JPH11501511A

JPH11501511A - 核酸結合パートナーの結合特性の調節

Info

Publication number: JPH11501511A
Application number: JP8526598A
Authority: JP
Inventors: オルム，ヘンリック; レステル，アン−ウレルプ
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー
Priority date: 1995-03-04
Filing date: 1996-03-04
Publication date: 1999-02-09
Also published as: ATE201453T1; US7682786B1; EP0815259A1; DE69612970T2; EP0815259B1; WO1996027679A1; DK0815259T3; US20090325301A1; DE69612970D1; ES2157426T3

Abstract

(57)【要約】標的とプローブとの複合体を形成するために、該標的を他の標的存在下で、該標的と結合可能な該プローブと接触させることによる該標的の存在の特異的決定方法であって、該接触を該結合の特異性を高める化合物の存在下で行なうか、または、形成した複合体が該結合特異性を高める化合物と接触する。この方法は、診断アッセイにおいて関連した核酸間のよりよい識別への道を開く。

Description

【発明の詳細な説明】核酸結合パートナーの結合特性の調節本発明は、核酸または別の非天然性核酸結合パートナーへの結合により核酸または非天然性核酸結合パートナーの存在を特異的に決定する方法、核酸または非天然性核酸結合パートナーの検出方法、核酸の識別方法ならびにこれらの方法で調製され、かつ、これらの方法に有用な組成物に関する。すべてのＤＮＡ診断方法の基礎をなすものは、可逆的変性を被る相補的核酸のユニークな能力である。したがって、適当な条件下でＤＮＡプローブを核酸複合混合物と混合する場合、ＤＮＡプローブはその相補的標的配列を捜し出し、それにに対してのみ結合する。診断プローブの適性を述べるために用いられる２つの重要なパラメーターは、親和性と特異性である。親和性は、その標的配列に対するプローブの結合力の尺度であり、特異性は、完全に相補的な標的配列とミスマッチした標的配列とを識別する能力の尺度である。実際、高特異的プローブの使用は、間違った実在を生じるリスクを最小にするが、高親和性プローブの使用は、プローブ／標的複合体を冗長な手順から生き残らせるので感度を最大にする。現在まで、核酸類似体または非天然性核酸結合パートナー（ＮＮＮＢＰｓ）に対する多くの提案がなされてきた。しかしながら、いわゆるペプチド核酸類（ＰＮＡｓ、国際公開第９２／２０７０３号パンフレット）のみが、治療および診断の両方に使用するために価値あるものであることが示されている。標準的な核酸と比べて、ＰＮＡは、その標的核酸に対して親和性および特異性の両方が増大している。したがって、ＰＮＡは、診断プローブとしてはＤＮＡより優れている。本発明は、反応混合物にある種の成分を添加することにより、ＰＮＡの特異性をさらに増大させ、したがって、診断アッセイにおけるＰＮＡの有用性をさらに増大させることができることを記載する。ユージンピー．ゴールドバーグ(Eugene P．Goldberg)とアキオナカイマ(A kio Nakaima)により編集されたバイオメディカルポリマー（１９８０）２７１〜２９７頁において、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がポリヌクレオチドのビニルアナログ内にインターカーレートし、このインターカーレーションが、ビニルアナログに核酸等のポリアニオンへの結合（親和）力をかなり減少させる負の電荷を与えることを開示している。本発明の目的は、一般的にはＮＮＮＢＰｓおよび具体的にはＰＮＡｓを用いて核酸アッセイを改良することにある。本発明の主題は、１または複数の標的と１または複数のプローブとの複合体を形成するために、該１または複数の標的に結合可能な該１または複数のプローブを用いて決定対象外の１または複数の標的の存在下で、該１または複数の標的と接触させることにより、該１または複数の特定の標的の存在を特異的に決定する方法であり、その方法において、ａ）該結合の特異性を高める化合物の存在下で接触を行ない、またはｂ）形成した複合体を、該結合の特異性を高める化合物と接触させる。本発明のさらなる目的は、該結合を行なうための試薬および該結合の特異性を高める化合物の使用である。１または複数の標的および１または複数のプローブは、塩基対形成により互いに結合可能であり、核酸または非天然性核酸結合パートナー（ＮＮＮＢＰ）のいずれかである。両方とも核酸である１または複数のプローブおよび１または複数の標的の組み合わせは、排除される。本発明において、核酸は、糖およびリン酸部分のバックボーンならびに該バックボーンに結合した塩基Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｕおよび任意に修飾された塩基を含む標識または非標識デオキシリボ核酸もしくはリボ核酸である。核酸は、いかなる所望の起源であってもよい。核酸は、生物から単離されても生物に存在していてもよい。生物としては、例えば、ウイルスおよび細菌ばかりでなく、動物、植物またはヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。核酸は、例えば、生物から抽出もしくは濃縮による等の種々の方法により得ることが可能であり、または、例えば、増幅もしくはｃＤＮＡ生成により産生することができる。また、核酸は、化学合成することも可能である。本発明の方法の初期において、核酸は、二本鎖または一本鎖核酸として存在することが可能である。一本鎖であることが好ましく、または加熱もしくは低イオン強度による変性等の公知の方法により一本鎖にすることが好ましい。核酸またはＮＮＮＢＰいずれかに存在するバックボーンは、それぞれ、特異的ヌクレオ塩基を保持する少なくとも２つの実質的に同一のユニット構造である。天然に存在するバックボーンは、糖リン酸バックボーンである。このものは、リン酸の位置で(Acc．Chem．Res．1995，28，366-374)または糖の位置で(Acc．Che m．Res．1995，28，366-374)または繰り返しユニットとしてモルホリン(Acc．Ch em．Res．1995，28，366-374)、ビニル(Acc．Chem．Res．1995，28，366-374)もしくは偽ペプチド(Science 1991，254，1497-1500)部分を用いることによるより劇的な変化で修飾することができる。決定対象外の標的は、特に、標的とは塩基配列が異なる核酸である。後記のいくつかの場合において、決定対象の標的および決定対象外の標的は、関連標的または関連核酸と称される。例えば、病気または病原体を示唆する核酸の決定の場合、決定対象外の標的は、健常人には存在しない核酸であり、健康状態における核酸とは塩基配列が異なるものであってもよい。ＮＮＮＢＰｓは、塩基対形成により核酸と結合可能な天然に存在しない分子である。さらに、ＮＮＮＢＰｓは、少なくともバックボーン中で核酸とは構造上異なるものと定義される。バックボーンに、好ましくは非天然性の部分の添加または該バックボーン、好ましくは他の部分によるリン酸および／または糖部分の成分の１以上もしくはすべての置換で、構造上の相違を生じさせることができる。本発明によれば、ＮＮＮＢＰｓは、核酸の塩基とＮＮＮＢＰの塩基間の水素結合を介する（好ましくは特異的）塩基対形成により核酸に結合するものと定義され、従って、複合体を形成する。塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ等の天然のヌクレオ塩基または天然の核酸に存在しないが、例えば、Ｓ、ＮＨもしくはＣＨ₂によるＯの置換等の原子の置換によるか、例えば、ＮＮＮＢＰの塩基と核酸もしくはＮＮＮＢＰの対応する塩基間の水素結合に関するか影響する原子の誘導等の基の添加により天然物から派生した複素環塩基である。最も好ましい複合体は、ＮＮＮＢＰの１つの鎖および核酸の１つの鎖またはＮＮＮＢＰの２つの鎖および核酸の１つの鎖を含む。第１の（好ましい）場合において、複合体は二重らせんと呼ばれ、第２の場合において、複合体は三重らせんと呼ばれる。従って、ＮＮＮＢＰｓは、下記一般式を有するものとして定義することができる、ＢＢ（−Ｌ）_n （式０）式中、ＢＢは核酸とは異なるバックボーンであり、およびＬは、天然のヌクレオ塩基または天然の核酸に存在しない複素環塩基の群から選ばれる。ｎは、２〜１００の自然数である。ＢＢおよびＬの両方は、ＮＮＮＢＰのその相補的核酸への結合力を破壊させない部分により置換または未置換されてもよいと理解される。特に、ＮＮＮＢＰをプローブとして用いた場合、それは、標識を保持してもよい。従って、かかるプローブは、下記式の化合物として定義することができる、（ＢＢ（−Ｌ）_n）（標識）_o （式００）式中、ＢＢ、Ｌおよびｎは、前記定義の通りであり、および標識は直接もしくは間接的な検出基または固定可能な基であり、およびｏは、１以上、好ましくは１〜５の自然数である。ＮＮＮＢＰｓは、天然の核酸類似体と比較して、相補的核酸に対してより高親和性を有することが好ましい。いくつかのＮＮＮＢＰｓについては、Recueil 91 ，1069-1080(1971)，Methods in Molecular Biology 29，355-389(1993)，Tetra hedron 31，73-75(1975)，J．Org．Chem．52，4202-4206(1987)，Nucl．Acids R es．17，6129-6141(1989)，Unusual Properties of New Polymers(Springer Ver lag 1983)，1-16，Specialty polymers(Springer Verlag 1981，1-51、国際公開第92/20823号パンフレット、国際公開第94/06815号パンフレット、国際公開第86 /05518号パンフレットおよび国際公開第86/05519号パンフレットに要約されている。これらは、ペプチドおよび非ペプチド化合物である。ＮＮＮＢＰは、荷電または非荷電分子であってもよい。ＮＮＮＢＰｓは、天然の核酸よりも少ない電荷を保持していることが好ましく、本質的に非荷電ＮＮＮＢＰｓが最も好ましい。最も好ましいＮＮＮＢＰｓは、糖／リン酸バックボーンを含まないが、例えば、国際公開第92/20702号パンフレットおよび国際公開第92/20703号パンフレットに記載のようにペプチドバックボーンを含む。好ましいＮＮＮＢＰｓは、該バックボーンに沿ってスペースを空けた位置に多数の塩基を生じるポリアミドバックボーンからなる化合物であり、該バックボーンの窒素原子に結合した各塩基、相補的塩基配列を有する核酸と結合して、ＮＮＮＢＰと類似の核酸とその相補的核酸間の複合体よりも、例えば、加熱または低イオン強度による変性に対してより安定な複合体を形成可能な化合物である。下記一般式を有する化合物が特に好ましい、ｎは、少なくとも２であり、各Ｌ¹〜Ｌⁿは、独立に、水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜４のアルカノイル基、天然のヌクレオ塩基、非天然のヌクレオ塩基、芳香族部分、ＤＮＡインターカーレーター、ヌクレオ塩基結合基、複素環部分、レポーターリガンドおよびキレーティング部分からなる群より選ばれる；各Ｃ¹〜Ｃⁿは、(ＣＲ⁶Ｒ⁷)_y（好ましくはＣＲ⁶Ｒ⁷、ＣＨＲ⁶ＣＨＲ⁷またはＣＲ⁶ Ｒ⁷ＣＨ₂）であり、式中、Ｒ⁶は水素原子であり、Ｒ⁷は、天然のα−アミノ酸の側鎖からなる群より選ばれたものであり、または、Ｒ⁶およびＲ⁷は、独立に、水素原子、炭素数２〜６のアルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルチオ基、ＮＲ³Ｒ⁴およびＮＲ⁵からなる群より選ばれ、式中、Ｒ³およびＲ⁴は、下記に定義された通りであり、そして、Ｒ⁵は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基またはアルキルチオ置換炭素数１〜６のアルキル基であり、または、Ｒ⁶およびＲ⁷は、一緒になって脂環系または複素環系を完成させる；各Ｄ¹〜Ｄⁿは、(ＣＲ⁶Ｒ⁷)_z（好ましくはＣＲ⁶Ｒ⁷、ＣＨＲ⁶ＣＨＲ⁷またはＣＨ₂ ＣＲ⁶Ｒ⁷）であり、式中、Ｒ⁶およびＲ⁷は、前記定義の通りである；各ｙおよびｚは、０または１〜１０の整数であり、ｙ＋ｚの合計は、少なくとも２、好ましくは２より大きいが１０以下である；各Ｇ¹〜Ｇ^n-1は、別の配向で、−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³Ｃ⁵−、−ＮＲ³ＳＯ−、または−ＮＲ³ＳＯ₂−であり、式中、Ｒ³は下記に定義された通りである；各Ａ¹〜ＡⁿおよびＢ¹〜Ｂⁿは、以下にように選ばれる：（ａ）Ａは、式(IIa)、(IIb)、(IIc)もしくは(IId)の群であり、Ｂは、ＮもしくはＲ³Ｎ⁺である；または（ｂ）Ａは式(IId)の群であり、ＢはＣＨである；式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂である；Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴である；各ｐおよびｑは、０または１〜５の整数であり、ｐ＋ｑの合計は、１０以下である；各ｒおよびｓは、０または１〜５の整数であり、ｒ＋ｓの合計は、１０以下である；各Ｒ¹およびＲ²は、独立に、水素原子、ヒドロキシ−もしくはアルコキシ−もしくはアルキルチオ−置換されてもよい炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アミノ基およびハロゲンからなる群より選ばれる；そして各Ｒ³およびＲ⁴は、独立に、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシ −もしくはアルコキシ−もしくはアルキルチオ−置換炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキルチオ基およびアミノ基からなる群より選ばれる；そしてＱは、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＳＯ₃Ｈまたは−ＳＯ₂−ＮＲ’Ｒ” または−ＣＯ₂Ｈもしくは−ＳＯ₃Ｈの活性化誘導体であり、そして、Ｉは、−ＮＲ’Ｒ”であり、式中、Ｒ’およびＲ”は、独立に、水素原子、アルキル基、アミノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレート化剤、ペプチド、蛋白質、炭水化物、脂肪、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸、ヌクレオチド三リン酸、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドならびに可溶性および不溶性ポリマーからなる群より選ばれる。また、他の置換基（例えば、アルコキシ基）中のアルキル基について述べると、１〜４個の炭素原子を含むことが好ましく、非環式および非分岐状であることが好ましい。本発明の反応基は、標識を付加するために用いることができる基または固相にプローブもしくは標的を固定させるために用いることができる基である。かかる反応基の例としては、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド−エステル等の活性化エステルが挙げられる。アミノ保護基は、例えば、ペプチド合成においてアミノ基を所望しない他の分子との反応から保護するために通常用いられる基である。これらの保護基は、所望ならば、分子の主要成分へのアミノ基の付加を破壊しない方法により除去することができる。適する保護基は、Ｎ−Ｂｏｃまたは類似のものである。インターカーレーターは、二重らせんＤＮＡ中の塩基間にそれ自体を挿入できる分子である。かかるインターカーレーターは、通常、エチジウムブロミドまたはアクリジニウム化合物等のポリ芳香族類である。キレート化剤は、分子を複合化させることができるか、または、複合体が本発明の方法の工程の間に必要としない破壊を受けないようなかかる分子複合体をすでに含む分子である。キレート化剤は、例えば、ルテニウム等の検出可能な金属イオンまたは他の蛍光部分と複合体を形成させることにより、プローブまたは標的を標識するために用いることができる。特に好ましいキレート化剤は、ビピリジル部分により複合体を形成したルテニウムを含む。ペプチドは、レポーターリガンドとして使用したり、プローブに標識を付加するために使用することができる。特に好適なペプチドは、プローブに標識したリン酸基を付加するために用いることができるケンプチド部分である。蛋白質は、例えば、他の部分により認識可能な蛋白質等の特に生物活性蛋白質からなる。かかる認識可能な蛋白質は、例えば、抗体により認識可能な免疫学的に活性な蛋白質である。さらなる生物活性蛋白質は、基質を産物に変換するために用いることができる酵素である。好適な酵素は、例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼである。炭水化物は、プローブを検出可能部分または固相に付加するために用いることができる糖分子である。例えば、糖がレクチンで認識されるように、いくつかの炭水化物は、結合パートナーにより認識される。ステロイドは、検出可能部分または固相等の他の部分にプローブを付加するために、特に有用である。特に好適なステロイドは、試料中に通常存在しないステロイドである。ヌクレオシドは、天然の核酸に通常存在する糖部分および塩基部分を含む部分である。ヌクレオチドは、天然の核酸に通常存在する少なくとも１つのリン酸、１つの糖および１つの塩基部分からなる化合物として一般に呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、２〜５０ヌクレオチド部分の長さを有する核酸として一般に呼ばれる。可溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコールである。非可溶性ポリマーは、プローブの固定化に用いられる化合物である。それらは、例えば、樹脂またはポリスチロールからなる。これらのＮＮＮＢＰｓは、標識、レポーター基またはＮＮＮＢＰｓの固相への結合のための反応基として作用する基を付加していることが好ましい。該基は、ＮＮＮＢＰの塩基部分またはバックボーンに付加していてもよい。塩基部分での修飾は、塩基のどの部位であってもよい。バックボーンの修飾は、どの原子の位置であってもよいが、該バックボーンの末端の一方または両方であることが好ましい。本発明の決定対象の標的は、試料中の存在または量を検出しようとする分子である。大抵の場合、試料に存在する標的の量は、既知ではない。しかし、いくつかの場合では、本発明の方法により標的が存在するか否かだけを決定しなければならないことがあり得る。この場合、存在する標的の量を前もって限定してもよい。しかし、大抵の重要な場合では、標的の量は、決定前には不明かつ限定されず、細胞等の試料中では核酸または核酸含有剤の量とどうにか相関している。それに比べて、プローブは、標的を決定するための手段である。したがって、試料に添加する試薬中のプローブの存在および量は、限定されおよび／または既知である。大抵の場合、プローブの量は、試料に存在することが期待される量より過剰である。したがって、対応する標的へのプローブの結合量は、試料中の標的の存在の判断を与える。インキュベーション後標的に結合しなかったプローブ量を、標的およびプローブ間で形成した複合体から除去することがさらに好ましい。複数の標的および１または複数のプローブ間の複合体形成は、二本鎖核酸ハイブリッドを形成するために核酸のハイブリダイゼーションに通常適用される条件下で起こるが、低塩濃度条件下でも起こる。かかる条件は、国際公開第９２／２０７０３号パンフレットに記載されている。しかし、本発明においては、通常より低塩濃度を用いることが好ましい。好ましい低塩濃度としては、５〜５０ｍＭである。塩は、ハイブリダイゼーション反応に通常適用されるものである。それらは、例えば、カチオンとしてはナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはマンガン等、アニオンとしてはリン酸、硫酸または塩化物等が挙げられる。リン酸ナトリウム等の緩衝性を有する塩が最も好ましい。低塩濃度は、ＮＮＮＢＰのその相補的核酸またはＮＮＮＢＰへの結合と競合する可能性のある核酸／核酸相互作用を不安定化させるので好ましい。また、多くの免疫学的および酵素学的反応は低塩濃度に適合し、よって、反応混合物を変化させることなく生じた複合体を検出ならしめる。最も効果的な方法で本発明を使用するためには、１または複数の標的および１または複数のプローブおよび化合物を、インキュベーションの間、溶液の状態に溶解させる。しかし、該インキュベーションの後、形成した複合体を固相に固定することが可能である。本発明の中核は、ＮＮＮＢＰおよび核酸および／またはＮＮＮＢＰｓ間の結合特異性を高める化合物の使用である。現在まで、核酸相互または核酸のＮＮＮＢＰｓへの結合特異性を調節ならしめる化合物は見出されていない。本発明の方法に使用されるいくつかの化合物は、以前から公知であったけれども、核酸およびその結合パートナー間の結合特異性を効果的に高めるものとして認識されていなかった。本発明によれば、効果的な化合物の１つは、親和性を有する表面への核酸の結合を阻害するために通常用いられるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。さらに、当該技術分野で行なった実験は、当該技術分野で用いたＮＮＮＢＰｓのポリアニオン（核酸もまたポリアニオンである）への親和性が減少したことを示したので、ＳＤＳは、ＮＮＮＢＰｓとともに使用した場合不利でさえあると従来技術で結論された。その結合がＮＮＮＢＰおよびポリアニオン間の反発を生じるＮＮＮＢＰに結合するように思われるので、明らかに、当該技術分野は、結合アッセイでのＳＤＳの使用を思いとどまらせた。しかし、本発明により、例えば、ＳＤＳはＮＮＮＢＰｓの核酸または／およびＮＮＮＢＰｓへの結合特異性を高める予期せぬ性質を有するということがわかった。さらに、ＳＤＳ以外の他の多くの化合物が同様の特性を有することがわかった。好ましい化合物は、少なくとも１つの疎水性部分および少なくとも１つのイオン性または親水性部分を有し、界面活性剤または洗剤の群から選ばれる。界面活性剤を、水溶液の表面張力を低減させる化合物として定義する。洗剤は、イオン性または親水性部分および親油性部分からなる化合物である。界面活性剤および洗剤は、水溶液中でミセルを形成する傾向を有する化合物である。前記化合物は水溶液に可溶性であることが好ましい、なぜなら、核酸およびＮＮＮＢＰｓも水溶液に可溶性であるからである。本発明によれば、全体で電荷を有する化合物が好ましいことが認識された。これらの中で、１以上の負の電荷を有する化合物が、正の電荷を有するよりも好ましい。荷電分子を、水に溶解させたときに対インから実質的に解離する分子として定義し、両性イオン化合物はより好ましくない。非荷電化合物が最も好ましくない。本発明によれば、好ましい化合物は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはドデシル硫酸リチウム（ＬｉＤＳ）およびＤＴＡＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）である。特異性を高めるために必要な化合物の濃度は、用いる化合物によりある範囲まで変えることが可能である。例えば、ＳＤＳは、１．７３ｍＭ〜１７．３４ｍＭのモル濃度に等しい０．０５〜０．５％ｗ／ｖの範囲の濃度で使用することが好ましく、特に好ましい濃度は、好ましくは３．４７ｍＭ〜６．９４ｍＭのモル濃度に等しい０．１〜０．２％である。一般的な規則として、混合物の塩濃度が低い場合は、化合物の濃度は範囲の上限領域にあり、混合物の塩濃度が高い場合または通常のハイブリダイゼーションアッセイでは、化合物の濃度は、範囲の下限領域にある。さらに、プローブ／標的二重らせんの初期Ｔ_Mが低ければ低い程、効果を得るために必要なＳＤＳはより少なくなる。この知見と一致して、各ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの初期Ｔ_Mの、本発明の効果を得るために必要なＳＤＳの濃度に対するプロットに、直線を合わせることができる。さらに、前記ミセル形成に必要な濃度以上の濃度を用いることが好ましい。さらに、ＰＮＡｓ間の結合の場合、これらの二重らせんの初期Ｔ_Mから予想されるよりもやや高めのＳＤＳ濃度が必要であるかもしれない。ＮＮＮＢＰの結合特異性を高める化合物を用いて、核酸またはＮＮＮＢＰｓまたは、ＮＮＮＢＰへの結合を所望しない核酸もしくは非天然性核酸の存在下での核酸もしくは非天然性核酸群さえも特異的に決定することができる。本発明の定義における特異性とは、異なる塩基配列を有する核酸または非天然性核酸を識別する能力として定義される。区別対象の核酸は、ＮＮＮＢＰにとって塩基ミスマチを意味する一定の位置（他の核酸）で少なくとも１つの異なる塩基を含む。この位置は、塩基対形成により核酸またはＮＮＮＢＰと結合したＮＮＮＢＰの塩基の位置内に局在している。もちろん、ＮＮＮＢＰは、核酸への結合には関与しない他の部分を含んでもよい。本発明の方法は、標的およびプローブの種類に応じていくつかの経路により行なうことができる。第１の態様において、標的が核酸で、プローブがＮＮＮＢＰであることが好ましい。このことは、特殊な感染または後天性もしくは先天性遺伝病と相関している核酸を決定するために特に好適な態様であるかもしれない。この場合、標的核酸を含む試料溶液を提供した後、プローブＮＮＮＢＰを試料溶液に添加する。核酸およびＮＮＮＢＰ間の複合体形成は、試料中の標的核酸の存在または量の指標として解釈される。この場合、大抵の決定において、決定前には標的核酸の量は不明である。したがって、複合体形成により得られたシグナルと、この標的核酸およびプローブＮＮＮＢＰの既知の量を含む試料の複合体を測定することにより得られたシグナルとを相関させることが有利である。次いで、このＮＮＮＢＰを検出可能なように標識するか、または、固相に固定ならしめる経路で標識する（この場合さらに検出可能な標識プローブが必要であるかもしれない）ことが好ましい。別の場合、標的およびプローブは両方ともＮＮＮＢＰｓである。これは、分析対象物、特に核酸の存在、不在または量を、標的ＮＮＮＢＰの存在、不在または量により間接的に決定する場合であるかもしれない。今度は、標的ＮＮＮＢＰの存在または量は、試料中の分析対象物の存在または不在の指標である。第２のＮＮＮＢＰ（プローブ）を用いて、第１のＮＮＮＢＰの存在、不在または量を決定し、したがって、第２のＮＮＮＢＰは、試料中の分析対象物の存在、不在または量の指標である。この場合、標的ＮＮＮＢＰの量を、試料中の分析対象物の量により定義する。かかる態様の例は、標的ＮＮＮＢＰを分析対象物である核酸またはその断片と結合させることによる核酸の決定である。本発明によれば、この場合、原試料中に含まれる核酸または標的ＮＮＮＢＰのいずれかを、他の核酸またはＮＮＮＢＰから識別することができる。プローブＮＮＮＢＰも、試料溶液中の標的ＮＮＮＢＰと、例えば、決定対象外の核酸であるが類似の塩基配列を有する他の配列とを区別することができる。この場合、プローブＮＮＮＢＰは、標的ＮＮＮＢＰまたはその一部に対して塩基配列が相補的である。第３の態様において、標的はＮＮＮＢＰであり、プローブは核酸である。この場合は、第２の態様と同様であるが、プローブが核酸でありその標的への結合を、決定対象の分析物への標的ＮＮＮＢＰの結合の指標として用いるという点で第２の態様とは異なっている。したがって、本発明の態様において直接および間接の両方の決定が可能である。本発明の目的は、決定対象外の標的と比べて、該標的の塩基配列に対する１または複数のプローブの相補性の違いを用いることである。少なくとも１つの塩基の位置での核酸の相違の例としては、例えば、β−グロビン遺伝子の野生型および鎌型細胞アレル等のアレルが挙げられる。該相違は、突然変異、挿入および欠失により生じることが可能である。本発明により識別できるさらなる標的の例としては、ｐ５３遺伝子の異なる配列が挙げられる。また、本発明の方法を用いて、標的群を決定することができる。標的群が配列において同一である少なくとも１つのセグメントからなるなら、たとえ該標的が実質的に異なる他の配列からなる場合でも、このセグメントを用いて該群すべての標的を一緒に決定することができる。例えば、細菌群（サルモネラ属のメンバー等）は、それらの核酸において同一であるがクラミジア等の他の属の配列とは異なる進化上保存された塩基の範囲を有する。本発明の方法を用いて、配列において密接に関連する標的間を区別することが可能であるということを理解することは重要である。他方、例えば、進化上保存された配列モチーフ等の共通の標的ドメインを共有するなら、異なる配列を有する標的群を決定することが可能である。密接に関連する標的間を区別するために、決定対象外の密接に関連した配列とは配列が異なる該標的のセグメントを選択する。検出対象の標的を他の標的と区別するために、該標的のこのセグメントと相補的となるように、しかし、決定対象外の１または複数の標的の対応する配列とのミスマッチを有するようにプローブの配列を選択しなければならない。さらに、プローブは、１または複数の標的セグメントと相補的なセグメントに加え、１または複数の標的の対応するセグメントに相補的でない１以上のセグメントからなり得る。これらのセグメントは、例えば、他の核酸またはＮＮＮＢＰｓの認識に好適な塩基配列であってもよい。ミスマッチの位置は、標的に結合するプローブのセグメントがこのミスマッチ部位を包含するように選ばれる。もちろん、配列において１以上の違いを含む標的を決定対象外の標的から区別することもできる。本発明の方法によれば、１または複数のプローブの塩基配列を、決定されるべきでない他の標的配列と配列が異なる決定対象の標的セグメントと完全に相補的となるように選ぶ。標的の長さおよびこの結果として、プローブの長さは、結合の親和性および特異性に影響するさらなる手段である。プローブの結合セグメント配列が短くなればなるほど、本質的な特異性が高くなるが、親和性は低くなる。国際公開第９２／２０７０３号パンフレットに記載のペプチド核酸の場合、結合セグメントの長さは、優れた親和性および特異性を有するために１０〜２０塩基であるべきである。１２〜１７塩基の長さが最も好ましい。本発明の１つの中核は、化合物を用いて、プローブおよび相補的標的の複合体ならびに少なくとも１つのミスマッチ塩基対を含むプローブおよび１または複数の標的の複合体の融解温度の差（ΔＴ_m）を増加させることが可能であるという発見である。このことは、関連した核酸間の区別が化合物なしの状態よりもずっと容易であるという結果となる。しかし、化合物により課されたより高い結合特異性は、結合反応の間の反応混合物の温度を、特異性を失うことなく、化合物なしの反応混合物よりも低くすることができるという結果となる。これは、化合物の不在下よりも化合物の存在下の方が、アッセイをずっと速く完了させることができる（ＮＮＮＢＰｓが相補的核酸に結合する速度は、温度が下がるにつれて上昇し、複合体が融解する温度よりも１５〜２５℃以下で最高の速度が観察される）という非常に重要な結果となる。低温度で高度に特異的なアッセイを行なう能力は、高温度では都合の悪い日常的および自動的診断への応用に対してさらに重要である。本発明によれば、少なくとも３つの経路で方法を行なうことが可能である。第１の態様において、プローブおよび標的間の複合体を形成させる前に、化合物を決定対象の標的を含む試料と接触させる。このことは、最初に化合物を試料に添加し、次にプローブを試料に添加することにより行なうことができる。該説明に故意に結合させることなく、プローブとより良くマッチした複合体が迅速に形成され、その形成後はプローブおよび決定対象外の標的間で形成可能でたぶん形成されたであろう複合体よりもより安定であると仮定する。本発明の第２の態様において、プローブおよび決定対象の標的およびおそらく決定対象外の（関連）標的（１または複数）間の複合体の形成後に、化合物を反応混合物に添加する。また、この理論に故意に結合させることなく、化合物は、配列により多くのミスマッチを有する複合体を選択的に不安定化させ、よって、所望の複合体はインタクトな状態のままで所望しない複合体の数を減少させるように作用すると仮定する。第１および第２の態様の間のすべての場面で化合物を添加することが可能なことは勿論である。次いで、中間の態様が考案されるが、同様の進歩的効果を有する。複合体の形成後、決定対象の標的の存在を、該複合体の存在により分析することができる。核酸または核酸およびＮＮＮＢＰｓを含む複合体のいずれかに対して従来技術で公知の二重らせんまたは三重らせん構造の存在を決定する非常に多くの種類の可能性がある。これらの方法すべては、本発明の方法に類似して適用できる。プローブおよび標的間の複合体の存在を決定する１つの単純な手段は、混合物の温度を上げたり下げたりする工程の間、反応混合物の吸光度の変化を光度計で観察することである。このことは、融解曲線の検出として公知である。混合物の吸光度は、決定対象の複合体の融解温度（Ｔ_m）で有意に変化する。したがって、複合体の存在は、予想される融解温度で吸光度が変化するかどうかをチェックすることにより決定できる。より現代的なアッセイでは、プローブまたは決定対象の標的のいずれかを標識を含むように修飾する。プローブまたは標的を標識する手段は、当業者に一般に知られている。プローブまたは標的を、合成の間標識してもよいし、合成後の工程で標識してもよい。プローブまたは標的を合成の間標識する場合、すでに標識されているか、または標識の付加に用いられる反応基を含むモノマーユニットを用いることは公知である。合成は、厳密に化学的な経路または酵素学的工程により行なうことができる。核酸の合成のために最も便利な合成は、ホスホトリエステル法におけるような活性化モノリボヌクレオシドモノホスフェートの使用を含むことが通常知られている。例えば、欧州特許出願公告第０１３５５８７号明細書に記載のいかなる標識も、合成の間に導入することができる。プローブを酵素学的に標識した場合、可能な合成手段としては、ニックトランスレーションまたは欧州特許出願公告第００６３８７９号明細書に記載の方法が挙げられる。また、合成後にプローブを標識した場合、既報の方法がいくつかある。独国特許出願公開第２９１５０８２号明細書によれば、塩基部分の反応基は、標識部分と反応することができる。合成後の標識のさらなる方法は、欧州特許出願公告第０１７３２５１号明細書に記載されている。また、決定対象の標的は、例えば、前記化学標識、ニックトランスレーション、ターミナルトランスフェラーゼおよび標識モノヌクレオチドを用いる伸長等の標識部分を用いる伸長またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによる標識モノヌクレオチド等の標識モノマーの酵素学的取り込み等の酵素学的反応における標識部分の取り込み等のいくつかの手段で標識することも可能である。本発明に記載の標識は、直接または間接的に検出可能な基である。直接検出可能な基としては、放射活性基（³²Ｐの取り込みによる等）、色素基、蛍光基または金属原子等の基である。間接的に検出可能な基としては、例えば、抗体、抗原、ハプテンまたは酵素等の免疫学的または酵素学的に活性な化合物が挙げられる。これらは、例えば、抗原もしくは該抗原に対する抗体もしくはハプテン等の標識された免疫学的結合パートナーまたは適当な酵素基質等を用いて、次の反応または一連の反応で検出される。臭素等のハプテン、ジゴキシゲニン、ジゴキシンまたはフルオレセインが特に好ましい。さらに好ましい間接的に検出可能な基は、ビオチンである。レポーター基は、間接的に検出可能な基である。本発明によれば、反応基は、標識を作製したり、固相にプローブもしくは標的を固定するために用いることが可能な基である。かかる反応基としては、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド−エステル等の活性エステルが挙げられる。標識は、プローブの標識への結合を妨げないような、プローブまたは標識のいずれの位置に付加してもよい。好ましい位置は、塩基のアミノ基等のヘテロ原子をもつ位置およびバックボーン、特にバックボーンのいずれかの末端の反応基の位置である。標識へのカップリングに好適なバックボーンの基は、２つのモノマーユニットをともにカップリングさせるために用いられるモノマーユニット中の基であってもよい。好適な基としては、カルボン酸または１級もしくは２級アミノ基が含まれる。特定の位置への標識のカップリング反応は、カップリングに用いる特定の基に依存し、ヌクレオチド化学またはペプチド化学のいずれかの技術分野に属する者にとって一般に公知である。かかる標識を含む複合体は、複合体の固相への結合および過剰の標識プローブ等の未結合標識化合物の除去後、検出されることが好ましい。この結合は、プローブよりも決定対象の標的の異なるセグメントにハイブリダイズするいわゆる捕捉プローブを用いることにより容易になされる。かかる構成は、例えば、欧州特許出願公開第００７９１３９号明細書に記載されている。もちろん、この構成は、プローブを検出可能に標識されるよりも固相に結合されるように修飾し、形成した複合体が形成後に固相に結合することが可能である。その後、検出可能に標識したプローブを標的の別のセグメントにハイブリダイズさせ、固定した標識を測定することにより、固定した複合体を検出する。しかし、Method in Enzymunology 100，266-285(1983)に記載のサザンブロット、ドットブロットまたは逆ドットブロット（欧州特許出願公告第０２３７３６２に記載されている）等の単純な手法も、適用することができる。後者の場合、決定対象の標的は、原核酸を鋳型として用いた増幅反応から生じ、増幅の間標識部分が取り込まれた核酸である。ＮＮＮＢＰを固相に結合する。固定したＮＮＮＢＰおよび検出可能に標識された標的核酸間の複合体形成後、固相に付着した標識の量を決定かつ使用して、試料に初めから存在する標的核酸の量を計算する。本発明は、異なる配列を有する多数のＮＮＮＢＰｓのスポットへの核酸の並行ハイブリダイゼーションに特に有利である。かかる態様は、オリゴヌクレオチドの代わりにＮＮＮＢＰｓを用いて、国際公開第８９／１０９７７号パンフレット、国際公開第９０／１５０７０号パンフレットおよび米国特許第５，２０２，２３１号明細書に記載の態様に類似していることが認識される。本発明を用いて、欧州特許出願公開第０２０１１８４号明細書に記載の伸長産物（増幅物）等の増幅手法の結果である核酸を非常に容易に検出することができる。本発明は、診断アッセイの感度を高め、プローブと完全にマッチせず決定対象外の標的を含む複合体を脱ハイブリダイズさせるためにストリンジェントな洗浄を避けるために用いることが可能であるという有利な点を有する。本発明のさらなる目的は、非天然性核酸結合パートナーへの核酸または非天然性核酸の結合を行なうための試薬であり、該試薬は、非天然性核酸結合パートナーおよび該結合特異性を高め、かつ、ドデシル硫酸ナトリウムではない化合物を含む。この試薬は、例えば、塩、緩衝物質および他のアジュバントをさらに含んでもよい。本発明のさらなる目的は、非天然性核酸結合パートナーへの核酸または非天然性核酸の結合を行なうための試薬キットであり、該試薬キットは、非天然性核酸結合パートナーおよび該結合特異性を高め、かつ、ドデシル硫酸ナトリウムではない化合物を別々の容器に含む。また、これらの容器はいずれも、例えば、塩、緩衝物質および他のアジュバントをさらに含んでもよい。図１は、ＳＤＳの濃度に依存したＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の温度安定性（Ｔ_m）を示す。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの温度安定性はＳＤＳの濃度に依存しないが、ＰＮＡとＤＮＡの相補性の程度に依存し、温度安定性がかなり異なることが明らかである。さらに、各場合の判別に対するＳＤＳの最適濃度が明らかになる。特定のＳＤＳ濃度での完全に相補的なＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんと１塩基ミスマッチしたＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせん間のＴ_m値の間隔が大きければ大きいほど、識別化（結合選択性）が良くなる。図２は、マッチしたＰＮＡ／ＤＮＡ複合体対ミスマッチしたＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の温度安定性を示す。一定のＳＤＳ濃度では、複合体形成の程度およびＳＤＳ添加は、温度安定性に関してほとんど影響を及ぼさないことが明らかになる。図３は、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体対ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの温度安定性におけるミスマッチの影響を示す。すべてのＳＤＳ濃度において、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体に対する特異性（完全に相補的なＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんと１塩基ミスマッチしたＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせん間のＴ_m値の差）がより高いが、ある濃度を越えるＳＤＳを選択することにより、この高特異性をさらに増加させることが可能であることが明らかになる。この実施例では、０．９５％から増加して０．９５％ＳＤＳ〜０．１３％ＳＤＳの濃度で、特異性が最高である。０．１３％ＳＤＳを越えても、０．９５％未満のＳＤＳよりも特異性が高い。濃度範囲は、配列および長さの違いに対して異なるが、一般的な傾向が見られる。図４は、ＳＤＳの不在下および完全に相補的なＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんには影響しない最高濃度のＳＤＳの存在下で、種々のミスマッチを有するＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の温度安定性を示す。図５は、種々のＳＤＳ濃度および種々の塩濃度でのＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の温度安定性を示す。上方の４つの曲線は、マッチしたＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんであり、下方の４つの曲線は、１塩基のミスマッチしたＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんである。図６は、別の洗剤（ＤＴＡＢ）の種々の濃度でのＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせん対ＤＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの温度安定性を示す。図７は、ＬｉＤＳがＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんにおいてＳＤＳと同様の効果を奏することを示す。以下、実施例により本発明を詳細に説明する。一般的な注意実施例でＮＮＮＢＰｓとして用いるＰＮＡ分子は、国際公開第９２／２０７０２号パンフレットに記載の教示に従って調製することができるし、PerSeptive B iosystems 社 Cambridge，MA 02139,USAからモノマーまたはオリゴマーの型で購入することができる。下記反応の各場合において、特に述べない限り、結合反応は、核酸としてＤＮＡ−オリゴデオキシリボヌクレオチド５’−ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡ− ３’（配列番号：６）を用いて行なった。反応は、異なるＮＮＮＢＰｓ（ミスマッチなしまたは１以上のミスマッチを含む）の使用によって異なる。実施例１ＳＤＳを使用してＰＮＡのその相補的ＤＮＡへの親和性を調節できる２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、４．５ｍＭのＰＮＡ、４．５ｍＭの相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび０〜０．５％のＳＤＳを含む一連の１ｍｌのハイブリダイゼーション反応を始めた。溶液を９５℃に加熱し、室温で一晩置いてハイブリッドを形成させた。次の日、追加の適当な緩衝液（２５ｍｌＮａ₂ ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０および０〜０．５％のＳＤＳ）２ｍｌをハイブリダイゼーション溶液に添加し、Perkin-Elmer λ２分光光度計を用いて、融解温度Ｔ_mとして測定した各二重らせんの温度安定性を分光光度法的に決定した。３つの異なる１５マーＰＮＡ、１つの１８マーＰＮＡおよび１つの対照１５マーＤＮＡ全てを分析した。図に示すように、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重らせんは、試験した全濃度範囲のＳＤＳにより影響されることなく残存する。対照的に、ＳＤＳ濃度がある閾値を越えたときにすべてのＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんで、Ｔ_mのかなりシャープな減少が観察される。この結果により、ＳＤＳを使用してＰＮＡのその相補的ＤＮＡへの親和性を調節できることが示される。図１の説明ハイブリダイゼーション溶液中のＳＤＳの関数としての相補的ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの温度安定性の図面。白抜き四角：ＤＮＡ（５’−ＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＴ−３’、配列番号：２）にハイブリダイズするＰＮＡ（Ｈ −Ａｄｏ₃−ＡＣＡＣＧＧＡＧＧＴＧＴＡＧＡＡＡＴ−ＮＨ₂；「Ａｄｏ」は、８ −アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸リンカーを示す、配列番号：１）、黒四角：ＤＮＡ（５’−ＴＣＡＣＧＡＡＣＡＡＣＧＣＧＡ−３’、配列番号：４）にハイブリダイズするＰＮＡ（Ｈ−Ａｈａ−ＴＣＧＣＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＡ− ＮＨ₂；「Ａｈａ」は、アミノヘキサン酸リンカーを示す、配列番号：３）、白抜き丸：ＤＮＡ（５’−ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡ−３’、配列番号：６）にハイブリダイズするＰＮＡ（Ａｄｏ₃−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ− Ｇｌｙ−ＮＨ₂、配列番号：５）、黒丸：ＤＮＡ（５’−ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＴＡＣＡ−３’、配列番号：１０）にハイブリダイズするＰＮＡ（Ａｄｏ₃− ＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、配列番号：９）、黒三角：ＤＮＡ（５’−ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡ−３’、配列番号：６）にハイブリダイズするＤＮＡ（５’−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−３’、配列番号：７）。実施例２ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんにおけるＳＤＳの効果は可逆的である観察されたＳＤＳの効果が可逆的であるかどうかを決定するために、以下の３つの状態を比較した。Ａ．ＳＤＳの非存在下でＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんを形成させ、分析直前にＳＤＳを添加する。Ｂ．ＳＤＳの存在下でＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんを形成させる。Ｃ．ＳＤＳの存在下でＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんを形成させ、分析直前にＳＤＳを低濃度まで希釈する。ハイブリダイゼーション反応を、以下のように行なった。状態Ａ．完全にマッチしたＰＮＡ／ＤＮＡ（反応１）：４．５ｍＭの１５マーＰＮＡ、４．５ｍＭの相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０を含むハイブリダイゼーション反応（１ｍｌ）。ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ（反応２）：４．５ｍＭの１５マーＰＮＡ、４．５ｍＭの１塩基ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０を含むハイブリダイゼーション反応（１ｍｌ）。溶液を９５℃に加熱し、室温で一晩置いてハイブリッドを形成させた。次の日、２ｍｌの２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、１．５％ＳＤＳをハイブリダイゼーション反応１に添加し（最終濃度、２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、１．０％ＳＤＳ）、２ｍｌの２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、０．１５％ＳＤＳをハイブリダイゼーション反応２に添加した（最終濃度、２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、０．１％ＳＤＳ）。緩衝液を添加後直ちに、Perkin-E lmer、λ２分光光度計を用いて、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの温度安定性を分光光度法的に決定した。状態Ｂ．完全にマッチしたＰＮＡ／ＤＮＡ（反応３）：４．５ｍＭの１５マーＰＮＡ、４．５ｍＭの相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、１．０％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション反応（３００ｍ）。完全にマッチしたＰＮＡ／ＤＮＡ（反応４）：４．５ｍＭの１５マーＰＮＡ、４．５ｍＭの相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション反応（１ｍｌ）。ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ（反応５）：４．５ｍＭの１５マーＰＮＡ、４．５ｍＭの１塩基ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション反応（１ｍｌ）。溶液を９５℃に加熱し、室温で一晩置いてハイブリッドを形成させた。次の日、２．７ｍｌの２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、１．０％ＳＤＳを反応３に添加し（最終濃度、２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、１．０％ＳＤＳ）、２．０ｍｌの２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、０．１％ＳＤＳを反応４および５に添加した（最終濃度、２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、０．１％ＳＤＳ）。緩衝液を添加後直ちに、Perkin-Elmer、λ２分光光度計を用いて、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの温度安定性を分光光度法的に決定した。状態Ｃ．完全にマッチしたＰＮＡ／ＤＮＡ（反応６）：４．５ｍＭの１５マーＰＮＡ、４．５ｍＭの相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、１．０％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション反応（３００ｍｌ）。ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ（反応７）：４．５ｍＭの１５マーＰＮＡ、４．５ｍＭの１塩基ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、１．０％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション反応（３００ｍｌ）。溶液を９５℃に加熱し、室温で一晩置いてハイブリッドを形成させた。次の日、２．７ｍｌの２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０をハイブリダイゼーション反応６および７の両方に添加した（最終濃度、２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．、０．１％ＳＤＳ）。緩衝液を添加後直ちに、Perkin-Elmer、λ２分光光度計を用いて、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの温度安定性を分光光度法的に決定した。分析物の結果を、表１Ａ（マッチＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせん）および表１Ｂ（ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせん）に示す。表に示すように、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんのＴ_mは、最終SＤＳ濃度にのみ依存し、ＳＤＳの効果が可逆的であることを示す。図２の説明。Ａ：ＳＤＳの添加および希釈の程度を関数とする相補的ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせん（ＰＮＡ：Ａｄｏ₃−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−Ｇｌｙ −ＮＨ₂、配列番号：５およびＤＮＡ：５’−ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡ −３’、配列番号：６）の温度安定性。Ｂ：ＳＤＳの添加および希釈の程度を関数とする１塩基ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせん（ＰＮＡ：Ａｄｏ₃−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、配列番号：５およびＤＮＡ：５ ’−ＴＡＧＴＴＧＴＣＡＣＧＴＡＣＡ−３’、配列番号：１１）の温度安定性。実施例３ＳＤＳを使用してＰＮＡのその相補的ＤＮＡへの特異性を調節できる２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、４．５ｍＭの１５マーＰＮＡ、４．５ｍＭの相補的もしくは１塩基ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチド相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび０〜０．５％のＳＤＳを含む一連の１ｍｌのハイブリダイゼーション反応を始めた。溶液を９５℃に加熱し、室温で一晩置いてＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成させた。次の日、追加の適当な緩衝液（２５ｍｌＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０および０〜０．５％のＳＤＳ）２ｍｌをハイブリダイゼーション溶液に添加し、Perkin-Elmer λ２分光光度計を用いて、融解温度Ｔ_m として測定した温度安定性を分光光度法的に決定した。対照として、相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはミスマッチを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかとハイブリダイズしたＤＮＡを分析した。図３に示すように、完全に相補的なＤＮＡ／ＤＮＡ二重らせんのＴ_m値または１塩基ミスマッチＤＮＡ／ＤＮＡ二重らせんのＴ_mのいずれも、試験した範囲の濃度のＳＤＳ（０〜０．５％）の存在により影響されない。対照的に、完全に相補的なＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんおよび１塩基ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの両Ｔ_mは、ＳＤＳにより影響される。しかし、２つの異なるＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんのＴ_mに影響を及ぼすのに必要なＳＤＳの濃度は、全く異なる。したがって、ミスマッチを含むＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんは、０．０９５％を越えるＳＤＳ濃度により影響されるが、完全にマッチしたＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんは、ＳＤＳ濃度が０．１３％を越える濃度までは影響されない。この結果により、ＳＤＳを使用してＰＮＡのその相補的ＤＮＡへの特異性を増加できることが示される。ＰＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチド間の１塩基ミスマッチの１２個の可能な種類を含む分析に拡大させた。図４は、ＳＤＳの非存在下および完全に相補的なＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんには影響しない最高濃度のＳＤＳ（０．１３％）の存在下で得られたＴ_m 値の比較図を示す。このＳＤＳ濃度でのすべてのミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの温度安定性は、ＳＤＳ非存在下での７〜１７℃と比較して、１５〜３２ ℃間のＴ_mを有し、かなり影響される。ゆえに、ＰＮＡのその完全にマッチしたＤＮＡ標的に対する特異性を高めるＳＤＳの能力は、一般的な現象である。図３の説明：ハイブリダイゼーション溶液中のＳＤＳの関数としての相補的および１塩基ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡならびにＤＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの温度安定性の図面。白抜き四角：ＤＮＡ（５’−ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡ−３ ’、配列番号：６）にハイブリダイズするＰＮＡ（Ａｄｏ₃−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、配列番号：５）、黒四角：ＤＮＡ（５’−ＴＡＧＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＡ−３’、配列番号：８）にハイブリダイズするＰＮＡ（Ａｄｏ₃−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、配列番号：５）、白抜き丸：ＤＮＡ（５’−ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡ−３’、配列番号：６）にハイブリダイズするＤＮＡ（５’−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−３’、配列番号：７）、黒丸：ＤＮＡ（５’−ＴＡＧＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＡ−３’、配列番号：８）にハイブリダイズするＤＮＡ（５’−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−３’、配列番号：７）。図４の説明：ＳＤＳ非存在下および完全に相補的なＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんには影響しない最高濃度でのＳＤＳ存在下で、１個の相補的および１２個の１塩基ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの温度安定性の図面。灰色の棒線：ＳＤＳ非存在下のＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの温度安定性。黒の棒線：０．１３％ＳＤＳ存在下のＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの温度安定性。実施例４ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんにおけるＳＤＳの効果はハイブリダイゼーション溶液のイオン強度により調節できる４．５ｍＭの１５マーＰＮＡ、４．５ｍＭの相補的もしくは１塩基ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかならびに様々な濃度のＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０およびＳＤＳを含む一連の１ｍｌのハイブリダイゼーション反応を始めた。溶液を９５℃に加熱し、室温で一晩置いてハイブリッドを形成させた。次の日、Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０およびＳＤＳの濃度を変えることなく、試料を３ｍｌに希釈した。次いで、Perkin-Elmer λ２分光光度計を用いて、融解温度Ｔ_m として測定した各二重らせんの温度安定性を分光光度法的に決定した。図５に示すように、相補的および１塩基ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの両Ｔ_mにおける効果を産するのに必要なＳＤＳのレベルは、溶液のイオン強度とともに変化する。ゆえに、イオン強度が低くなるにつれて、Ｔ_m効果を産するためにより高濃度のＳＤＳが必要とされる。このことにより、Ａ：ＳＤＳは、ＳＤＳ分子それ自体としてその効果を及ぼさないが、むしろ、溶液のイオン強度に依存して形成されるより高次のＳＤＳ構造（すなわち、ミセルＳＤＳ）を介してその効果を及ぼし、Ｂ：ＳＤＳとイオン強度とを組み合わせて用いて、完全マッチ対１塩基ミスマッチＤＮＡ標的間を識別するＰＮＡの能力を調節することができることが示される。図５の説明：ハイブリダイゼーション溶液中のＳＤＳおよびイオン強度の関数としての相補的および１塩基ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの温度安定性の図面。ＰＮＡ（Ａｄｏ₃−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、配列番号：５）をＤＮＡ（５’−ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡ−３’、配列番号：６）にハイブリダイズさせることにより、完全に相補的なＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんを作製した。ＰＮＡ（Ａｄｏ₃−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、配列番号：５）をＤＮＡ（５’−ＴＡＧＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＡ−３’、配列番号：８）にハイブリダイズさせることにより、１塩基ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんを作製した。黒四角：ＳＤＳ非存在下で完全にマッチした二重らせん。白抜き四角：０．１０％ＳＤＳ存在下で完全にマッチした二重らせん。黒丸：０．１５％ＳＤＳ存在下で完全にマッチした二重らせん。白抜き丸：０．２０％ＳＤＳ存在下で完全にマッチした二重らせん。黒三角：ＳＤＳ非存在下で１塩基ミスマッチ二重らせん。白抜き三角：０．１０％ＳＤＳ存在下で１塩基ミスマッチ二重らせん。黒菱形：０．１５％ＳＤＳ存在下で１塩基ミスマッチ二重らせん。白抜き菱形：０．２０％ＳＤＳ存在下で１塩基ミスマッチ二重らせん。実施例５ＳＤＳに加え、洗剤ＤＴＡＢを用いてＰＮＡのその相補的ＤＮＡに対する親和性および特異性を調節できる２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、４．５ｍＭの１５マーＰＮＡ、４．５ｍＭの相補的もしくは１塩基ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかおよび０〜０．１６％のＤＴＡＢを含む一連の１ｍｌのハイブリダイゼーション反応を始めた。溶液を９５℃に加熱し、室温で一晩置いてＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成させた。次の日、追加の適当な緩衝液（２５ｍｌＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０および０〜０．１６％のＤＴＡＢ）２ｍｌをハイブリダイゼーション溶液に添加し、Perkin-Elmer λ２分光光度計を用いて、融解温度Ｔ_mとして測定した各二重らせんの温度安定性を分光光度法的に決定した。図６に示すように、完全に相補的なＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんおよび１塩基ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの両Ｔ_mは、ＤＴＡＢにより影響される。しかし、２つの異なるＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんのＴ_mに影響を及ぼすのに必要なＤＴＡＢの濃度が異なる。したがって、ミスマッチを含んだＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんは、０．１１％を越えるＤＴＡＢの濃度により影響されるが、完全にマッチしたＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんは、０．１２５％を越えるＤＴＡＢの濃度まで影響されない。この結果により、ＳＤＳと類似のＤＴＡＢを使用してＰＮＡのその相補的ＤＮＡへの親和性および特異性を調節できることが示される。図６の説明：ハイブリダイゼーション溶液中のＤＴＡＢの関数としての相補的および１塩基ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡならびにＤＮＡ／ＤＮＡ二重らせんの温度安定性の図面。白抜き四角：ＤＮＡ（５’−ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡ− ３’、配列番号：６）にハイブリダイズするＰＮＡ（Ａｄｏ₃−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、配列番号：５）；黒四角：ＤＮＡ（５’− ＴＡＧＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＡ−３’、配列番号：８）にハイブリダイズするＰＮＡ（Ａｄｏ₃−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、配列番号：５）。実施例６洗剤ドデシル硫酸リチウム（ＬｉＤＳ）を用いてＰＮＡのその相補的ＤＮＡに対する親和性および特異性を調節できる２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、４．５μＭの１５マーＰＮＡ、４．５ μＭの相補的もしくは１塩基ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかおよび０〜０．３％のＬｉＤＳを含む一連の１ｍｌのハイブリダイゼーション反応を始めた。溶液を９５℃で５分加熱し、室温で一晩置いてハイブリッドを形成させた。次の日、追加の適当な緩衝液（２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０および０〜０．３％のＬｉＤＳ）２ｍｌをハイブリダイゼーション溶液に添加し、Pe rkin-Elmer λ２分光光度計を用いて、（融解温度Ｔ_mとして測定した）各二重らせんの温度安定性を分光光度法的に決定した。図５に示すように、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんのＴ_mは両方とも、ＬｉＤＳの添加により影響され、実施例３におけるＳＤＳの効果と類似し、この効果は、相補的ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんに対するよりも１塩基ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんに対して、より低濃度のＬｉＤＳで起こる。しかし、ＳＤＳと比較して、ＬｉＤＳの効果はより低濃度で起こる。図７の説明：ハイブリダイゼーション溶液中のＬｉＤＳの濃度の関数としての相補的および１塩基ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡならびにＤＮＡ／ＤＮＡ複合体の温度安定性の図面。四角：完全に相補的なＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせん（ＤＮＡ：５ ’−ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡ−３’（配列番号：６）にハイブリダイズするＰＮＡ：Ａｄｏ₃−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂（配列番号：５））；丸：１塩基ミスマッチＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせん（ＤＮＡ：５’ −ＴＡＧＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＡ−３’（配列番号：８）にハイブリダイズするＰＮＡ：Ａｄｏ₃−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂（配列番号：５）ミスマッチの位置に下線）。実施例７ＰＮＡオリゴマーの合成Ｂｏｃ法を伴う通常の固相法ペプチド合成により、ＰＮＡ合成を行なう。ＰＮＡオリゴマーは、手動で合成することができるが、自動合成がより適する。本発明者らは、現在、ＡＢＩ４３３Ａペプチド合成機で、オリゴマーを合成しており、以下の明細書は、この合成機および標準の５μＭのスケールに基づいている。用いたＰＮＡモノマーは：ＢｏｃＡ（Ｚ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃ（Ｚ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇ（Ｚ）−ＯＨおよびＢｏｃ−Ｔ−ＯＨ（Ｂｏｃ＝バックボーンアミノ基ならびに８−アミノ−３，６−ジオキサ−オクタン酸（独国特許出願公開第３９４３５２２号明細書）、グリシンおよび６−アミノ−ヘキサン酸のアミノ基に対してのｔｅｒｔ．ブチルオキシカルボニル；Ｚ＝環外アミノ基の塩基に対してのベンジルオキシカルボニル）である。樹脂５０ｍｇのＭＢＨＡ樹脂（約０．１００ｍｍｏｌ／ｇの負荷）を各合成に用いた。アミノ酸等の第１のモノマーを用いて、適当な配列で樹脂をダウンロードする（負荷は定量Ｋａｉｓｅｒ試験によりチェックする）。Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂（またはＢｏｃ−モノマー−樹脂）の調製Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂に対する実験を説明するが、Ｂｏｃ−モノマー−樹脂も同様に調製する。３ｇのＭＢＨＡ樹脂（４−メチル−ベンズヒドリルアミン１００〜２００メッシュ、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）（約０．４５ｍｍｏｌ／ｇ、１．３５ｍｍｏｌアミン）を、ＤＣＭ（ジクロロメタン、Ｌａｂｓｃａｎ）で膨潤させ、次いで、ＤＣＭ（２ｘ）、ＤＣＭ中の５％ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ａｌｄｒｉｃｈ）（３分）、ＤＣＭ（２ｘ）で洗浄した。Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（２１０ｍｇ（１．２０ｍｍｏｌ）、ＭＷ：１７５．４ｇ／ｍｏｌ）を、ＤＭＦ／ピリジン／ＤＩＥＡ（１５／１５／１）に溶解し、ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）（４５０ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌｅ）も同様にＤＭＦ／ピリジン／ＤＩＥＡに溶解する。該アミノ酸にＨＢＴＵを添加し、１分間前活性化させる。次いで、この混合物を樹脂に添加する。樹脂を覆うのに必要なだけの正確な量の溶媒を用いる。このものを一晩反応させる。次いで、樹脂上の未反応のアミノ基を無水酢酸／ピリジン／ＮＭＰ（Ｎ−メチル−ピロリドン）（１／２／２）を用いて２〜３時間キャップする。なお、Ｋａｉｓｅｒ試験は、陰性でなければならない。ＰＮＡモノマーの負荷に対して、同量、同溶媒および同時間を用いる。Ｋａｉｓｅｒ試験試薬Ａ：４０ｇのフェノールと１０ｍｌのエタノールを混合する。溶解するまで温める。１００ｍｌの水に６５ｍｇのシアン化カリウムを溶解する。２ｍｌのＫＣＮ溶液を１００ｍｌのピリジンに希釈する。フェノールとＫＣＮ／ピリジン溶液を混合する。試薬Ｂ：２．５ｇのニンヒドリンを５０ｍｌのエタノールに溶解する。Ｋａｉｓｅｒ試験（定性）約２〜５ｍｇの吸引乾燥樹脂を取り出し、１滴のＡおよび２滴のＢを添加する。１００℃で２分間加熱する（青（または黒）：陽性；淡黄色：陰性）。Ｋａｉｓｅｒ試験（定量）約５０ｍｇのダウンロード（＋キャップ）した樹脂を計量し、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／ｍ−クレーゾールを用いて２回３分間脱保護する。樹脂（＋ＤＩＥＡ処理）を洗浄する。吸引により乾燥しているＤＣＭで樹脂を少なくとも洗浄する。５〜１０ｍｇの試料を取り出し、タールを塗ったチューブに入れる。これらのものを、ヒートブロックで１０分間加熱する。樹脂の「乾燥」質量（Ｗ_mg）を決定する。各チューブに１００μｌの試薬Ａおよび２５μｌの試薬Ｂを添加する。１００℃で５分間加熱する。１ｍｌの６０％アルコールを添加し、樹脂を濾過する。ＤＣＭ中０．５ＭＥｔ₄ＮＣｌを０．２ｍｌ用いて樹脂を２回洗浄する。４７５ｍｌの６０％エタノール（＝Ｖ_ml）を加えることにより全体の容量を２ｍｌに調整する。対照として６０％エタノールを用いて５７０ｎｍでの吸光度を測定する。吸光度が２．５よりも高い場合、６０％エタノールで希釈する（ＮＢ：Ｖ_mlを変える）。以下の式により試験の平均値を計算する：０．０５０〜０．１００付近の値が理想的である。値が低いほど産物が減少し、値が高いほどオリゴマー化の間凝集の問題が生じる（Anal．Biochem．117，147-157(1981)を参照）。Ｂｏｃ脱保護化１ｍｌのＴＦＡ／ｍ−クレゾール（９５／５）を、１分１回および３．５分１回添加することにより、ｂｏｃ保護基を除去する。カップリング１００μｌ（０２６Ｍ）の各モノマーを、別々のカートリッジに置く。各カップリングでは、合成機はこの量のモノマーを使用する。各カップリングの前に、最初に１２５μｌのＨＢＴＵ（０．２０１Ｍ）および次に１２５μｌのＤＩＥＡ（０．４１Ｍ）を、カートリッジ内のモノマー溶液に添加する。これらの溶液中の溶媒は、ＮＭＰである。合計３５０μｌを反応容器に添加する。３３分間カップリングを行なう。キャッピングカップリング後、最後の追加モノマーをキャップする。反応容器に１ｍｌのＡｃ₂Ｏ／ＮＭＰ／ピリジン（１／２／２）を１分間で添加することにより、これを行なう。樹脂からの切断最後のモノマーをカップリング後、ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）処理により樹脂からオリゴマーを除去する。この方法により、アミドとして修飾したカルボキシ末端を有する（−ＮＨ₂末端と指定、一方、アミノ末端は− Ｈと指定）オリゴマーを得る。すべての溶液は、毎回新しく調製しなければならない。１．２種類の溶液を調製する：Ｉ：ＴＦＡ／ジメチルスルフィド／ｍ−クレゾール（１：３：１） II：ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメチルスルホン酸、９：１）樹脂を１００％ＴＦＡを用いて１分間洗浄する。１ｍｏｌの溶液Ｉ、その後１ｍｌの溶液IIを反応容器（スクリューキャップとフリット(fritte)を有するガラス容器）に加え、１時間攪拌させる。１００％ＴＦＡを用いて１分間洗浄する。ＴＦＭＳＡ／ＴＦＡ／ｍ−クレゾール（２：８：１）の溶液を調製し、この２ｍｌを反応容器に添加する。樹脂の色が黒に変わる！１．５時間攪拌させる。黒色溶液をエーテル（２５〜５０ｍｌ）で「破裂」させ、オリゴマーを沈殿させる。１〜２ｍｌのＴＦＡを用いて２回黒色樹脂を洗浄し、また、これにエーテルを加える。０．４４μのｔｅｆｌｏｎフィルターを用いて沈殿物を濾過し、エーテルで数回洗浄する。５％酢酸水溶液に溶解し、フィルターから吸引することにより、フィルターからオリゴを除去する。数回洗浄する。オリゴマーの水溶液を凍結し、凍結乾燥により溶媒を除去する。ＱＣ−チェックＨＰＬＣに基づき、粗製物は通常８０〜９０％の純度で得られる（１５マー）。逆相ＨＰＬＣにより、これを精製する。ＤｅｌｔａＰａｋ（Ｃ₁₈）、１００ Å、５μｍ、３．９ｘ１５０（Ｗａｔｅｒｓ）（流速１ｍｌ／分）カラムを、分析用分析のために使用し、Ｖｙｄａｃ（Ｃ₁₈）、３００Å、５μｍ、１０ｘ２５０（流速３ｍｍｌ／分）を分取用目的のために用いる。両方の場合で用いるグラジエントは、０〜２分１００％Ａ；２〜３０分１００〜６０％Ａ；３０〜３５分６０％Ａ；３５〜４０分６０〜０％Ａ；４０〜４５分０％Ａ；４５〜５０分０〜１００％Ａ；５０〜５５分１００％Ａである。（Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、Ｂ：０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより純物質をキャラクタライズし、相補的ＤＮＳ標的に対するＰＮＡオリゴマーの温度安定性を評価する。試料中のＰＮＡの正確な量は、溶液の光学密度により測定する。以下の値を用いる： ε₀：Ｔ＝８．８、Ｃ＝７．３、Ｇ＝１１．７、Ａ＝１５．４ＯＤ＝ε₀ｘμｇｘＭｗ¹。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年２月２８日【補正内容】樹脂からの切断最後のモノマーをカップリング後、ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）処理により樹脂からオリゴマーを除去する。この方法により、アミドとして修飾したカルボキシ末端を有する（−ＮＨ₂末端と指定、一方、アミノ末端は− Ｈと指定）オリゴマーを得る。すべての溶液は、毎回新しく調製しなければならない。１．２種類の溶液を調製する：Ｉ：ＴＦＡ／ジメチルスルフィド／ｍ−クレゾール（１：３：１） II：ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメチルスルホン酸、９：１）樹脂を１００％ＴＦＡを用いて１分間洗浄する。１ｍｏｌの溶液Ｉ、その後１ｍｌの溶液IIを反応容器（スクリューキャップとフリット(fritte)を有するガラス容器）に加え、１時間攪拌させる。１００％ＴＦＡを用いて１分間洗浄する。ＴＦＭＳＡ／ＴＦＡ／ｍ−クレゾール（２：８：１）の溶液を調製し、この２ｍｌを反応容器に添加する。樹脂の色が黒に変わる！１．５時間攪拌させる。黒色溶液をエーテル（２５〜５０ｍｌ）で「破裂」させ、オリゴマーを沈殿させる。１〜２ｍｌのＴＦＡを用いて２回黒色樹脂を洗浄し、また、これにエーテルを加える。０．４４μのＴｅｆｌｏｎ^TMフィルターを用いて沈殿物を濾過し、エーテルで数回洗浄する。５％酢酸水溶液に溶解し、フィルターから吸引することにより、フィルターからオリゴを除去する。数回洗浄する。オリゴマーの水溶液を凍結し、凍結乾燥により溶媒を除去する。ＱＣ−チェックＨＰＬＣに基づき、粗製物は通常８０〜９０％の純度で得られる（１５マー）。逆相ＨＰＬＣにより、これを精製する。Ｄｅｌｔａｐａｋ（Ｃ₁₈）、１００ Å、５μｍ、３．９ｘ１５０（Ｗａｔｅｒｓ）（流速１ｍｌ／分）カラムを、分析用分析のために使用し、Ｖｙｄａｃ（Ｃ₁₈）、３００Å、５μｍ、１０ｘ２５０（流速３ｍｍｌ／分）を分取用目的のために用いる。両方の場合で用いるグラジエントは、０〜２分１００％Ａ；２〜３０分１００〜６０％Ａ；３０〜３５分６０％Ａ；３５〜４０分６０〜０％Ａ；４０〜４５分０％Ａ；４５〜５０分０〜１００％Ａ；５０〜５５分１００％Ａである。（Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、Ｂ：０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．１または複数の標的とプローブとの複合体を形成するために、該１または複数の標的に結合可能な該プローブを用いて、決定対象外の１または複数の標的の存在下で、該１または複数の標的と接触させることにより、該１または複数の標的の存在を特異的に決定する方法であって、ａ）該結合の特異性を高める化合物の存在下で接触を行ない、またはｂ）形成した複合体を、該結合の特異性を高める化合物と接触させる、標的の存在の特異的決定方法。２．該化合物が水溶液に可溶性であることを特徴とする請求項１記載の方法。３．該化合物が疎水性部分を有し、親水性部分を任意に有することを特徴とする請求項１または２記載の方法。４．該化合物が、界面活性剤または洗剤からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の方法。５．該化合物が、ドデシル硫酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の方法。６．該化合物が、正に荷電していることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の方法。７．該１もしくは複数の標的と該プローブとの該接触または形成した該複合体と該化合物との該接触が、５〜５０ｍＭの濃度で追加の塩を含む溶液中で行なわれることを特徴とする請求項１〜６いずれか記載の方法。８．該化合物が、０．０５〜０．５％の濃度で存在していることを特徴とする請求項１〜７いずれか記載の方法。９．１もしくは複数の標的、１もしくは複数のプローブおよび該化合物、または形成した複合体および該化合物が、溶液中で接触していることを特徴とする請求項１〜８いずれか記載の方法。１０．結合パートナーの特異性を高める化合物であって、ドデシル硫酸ナトリウムではない化合物およびプローブを含むことを特徴とする、プローブへの１または複数の標的の結合を行なう試薬キット。１１．下記のものを別々の容器に含むことを特徴とする、プローブへの標的の結合を行なう試薬キット、 −プローブ、 −該結合の特異性を高める化合物であって、ドデシル硫酸ナトリウムではない化合物。１２．核酸と少なくとも１つの位置において該核酸の配列とは異なる配列を含む核酸とを識別するための、該核酸の核酸結合パートナーへの結合特異性を高める化合物の使用。１３．核酸の非天然性核酸結合パートナーへの結合特異性を高めるための、界面活性剤および洗剤からなる群より選ばれた化合物の使用。１４．核酸の非天然性核酸結合パートナーへの結合特異性に対するアッセイ温度を下げるための、界面活性剤および洗剤からなる群より選ばれた化合物の使用。１５．核酸の非天然性核酸結合パートナーへの結合速度を高めるための、界面活性剤および洗剤からなる群より選ばれた化合物の使用。１６．非天然性核酸結合パートナーが、同じ長さと配列の核酸類似体よりも核酸に強力に結合することを特徴とする請求項１２〜１５いずれか記載の使用。１７．ポリアミドバックボーンを有する非天然性核酸結合パートナー、および該非天然性核酸結合パートナーへの核酸の結合特異性を高める化合物を含む組成物。１８．ポリアミドバックボーンを有する非天然性核酸結合パートナー、および該非天然性核酸結合パートナーへの核酸の結合特異性を高める化合物を別々の容器に含む試薬キット。１９．プローブおよび結合パートナーの特異性を高める化合物を含み、該プローブはポリビニルホモポリマーでないことを特徴とする、１または複数の標的のプローブへの結合を行なう試薬キット。２０．プローブおよび結合パートナーの特異性を高める化合物を含み、該プローブは所定の長さを有することを特徴とする、１または複数の標的のプローブへの結合を行なう試薬キット。