方に添加することによって改良されることを発見した。メチオニンの添加はその 組成物の保存安定性を４２℃で３カ月以上にまで延長した。 好ましい実施態様の説明 本発明の好ましい薬学的組成物は１０ｍｌガラスバイアル中の凍結乾燥された 固体であり、それは下記の組成を有する： ボツリヌスＡ型神経毒、１００Ｕ メチオニン、１ｍｇ／バイアル トレハロース、１０ｍｇ／バイアル 血清アルブミン、０．５ｍｇ／バイアル 好ましい組成物は水中に、神経毒、血清アルブミン、トレハロースおよびメチ オニンの同濃度を含む液体の予備凍結乾燥処方から作られる。 Ａ型Ｃ．ボツリナムのＨａｌｌＡ種（ＡＴＣＣに寄託）を用いて好ましいＡ型 神経毒を生成する。この菌種は高い毒性力価および速やかな細胞溶解の開始（通 常は４８時間以内）により、Ａ型ボツリヌス毒素の産生ために日常的に用いられ る。 毒素産生のためにＨａｌｌＡ種の培養物を、２．０％ＮＺアミンまたはＴＴ（ シェフィールド研究所、ノルウィッチ、ＮＹ）、１．０％酵母抽出物（ディフコ ）、および０．５％デキストロース、からなる毒素産生培地（ＴＰＭ）（ｐＨ７ ．３ ７．４）の１０〜２０リットル量中で３７℃で５〜７日間静止下で増殖さ せる。 実質上純粋なＡ型神経毒を作るために、Ａ型毒素複合体を最初にM.C. グッド ノーの博士論文（Goodnough,M.C.１９９４、医学的用途のためのＣ．ボツリナム 毒素の特徴づけおよび安定化、博士論文（Ph.D.thesis）、ＵＷ−マジソン、１ ９８２年のツェ（Tse）らから採用）に記載されている方法によって精製する。 Ａ型神経毒は複合体の関連した無毒性タンパク質からツェらの方法（１９８２ ）の変法によって精製する（グッドノー、１９９４、 学位請求論文、ウィスコンシン−マジソン大学、ＵＳＡ）。毒素複合体はＤＥＡ Ｅ−セファデックスＡ５０（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ） 、ｐＨ５．５のカラムから回収し、固体硫酸アンモニウム３９ｇ／１００ｍｌの 添加によって沈殿させる。沈殿した毒素複合体を遠心分離によって集め、２５ｍ Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．９に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化したＤＥ ＡＥ−セファデックスＡ５０カラムに入れる。毒素は複合体の無毒性タンパク質 から分離され、カラムから０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムグレディエントで溶出す る。部分的に精製された神経毒をＤＥＡＥ−セファデックスＡ５０カラム、ｐＨ ７．９、から回収し、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、に対して透析す る。透析した毒素を２５ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ７．０、中でＳＰ−セファデ ックスＣ５０（シグマケミカル社）に適用する。これらの条件下では混入物質は カラムに結合しない。神経毒を０〜０．２５Ｍ塩化ナトリウムグレディエントで 溶出する。神経毒をさらに金属アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過ま たはその他のタンパク質クロマトグラフィー法によって精製することができる。 凍結乾燥のために、予備凍結乾燥処方をガラスバイアルに入れ、テフロンで内 張りしたスクリューキャップ栓をゆるく閉め、そのサンプルを液体窒素中で速や かに凍結する。凍結サンプルを凍結乾燥フラスコに入れ、それを液体窒素に浸す 。圧力が約６０ｍトール未満に低下したとき、液体窒素ジャケットを除去する。 圧力を３０〜６０ｍトール以下に維持し、凝縮器の温度を−６０℃に維持する。 バイアルおよびそれらの内容物を室温にし、次の１８〜２４時間周囲温度で乾燥 を続ける。フラスコを取り出し、バイアルにぴったり キャップする。 メチオニンを含む上記の予備凍結乾燥処方およびメチオニンを含まない同一処 方から作った凍結乾燥した生成物のバイアルを種々の温度で保存し、凍結乾燥し た生成物の保存安定性に与えるメチオニンの影響を調べた。これらの場合に、し っかりと蓋をしたバイアルをプラスチックバッグに入れ、封をし、種々の温度（ −２０、４、３７または４２℃）で保存し、内容物の毒性を種々の時点に試験し た。凍結乾燥製剤をその後１．０ｍｌの蒸留水で希釈した。希釈のために０．８ ５％生理食塩液を使用する場合も、同じ結果が出た。生成溶液は透明で、粒状物 を含んでいなかった。これらの溶液は予備凍結乾燥処方のために使用した同じ方 法によって滴定した。 異なるＡおよびＢ型神経毒処方の凍結乾燥後の活性の回収パーセント（凍結乾 燥後のバイアルあたりのマウス腹腔内致死量の数値を凍結乾燥前のマウス腹腔内 致死量の数値で割り、それに１００を掛けて計算した）を表１に示す。 本発明の好ましい組成物の主な利点は、生物学的活性神経毒の高 い回収率、および３７℃〜４２℃高温における３カ月以上の長期安定性（保存寿 命）である。これに対して現在の市販生成物は−１０℃以下の温度で保存しなけ ればならない。 トレハロースを含む組成物の保存寿命をメチオニンがさらに改善する正確なメ カニズムは知られていない。しかし改善がアミノ酸中のチオアルキル基の存在と 関係しているように見える。表２は凍結乾燥したＡ型神経毒生成物を種々の温度 で保存した後の活性の回復を示す。 Ａ型の他に、同様な毒性活性をもつが、抗原性が異なるボツリヌス毒素の他の ６種類の血清型がある。それらはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧである。Ａ型 は米国ではボツリヌス中毒症例の主要毒素である。Ｂ型毒素はヨーロッパで最も 流行している。種々の血清型によって起きる疾患の症状は大体同じである。そこ で、或る場合には、本発明の薬学的組成物に他の血清型の１つを用いることが所 望されるかも知れない。 好ましい多糖類糖質はトレハロースである。しかし場合によってはその他の糖 質、例えばマルトトリオースなども用いられる。使用するトレハロースの量は好 ましくは予備凍結乾燥した液体処方１ｍｌあたり約１０ｍｇ〜約１５０ｍｇであ る。約１００ｍｇ／ｍｌの使用が特に好ましい。 好ましいチオアルキルアミノ酸はメチオニンである。しかし場合によってはシ ステインの使用が好ましいかも知れない。ボツリヌス毒性を有する化合物の変性 を有効に阻止するメチオニン量は好ましくは予備凍結乾燥した処方１ｍｌあたり 約１ｍｇ〜約１０ｍｇである。約１０ｍｇメチオニン／ｍｌの使用が特に好まし い。 種々の毒素製剤（低または高比毒性を含む）の抗原性を、ボツリヌス毒素によ る巣状異緊張症の治療を模して致死量以下の毒素をウサギに反復注射することに よって評価した。サンプルを活性致死量の同じ数値を含むように標準化し、ウサ ギからの免疫反応を比較した。 各製剤（すなわち活性および不活性の両方）の総毒素濃度をＡ型ボツリヌス毒 素に特異的な酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。 ボツリヌス毒素に対するウサギの免疫反応は注射した毒素（活性＋不活性）の 濃度並びに動物をその濃度にさらした回数に依存することを、その他の試験結果 は示している。これらの結果から、凍結乾燥／再溶解毒素生成物の比活性が高け れば高いほど、患者は与えられた用量でより少ない抗原性物質にさらされ、患者 に中和抗体が発生する機会はより少なくなることがわかる。こうして、最初の活 性の高パーセントの回収を可能にし、トレハロースおよびメチオニンを含んで３ カ月以上室温以上の温度で保存できるようになった、実質上純粋な神経毒の凍結 乾燥した薬学的組成物を得ることが好ましい。 本発明の精神および範囲を逸脱することなく多くの変更および変化が加えられ 得ることは当業者には当然である。そこで本発明は、請求の範囲によってのみ限 定されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 グツドノー，ミカエル シー. アメリカ合衆国 53589 ウイスコンシン ストウフトン スプリング ロード 2097

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）ボツリヌス毒性を有する化合物と； （ｂ）安定化タンパク質と； （ｃ）多糖類糖質と； （ｄ）チオアルキル化合物； とを含んでなり、チオアルキル化合物は、室温以上の温度で化合物の変性を防ぐ のに有効な量存在する、凍結乾燥した固体薬学的組成物。 ２．安定化タンパク質がヒト血清アルブミンである請求項１記載の組成物。 ３．チオアルキル化合物がメチオニンおよびシステインから選択される請求項１ 記載の組成物。 ４．多糖類糖質がトレハロースである請求項１記載の組成物。 ５．ボツリヌス毒性を有する化合物がＡ型ボツリヌス神経毒である請求項１記載 の組成物。 ６．ボツリヌス毒性を有する化合物がＡ型ボツリヌス毒素複合体である請求項１ 記載の組成物。 ７．純粋なＡ型ボツリヌス神経毒、および室温における組成物の保存安定性を高 めるのに有効な量のトレハロースおよびメチオニンを含んでなる室温で４カ月ま で効力を失わずに安定であるボツリヌス神経毒の凍結乾燥した固体薬学的組成物 。 ８．ボツリヌス毒性を有するメンバーと、安定化タンパク質と、多糖類糖質と、 チオアルキル化合物と水とを含む予備凍結乾燥処方を作り、その処方を凍結乾燥 し、水を除去して凍結乾燥した固体組成 物を得ることを含んでなる請求項１記載の凍結乾燥した固体組成物の製造方法。