【発明の詳細な説明】
ラジカル伝達薬剤の存在下での芳香族化合物の生体触媒のカップリングの方法
発明の背景
本発明は、フェノール、チオフェノール及びアニリンのような芳香族化合物の
生体触媒のカップリングに関し、特に、ペルオキシダーゼ酵素、過酸化物及びラ
ジカル伝達薬剤の存在下で立体的に阻害された芳香族化合物をカップリングして
二量体化する方法に関する。
西洋わさびまたは大豆ペルオキシダーゼを用い、フェノール類の生体触媒酸化
カソプリングは、Ｐokora等の米国特許4,900,671及びＪohnson等の米国特許5,18
8,953に開示されている。ジアルキル及びジアリールフェノール、例えば、2,4−
ジアルキルフェノール、2,6−ジアルキルフェノールの二量体化は、1995年1月27
日出願された同時に係属中の米国出願Ｎo.08/379,202において議論されている。
Ｋlibanov等は、"廃水からの有毒なフェノール及びアニリンの酵素による除去
"Ｊ．of Ａppl．Ｂiochem．2，414−421(1980)で、廃水からのフェノール及びア
ニリンの、酉洋わさびペルオキシダーゼの補助重合及び沈殿を教示し、廃水から
除去することが困難なフェノール類の除去能は、他の容易に除去できるフェノー
ル類の存在により高められると開示した。生成物は除去困難なフェノール類と除
去容易なフェノールの両方を含む混合ポリマーであると考えられる。
発明の概要
本発明は、米国特許4,900,671及び5,188,953で教示された方法を改善したもの
で、効率的に酵素の活性部位に達しない(例えば，立体的阻害のために)、ペルオ
キシダーゼに反応しないかまたはペルオキシダーゼによる反応が不十分ないくつ
かの芳香族化合物が、ラジカル伝達薬剤の導入により反応し得る。本発明の特定
の実施態様によると、2,4−及び2,6−ジ置換芳香族化合物は、ペルオキシダーゼ
、過酸化物及びラジカル伝達薬剤の存在下で反応し、優れた収量で二量体を提供
する。
本発明には、おそらくフェノール性のヒドロキシの近くで立体的に阻害される
基
のために、それ自身とはペルオキシダーゼに反応しない2,4−及び2,6−ジ置換芳
香族化合物の反応に特に有用である。これらの化合物はラジカル伝達薬剤の非存
在下では、ごくわずかまたはまったく反応しない。ラジカル伝達薬剤は酵素の基
質であることを特徴とする。それは、立体的に阻害されず、酵素の活性部位に達
することができ、そこで酸化されてラジカルを形成する。このラジカルが芳香族
化合物と反応して、水素原子を離脱させ、芳香族化合物のラジカルを生成する。
驚いたことに、ラジカル伝達薬剤は、有意な量で、置換芳香族化合物とカップリ
ングしないようである。化学的に結合したラジカル伝達薬剤が、二量体生成物に
みられた場合はわずかにある。
本発明の好適な実施態様によると、芳香族化合物は、2,4−または2,6−ジ置換
フェノール、チオフェノールまたは芳香族アミン、例えば、アニリンである。2,
4−または2,6−芳香族化合物は、好ましくは、ダイズペルオキシダーゼ及び過酸
化水素の存在下で、ラジカル伝達薬剤として、フェノールを用いて反応され、対
応する二量体を提供する。本発明は、2,4及び2,6−ジ置換フェノールを3,3',5,5
'−テトラ置換−ビフェニル−2,2'ジオール及び3,3'、5,5'−テトラ置換−ビフ
ェニル−4,4'ジオールにそれぞれ転換する際に特に有用である。
従って、本発明の目的は、フェノール、チオフェノール及びアニリンからなる
群から選択されるある置換された芳香族の単量体の二量体化方法、特に、2,4−
または2,6−ジ置換芳香族の単量体を、フェノールまたは他のペルオキシダーゼ
基質をラジカル伝達薬剤として用いて、対応するテトラ置換二量体に二量体化す
る方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、ジ−tert−アルキル置換フェノール、チオフェノール及
びアニリンのような立体的に阻害される芳香族化合物を、ペルオキシダーゼ酵素
、過酸化物及びラジカル伝達剤を水性媒体中に存在された状態で、二量体化する
方法を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、次の記述及び添付の請求の範囲により明らかに
される。
定義
過酸化物の"プルポロガリン単位"とは、110mＭのリン酸カリウム、44mＭのピ
ロガロール及び8mＭの過酸化水素を含み、pＨが6の溶液に加えた場合に、光路の
長さが1cmで、420nmで1分間で測定された、12単位の吸光度の変化を生じる過酸
化物の量を意味する(Ｓigma Ｃhemical Ｃo.，Ｐeroxidase Ｂulletin)。
発明の詳細な説明
本発明の実施により、式(Ｉ)の芳香族化合物が、ペルオキシダーゼ、過酸化物
及びラジカル伝達薬剤の存在下で反応させられ対応する二量体を生成する。芳香
族化合物は、置換フェノール、チオフェノールまたはアニリンであり、一般に式
(Ｉ)で表すことができる。
式中、Ｘは−ＯＨ，−ＳＨまたは−ＮＨＲ表し、ＲはＨ、アルキル基またはアリ
ール基であり；Ｒ1及びＲ2は、アルキル基、アリール基、アルケニル基、アルキ
ニル基、脂環式基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリルオキシ基、ヒドロキシ
基、ホルミル基またはアミノ基、例えば、ジアルキルアミノ基またはジアリール
アミノ基；Ｒ3及びＲ4は、Ｒ1及びＲ2と同じ定義でよく、さらに水素原子を表し
てもよく、本発明は、2,4−または2,6−ジ置換芳香族化合物の二量体化に特に有
用で、この場合Ｒ3及びＲ4は水素である。本発明の特に有用なもう一つの点は、
芳香族化合物、が、2,4−または2,6−ジ置換分岐、アルキルまたはアリールフェ
ノール、特に2,4−または2,6−ジ−ｔ−ブチルフェノールの場合であり、結果と
して生じるジオールは3,3'、5,5'テトラ−ｔ−ブチルービフェニル−4,4'ジオー
ルである。当業者であれば、化合物における置換基が典型的に同一である場合、
２個の異なる置換基を有する化合物と異なる置換基を有する芳香族化合物の混合
物も同様に反応すると理解するであろう。
特別のメカニズムにより発明を限定することは望ましくないが、本発明は、2,
4−ジ置換フェノール(Ａ)及び2,6−ジ置換フェノール(Ｂ)の二量体化反応を図解
する。次の反応式(ＡまたはＢ)に関与する：
酵素Ｅがフェノール(II)と反応し、水素を水酸基から離脱させ、フェノキシラ
ジカル(III)を生成する。フェノキシラジカル(III)が、未反応またはごくわずか
に反応するフェノール基質(IV)または(VII)からフェノール性水素を離脱させ、
フェノール(II)を再生し、新しく置換されたフェノールのラジカル(Ｖ)または(V
III)を生成する(共鳴構造(Ｖa)及び(Ｖb)または(VIIIa)および(VIIIb)として開
示)。2,4−ジ置換フェノールの反応では、構造(Ｖb)を経て反応が進み、新しい
二量体生成物(ＶI)が産生される。2,6−ジ置換フェノールの反応では、構造(VII
Ib)を経て反応が進み、中間物キノン(IX)が形成され、これが単量体の基質(VII)
またはフェノール(II)により還元され、または置換されたフェノールのラジカル
(VIIIb)から直接的に対応するより二量体(Ｘ)に至る。
芳香族の基質反応の実施は多くの異なる方法を用いることができる。芳香族の
基質、酵素及び過酸化物の溶液が個々に調製され、計量されて反応容器に入れら
れ、または芳香族の基質と酵素溶液を事前に混合してから、過酸化物を徐々に加
える。代わりに、酵素及び芳香族の基質を共通の溶媒に溶解しこれに過酸化物を
後で加えることもできる。当業者であれば、多くの異なる反応／混合手順が有用
であるものと解する。好ましい手順としては、過酸化物を過酸化物の濃度が反応
を阻害し酵素が失活させるレベルにならないように消費される速度にほぼ等しく
なる調節速度で添加する。一般に、反応の実施は、置換芳香族の基質とラジカル
伝達薬剤をペルオキシダーゼ酵素が含まれている反応媒体に加えることにより行
われる。過酸化物は、反応が完了またはほとんど完了するまで所定の割合で添加
する。より少量のラジカル伝達薬剤が、ラジカル伝達薬剤の適切な濃度を計量す
ることにより、及び過酸化物の添加量と同じ割合を用いることができる。
ここに記載されたもの同時に係属中の1995年1月27日の出願、米国特許出願Ｎo
.08/379,202において検討されたように、2,6−ジ置換フェノールの生体触媒反応
は、ビフェノール生成物と対応のキノンを第１段階で生じ、第２段階でキノンを
より高温で所望のジオールに還元する。還元剤は、キノンが誘導されるフェノー
ルの基質が好ましい。キノンの副産物もまた本願の方法で生じ得る。キノンは、
フェノール類の基質またはラジカル伝達薬剤のいずれかにより還元できる。2,4
−ジ置換フェノールの生体触媒反応により、キノンは形成されずに、所望のテト
ラ置換フェノー
ルが得られる。
反応に使われる芳香族化合物の濃度は特に重要ではない。典型的には、約3mol
の量で用いられるが、典型的には、1から2mol濃度で十分である。
本発明は、2,4−または2,6−ジ置換の芳香族化合物の反応に応用するのが最も
価値がある。式(Ｉ)において、Ｒ1及びＲ2によって定義された置換基は、さらに
、約1から8までの炭素原子を有するアルキル基、例えば、メチル、エチル、ブチ
ル、tert−ブチル、ヘキシル等;約6から10までの炭素原子を有するアリール基、
例えば、フェニル、ナフチル、アルキル置換基も含むフェニル;約2から8までの
炭素原子を含むみ、1個またはそれ以上の不飽和部位を有するアルケニル基;約2
から8までの炭素原子を含み、2個またはそれ以上の不飽和部位を有するアルキニ
ル基;約5から10までの炭素原子を有する脂環式基、例えば、シクロペンタン、シ
クロヘキサン、シクロオクタン、メチルシクロペンタン等;約1から8までの炭素
原子を有するアルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、ブトキシ等;約6から
10までの炭素原子を有するアリルオキシ基、例えば、フェノキシ、メチルフェノ
キシ、エチルフェノキシ、ブチルフェノキシ等;ホルミル基;アルキル基が約1か
ら8までの炭素原子を有するによるジアルキルアミノ基;またはアリール基が約6
から10までの炭素原子を有するによるジアリールアミノ基、例えば、フェニル、
メチルフェニル、エチルフェニル、等としてもよい。
本発明について有用なラジカル伝達薬剤は、酵素の基質である任意の化合物、
すなわち、酵素の活性部位と反応し、置換またはより置換芳香族の基質から水素
原子を離脱させる、ラジカルを生成し、二量体が形成される任意の化合物である
。好ましくは、ラジカル伝達薬剤は、芳香族化合物からのヒドロキシの水素原子
がペルオキシダーゼにより離脱させられ、水素原子を効率的に離脱させるラジカ
ルを生成するフェノール化合物である。もっとも好ましくは、ラジカル伝達薬剤
は、フェノールであるが、他のフェノール、チオフェノール、またはアニリンと
用いることができる。例えば、ラジカル伝達薬剤には、モノ−アルキルフェノー
ル、例えば、パラ−ｔ−ブチルフェノール、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、
ｐ−クレゾール、ｐ−ブチルフェノール、等;ｐ−フェニルフェノール;ビスフェ
ノール−Ａ;ハロゲン化フェノール、例えば、ｐ−クロロフェノール等;も有用で
ある。ここでラジカ
ル伝達薬剤は、ラジカル伝達薬剤により生成されたラジカルは、置換芳香族の基
質から水素原子を離脱させ、その結果、生成されたフェノキシラジカルは、ラジ
カル伝達薬剤により生成されたラジカルよりさらに安定であるフェノキシラジカ
ルを生じるため二量体に取り込むものではないと思われる。ラジカル伝達薬剤は
、再生される一方、芳香族の基質からのさらに安定なラジカルによって二量体化
される。
使用されるラジカル伝達薬剤の量は置換芳香族化合物の濃度と性質に依存し、
式(Ｉ)の芳香族化合物に対し、一般には、約1から20％、典型的には、約2から4
％である。
本発明には、種々のペルオキシダーゼが有効に利用される。好ましいペルオキ
シダーゼは、ダイズペルオキシダーゼであるが;その他のペルオキシダーゼ、例
えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、マメ科植物、例えば、エンドウマメ、クラ
スタマメ、ヒヨコマメ及びランナーマメからのペルオキシダーゼも使える。米か
らのペルオキシダーゼ及び、アオイ科の植物、例えば、綿からのペルオキシダー
ゼも使用でき、微生物のペルオキシダーゼも同様に使用でき、合成酵素、組み換
えＤＮＡにより生産された酵素も使用できると思われる。
使用する酵素の量は、多くの因子、例えば、用いる特定の置換芳香族類、反応
温度、pＨ等に依存する。本発明において有用な酵素の量は、一般に、芳香族化
合物の1グラム当たり10からプルプロガリン単位である。フェノール単量体の溶
液にほぼ等しいボリュウムで加えられるようなおおよその濃度に酵素溶液を調製
するのが一般に望ましいが、これは必ずしも必要ではなく、場合によっては、大
きく異なる場合がある。
本発明に用いられる過酸化物は、典型的には、過酸化水素であるが、他の過酸
化物も使用できる。潜在的に有用な他の過酸化物の例としては、メチル過酸化物
、エチル過酸化物等が含まれる。過酸化物は、置換芳香族の基質1molに対し、約
0.1から2.5molの総量及び、さらに典型的に、置換芳香族の基質1molに対し、約0
.1molから1.0molで反応させられる。芳香族化合物の性質に応じて、溶液に近い
または溶液として反応させられる。高濃度の過酸化物は反応を阻害するから、過
酸化水素は好ましくは濃度が1mＭから10mＭまでで水に溶解され、反応媒体に、
一定の速度または次に述べるように単量体の量が減少するのに伴って初期速
度から減少する速度で添加される。過酸化物の溶液を添加する初期速度(mol/min
.)は、平均反応速度の約２倍に設定される。典型的には、過酸化物は最初は、1m
ol当たり置換芳香族の基質7mＭ／min.のポンプの添加速度により添加され、その
後、添加速度は、置換芳香族の基質の反応に伴う反応速度の減少並びに低い芳香
族の基質濃度に対して、低めに調節される。反応における過酸化物の濃度が12m
Ｍに越えず、好ましくは、3から5mＭにするように調節される。
反応は、水性媒体、例えば、水または水と水に可溶もしくは不溶な有機溶媒の
混合物において行われる。溶媒が水と有機溶剤の混合物のときは、典型的には、
約60％まで、好ましくは30％までの量で存在する。有用な有機溶剤の代表的な例
として、ヘキサン、トリクロメタン、メチルエチルケトン、エチル酢酸塩、ブタ
ノール、エタノール、メタノール、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロ
フラン(THF)、ジメチルホルムアミドメチルギ酸塩、アセトン、ｎ−プロパノー
ル、イソプロパノール、ｔ−ブチルアルコール等並びにその混合物があげられる
。
置換された芳香族の単量体は、一般には水に溶けないので、約35℃から60℃ま
で高い温度、典型的には、45℃から60℃までの温度が芳香族の基質を反応媒体中
に分散させるために用いられ、その後完全に混合される。また、望ましくは、基
質の反応媒体に界面活性剤を加え、芳香族の基質の分散を改善することによって
、反応を改善する。
本発明に従って生成されたテトラ置換芳香族の二量体は、種々の用途を有し、
例えば、エポキシ樹脂、難燃性素材、抗酸化物、ポリエステル、ポリカーボネー
トの製造、及び芳香族の二量体が使用される他の用途にも有用である。
次に、本発明を次の非限定的な実施例によって、さらに具体的に説明する。
実施例１
85グラム(410mＭ)の2,4−ジ−tert−ブチルフェノール、0.5グラム(5mM)のフ
ェノール、40ml(15,000ppu)のダイズペルオキシダーゼ溶液(375ppu/ml)及び90ml
の脱イオン水を機械的な攪拌機が装備され、水ジャソケットをもつ３首の丸底し
たフラスコに加え、55℃まで昇温した。また、反応の過程で水酸化ナトリウムを
連続に加え、pＨを7.5及び8.5の間に維持した。反応混合物は塩酸で中和し、
未反応単量体及び副産物を濾過して除去した。乾燥した後、81グラムの2,4−ジ
−tert−ブチルフェノールニ量体を95％の収量で得た。
実施例２
122グラムの2,6−ジメチルフェノールと6グラムのフェノールを、48℃で撹拌
しながら、200mlのダイズペルオキシダーゼ溶液(17.080ppu単位)を加えた。反応
混合物に36mlの35％過酸化水素を6時間かけて添加する。過酸化水素の添加が完
了したところで、反応混合物を100℃で1.5時間加熱した。生成物を濾過によって
回収し、30℃で30分間200mlトルエンで2回洗浄し、未反応単量体及びポリフェニ
レン酸化物を除去した。乾燥した後、88グラムのテトラメチルビフェニル、24グ
ラムの単量体及び8グラムのポリフェニレン酸化物を回収した。
実施例３
122グラムの2,6−ジメチルフェノール及び6グラムのフェノールを60mlのメタ
ノールに溶解し、51℃で撹拌しながら、140mlのダイズペルオキシダーゼ溶液(9,
150ppu単位)に加える。反応混合物に32mlの35％過酸化水素を3時間かけて添加し
た。過酸化水素の添加完了後、メタノールを蒸留で除去し、30℃で、30分間200m
lのトルエンで2回洗浄した。乾燥後、67グラムのテトラメチルビフェニル、35グ
ラムの単量体及び19グラムのポリフェニレン酸化物を回収した。
本発明を詳細にかつその好適な実施態様を参照しながら説明したが、請求の範
囲に記載された発明の範囲を逸脱しないように変形並びに変更を行うことができ
ることは明らかである。Detailed Description of the Invention Method of Biocatalytic Coupling of Aromatic Compounds in the Presence of Radical Transfer Agent Background of the Invention The present invention relates to the biocatalytic coupling of aromatic compounds such as phenol, thiophenol and aniline. More particularly, the present invention relates to a method for coupling and dimerizing a sterically hindered aromatic compound in the presence of a peroxidase enzyme, a peroxide and a radical transfer agent. The biocatalytic oxidative coupling of phenols using horseradish or soybean peroxidase is disclosed in US Pat. No. 4,900,671 to Pokora et al. And US Pat. No. 5,188,953 to Johnson et al. Dimerization of dialkyl and diarylphenols, e.g., 2,4-dialkylphenol, 2,6-dialkylphenol, is discussed in co-pending U.S. application Ser.No. 08 / 379,202, filed Jan. 27, 1995. ing. Klibanov et al., "Enzymatic removal of toxic phenols and anilines from wastewaters" of Appl. Biochem. 2,414-421 (1980) teaches the co-polymerization and precipitation of horseradish peroxidase of phenol and aniline from wastewater, and the ability to remove phenols that are difficult to remove from wastewater is readily available. It was disclosed that it was enhanced by the presence of phenols that could be removed. The product is believed to be a mixed polymer containing both hard-to-remove phenols and easy-to-remove phenols. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is an improvement over the methods taught in U.S. Patents 4,900,671 and 5,188,953, which do not efficiently reach the active site of the enzyme (e.g., due to steric inhibition), do not respond to peroxidase, or Some aromatic compounds that are poorly reacted by peroxidase can react by the introduction of radical transfer agents. According to a particular embodiment of the invention, the 2,4- and 2,6-disubstituted aromatic compounds react in the presence of peroxidase, peroxide and radical transfer agent to form the dimer in excellent yield. provide. The present invention is particularly useful for the reaction of 2,4- and 2,6-disubstituted aromatics which do not react with peroxidase itself, possibly due to sterically hindered groups near the phenolic hydroxy. Useful. These compounds react little or no at all in the absence of radical transfer agents. The radical transfer agent is characterized in that it is a substrate for the enzyme. It is not sterically hindered and can reach the enzyme's active site, where it is oxidized to form radicals. The radical reacts with the aromatic compound to release a hydrogen atom, thereby generating a radical of the aromatic compound. Surprisingly, radical transfer agents do not appear to couple in significant amounts with substituted aromatics. There are few cases where chemically linked radical transfer agents are found in the dimer product. According to a preferred embodiment of the present invention, the aromatic compound is a 2,4- or 2,6-disubstituted phenol, thiophenol or an aromatic amine such as aniline. The 2,4- or 2,6-aromatic compound is reacted with phenol as a radical transfer agent, preferably in the presence of soy peroxidase and hydrogen peroxide to provide the corresponding dimer. The present invention relates to 2,4 and 2,6-disubstituted phenols with 3,3 ', 5,5'-tetrasubstituted-biphenyl-2,2'diol and 3,3', 5,5'-tetrasubstituted- It is particularly useful in converting to biphenyl-4,4'diol, respectively. Accordingly, an object of the present invention is a process for the dimerization of certain substituted aromatic monomers selected from the group consisting of phenols, thiophenols and anilines, in particular 2,4- or 2,6-di- It is an object of the present invention to provide a method for dimerizing a substituted aromatic monomer into a corresponding tetra-substituted dimer using a phenol or other peroxidase substrate as a radical transfer agent. Another object of the present invention is to provide sterically hindered aromatic compounds such as di-tert-alkyl-substituted phenols, thiophenols and anilines with peroxidase enzymes, peroxides and radical transfer agents in aqueous media. It is an object of the present invention to provide a method for dimerization in a state where it has been performed. Other objects and advantages of the invention will be apparent from the following description and the appended claims. DEFINITIONS The term "purporogallin units" of a peroxide refers to a solution containing 110 mM potassium phosphate, 44 mM pyrogallol and 8 mM hydrogen peroxide and having a light path length of 1 cm and 420 nm when added to a solution having a pH of 6. Means the amount of peroxide that produces a change in absorbance of 12 units, measured in 1 minute (Sigma Chemical Co., Peroxidase Bulletin). DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION According to the practice of the present invention, an aromatic compound of formula (I) is reacted in the presence of peroxidase, peroxide and a radical transfer agent to form the corresponding dimer. The aromatic compound is a substituted phenol, thiophenol or aniline and can be generally represented by the formula (I). In the formula, X represents -OH, -SH or -NHR, R is H, an alkyl group or an aryl group; R 1 and R 2 are an alkyl group, an aryl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alicyclic group A halogen atom, an alkoxy group, an allyloxy group, a hydroxy group, a formyl group or an amino group, for example, a dialkylamino group or a diarylamino group; R 3 and R 4 may be the same as defined for R 1 and R 2 ; It may represent, the invention is particularly useful for the dimerization of 2,4- or 2,6-di-substituted aromatic compounds, where R 3 and R 4 are hydrogen. Another particularly useful aspect of the present invention is that the aromatic compound is a 2,4- or 2,6-disubstituted branched, alkyl or aryl phenol, especially 2,4- or 2,6-di-t-. In the case of butylphenol, the resulting diol is 3,3 ', 5,5'tetra-t-butyl-biphenyl-4,4'diol. Those skilled in the art will appreciate that where the substituents on a compound are typically the same, a mixture of a compound having two different substituents and an aromatic compound having different substituents will react similarly. Although it is not desirable to limit the invention by a particular mechanism, the present invention illustrates the dimerization reaction of 2,4-disubstituted phenol (A) and 2,6-disubstituted phenol (B). Involved in the following reaction formula (A or B): Enzyme E reacts with phenol (II) to release hydrogen from the hydroxyl group and produce phenoxy radical (III). The phenoxy radical (III) releases phenolic hydrogen from the unreacted or only slightly reacted phenolic substrate (IV) or (VII), regenerates phenol (II), and newly substituted phenol radical (V) Or (VIII) (disclosed as resonance structures (Va) and (Vb) or (VIIIa) and (VIIIb)). In the reaction of the 2,4-disubstituted phenol, the reaction proceeds via the structure (Vb) to produce a new dimer product (VI). In the reaction of the 2,6-disubstituted phenol, the reaction proceeds via the structure (VII Ib) to form an intermediate quinone (IX), which is reduced by the monomeric substrate (VII) or phenol (II), Or directly from the substituted phenol radical (VIIIb) to the corresponding dimer (X). The performance of the aromatic substrate reaction can use a number of different methods. Aromatic substrate, enzyme and peroxide solutions are prepared individually and weighed into reaction vessels, or premixed aromatic substrate and enzyme solution, then add peroxide slowly . Alternatively, the enzyme and the aromatic substrate can be dissolved in a common solvent to which the peroxide is later added. One skilled in the art will appreciate that many different reaction / mixing procedures are useful. In a preferred procedure, the peroxide is added at a controlled rate that is approximately equal to the rate at which the peroxide is consumed so that the concentration of peroxide does not inhibit the reaction and deactivate the enzyme. In general, the reaction is carried out by adding a substituted aromatic substrate and a radical transfer agent to a reaction medium containing a peroxidase enzyme. The peroxide is added at a predetermined rate until the reaction is complete or almost complete. Smaller amounts of the radical transfer agent can be used by weighing the appropriate concentration of the radical transfer agent and using the same proportions as the peroxide loading. The biocatalytic reaction of 2,6-disubstituted phenols as described in co-pending application Ser. Jan. 27, 1995, U.S. Pat. And a corresponding quinone are formed in a first step, and in a second step the quinone is reduced to the desired diol at higher temperatures. The reducing agent is preferably a phenolic substrate from which quinone is derived. Quinone by-products can also be produced in the present method. Quinones can be reduced by either phenolic substrates or radical transfer agents. The biocatalytic reaction of the 2,4-disubstituted phenol yields the desired tetra-substituted phenol without forming quinone. The concentration of the aromatic compound used in the reaction is not particularly important. Typically, an amount of about 3 mol is used, but typically 1 to 2 mol concentration is sufficient. The invention is most valuable when applied to the reaction of 2,4- or 2,6-disubstituted aromatics. In formula (I), the substituents defined by R 1 and R 2 further include alkyl groups having about 1 to 8 carbon atoms, such as methyl, ethyl, butyl, tert-butyl, hexyl, and the like; Aryl groups having 6 to 10 carbon atoms, e.g. phenyl, naphthyl, phenyl also containing alkyl substituents; alkenyl groups containing about 2 to 8 carbon atoms and having one or more sites of unsaturation An alkynyl group containing about 2 to 8 carbon atoms and having two or more sites of unsaturation; an alicyclic group having about 5 to 10 carbon atoms, e.g., cyclopentane, cyclohexane, cyclooctane An alkoxy group having about 1 to 8 carbon atoms, such as methoxy, ethoxy, butoxy, etc .; an allyloxy group having about 6 to 10 carbon atoms, e.g. For example, phenoxy, methylphenoxy, ethylphenoxy, butylphenoxy, etc .; formyl groups; dialkylamino groups where the alkyl group has about 1 to 8 carbon atoms; or where the aryl group has about 6 to 10 carbon atoms. It may be a diarylamino group, for example, phenyl, methylphenyl, ethylphenyl, and the like. Radical transfer agents useful for the present invention include any compound that is a substrate for an enzyme, i.e., reacts with the active site of the enzyme to generate a radical that releases a hydrogen atom from a substituted or more substituted aromatic substrate; Any compound from which a dimer is formed. Preferably, the radical transfer agent is a phenolic compound in which the hydrogen atom of the hydroxy from the aromatic compound is released by peroxidase, generating a radical that efficiently releases the hydrogen atom. Most preferably, the radical transfer agent is phenol, but can be used with other phenols, thiophenols, or anilines. For example, radical transfer agents include mono-alkylphenols such as para-t-butylphenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-butylphenol, etc .; p-phenylphenol; bisphenol-A; halogenated phenol , For example, p-chlorophenol and the like; Here, the radical transfer agent, the radical generated by the radical transfer agent, releases a hydrogen atom from the substituted aromatic substrate, and as a result, the generated phenoxy radical is more stable than the radical generated by the radical transfer agent. It is believed that the phenoxy radical is not incorporated into the dimer because it produces the phenoxy radical. Radical transfer agents are regenerated while being dimerized by more stable radicals from aromatic substrates. The amount of radical transfer agent used depends on the concentration and nature of the substituted aromatic compound, and is generally about 1 to 20%, typically about 2 to 4%, based on the aromatic compound of formula (I). %. In the present invention, various peroxidases are effectively used. The preferred peroxidase is soybean peroxidase; however, other peroxidases, such as horseradish peroxidase, legumes such as pea, cluster beans, chickpeas and runner beans, can also be used. It is contemplated that peroxidase from rice and peroxidase from mallow plants, such as cotton, may be used as well as microbial peroxidase, as well as synthetic enzymes and enzymes produced by recombinant DNA. The amount of enzyme used depends on many factors, such as the particular substituted aromatics used, reaction temperature, pH, and the like. The amount of enzyme useful in the present invention is generally from 10 to purpurogallin units per gram of aromatic compound. It is generally desirable to prepare the enzyme solution to an approximate concentration such that it is added at a volume approximately equal to the solution of the phenolic monomer, but this is not necessary and in some cases can vary widely. The peroxide used in the present invention is typically hydrogen peroxide, but other peroxides can be used. Examples of other potentially useful peroxides include methyl peroxide, ethyl peroxide, and the like. The peroxide is reacted in a total amount of about 0.1 to 2.5 mol per mol of the substituted aromatic substrate, and more typically about 0.1 to 1.0 mol per mol of the substituted aromatic substrate. Depending on the nature of the aromatic compound, the reaction may be close to or as a solution. Since high concentrations of peroxide inhibit the reaction, hydrogen peroxide is preferably dissolved in water at a concentration of 1 mM to 10 mM and the reaction medium has a constant rate or amount of monomer as described below. It is added at a rate that decreases from the initial rate as it decreases. The initial rate (mol / min.) Of adding the peroxide solution is set to about twice the average reaction rate. Typically, the peroxide is initially added at a pump addition rate of 7 mM / min. Of the substituted aromatic substrate per mole, after which the addition rate is determined by the reaction rate associated with the reaction of the substituted aromatic substrate. To a lower concentration as well as lower aromatic substrate concentrations. The concentration of peroxide in the reaction is adjusted so that it does not exceed 12 mM, preferably between 3 and 5 mM. The reaction is carried out in an aqueous medium, for example, water or a mixture of water and a water-soluble or insoluble organic solvent. When the solvent is a mixture of water and an organic solvent, it is typically present in an amount up to about 60%, preferably up to 30%. Representative examples of useful organic solvents include hexane, trichloromethane, methyl ethyl ketone, ethyl acetate, butanol, ethanol, methanol, dioxane, acetonitrile, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide methyl formate, acetone, n-propanol, isopropanol , T-butyl alcohol and the like, and mixtures thereof. Since substituted aromatic monomers are generally insoluble in water, elevated temperatures from about 35 ° C to 60 ° C, typically from 45 ° C to 60 ° C, cause the aromatic substrate to react with the aromatic medium. Used to disperse therein and then thoroughly mixed. Also, desirably, the reaction is improved by adding a surfactant to the substrate reaction medium to improve the dispersion of the aromatic substrate. The tetra-substituted aromatic dimers produced according to the present invention have a variety of uses, such as the production of epoxy resins, flame retardant materials, antioxidants, polyesters, polycarbonates, and aromatic dimers. It is also useful in other applications where is used. Next, the present invention will be described more specifically by the following non-limiting examples. Example 1 85 grams (410 mM) of 2,4-di-tert-butylphenol, 0.5 grams (5 mM) of phenol, 40 ml (15,000 ppu) of a soybean peroxidase solution (375 ppu / ml) and 90 ml of deionized water were mechanically combined. A three-necked round-bottomed flask equipped with a water stirrer and equipped with a water stirrer, was heated to 55 ° C. Also, sodium hydroxide was added continuously during the course of the reaction to maintain the pH between 7.5 and 8.5. The reaction mixture was neutralized with hydrochloric acid, and unreacted monomers and by-products were removed by filtration. After drying, 81 grams of 2,4-di-tert-butylphenol dimer were obtained in 95% yield. Example 2 122 grams of 2,6-dimethylphenol and 6 grams of phenol were added with stirring at 48 ° C while 200 ml of a soybean peroxidase solution (17.080 ppu units) was added. To the reaction mixture is added 36 ml of 35% hydrogen peroxide over 6 hours. When the addition of hydrogen peroxide was complete, the reaction mixture was heated at 100 ° C. for 1.5 hours. The product was collected by filtration and washed twice with 200 ml toluene at 30 ° C. for 30 minutes to remove unreacted monomer and polyphenylene oxide. After drying, 88 grams of tetramethyl biphenyl, 24 grams of monomer and 8 grams of polyphenylene oxide were recovered. Example 3 122 grams of 2,6-dimethylphenol and 6 grams of phenol are dissolved in 60 ml of methanol and added to 140 ml of soybean peroxidase solution (9,150 ppu units) with stirring at 51 ° C. To the reaction mixture was added 32 ml of 35% hydrogen peroxide over 3 hours. After the addition of hydrogen peroxide was completed, methanol was removed by distillation, and the mixture was washed twice with 200 ml of toluene at 30 ° C. for 30 minutes. After drying, 67 grams of tetramethyl biphenyl, 35 grams of monomer and 19 grams of polyphenylene oxide were recovered. Although the present invention has been described in detail and with reference to preferred embodiments thereof, it will be apparent that variations and modifications can be made without departing from the scope of the invention as set forth in the appended claims.
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(72)発明者 ボロヴスキー，ジョセフ
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(72)発明者 ポコラ，アレクサンダー
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(72) Borovsky, Joseph
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(72) Inventor Pokola, Alexander
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