JPH11500920A - 修飾された組換えタンパク質を細菌系において発現させるプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、プロモーター列と、外因性タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、外因性タンパク質を修飾し得る酵素をコードするヌクレオチド配列とを含むプラスミドを提供する。本発明の特定実施態様においては、コードされている外因性タンパク質がヒトβ−カゼインであり、コードされている酵素が細菌系中で組換えβ−カゼインをリン酸化し得るヒトキナーゼである。

Description

【発明の詳細な説明】 修飾された組換えタンパク質を細菌系において 発現させるプラスミド 技術的分野 本発明は、修飾された組換えタンパク質を細菌系において産生させる新規な方 法に関する。この方法は、外因性タンパク質をコードするヌクレオチド配列と該 タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで修飾し得る酵素とを有する単一ベクターを作製す る段階と、修飾されたタンパク質を産生させるために宿主細胞中でベクターを発 現させる段階とから成る。１つの特徴によれば本発明は、プロモーターと、タン パク質をコードする配列と、酵素をコードする配列とを順次に含む単一ベクター に関する。修飾されたタンパク質が天然型ヒトタンパク質と同じ生物活性を有す ることを証明するデータを提示する。発明の背景 ヒトの母乳がヒトの乳児の最良の栄養源であることは普遍的に認識されている 。ヒトの母乳は、発育中の乳児にとって理想的な栄養源であるだけでなく、乳児 を種々の生物による感染から保護する免疫グロブリン及び非免疫性因子の双方を 含有して いる。ヒトの母乳はまた、乳児によって消化され易く、牛乳を主成分とする乳児 用調合乳よりもアレルギー反応を起し難い。 ヒトの母乳は、牛乳及び他の哺乳動物種の乳に比べると、種々の違いを有して いる。先ず、ヒトの母乳と牛乳とを比較すると、タンパク質の総含量及びタンパ ク質の種類が違っている。牛乳中には主要な４種類のウシカゼインが同定されて いる。牛乳は２種類のα−カゼインに加えてβ−カゼインとκ−カゼインとを含 むが、ヒトの母乳はβ−カゼイン及びκ−カゼインのみを含む。更に、ヒトの母 乳のタンパク質のアミノ酸配列は他の哺乳類の乳タンパク質のアミノ酸配列とは 異なっている。 ヒトの母乳の有利な特性をいくつか有しており、しかも牛乳を主成分とする乳 児用調合乳に関連した欠点、例えば乳児のアレルギー応及び消化不良、などが除 去された乳児用調合乳を開発する努力が続けられてきた。このための望ましい方 法が、天然形態のヒト母乳タンパク質のようなヒト母乳の数種類の既知の成分を 調合乳に添加する方法であることは直観的に判ることである。牛乳及び他の哺乳 類の乳とは異なるアミノ酸配列をもつヒトのカゼインは重要な物質であり、天然 形態で乳児用調合乳に添加するならば、調合乳の栄養価を高め、同時に、ヒト 以外の動物の乳タンパク質に固有の欠点を軽減するであろう。 ヒトの母乳は、乳児の成長及び発育に必要なタンパク質の合成に必要なアミノ 酸の供給源となるだけでなく、カゼインも含めて他の重要な生物学的機能を有す るタンパク質を含有すると認識されている。β−カゼインは哺乳類の乳腺で最も 豊富に合成される乳タンパク質の１種である。このタンパク質は、ゴルジ装置で 翻訳後修飾された後、ミセルと呼ばれるカルシウム依存性の大凝集体として放出 される。β−カゼインは単一物質ではなく、催乳ホルモンに応答して授乳中に分 泌されるリンタンパク質の不均一なグループである。ヒトのβ−カゼインの一次 構造は、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５９：５１３２−５１３８，１９８４）によって決定 された。これは、アミノ末端近傍に存在する特異的なセリル残基及びトレオニル 残基にリン酸化部位をもつリン酸化タンパク質であることが判明した。ヒト及び ウシのβ−カゼインの比較は４７％の一致を示した。ヒトのκ−カゼインの配列 は、Ｂｒｉｇｎｏｎら（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ １８８：４８−５４， １９８５）によって決定された。β−カゼインはリン酸化されているが、κ−カ ゼインはグリコシル化されている。 いくつかの生物学的効果はヒト母乳のカゼインに帰すべきであると考えられて おり、このような効果としては、（１）カルシウム吸収の増進、（２）アンギオ テンシンＩ変換酵素の阻害、（３）アヘン様作用、及び、（４）免疫促進及び免 疫調節効果、がある。 ヒトカゼインは、大部分（＞８０％）のβ−形と少量のκ−形とから成る（Ｇ ｒｅｅｎｂｅｒｇら，１９８４）。天然型β−カゼインは２５ｋＤａのタンパク 質である。ヒトの母乳中で、β−カゼイン分子は、ポリペプチド鎖あたりリン酸 基０〜５個の範囲の種々の程度の翻訳後リン酸化を示す（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら ，１９８４；Ｈａｎｓｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎ ｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４：３７３−３８１，１９９３）。天然型タン パク質中のリン酸基はアミノ末端の近傍に存在するセリン残基及びトレオニン残 基に結合している（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，１９８４）。 細菌細胞中の外因性遺伝子の発現は、組換え真核生物タンパク質を産生するた めの有用な方法を提供する。しかしながら、 大腸菌のような細菌は、必要な内在性酵素を有していないので、多くの真核生物 タンパク質が要求するような翻訳後修飾物を生じさせることができない。従って 、大腸菌中で産生される真核生物タンパク質では、グリコシル化、リン酸化、ア セチル化またはアミド化のような真核細胞内部で生じるはずの特異的翻訳後修飾 が欠如している。 適当なクローニング技術が開発される以前は、精製タンパク質のキナーゼによ るリン酸化は化学的試薬を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで行われていた。この方法で は、タンパク質基質とキナーゼ酵素とを精製する必要があり、これは効率が悪く 、商品化を目的としたときには採算が合わない。ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法はまた 、工業化のために規模拡大が望まれる場合には役に立たない。従って、タンパク 質をｉｎ ｖｉｖｏでリン酸化する微生物の遺伝子操作方法を開発することが必 要である。 Ｐａｗｓｏｎらのカナダ特許出願第２，０８３，５２１号は、リン酸化された 外因性タンパク質を宿主細胞中で産生する方法を教示している。Ｐａｗｓｏｎら の方法では、細菌細胞に２種類のベクターを導入する必要がある。一方のベクタ ーは、タンパク質キナーゼの触媒ドメインによってリン酸化され得る外因 性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有している。他方のベクターは、 タンパク質キナーゼ触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を有している。 双方のベクターを大腸菌に導入し、外因性タンパク質及びタンパク質キナーゼ触 媒ドメインの産生を誘発し、外因性タンパク質をリン酸化する。次に、細菌細胞 を溶解し、リン酸化された外因性タンパク質を標準単離技術を用いて単離する。 カナダ特許出願第２，０８３，５２１号は、本発明方法を示唆するものでも開 示するものでない。本発明は、基質及びキナーゼ酵素の双方を発現する単一ベク ターを提供する。Ｐａｗｓｏｎらの方法では２種類のベクターの使用が必要であ る。本文中に開示された発現系は、ホスホセリンに対する抗体によって測定され るように外因性タンパク質を特異的にリン酸化させるが、Ｐａｗｓｏｎらの発現 系は、宿主タンパク質及び外因性タンパク質の双方を非特異的にリン酸化する。 これは、工業的応用を目的とした規模拡大計画の対象として宿主細菌を増殖させ る場合には欠点となるであろう。本発明は、Ｐａｗｓｏｎらの発明と違って、商 業生産に好適なリン酸化組換えタンパク質の高レベル産生方法を提供する。 Ｓｉｍｃｏｘら，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏ ｌｏｇｙ ７（３）：６８−６９（１９９４）は、チロシンキナーゼプラスミド を含む２種類の大腸菌株を構築した。これらのＴＫ（チロシンキナーゼ）菌株は 、リン酸化標的ドメインまたはタンパク質をコードする配列を含むプラスミドに よって形質転換されると、リン酸化タンパク質を産生するために使用できる。双 方の大腸菌株が誘導チロシンキナーゼの遺伝子を含む。一方の菌株ＴＫＢ１は、 その発現がＴ７プロモーターによって指令される遺伝子を発現させるために有用 である。Ｓｉｍｃｏｘらによって開発された系は、チロシンキナーゼ含有プラス ミドと、リン酸化されるべきタンパク質またはドメインをコードする遺伝子を含 むプラスミドベクターとから成る２種類の構築物を必要とする点に本発明の系と の違いを有している。 ヒトβ−カゼインの構造及び機能をより十分に理解し且つその合成及び分泌の 調節に影響を与える因子を研究するために、このタンパク質のｃＤＮＡをクロー ニングし、配列決定し（Ｌ ｐｅａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｌｅ ｔｔｅｒｓ ２６９：１５３−１５６，１９９０）、ヒト母乳のβ−カゼインを 大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで産生させた（Ｈａｎｓｓｏｎら，１９９３）。Ｈ ａｎｓｓｏｎらは、ｐＹＥＳ ２．０ベクター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、組換えヒトβ−カゼインがパン酵母 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現することを示した。産生レベルは大腸菌で検 出された産生の約１０％であると算定された。しかしながら、タンパク質をリン 酸化し得る内在性酵素を有する真核細胞であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから得 られた組換えβ−カゼインはリン酸化されたが、自生状態ではリン酸化能力が欠 如している原核細胞である大腸菌によって産生されたタンパク質はリン酸化され ていなかった。その後、大腸菌中で産生され大腸菌から精製された組換えヒトカ ゼインキナーゼII（ｒｈＣＫII）が、タンパク質基質をｉｎ ｖｉｔｒｏでリン 酸化できることが示された（Ｓｈｉら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ ９１：２ ７６７−２７７１，１９９４）。本発明の１つの特定実施態様 は、大腸菌を形質転換させリン酸化β−カゼインを産生させるために、組換えヒ トカゼインキナーゼIIをコードするヌクレオチド配列をβ−カゼインをコードす るヌクレオチド配列と共に単一構築物中で使用する。発明の概要 ここに、修飾された組換えタンパク質を宿主細胞中で産生させる方法が開示さ れている。この方法は、外因性タンパク質と外因性タンパク質を修飾し得る酵素 との双方をコードする単一ベクターの作製から成る。本発明方法によって修飾さ れ得る外因性タンパク質の非限定的代表例としては、β−カゼインのようなヒト カゼイン、細胞の受容タンパク質、パルミトイル化タンパク質のような脂肪アシ ル化タンパク質、哺乳動物の筋肉タンパク質、レトロウイルスのｇａｇポリタン パク質、及び、レトロウイルスのｓｒｃキナーゼによって標的とされる哺乳動物 のタンパク質がある。合成後に共有結合パルミテートをもたらすトランスメンブ ラン糖タンパク質としては、インスリン、アドレナリンβ₂受容体及びトランス フェリン受容体がある。細胞表面受容体として機能するタンパク質、チロシン及 びセリン／トレオニンキナーゼ、それらの基質、ホスファターゼ、Ｇ− タンパク質及びＣａ²⁺は、脂肪アシル化されることが知られている。宿主細胞中 で官能基を特異的外因性タンパク質に転移させる能力を有するという理由で本発 明に有用な酵素の非限定的代表例としては、チロシンキナーゼ、カゼインキナー ゼのようなキナーゼ類、哺乳動物及び酵母のパルミトイルトランスフェラーゼの ようなトランスフェラーゼ類、レトロウイルスのｓｒｃ遺伝子によってコードさ れるキナーゼ類がある。本発明で有用なプロモーターの代表例は、Ｔ７、λＰ_L 、λＰ_R及びＴａｃのような誘導プロモーター、ｂｌａ及びｓｐａのような構成 プロモーターある。形質転換されることができ次いで修飾されたタンパク質を発 現することができる宿主細胞の非限定的代表例としては、大腸菌Ｋ−１２及び大 腸菌Ｂ、バチルス種、ラクトバチルス種及びストレプトコッカス種のような細菌 細胞、酵母細胞または哺乳類細胞のような真核細胞がある。 外因性タンパク質とは、当該タンパク質を産生する生物の外部に起原を有する タンパク質を意味する。関連するＤＮＡクローニング文献の分野で、この用語は ときには、形質転換されたレシピエント生物によって産生された組換えタンパク 質を意味するために使用される。または、ＤＮＡクローニング技術を用 いて産生される外因性タンパク質が組換えタンパク質と呼ばれることもある。文 献では両者が区別されないことも多いので、本文中ではこの用語を互換的に使用 する。しかしながら、開示された発明に関する記載においては、形質転換された 生物によって産生されるタンパク質を意味するときは「組換え」なる用語を使用 し、天然型の非組換えタンパク質または該タンパク質をコードするヌクレオチド 配列を意味するときは「外因性」なる用語を使用する。 本発明は、修飾された組換えタンパク質を宿主細胞中で産生させる方法を開示 している。この方法は、プロモーター配列と、外因性タンパク質配列と、外因性 タンパク質を修飾し得る酵素をコードするヌクレオチド配列とを有する単一ベク ターを作製する段階と、宿主細胞をこのベクターによって形質転換させる段階と 、産生された酵素が産生された組換えタンパク質を修飾するように宿主細胞中で このベクターを発現させる段階と、産生され修飾された組換えタンパク質を単離 する段階とから成る。本発明はまた、より特定的な実施態様として、リン酸化さ れた組換えタンパク質を宿主細胞中で産生する方法を開示している。この方法は 、プロモーター配列と、タンパク質キナーゼによっ てリン酸化され得る外因性タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、外因性 タンパク質をリン酸化し得るタンパク質キナーゼをコードするヌクレオチド配列 とを順次に含む単一ベクターを作製する段階と、宿主細胞をこのベクターによっ て形質転換させる段階と、産生されたタンパク質キナーゼが産生された組換えタ ンパク質をリン酸化するように宿主細胞中このでベクターを発現させる段階と、 リン酸化されたタンパク質を単離する段階とから成る。 より特定的には本発明は、修飾された組換えヒトタンパク質を細菌性発現系中 で産生させる新規な方法を提供する。この方法で得られる組換えヒトタンパク質 は、ヒト細胞に対するインフルエンザ菌Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの付着の阻害 、及びヒト小児中耳炎の予防及び治療に有用である。キナーゼのアルフアサブユ ニット及びベータサブユニットを夫々が発現する２種類のヒトカゼインキナーゼ をコードする配列の組合せを使用すると、これらの配列が組換えリン酸化ヒトβ −カゼインを大腸菌中でｉｎ ｖｉｖｏで産生することが示された。ヒトカゼイ ンキナーゼIIをコードする配列を、β−カゼインをコードする配列とタンデム配 置すると、その結果として、大腸菌中で産生 された組換えβ−カゼインの有意な部分がヒト母乳中と同様にリン酸化されてい た。本発明方法はまた、形質転換宿主細胞中で組換えタンパク質をｉｎ ｖｉｖ ｏで特異的グリコシル化、アミド化もしくはアセチル化するため、または、形質 転換宿主細胞中で適当な組換えタンパク質基質に脂肪酸を転移するために使用で きる。 本発明の特定実施態様においては、ヒトカゼインキナーゼII（ｈＣＫ11βα） をコードするヌクレオチド配列を、ヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド 配列と共に単一構築物として細菌発現系で同時発現させ、組換えヒトβ−カゼイ ンの適正なセリン残基及びトレオニン残基の効率的なｉｎ ｖｉｖｏリン酸化を 達成する。ｈＣＫIIβαをコードするヌクレオチド配列と、ヒトβ−カゼインを コードするヌクレオチド配列とを、単一の誘導発現ベクターを用いて大腸菌中で 同時発現させる実験は、組換えｈＣＫIIβαが組換えβ−カゼインをｉｎ ｖｉ ｖｏでリン酸化する能力を有することを示した。これは、実験及び創意を必要と する自明でない予想外の結果であった。初期の調節実験で得られた陰性結果によ って示されたように、開示された発明は予想外の結果を示した。本発明方法は、 有益なヒ トタンパク質を栄養製品及び医薬製品に添加できるという有用な且つ有益な結果 を生じる。 本発明方法を用いて産生されたリン酸化β−カゼインは、ヒト咽頭細胞へのイ ンフルエンザ菌Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの付着を阻害する能力によって示され たように天然型のヒトβ−カゼインと同じ生物活性を有することが示された。図面の簡単な説明 図１は、大腸菌中の誘導性細胞内発現のために構築された発現ベクターｐＳ６ ３７及びｐＲＪＢ−６の物理的地図を示す。ｐＲＪＢ−６を作製するためにｐＳ ６３７から１９１塩基対を除去した。 図２は、発現ベクターｐＲＪＢ−６及びｐＲＪＢ−９の物理的地図を示してお り、ｐＲＪＢ−９を形成するためにｐＲＪＢ−６をどのように切断してＣＫIIβ αに結合させるかを示している。 図３は、発現ベクターｐＳ６３７及びｐＲＪＢ−７の物理的地図を示しており 、ｐＲＪＢ−７を形成するためにｐＳ６３７をどのように切断してＣＫIIβαに 結合するかを示している。ｐＲＪＢ−７は、β−カゼイン遺伝子及びカゼインキ ナーゼ遺 伝子の双方の上流にＴ７プロモーターを有している。 図４は、誘導性発現のため及び大腸菌の細胞内に局在するタンパク質の産生を 媒介するために構築された発現ベクターｐＳ７５０の物理的地図を示す。 図５は、ベクターｐＳ７５０及びｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαを用いて大腸菌 ＢＬ２１株中で産生されクーマシーブリリアントブルーで染色されたＭｅｔ−β −カゼインのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。大腸菌及び他の細菌中ではそれらのタン パク質の合成はアミノ酸メチオニンで開始されるので、プラスミドｐＳ７５０の 構築中にメチオニン（Ｍｅｔ）のコドンをβ−カゼインをコードする配列の上流 に配置した。このため、リボソームがポリペプチド鎖の増殖起点を認識し得る。 産生すべきタンパク質をコードする配列の上流にＭｅｔが挿入されているときに だけ細胞内組換えβ−カゼインが産生され得る。レーン１：分子量マーカー（Ｂ ｉｏ−Ｒａｄ予備染色、相対分子量１０６、８０、４９．５、３２．５、２７． ５、１８．５ｋＤａ）；レーン２：非リン酸化組換えβ−カゼイン；レーン３： ５Ｐ−β−カゼイン；レーン４：ＢＬ２１（ＤＥ３）中のＩＰＴＧ誘導ｐＳ７５ ０；レーン５：ＢＬ２１（ＤＥ３）中のＩＰＴＧ誘導 ｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα；レーン６：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬ ｙｓＳ中のＩＰＴＧ誘導ｐＳ７５０；レーン７：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ 中のＩＰＴＧ誘導ｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα；レーン８：ＢＬ２ １（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ中のＩＰＴＧ誘導ｐＳ７５０；レーン９：ＢＬ２１（Ｄ Ｅ３）ｐＬｙｓＥ細胞中のＩＰＴＧ誘導ｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβ α；レーン１０：５個のリン酸基が結合した天然型β−カゼイン（５Ｐ−β−カ ゼイン）。矢印は、β−カゼインバンドを示す。 図６は、いずれもベクターｐＳ７５０及びｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαを用い てＥｔｈｙｌ Ｓｔａｉｎｓで染色した大腸菌ＢＬ２１株中で産生されたＭｅｔ −β−カゼインのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：５個のリン酸基が結合し た天然型β−カゼイン（５Ｐ−β−カゼイン）；レーン２：ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＥ細胞中のＩＰＴＧ誘導ｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα；レ ーン３：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ中のＩＰＴＧ誘導ｐＳ７５０；レーン４ ：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中のＩＰＴＧ誘導ｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ −ＣＫIIβα；レーン５：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中のＩＰ ＴＧ誘導ｐＳ７５０；レーン６：ＢＬ２１（ＤＥ３）中のＩＰＴＧ誘導ｐＳ７５ ０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα；レーン７：ＢＬ２１（ＤＥ３）中のＩＰＴＧ 誘導ｐＳ７５０；レーン８：５Ｐ−β−カゼイン；レーン９：非リン酸化組換え β−カゼイン；レーン１０：分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ予備染色、相対分 子量１０６、８０、４９．５、３２．５、２７．５、１８．５ｋＤａ）。矢印は 、リン酸化β−カゼインバンドを示す。これは原写真では緑色のバンドとして観 察される。 図７は、いずれもベクターｐＳ７５０及びｐＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαを用いて Ｅｔｈｙｌ Ｓｔａｉｎｓで染色した大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ 中で産生されたＭｅｔ−β−カゼインのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：分 子量マーカー（Ｂｉｏ Ｒａｄ予備染色）；レーン２：非誘導ｐＳ７５０；レー ン３：ＩＰＴＧ誘導ｐＳ７５０；レーン４：非誘導ｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ −ＣＫIIβα；レーン５：ＩＰＴＧ誘導ｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβ α；レーン６：非誘導ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα；レーン７：ＩＰＴＧ誘導ｐ ＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα；レーン８：天然型５Ｐ−β−カゼイン；レーン９： 組換えβ−カゼイン；：レーン１０：分子量 マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ予備染色、相対分子量１０６、８０、４９．５、３２ ．５、２７．５、１８．５ｋＤａ）。矢印はリン酸化されたβ−カゼインバンド を示す。これは原写真では緑色のバンドとして観察される。 図８は、ヒトβ−カゼインに対する抗体を用いたウエスタンイムノブロット分 析を示す。レーン１：分子量マーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、相対分子量４３． １、２９．２、１８．８、１６．５、６．４ｋＤａ）；レーン２：５０ｎｇの天 然型ヒトβ−カゼイン；レーン３：非誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ ｐＲＪＢ−７）；レーン４：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ −７）；レーン５：非誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ −ＣＫIIβα）；レーン６：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ− １１ｄ−ＣＫIIβα）；レーン７：非誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ ｐＲＪＢ−９）；レーン８：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ −９）。 図９は、ホスホセリンに対する抗体を用いたウエスタンイムノブロット分析を 示す。レーン１：低分子量マーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、相対分子量４４、２ ８．７、１８．５、１４． ７、５．８、２．９ｋＤａ）；レーン２：１μｇの天然型ヒトβ−カゼイン；レ ーン３：２μｇの天然型ヒトβ−カゼイン；レーン５：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα）；レーン６：誘導ＨＭＳ１７４ （ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）；レーン７：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３ ）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−７）；レーン８：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙ ｓＳ（ｐＳ６３７）；レーン１０：１μｇの組換えヒトβ−カゼイン；レーン１ １：２μｇの組換えヒトβ−カゼイン。 図１０は、ヒトβ−カゼインに対する抗体を用いたイムノブロット分析を示す 。レーン１：分子量マーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、相対分子量４４、２８．９ 、１８．５、１４．７、５．８ｋＤａ）；レーン２：天然型ヒトβ−カゼイン； レーン３：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）；レーン４ ：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＳ６３７）；レーン５：誘導ＨＭ Ｓ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα）；レーン６：組 換えヒトβ−カゼイン。 図１１は、ホスホセリンに対する抗体を用いたイムノブロット分析を示す。レ ーン１：分子量マーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲ Ｌ、相対分子量４４、２８．９、１８．５、１４．７、５．８、２．９ｋＤａ） ；レーン２：１μｇの天然型ヒトβ−カゼイン；レーン３：５００ｎｇの天然型 ヒトβ−カゼイン；レーン４：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪ Ｂ−９）；レーン５：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＳ６３７）； レーン６：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβ α）；レーン７：：１μｇの組換えヒトβ−カゼイン；レーン８：５００ｎｇの 組換えヒトβ−カゼイン。発明の詳細な説明 本発明は、修飾された組換えタンパク質を宿主細胞中で産生させる方法に関す る。より特定的な実施態様において本発明は、リン酸化ヒトタンパク質を細菌細 胞中で産生させる方法に関する。方法は、タンパク質キナーゼによってリン酸化 され得る外因性タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、適正なタンパク質 キナーゼをコードするヌクレオチド配列との双方を有する単一ベクターを作製す る段階と、産生されたキナーゼが産生された外因性タンパク質をリン酸化するよ うに宿主細胞中でベクターを発現させる段階と、リン酸化された組換えタンパク 質を単離する段階とから成る。本発明は、リン酸化されるべきタ ンパク質をコードするヌクレオチド配列とキナーゼをコードするヌクレオチド配 列とを単一構築物中にプロモーターと共にタンデムに配置することによって、高 レベルの特異的リン酸化が達成され、しかも多数ベクターに伴う不利な特徴、例 えば抗生物質耐性遺伝子をマーカーとして使用する必要性が除去されるという予 想外の発見を提供する。単一構築物系の使用は、工業利用を目的とした処理手順 の規模拡大を容易にする。本発明方法は外因性タンパク質を発現させ得る任意の 宿主細胞系で有用であることが理解されよう。適当な宿主細胞としては、細菌の ような原核細胞と酵母及び動物細胞のような真核細胞との双方がある。 本発明の好ましい実施態様では、宿主細胞が大腸菌である。いくつかの異なる 発現フォーマットでβ−カゼインをコードするヌクレオチド配列を用い、大腸菌 の菌株中での組換えヒトβ−カゼインの発現を試験した。一連の実験後、ヒトβ −カゼインをコードする配列がヒトカゼインキナーゼＣＫIIβαをコードする配 列と単一構築物中に配置されているときに、組換えヒトβ−カゼインが有効にリ ン酸化されるという結論が得られた。双方の遺伝子が１つのプラスミド中にタン デムに配置されてい るときのリン酸化効率は、キナーゼをコードする配列とβ−カゼインをコードす る配列とが異なる２つのベクター中に配置されている実験系に比べて低下しては いなかった。材料及び方法 実施例１から５に記載の試験では以下の材料及び方法を使用した。追加の材料 及び／または方法に関しては、個々の実験で必要に応じて記載する。実施例６で 使用した材料及び方法に関しては別に記載する。プラスミド 図１に示すプラスミド構築物ｐＳ６３７は、追加のアミノ酸であるグルタミン （Ｇｌｎ）を１９位にコードしている以外は、Ｈａｎｓｓｏｎら（１９９３）に よって構築され記載されたｐＳ２６に等しい。この文献は参照によって本発明に 含まれるものとする。出発発現ベクターｐＳ２６を修飾し、ヒト集団中に最も多 く見出される変異体に等しい組換えβ−カゼインタンパク質を産生するｐＳ６３ ７を作製した。 構築物ｐＳ６３７は、参照によって本発明に含まれるカゼインキナーゼIIをコ ードするヌクレオチド配列（Ｓｈｉら，１９９４）と同時発現するように、β− カゼインをコードするヌク レオチド配列の下流に２つのカゼインキナーゼサブユニットβ及びαをコードす るＣＫIIβαをコードするヌクレオチド配列をカセット形態で配置することによ って作製した。３つのシストロンがタンデム配置された発現ベクターｐＥＴ−１ １ｄ−ＣＫIIβαは、Ｓｈｉら（１９９４）によって作製されたＣＫIIβαを含 むプラスミドである。先ず、β−カゼインをコードする配列の下流の２つの部位 でｐＳ６３７を切断し再結合した。２つの切断部位の間の１９１塩基が欠失した 図１に示すプラスミドｐＲＪＢ−６を単離した。ｐＲＪＢ−６に挿入するための キナーゼＣＫIIβαを作製した。挿入後に得られた構築物をｐＲＪＢ−９と命名 し、図２に示す。ｐＲＪＢ−９は、リン酸化β−カゼインの産生を媒介するよう に設計された単一構築物である。更に、ｐＳ６３７を修飾して、プラスミドｐＳ ７５０及びｐＲＪＢ−７を構築した。これらのプラスミドに関しては詳細に後述 する。宿主細胞 後述する本発明の特定実施態様では、記載されたベクターによって形質転換さ れた宿主生物は大腸菌であった。本発明方法で使用できる他の代表的生物として は、バチルス、ラクトバチ ルス及びストレプトコッカスの種がある。プロモーター 後述する本発明の特定実施態様においてはＴ７プロモーターを使用した。本発 明方法で使用できる他の代表的プロモーターとしては、誘導プロモーターλＰ_L 、λＰ_R及びＴａｃ、構成プロモーターｂｌａ及びｓｐａがある。細菌発現用プラスミドの構築 詳細な方法 発現ベクターｐＳ６３７ 発現ベクターｐＳ６３７は、β−カゼインをコードする配列の１９位のアミノ 酸残基としてグルタミン（Ｇｌｎ）をコードするヌクレオチドトリプレットを含 むので、Ｈａｎｓｓｏｎら（１９９３）に記載のｐＳ２６とは違っている。ｐＳ ２６の配列よりも頻繁にヒト集団中に見出されるヒトｃＤＮＡ変異体からこのヌ クレオチド配列を単離した。ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)増幅のために２つの 合成オリゴヌクレオチドを合成した。合成オリゴヌクレオチドは、適当な制限部 位を提供し、細菌によって優先的に使用されるアミノ酸のコドンを取込んでいた 。２つのオリゴヌクレオチドをＳＹＭ４１７４（配列１）及びＳ ＹＭ４１７５（配列２）と命名し、以下に示す： ＳＹＭ４１７４：５′−ＣＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＡＴＧＣＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴ ＣＧＡＡＴＣ−３′ ＳＹＭ４１７５：５′−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＧＴＴＴＡＡＣ ＴＴＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＣＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＣＧＧＴＧＡＴＣＧＡＴＴＣ −３′ Ａｕｓｕｂｅｌら，（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，Ｖｏｌ．２，Ｓｕｐｐ．１６．１５． ０．３−１５．１．１７（１９９１）に記載の手順でＰＣＲ増幅を実施し、増幅 フラグメントをＰＳｔＩ及びＡｖａIIで消化して８５ｂｐのフラグメントを作製 した。Ｈａｎｓｓｏｎら（１９９３）によって記載されたプラスミドｐＳ２１を ＥｃｏＲＶ及びＡｃｃＩによって消化し、３２８ｂｐのフラグメントをケル電気 泳動によって単離した。単離したフラグメントを電気溶出によってアガロースゲ ルから精製し、ＡｖａIIで消化した。この結果として得られた１９７ｂｐのＡｖ ａII／ＡｃｃＩフラグメントを単離した。ＰｓｔＩ／ＡｖａII消化しＰＣＲ増幅 した８５ｂｐのフラグメント及び１９７ｂｐのＡｖａII／ＡｃｃＩを、ＰｓｔＩ ／ＡｃｃＩ 消化したｐＳ２５（Ｈａｎｓｓｏｎらに記載のプラスミド）に結合した。得られ たプラスミド構築物を配列決定し、ｐＳ６３６と命名した。６４４ｂｐのＮｄｅ Ｉ及びＢａｍＨＩ制限フラグメントをｐＳ６３６から単離し、Ｎｄｅｌ／Ｂａｍ ＨＩ消化したベクターｐＳ２６（Ｈａｎｓｓｏｎらに記載のプラスミド）に導入 した。得られた発現ベクターをｐＳ６３７と命名した。発現ベクターｐＲＪＢ−９ Ｓｈｉら（１９９４）によって作製されたＣＫIIβαをコードする配列を含む ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαプラスミドを、組換えβ−カゼインと同時発現する ように操作した。先ず、ｐＳ６３７のβ−カゼインをコードする配列の下流の２ つのＥｃｏＲ１部位を切断し再結合することによって、ｐＳ６３７から１９１塩 基対（ｂｐ）を除去した。上記２つの部位の間の１９１ｂｐを欠失しており、β −カゼインをコードする配列の３′端から１３２塩基離れた位置に単一のＥｃｏ ＲＶ部位を保持しているプラスミドｐＲＪＢ−６（図１）を単離した。ＣＫIIβ αをコードする配列を含むプラスミドｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαをＣｌａＩで 切断し、この部位をクレノウ酵素（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）で埋戻して平滑末端を作製した。ＣｌａＩで切断し埋戻し たＣＫIIβαをコードする配列を、ｐＲＪＢ−６のβ−カゼインをコードする配 列の下流に挿入し、得られた構築物をｐＲＪＢ−９と命名し、図２に示す。発現ベクタ−ｐＲＪＢ−７ 組換えβ−カゼインとＣＫIIβαキナーゼとを同時発現させるためにｐＳ６３ ７を操作し、ＣＫIIβαをコードする配列をβ−カゼインをコードする配列の直 後に配置した。ＣＫIIβαをコードする配列をＢｇｌII／ＢａｍＨＩフラグメン トとしてｐＳ６３７のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＲＪＢ−７と命名した。この フラグメントはその出発ベクターｐＥＴ−１１Ｄ−ＣＫIIβαに由来のＴ７プロ モーターを含んでいた。従って、図３に示すように、ｐＲＪＢ−７は２つのＴ７ プロモーターを含み、一方はβ−カゼインをコードする配列の上流、他方はＣＫ IIβαをコードする配列の上流に位置する。発現ベクターｐＳ７５０ 選択マーカーをアンピシリン耐性からカナマイシン耐性に変更するために、プ ラスミドｐＳ６３７をＰｖｕＩによって消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによ って処理して平滑末端を作 製した。直鎖化したベクターを単離し、ＨｉｎｃIIカナマイシン耐性ｇｅｎｂｌ ｏｃｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に結合した。得 られた発現ベクターをｐＳ７５０と命名した（図４）。組換えヒトカゼインキナーゼIIの発現ベクター 発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα（Ｓｈｉら，１９９４）は、Ｈａｒ ｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡのＤｒ．Ｃ．Ｗ ａｌｓｈによって提供された。 Ｓｔｕｄｉｅｒら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５： ６０−８９，１９９０）によって記載された手順で発現実験を実施した。カルベ ニシリンに耐性を与える遺伝子を含むプラスミドであるｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫII βαの場合には５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するルリアブイヨン（Ｌ Ｂ培地）で細菌を培養し、カナマイシンに耐性を与える遺伝子を含むプラスミド であるベクターｐＳ７５０の場合には、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有す るルリアブイヨン（ＬＢ培地）で細菌を培養した。クロラムフェニコールに耐性 を与えるｐＬｙｓプラスミドを含む菌株を使用したときは、培 地に３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した。Ｔ７発現系を誘導する ために、培養物を約ＯＤ６００＝０．５の密度まで増殖させ、０．４ｍＭのイソ プロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。誘導の約９ ０分後に細胞を採集した。組換えβ−カゼインの電気泳動及び検出 細胞を遠心によってペレット化し、１ｍｌの培養物から得られたペレットを１ ００μｌのサンプルバッファに溶解した。サンプルバッファはＴｒｉｓ，グリセ ロール、ＳＤＳ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びブロモフェノールブルーを 含有していた。Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５，１９ ７０）によって記載された手順でタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し た。Ｐｒｏｔｅａｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）電気泳動装置 中で不連続バッファ系に勾配ゲルを流し込み、処理した。Ｌａｅｍｍｌｉによっ て記載された手順でゲルを染色した。製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の使用説明書 に従って免疫ブロッティングを実施した。修飾タンパク質の単離手順 修飾されたタンパク質は当業界で公知の任意の標準手順によ って単離され得る。代表的な標準手順を以下に示す。 標準的な機械的及び化学的手順によって細胞を採集し、破壊する。次に、細胞 をバッファに懸濁させ、均質化し、遠心し、上清を廃棄する。得られた不溶性ペ レットを再懸濁させ、上清を廃棄する。この結果として洗浄された不溶性ペレッ トが得られる。得られたペレットを５０ｍＭのＴｒｉｓ及び６Ｍの尿素にｐＨ８ ．２で懸濁させ、均質化する。β−カゼイン上清Ｉを除去すると、不溶性抽出物 が得られるので、この抽出物を５０ｍＭのＴｒｉｓ及び６Ｍの尿素にｐＨ８．２ で再度懸濁させ、均質化する。β−カゼイン上清IIを除去し、上清Ｉ及びIIをプ ールする。残りの不溶性抽出物を廃棄する。プールした上清を５０ｍＭのＴｒｉ ｓ及びｐＨ８．２で１：１に希釈し、３Ｍの尿素で処理して、β−カゼインを抽 出する。β−カゼインの尿素抽出物を５０ｍＭのエタノールアミン、１００ｍＭ のＮａＣｌ，ｐＨ９．５に透析し、遠心し、５０ｍＭのエタノールアミン、１０ ０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ９．５でタンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌになるまで希釈 することによって、最終β−カゼイン溶液を得る。ペレットを廃棄する。実施例 実施例１及び２に記載の実験は、β−カゼインをコードするヌクレオチド配列 及びカゼインキナーゼをコードするヌクレオチド配列を夫々含む２つのベクター によって細菌を同時形質転換させたときにも、組換えβ−カゼインの産生に不利 な影響が及ばないことを示す。これらの実験はまた、これらの２つのベクターを 細菌系で使用することによって組換えリン酸化β−カゼインを産生できることを 示す。 実施例４は、プロモーターを含み、同時に、転写されリン酸化されるべきタン パク質をコードするヌクレオチド配列とキナーゼをコードするヌクレチド配列と の双方を含む単一構築物を細菌株の形質転換に使用した系を記載している。実施 例４では、単一プラスミドを用いる組換えリン酸化β−カゼインの産生を示した 。実施例５は、ヒト天然型β−カゼインに等しい組換えリン酸化β−カゼインを 細胞外に局在する形態で発現させる単一構築物系を記載している。実施例６は、 本発明のプラスミドの指令下で作成された天然型ヒトβ−カゼイン及び組換えヒ トβ−カゼインの６つのリン形態のヒト咽頭細胞へのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ の付着を阻害する能力の比較を示す。実施例１ ：大腸菌Ｂ中のβ−カゼインの産生：細胞内に局在する組換えＭｅｔ− β−カゼインのリン酸化 ：ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株 細菌発現系中で組換えβ−カゼインをｉｎ ｖｉｖｏでリン酸化する組換えヒ トβα（ｒｈＣＫII）の能力を分析するために、２つの誘導性発現ベクターを用 いて大腸菌中で実験を行った。発現ベクターｐＳ７５０を単独でまたは発現ベク ターｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαと組合わせて、Ｔ７宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３ ）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを形質転 換した。ＤＥ３は、ｌａｃ１リプレッサーとイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクト ピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導されるｌａｃＵＶ５プロモーターとＴ７Ｒ ＮＡポリメラーゼ遺伝子とを含むラムダファージ由来のＤＮＡフラグメントであ る。インデューサーの存在下で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが産生され、その結 果として、外因性遺伝子が転写される。プラスミドｐＬｙｓＳはクロラムフェニ コール耐性を与え、外来タンパク質の増殖速度及び産生には殆ど影響を及ぼさな い。このプラスミドは、大腸菌中のプラスミドの安定性を増加し、凍結及び解凍 によって細胞を溶解させ得るＴ７ リゾチームを含んでいる。 図５に示す結果は、大腸菌中で高レベルの組換えヒトＭｅｔ−β−カゼインが 産生され、組換えヒトＣＫIIβαの同時産生が産生量に影響を及ぼさないことを 示している。タンパク質の電気泳動分離及びリン酸塩染色によって、ＣＫIIβα が組換えヒトＭｅｔ−β−カゼインをｉｎ ｖｉｖｏでリン酸化したことが観察 される。実施例２ ：大腸菌Ｋ−１２中のβ−カゼインの産生：細胞内に局在する組換えＭ ｅｔ−β−カゼインのリン酸化 ：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）菌株 組換えヒトＭｅｔ−β−カゼインを産生させる宿主として、大腸菌Ｋ−１２株 ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＨＭＳ１７４ （ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを試験するために、ｐＳ７５０によって形質転換させた。 最も効率的な産生はＨＭＳ１７４ｐＬｙｓＳによって得られた。ｐＳ７５０及び ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαを用いる同時発現実験は、組換えヒトＭｅｔ−β− カゼイン産生の強力な誘導を示し、この誘導がｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαの存 在に無関係であることを示した。リン酸塩染色（図７）は、組換えヒトＣＫIIと 共 にｉｎ ｖｉｖｏで同時産生されたときのＭｅｔ−β−カゼインの効率的なリン 酸化を示した。本質的には２プラスミド系は、本発明の単一プラスミド系よりも 望ましくない。その理由は、宿主細胞中の各プラスミドの存在を発酵過程でモニ ターできるようにプラスミドの各々が抗生物質マーカーを含んでいなければなら ないからである。このため、増殖培地に２種類の抗生物質を使用する必要があり 細菌増殖が遅くなる。実施例３ ：ヒトβ−カゼイン大腸菌Ｋ−１２の産生：β−カゼインをコードする 配列とＣＫIIβαをコードする配列との双方を含む構築物ｐＲＪＢ−７ ：β−カ ゼインをコードする配列の上流のＴ７プロモーター ；ＣＫIIβαをコードする配 列の上流のＴ７プロモーター β−カゼインを含みまた各遺伝子がその上流にＴ７プロモーターを含む構築物 ｐＲＪＢ−７で、大腸菌Ｋ−１２宿主ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ＬｙｓＳを形質転 換させた。形質転換及び誘導の手順は、実施例４に記載するようなＮｏｖａｇｅ ｎ ｐＥＴ系マニュアルの手順に準拠した。ウエスタンブロット分析 分離及び転移、ブロッキング及び抗体の手順については実施 例４に記載する。図８は、４つの異なる構築物を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ ３）ＬｙｓＳ細胞によるβ−カゼインの産生を比較するイムノブロットを示す。 誘導及び非誘導の細胞培養物に由来の溶菌液を分析する。細胞は、ｐＥＴ−１１ ｄ−ＣＫIIβα（ＣＫIIβ及びＣＫIIαをコードする配列を含むプラスミド）、 ｐＲＪＢ−９（ＣＫIIβ−カゼイン及びＣＫII ＣＫIIβαをコードする配列の 双方を含みβ−カゼインをコードする配列だけがその上流にＴ７プロモーターを 含むハイブリッド構築物）、または、ｐＲＪＢ−７（β−カゼイン及びＣＫIIβ αをコードする配列の双方を含みβ−カゼイン及びＣＫIIβαをコードする配列 の各々が上流にＴ７プロモーターを含むハイブリッド構築物）を含む。ｐＲＪＢ −７による細菌の形質転換の結果として細菌増殖が顕著に減速した。大腸菌ＨＭ Ｓ１７４（ＤＥ３）ＬｙｓＳは、Ｔ７プロモーターを１つしか含まない構築物で あるｐＲＪＢ−９で形質転換された同じ菌株に比べてほぼ２倍の倍加時間を要し た。図８に示すウエスタンブロットは、ｐＲＪＢ−９を含む細胞に比較してｐＲ ＪＢ−７を含む誘導細胞による組換えＣＫIIβ−カゼインの産生低下を示す。こ れはレーン４（誘導ｐＲＪＢ−７）とレーン８（誘導ｐＲＪＢ−９） との比較によって明らかである。ｐＲＪＢ−７及びｐＲＪＢ−９の双方がｐＳ６ ３７に由来するが、ｐＲＪＢ−９だけが親構築物に等しい量のＣＫIIβ−カゼイ ンを産生した。ハイブリッド構築物中のＣＫII遺伝子の上流の追加のＴ７プロモ ーターの存在は、細胞増殖を減速させ、従って組換えタンパク質の産生を低下さ せるという結果を示した。 図９は、リン酸化タンパク質を検出するために溶菌液をホスホセリン抗体と共 に展開したウエスタンブロット分析を示す。ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα、ｐＲ ＪＢ−９（１つのＴ７プロモーターをもつハイブリッド構築物）、ｐＲＪＢ−７ （２つのＴ７プロモーターをもつハイブリッド構築物）またはｐＳ６３７（β− カゼインをコードする配列を含むがＣＫIIβαをコードする配列を含まない）を 含む誘導された大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ＬｙｓＳ細胞によるリン酸化組換 えβ−カゼインの産生を比較した。リン酸化β−カゼインは、ｐＲＪＢ−９を含 む細胞中でだけ産生された（レーン６）。ｐＲＪＢ−７を含む細胞の溶解液を含 むレーン７ではリン酸化タンパク質は全く検出されなかった。 ２つのＴ７プロモーターを有する構築物中でリン酸化タンパ ク質が検出されなかったことは、微生物中で適正に修飾された組換えタンパク質 を発現するための本発明で開示された単一構築物を開発するために、創意及び実 験の双方が必要であったことを示す。タンパク質をコードするヌクレオチド配列 とキナーゼをコードするヌクレオチド配列とを含む単一構築物中で２つのＴ７プ ロモーターを用いた実験は陰性結果を与えたが、異なる実験条件下では２つ以上 のプロモーター配列の使用が排除されないことも有り得る。２つの異なるプロモ ーターを使用するのが好ましいという状況も本発明の範囲内に維持される。実施例４ ：大腸菌Ｋ−１２中のヒトβ−カゼインの産生：β−カゼインをコード する配列とＣＫIIβαをコードする配列との双方を含む構築物ｐＲＪＢ−９ 本発明は、官能基を特異的部位に転移させる情報と修飾すべきタンパク質との 双方を発現する単一構築物を使用する。本発明の特定実施態様においては、転移 される官能基はリン酸基である。転移は、組換えヒトβ−カゼインの特異的部位 のｉｎ ｖｉｖｏリン酸化を媒介することが証明されたキナーゼによって行われ る。本発明は、ヒトβ−カゼインが大腸菌によってｉｎｖｉｖｏで特異的にリン 酸化されることを証明するだけでなく、 β−カゼインをコードする配列の上流に配置されたプロモーターを有しており単 一構築物系であるという利点を有している単一構築物がこの機能を適確に媒介す ることを示す。大腸菌Ｋ−１２ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの形質転換 β−カゼイン遺伝子とＣＫIIβα遺伝子とを含む構築物ｐＲＪＢ−９によって 大腸菌Ｋ−１２宿主ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ＬｙｓＳを形質転換した。形質転換 手順はＮｏｖａｇｅｎ ｐＥＴ系マニュアル（第４版、ＴＢ Ｎｏ．５５，１９ ９４年６月）に記載の手順に準拠した。発現の誘導 プラスミドｐＲＪＢ−９（図２）、ｐＳ６３７（図１）、またはｐＥＴ−１１ ｄ−ＣＫIIβα（Ｓｈｉら，１９９４）を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）Ｌ ｙｓＳ宿主細胞を３０℃でＯＤ６００＝０．５−０．６の密度まで増殖させた。 １ｍＭのインデューサーＩＰＴＧの添加前及び添加の６時間後に培養サンプルを 採取した。２つの１ｍｌアリコート中の細胞を微小遠心管で遠心することによっ てペレット化した。細胞をゲル電気泳動用のサンプルローディングバッファに再 懸濁させた後、各 アリコートから５００μｌの上清を採集した。使用済みの培養培地を、Ｍｉｃｒ ｏｃｏｎ １０スピンフィルター（Ａｍｉｃｏｎ）内で１０，０００×Ｇで３５ 分間濃縮した。１．０００×Ｇで３分間旋回させた後、残留液（ｒｅｔｅｎｔａ ｔｅ）を収集し、２倍の濃度の等量のサンプルバッファを添加した。ウエスタンブロット分析 １０−２０％勾配のＳＤＳ−ポリアタリルアミドプレキャストゲル（Ｉｎｔｅ ｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｓｙｓｔｅｍ）で細胞溶解液を分離し 、半乾燥ブロッターによってＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移した。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ Ｔｒａｎｓｆ ｅｒ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定電流(０．８ｍＡ／ｃｍ²)を４５ 分間流してゲルをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ ＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ ｅ）に電気ブロットした。転移バッファは、４８ｍＭのＴｒｉｓ、３９ｍＭのグ リシン、１．３ｍＭのＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）及び２０％のメタノー ルを含有していた。転移に先立って、フィルターを、先ずメタノール、次いで転 移バッファに浸漬した。ウエスタンブロット分析のために、膜をＴＢＳ（２５ｍ ＭのＴｒｉｓ，０． １５４ＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．４）中の３％ウシ血清アルブミン及び０．２％Ｔ ｗｅｅｎ中でブロックした。β−カゼインに対する一次抗体及びアルカリ性ホス ファターゼヤギ抗ウサギ抗体から成る二次抗体を、ブロッキングバッファで１： ８０００に希釈した。ホスホセリンを検出するために追加の抗体を使用した。ブ ロッキング反応及び抗体反応は、ＴＢＳ中に増幅グレードのブタ皮膚（Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む２％ゼラチン中で２５−２６℃で２時間行っ た。次いで、ブロットをＴＢＳで３０分間洗浄した。マウスモノクローナル抗ホ スホセリン（Ｓｉｇｍａ）から成る一次抗体を、２％ゼラチンブロッカーで１： ２００または１：１００に希釈し、２時間インキュベートした。ブロットをＴＢ Ｓで５分間ずつ２回洗浄した。ヤギ抗マウスアルカリ性ホスファターゼ（Ｓｉｇ ｍａ）から成る二次抗体をゼラチンブロッカー中で１：４０００に希釈し、１時 間インキュベートして、ＴＢＳ中で上記同様に洗浄した。発色用基質としてはニ トロブルーテトラゾリウム及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフ ェートを使用した。 図１０は、３つの異なる構築物を含む大腸菌Ｋ−１２ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３ ）ＬｙｓＳ細胞によるβ−カゼインの産生を 比較するイムノブロットを示す。細胞は、ｐＳ６３７（β−カゼインをコードす る配列を含むプラスミド）、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα（ＣＫIIβ及びαをコ ードする配列を含むプラスミド）またはｐＲＪＢ−９（β−カゼイン及びＣＫII βαの双方の配列をコードするハイブリッド構築物）を含む。レーン３及びレー ン４の比較は、ハイブリッド構築物ｐＲＪＢ−９が、その誘導起原であるＣＫII βαをコードする配列を含まないｐＳ６３７と等しい量のβ−カゼインを産生す ることを示す。この宿主細胞中でｐＲＪＢ−９及びｐＳ６３７の双方が４００− ５００ｍｇ／リットルのβ−カゼインを産生した。この実験は、β−カゼインを コードする配列をＣＫIIβαをコードする配列とタンデムに配置してもβ−カゼ インの産生量が有意に変化しないことを示す。 図１１は、リン酸化タンパク質を検出するために、溶菌液をホスホセリン抗体 と共に展開させたウエスタンブロット分析を示す。図８の溶菌液以外に、増加量 の天然型ヒトβ−カゼインと非リン酸化組換えβ−カゼインとを試験した。ＣＫ IIβαプラスミドに由来の溶菌液を含むレーン６では細菌タンパク質のリン酸化 は観察されない。これは、リン酸化が特異的であるこ とを示す。β−カゼインとＣＫIIβαをコードする配列とをタンデムに含むｐＲ ＪＢ−９を含むレーン４の細胞溶解液は、抗体と交差反応する強力なバンドを示 す。レーン４のバンドは、レーン２及び３に示す電気泳動分析によれば天然型ヒ ト母乳β−カゼインと同じ分子量を有している。レーン７及び８に示すように精 製された組換え非リン酸化ヒトβ−カゼインに対して、または、レーン５に示す ようにｐＳ６３７によってｉｎ ｖｉｖｏで発現された組換え非リン酸化ヒトβ −カゼインに対して、交差反応性は存在しなかった。この実験は、単一構築物を 用いた細菌系の形態の大腸菌Ｋ−１２中で完全形ヒトβ−カゼインの特異的な高 レベルリン酸化が生じることを示している。実施例５ ：大腸菌Ｋ−１２中のβ−カゼインの産生：細胞外に局在する組換えβ −カゼインのリン酸化 ：大腸菌リーダー配列とプロモーターとβ−カゼインをコ ードする配列とｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαとを含む構築物 この実施例では、大腸菌Ｋ−１２を形質転換し、細胞外に局在するリン酸化β −カゼインの産生を媒介するために使用される単一プラスミドの構築を開示する 。細菌細胞のペリプラズム空間にリン酸化タンパク質を分泌するように設計され た単一構 築物を作製するために、β−カゼインをコードする配列を、細胞形質へのタンパ ク質輸送を指令するリーダー配列を含む発現ベクターに導入する。これらの手順 から得られたクローンを標的ＤＮＡとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）を実施する。Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ＲｅａｇｅｎｔＣｏ．（ Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）で合成された以下のプライマーをＰＣＲに使用し得る： ＲＯ−４：５′−ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＣＴ−３′（配列３）及 びＲＯ−２９：５′−ＧＧＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＡＣ ＧＣＧ ＴＧＡ ＡＡ Ｃ−３′（配列４）。ＲＯ−２９の下線を付けた塩基は、細菌のタンパク質合成 開始コドンであるメチオニンを除去するために、β−カゼインをコードする配列 の末端にＭｌｕＩ部位を生じさせるべく取込まれた単一塩基変異である。この変 異取込みの目的は、得られるタンパク質がヒトβ−カゼインのアミノ酸配列に等 しいアミノ酸配列をもつようにすることである。次いでＰＣＲフラグメントを精 製する。修飾されていないコード配列の３′端をＢａｍＨＩで切断する。５′平 滑末端と３′ＢａｍＨＩ端とを有するこのフラグメントを、Ｔ７プロモーターを 含む発現ベクターｐＥＴ−２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏ ｎ，ＷＩ）にクローニングし、平滑末端をＭｓｃＩ及びＢａｍＨＩで切断する。 ここに記載の構築物はＴ７プロモーターを含むが、他のプロモーター配列の使用 も可能である。ＣＫIIβαをコードする配列を、ｐＲＪＢ−９の場合に上述した ように挿入する。実施例４に記載の手順に従って発現を誘導し、ウエスタンブロ ット分析を実施する。 ホスホセリンに対する抗体と交差反応し天然型β−カゼインと同様に泳動する タンパク質を同定するために、ウエスタンブロットを実施し、細菌細胞のペリプ ラズム空間から単離する。この実験は、組換えヒトβ−カゼインが異種の翻訳開 始及びシグナル配列に融合した配列によってコードされており、このコード配列 が上流にプロモーター配列を有しており、且つ、リン酸化されるべき該コード配 列がＣＫIIβαのようなキナーゼをコードする配列を含むプラスミド中に配置さ れているときは、組換えヒトβ−カゼインがリン酸化されることを示す。細胞外 に局在するリン酸化タンパク質の産生は、１ベクター系においても２ベクター系 においてもこれまで開示されたことはない。 産生されるリン酸化タンパク質が細胞内に局在する場合に比べて細胞外に局在 するときの利点は、その精製が容易なことで ある。細菌細胞のペリプラズム空間は細胞内よりも異物が少ないので精製された タンパク質の単離を速やかに行うことができる。このことは商業生産には特に有 利である。実施例６ ：天然型及び組換えヒトβ−カゼインの抗付着生物活性の比較 ヘモフィルスＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓは、リポ多糖−タンパク質細胞壁をもつ 小さいグラム陰性桿菌であり、ヒト及び動物種の粘膜に存在する偏性寄生菌であ る。全部ではないにしても多くのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｅの菌株の表面は、多糖カプセルで被覆されている。カプセル被覆されない分類 不能なＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの菌株は生後数カ月以内に殆どの個体の上気道 に転移増殖し、これらの種は中耳炎及び副鼻腔炎などのいくつかの疾病に最も関 連が深い（Ｍｕｒｒａｙら，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎ ｄ ｅｄ．，ｐ．２６０，１９９４）。また慢性気管支炎を悪化させたりする。 ヒト咽頭細胞に対するＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの付着を阻害する活性につい て、天然型ヒトβ−カゼインと、ｐＲＪＢ−９を含む細胞中で合成された組換え ヒトβ−カゼインとの比較 アッセイを実施した。０−５個のリン酸基をもつリン酸化タンパク質の比較を行 った。細胞及び細菌株 Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２ヒト咽頭癌細胞（ＤＴ５６２）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ）から入手した。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの分類不能な菌株をオハイオ州立大 のＤｒ．Ｌａｕｒｅｎ Ｂａｋａｌｅｔｚから入手した。細胞培養物 ９６ウエルのプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に、ウエ ルあたり２０，０００−２５，０００細胞の密度で播種したＤＴ ５６２細胞を 、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を補充 したダルベッコの改質イーグル培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）で培養した。９５％空気及び５％二酸化炭素の湿潤雰囲気中で３７℃で細 胞をインキュベートした。細胞が９０％以上の集密度に到達したときに実験を行 った。細胞を含むプレートを２００μｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（ ＧＩＢＣＯ）で３回洗浄することによって細菌添加に先立って血 清タンパク質を除去した。天然型ヒトβ−カゼイン ヒトの母乳から単離したβ−カゼインをＳｙｍｂｉｃｏｍＡＢ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏ ｓ １４５１，Ｓ−９０２ ２４ Ｕｍｅａ，Ｓｗｅｄｅｎから購入した。リン形態の分離 ７０００×ｇで４０℃で１０分間遠心することによって細胞を収集した。上清 を除去し、ペレット化した細胞をＪｏｈｎｓｏｎら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ ，１９９４年１２月，ｐｐ．１３５７−１３６０）に記載の凍結／解凍方法 で処理して、組換えβ−カゼインを遊離させた。０．４５μの膜で濾過した後、 β−カゼインを含有するサンプルを、アニオン交換カラム（Ｍｏｎｏ Ｑ １０ ／１０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ）に充填した。種々のリン形態を、２０ｍＭのエタノールアミン、６Ｍの尿素， ｐＨ９．５中の０−０．５ＭのＮａＣｌの直線勾配で５０分間処理して分離した 。 組換えβ−カゼインの種々のリン形態を、夫々の溶出時間と精製された天然型 ヒト母乳β−カゼインの溶出時間との比較に よって同定した。細菌の放射性標識 Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを少ない継代数の凍結アリコートからチョコレート 寒天プレートに画線培養し、９５％空気及び５％二酸化炭素の湿潤雰囲気下に３ ７℃で１８時間インキュベートして対数増殖期培養物を得た。採取した細菌を、 ０．０５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した燐酸塩緩衝生理食塩水（ ＰＢＳ）中で遠心し、等容のＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁させると、波長６００ｎｍ の光学密度（ＯＤ６００）２．４が得られた。¹¹¹インジウム−オキシン（¹¹¹Ｉ ｎ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を使用 して細菌を放射性標識した。５０μＣｉの¹¹¹Ｉｎ溶液を２．５ｍｌの細菌懸濁 液に添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。放射性標識した細菌を１０ ｍｌのＨＢＳＳで２回洗浄し、未結合の¹¹¹Ｉｎを除去し、３０ｎＭのＨＥＰＥ Ｓバッファ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン 酸）を補充した５ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁させた。¹¹¹Ｉｎ標識した２５μｌの 細菌懸濁液を２５μｌの試験物質と共に９６ウエルのポリプロピレンプレート中 で３７℃で１５分 間プレインキュベートして試験物質を細菌に結合させた。付着の定量 放射性標識した細菌と天然型ヒトβ−カゼインまたは組換えβ−カゼインとを 含む２５μｌのプレインキュベーション混合物を、ＤＴ５６２細胞を含むアッセ イプレートの各ウエルにピペット注入した。細菌が細胞単層に付着するようにア ッセイプレートを３７℃で２０分間インキュベートした。プレートをＨＢＳＳで ３回洗浄することによって未付着の細菌を除去した。細胞単層及び付着性Ｈ．ｉ ｎｆｌｕｅｎｚａｅを破壊するために、１００μｌの０．０５Ｎの水酸化ナトリ ウムを添加することによってアッセイを終了した。各ウエルの内容物をＣｏｂｒ ａポリエチレン管に入れ、Ｃｏｂｒａガンマーカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍ ｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）でカウントした。４つの重複サンプルの結果を平均化する ことによって結果を計算した。結果を、試験物質を含まない対照ウエル中の細菌 付着に比較したときの異なる６段階のリン酸化レベルの天然型ヒトまたは組換え （ｐＲＪＢ−９）β−カゼインに対する細菌付着の阻害パーセントで示す。結果 抗付着活性が終始観察されたのは、β−カゼインが３、４または５個のリン酸 基でリン酸化されているときだけであった。より低いリン酸化レベルでは、天然 型ヒトβ−カゼインまたは組換えβ−カゼインのいずれの場合にも抗付着活性は 全くまたは殆ど観察されなかった。しかしながら、β−カゼインが３、４または ５個のリン酸基を有するより高度なリン形態の場合にも、天然型ヒトβ−カゼイ ンまたは組換え（ｐＲＪＢ−９）ヒトβ−カゼインの間で抗付着生物活性の違い は本質的に存在しなかった。これらの結果は、ヒト咽頭細胞に対するＨ．ｉｎｆ ｌｕｅｎｚａｅの付着を阻害するβ−カゼインの生物活性がリン酸化のレベルに 依存することを示す。非リン酸化または極めて低リン酸化のβ−カゼインは効力 がない。ヒト咽頭細胞に対するＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの付着を阻害するため には３、４または５個のリン酸基の付着が必要である。本発明のプラスミドによ って産生されたリン酸化組換えβ−カゼインは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの付 着を阻害するために天然型ヒトβ−カゼインと同程度の効力がある。これらの結 果を表１にまとめる。 表１ 中耳炎の原因因子としてＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが同定された（Ｍｕｒｒａ ｙら，１９９４）。本発明のプラスミドの指令下で少なくとも３つの部位でリン 酸化された組換えヒトβ−カゼインがヒト細胞に対するＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｅの付着を阻害することは前述の実験で証明されたので、上述のようなリン酸化 組換えヒトβ−カゼインが、ヒト、特に小児の中耳炎の予防及び治療に使用でき るという結論が得られる。 治療効果は、本文中に開示された３個以上のリン酸基を有するリン酸化組換え ヒトβ−カゼインを治療有効量で含む乳児用調合乳のような腸溶性液体栄養製品 を小腸内供給するかまたは摂取させることによって与えられる。また、ヒトの口 腔咽頭細胞に対するＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａの付着は、治療有効量のリン酸化組 換えヒトβ−カゼインを含む製剤を鼻腔経由または咽喉噴霧剤として投与するこ とによって阻害できる。このような経鼻腔投与される製剤は点鼻剤または噴霧剤 のいずれの形態でもよい。ヒトβ−カゼインとの相互作用は、β−カゼインの摂 取及び消化後よりも上咽頭での直接接触によって生じると考えられるので、経腸 、咽喉噴霧及び経鼻腔製品の投与が有効であ ると考えられる。 本発明によれば、リン酸化された組換え哺乳類タンパク質を微生物中で商業的 規模で生産し得る。本発明方法は、組換えヒトβ−カゼインを非限定例とする組 換え外因性タンパク質を大量生産するために使用できる。バイオリアクター中の β−カゼインのリン酸化によって、天然型ヒトβ−カゼインと等価の組換えβ− カゼインを発酵槽で大規模に合成することが可能になる。これは、天然型のリン 酸化状態のヒトβ−カゼインを含む乳児用調合乳の産生を容易にする。本発明方 法はまた、リン酸化及び脱リン酸化によって調節され細胞物質代謝のシグナルと して作用する受容体のような細胞タンパク質をリン酸化するために使用できる。 本発明は、ペプチド受容体をリン酸化するための費用効果的な方法を提供し、医 用薬剤の製造に有用であろう。 組換えリン酸化ヒトβ−カゼインのような発酵タンパク質の工業生産には２プ ラスミド系よりも１プラスミド系のほうが好ましい。増殖培地中の抗生物質によ って与えられる選択圧力を用いずに組換えタンパク質を大量生産するときは、発 酵プロセス中にプラスミドの損失が生じる。その理由は、複数のプラス ミドを含む細胞がプラスミドを１つだけ含むかまたは全く含まない細胞に比べて 選択的な利点がなく、逆にプラスミドの存在が負担になって増殖が遅くなるから である。しかしながら、発酵過程で細菌中に双方のプラスミドを維持するために 必要な選択圧力を与えるべく複数の抗生物質を使用すると、細菌増殖の遅滞が頻 発し、所望の組換え産物の収率が低下する。従って、工業目的には、本文中に開 示した単一プラスミド系か従来から開示されていた２プラスミド系よりもはるか に好ましい。 ３−５個のリン酸基を有するリン酸化された組換えヒトβ−カゼインは、任意 の標準的または特定の経腸液体栄養製品に組込むことができる。このような製品 の非限定例としては、牛乳もしくはヤギ乳のようなヒト以外の哺乳動物の乳に由 来のタンパク質または大豆もしくは稲のような植物源に由来のタンパク質を含む 乳児用調合乳、並びに、その他の小児用飲料がある。３−５個のリン酸基を有す るリン酸化された組換えヒトβ−カゼインを添加した製品は、ヒト細胞に対する Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの付着を阻害し、ヒトの小児中耳炎を子防するために 有用である。 本文中に開示された天然型ヒトβ−カゼインの特性に類似の 特性または同一の特性を有する組換えリン酸化ヒトβ−カゼインを産生する新規 な方法の発見は、このタンパク質の添加によってヒトの母乳により近く、従って 乳児の発育により有利な乳児用調合乳の調製を可能にする。また、修飾された組 換えヒトタンパク質を細菌系において産生する方法の開示は、他の食物及び医薬 品へのヒトタンパク質の添加を可能にする。 添付の実験及び図面を参照しながら本発明の好ましい特定実施態様を上記に説 明してきたが、本発明がこれらの個々の実施態様に限定されないこと、本発明の 請求の範囲に定義された発明の要旨または範囲を逸脱することなく多くの変更及 び変形が当業者によって可能であることは明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/17 ＡＥＤ Ａ６１Ｋ 37/16 ＡＢＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０８／５５４，６４２ (32)優先日 1995年11月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，ＮＯ，Ｎ Ｚ (72)発明者 ハンソン，レナート スウエーデン国、エス−907・38・ウーメ ア、ビヨルクベーゲン、50 (72)発明者 バクスター，ジエフリー・ハリス アメリカ合衆国、オハイオ・43021、ガレ ナ、ビツグ・ウオルナツト・ロード・6515 (72)発明者 ハーズ，ロバート・ジヨージ アメリカ合衆国、オハイオ・43015、デラ ウエア、メイナード・ロード・4575

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）プロモーターと、 （ｂ）下流の、外因性タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、 （ｃ）下流の、外因性タンパク質を修飾し得る酵素をコードするヌクレオチド配 列とから成るプラスミド。 ２．プロモーターが、Ｔ７プロモーター、λＰ_LまたはλＰ_Rプロモーター、及び Ｔａｃプロモーターから成る誘導プロモーターのグループから選択されることを 特徴とする請求項１に記載のプラスミド。 ３．プロモーターが、ｂｌａ及びｓｐａから成る構成プロモーターのグループか ら選択されることを特徴とする請求項１に記載のプラスミド。 ４．外因性タンパク質がヒトタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載 のプラスミド。 ５．外因性タンパク質がヒトβ−カゼインであることを特徴とする請求項１に記 載のプラスミド。 ６．コードされている酵素がキナーゼであることを特徴とする 請求項１に記載のプラスミド。 ７．コードされている酵素がＣＫIIβαであることを特徴とする請求項１に記載 のプラスミド。 ８．（ａ）誘導性Ｔ７プロモーターと、 （ｂ）下流の、ヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド配列と、 （ｃ）下流の、ヒトβ−カゼインをリン酸化し得る酵素ＣＫIIβαをコードする ヌクレオチド配列とから成るプラスミド。 ９．少なくとも３個のリン酸基を含む組換えリン酸化ヒトβ−カゼイン。 １０．（ａ）プロモーターと、 （ｂ）下流の、ヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド配列と、 （ｃ）下流の、ヒトβ−カゼインをリン酸化し得る酵素をコードするヌクレオチ ド配列とから本質的に構成されるプラスミドの指令下に合成された請求項９に記 載の組換えリン酸化ヒトβ−カゼイン。 １１．（ａ）プロモーターと、 （ｂ）下流の、ヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド配 列と、 （ｃ）下流の、ヒトβ−カゼインをリン酸化し得る酵素をコードするヌクレオチ ド配列とから本質的に構成されるプラスミドの指令下に合成された少なくとも３ 個のリン酸基を含む組換えリン酸化ヒトβ−カゼイン。 １２．プラスミドのプローターが、Ｔ７プロモーター、λＰ_LまたはλＰ_Rプロモ ーター、及びＴａｃプロモーターから成る誘導プロモーターのグループから選択 されることを特徴とする請求項１１に記載の組換えリン酸化ヒトβ−カゼイン。 １３．プラスミドのプロモーターか、ｂｌａ及びｓｐａから成る構成プロモータ ーのグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の組換えリン酸 化ヒトβ−カゼイン。 １４．プラスミドの指令下にコードされている酵素がＣＫIIβαであることを特 徴とする請求項１１に記載の組換えリン酸化ヒトβ−カゼイン。